CN107981034B - 一株布氏乳杆菌hew-a666及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株新分离的布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）HEW‑A666，该菌具有显著的益生性以及抗逆性；其应用于全株玉米青贮，可明显降低玉米青贮的pH值，乙酸和乳酸的含量明显增多，乳酸菌含量也明显提高，而霉菌和酵母菌含量则低于检测限，从而提高玉米青贮的发酵品质；而且提高了全株玉米青贮的感官品质和有氧稳定性，且营养成分高，有利于动物对青贮玉米的饲用。

Description

一株布氏乳杆菌HEW-A666及其应用

技术领域

本发明涉及青贮用益生菌，特别涉及一株布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）HEW-A666及其应用。

背景技术

青贮饲料是在密闭环境下通过厌氧发酵使作物秸秆中的糖类转化为乳酸，产生酸性环境，抑制和杀死各种有害微生物的繁殖而达到保存新鲜饲料及青绿牧草营养成分的一种技术；这种饲料基本保留了青绿饲料原有的青绿、多汁、营养丰富等特点，而且青贮饲料来源丰富，在制作时可将秸秆的色泽及叶片保留。青贮饲料柔软多汁、气味酸甜、芳香且适口性好，能促进动物消化腺的分泌，提高饲料的消化率，其制作方法简便且不受气候和季节的限制，故被广泛应用。但青贮饲料的制作过程中涉及到饲料中部分营养物质如植物细胞壁的降解、微生物的发酵等过程，会直接影响青贮饲料品质的好坏，故在进行青贮饲料的加工制作过程中常使用添加剂对青贮过程进行调控。青贮添加剂可以用来提高青贮的营养物质，可以有效的促进青贮的发酵，改善青贮品质(增加需氧稳定性)，并提高饲料的适口性。

在青贮过程中增加乳酸菌，可以有效降低青贮中pH，增加乳酸的产量，以取得早期乳酸发酵的优势，有效抑制有害微生物的繁殖。乳酸菌依发酵糖生产乳酸的能力可将乳酸菌分为两类，一类是同质型发酵乳酸菌(homo-fermentative lactic acid bacteria)，如植物乳杆菌、戊糖片球菌等；另一类是异质型发酵乳酸菌(hetero-fermentative lacticacid bacteria)，如布氏乳杆菌等。研究结果表明，乳酸菌能减少酵母菌和霉菌的产生，有效抑制肠球菌和肺炎克雷伯菌等有害细菌及其他微生物的生长(张涛等，2009；Filya等，2006)。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供一株抗逆性和益生性强的布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）HEW-A666及其应用。

为了实现本发明的目的，本发明提供的布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）HEW-A666是从自然发酵秸秆中分离的乳酸杆菌菌株，通过菌落形态观察、生理生化特征、分子生物学鉴定等确定其为布氏乳杆菌。该菌株具有耐酸性，产酸性和抗逆性强，且对青贮腐败菌有抑制作用等。

本发明提供的布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）HEW-A666，已于2017年08月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101），保藏编号为CGMCCNO.14508，分类命名为布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）。

本发明还提供了上述布氏乳杆菌HEW-A666的培养方法，包括以下步骤：

1）将菌株HEW-A666在平板上划线培养，30℃，48h，从平板上挑取单菌落于100mL种子培养基中，30℃，180r/min震荡培养24h，获得HEW-A666一级种子液，活性达4.0×10⁹CFU/mL；

2）将HEW-A666一级种子液按照0.5%-5%（V/V）的接种量接种于50L发酵罐中，进行二级发酵，发酵4-12h获得HEW-A666二级种子液；

3）将HEW-A666二级种子液按照0.5%-5%（V/V）接种于5000L发酵罐中，进行三级发酵，发酵18-30h获得菌株HEW-A666发酵液，活菌数可达2.0×10¹⁰CFU/mL。

进一步地，其中所述种子培养基按重量百分比计由下述组分组成：葡萄糖0.5-2.5%，乳糖0.5-2.5%，酵母提取物0.2-2.0%，蛋白胨0.5-2.0%，硫酸镁0.01-1.0%，磷酸氢二钾0.01-0.5%，碳酸钙0.05-0.5%，氯化钠0.05-1.0%，硫酸锰0.01-0.5%，余量为水；pH6.8±0.2。

进一步地，其中所述种子培养基按重量百分比计由下述组分组成：葡萄糖1.5%，乳糖0.5%，酵母提取物0.4%，蛋白胨1.5%，硫酸镁0.05%，磷酸氢二钾0.02%，碳酸钙0.15%，氯化钠0.2%，硫酸锰0.02%，余量为水；pH6.8±0.2。

进一步地，其中所述二级发酵、三级发酵培养共同的条件如下，装液量为30%-65%（V/V），发酵温度为25-40℃，搅拌转速为80-150r/min。

进一步地，其中所述二级和三级发酵的培养基相同，按重量百分比计均由下述组分组成：葡萄糖2%，乳糖1%，酵母粉1.6%，胰蛋白胨0.8%，硫酸镁0.04%，磷酸氢二钾0.01%，碳酸钙0.1%，氯化钠0.3%，硫酸锰0.05%，余量为水；pH6.8±0.2。

另外，本发明进一步提供了上述布氏乳杆菌HEW-A666在青贮中的应用。

另外，本发明还提供了含有上述布氏乳杆菌HEW-A666的动物饲料。

本发明提供的布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）HEW-A666具有以下微生物学特征：在MRS平板上呈圆形，白色，凸起，表面光滑，边缘整齐，易挑起，菌落直径1-2mm，菌落形态如图1，显微形态如图2，革兰氏阳性，呈杆状，无芽孢，兼性厌氧，生长适宜温度范围为4℃-45℃，最佳生长温度为20℃-35℃，生长pH为3.0-9，最适pH为4-8；部分生理生化特性见表1。

表1 HEW-A666的部分生理生化特征

注：“＋”表示反应阳性；“－”表示反应阴性。

本发明的布氏乳杆菌HEW-A666具有显著的抑菌性能，可有效抑制肠杆菌、变形杆菌、醋酸菌、黄曲霉、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等青贮腐败菌的生长繁殖。

本发明的布氏乳杆菌HEW-A666具有较强的产酸性能，可以耐酸，且能保持93％以上的存活率。

本发明的布氏乳杆菌HEW-A666可用于全株玉米青贮，提高了全株玉米青贮的感官品质和有氧稳定性，且营养成分高，有利于动物对青贮玉米的饲用。

本发明具有以下有益效果：

1. 本发明布氏乳杆菌HEW-A666具有显著的益生性，能显著肠杆菌、变形杆菌、醋酸菌、黄曲霉、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等青贮腐败菌的生长繁殖，具有广谱抑菌性；

2. 本发明布氏乳杆菌HEW-A666具有具有优良的微生物学特性、显著的益生性及抗逆性和超强的发酵性能，可以耐酸，且能保持93％以上的存活率，更加适合饲料工业和畜牧养殖业的要求；

3. 本发明布氏乳杆菌HEW-A666应用于全株玉米青贮，可明显降低玉米青贮的pH值，乙酸和乳酸的含量明显增多，乳酸菌含量也明显提高，而霉菌和酵母菌含量则低于检测限，从而提高玉米青贮的发酵品质；而且在青贮中添加布氏乳杆菌HEW-A666可消耗淀粉，提高中性洗涤纤维含量，有利于奶牛等瘤胃动物维持瘤胃正常发酵功能；还可有效提高全株玉米青贮的感官品质和有氧稳定性，且营养成分高。

附图说明

图1是实施例1布氏乳杆菌HEW-A666在MRS培养基上的菌落形态图；

图2是实施例1布氏乳杆菌HEW-A666菌株的革兰氏染色图；

图3是实施例1布氏乳杆菌HEW-A666菌株系统发育树图。

具体实施方式

下面结合实施例解释本发明，实施案例仅用于说明本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

本发明中涉及到的百分号“%”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100mL溶液中含有溶质的克数。

实施例1 布氏乳杆菌HEW-A666的分离筛选、鉴定及保藏

1、菌种初筛

取自然发酵秸秆样品（河北保定玉米、河北保定小麦秸秆或辽宁盘锦水稻秸秆）1g于100mL MRS液体培养基中富集培养4h，吸取0.1mL富集培养液于MRS+碳酸钙的培养基平板上，进行分区划线，37℃倒置培养24-48h，挑取产生溶钙圈的不同形态的菌落进行纯培养，即从平板挑取单菌落在MRS平板上分离纯化，至少纯化3次得到纯菌种，于4℃保藏备用。

2、菌种复筛

选择接触酶阴性、革兰氏阳性杆菌，且不产芽孢的布氏乳杆菌共105株，分别编号，按下述方法进行筛选。

以下仅对菌株HEW-A666的性能进行描述，其余菌株性能均不如菌株HEW-A666。

1）菌株HEW-A666发酵液制备

将菌株HEW-A666在平板上划线培养，30℃，48h，从平板上挑取单菌落于100mL种子培养基中，30℃，180r/min震荡培养24h，获得HEW-A666一级种子液，活性达4.0×10⁹CFU/mL。将HEW-A666一级种子液按照1%（V/V）的接种量接种于50L发酵罐中，进行二级发酵，发酵5h获得HEW-A666二级种子液。将HEW-A666二级种子液按照1%（V/V）接种于5000L发酵罐中，进行三级发酵，发酵24h获得菌株HEW-A666发酵液，活菌数可达2.0×10¹⁰CFU/mL。

其中，种子培养基按重量百分比计由下述组分组成：葡萄糖1.5%，乳糖0.5%，酵母提取物0.4%，蛋白胨1.5%，硫酸镁0.05%，磷酸氢二钾0.02%，碳酸钙0.15%，氯化钠0.2%，硫酸锰0.02%，余量为水；pH6.8±0.2。

其中，二级、三级发酵培养共同的条件如下，装液量为60%，发酵温度30℃，搅拌转速为110 r/min。

将三级发酵液通过碟式离心机离心获得HEW-A666菌泥，活性达8.0×10¹¹CFU/g。

二级种子培养和三级发酵培养所用培养基相同（以重量百分比计），均为葡萄糖2%，乳糖1%，酵母粉1.6%，胰蛋白胨0.8%，硫酸镁0.04%，磷酸氢二钾0.01%，碳酸钙0.1%，氯化钠0.3%，硫酸锰0.05%，余量为水；pH6.8±0.2。

2）产酸性能测定

将HEW-A666按1%（体积比）的接种量接种于100mL MRS液体培养基中，30℃培养24h，每2h测一次pH值，同时采用HPLC检测发酵液中乳酸含量，如表2所示。从表2中可知，HEW-A666菌株发酵随着时间的延长pH逐渐下降，同时乳酸含量也随时间延长而逐渐增加，在发酵24h时乳酸产量最高达16.8g/L，pH最低，为3.48。

表2 布氏乳杆菌HEW-A666发酵pH及产酸含量

3）耐酸性能测定

分别将制备的HEW-A666发酵液1mL于9mL不同pH的酸溶液中（pH1.5、pH2.0、pH3.0、pH4.0、pH6.8），分别处理1h、2h和3h后，检测活菌数，结果如表3所示。从表3中可以看出，HEW-A666在pH1.5、pH2.0、pH3.0、pH4.0的酸溶液中分别处理1h存活率均在98%以上，分别处理2h存活率在96%以上，分别处理3h，存活率在93%以上，表明该菌株具有很高的耐酸性，可以耐受胃酸，顺利到达肠道发挥其作用。

其中，酸溶液制备：取100mL无菌水，分别加入稀盐酸调节其pH为pH1.5、pH2.0、pH3.0、pH4.0、pH6.8。

表3 布氏乳杆菌HEW-A666在不同pH酸溶液中处理后的存活情况

4）抑菌性能测定

检测菌株HEW-A666对肠杆菌、变形杆菌、醋酸菌、黄曲霉、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的拮抗性能，结果如表4所示，可知菌株HEW-A666对肠杆菌、变形杆菌、醋酸菌、黄曲霉、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌这六株腐败菌有较强抑制作用，其抑菌性能强。

表4 布氏乳杆菌HEW-A666对腐败菌的抑菌效果

综合考虑各菌株的产酸性能、耐酸性能和抑菌性能，菌株HEW-A666产生乳酸最多，产酸性能、耐酸性能及抑菌性最佳。

3、形态特征

HEW-A666菌落在MRS平板上呈圆形，白色，凸起，表面光滑，边缘整齐，易挑起，菌落直径1-2mm，菌落形态如图1，显微形态如图2，革兰氏阳性，呈杆状，无芽孢，兼性厌氧，生长适宜温度范围为4℃-45℃，最佳生长温度为20℃-35℃，生长pH为3.0-9，最适pH为4-8。

4、生理生化特征

通过对菌株HEW-A666进行生理生化试验，参照《常见细菌系统鉴定手册》鉴定菌株的种属。结果显示菌株HEW-A666为布氏乳杆菌。该菌的部分生理生化特性见表1。

5、分子生物学特征

首先提取HEW-A666的DNA基因组，并进行PCR扩增其16S rDNA基因片段，将PCR产物回收，并测序（由上海生物工程有限公司完成），将获得的序列在GenBank中进行Blast比对分析，发现菌株HEW-A666与布氏乳杆菌同源性达99.99%，结合该菌株的形态特征和生理生化特征，最终确定HEW-A666为布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）。

菌株HEW-A666的16S rDNA序列如序列表所示。将菌株HEW-A666的16S rDNA的序列与GenBank中已知序列进行Blast比对，从数据库中获得相关的种属的16S rDNA，利用Mega6.0软件构建系统发育树（图3），从图3所示的系统发育树可以看出，菌株HEW-A666与布氏乳杆菌（Lactobacillus buchnerLC094429）聚于同一分支，其相似性达到100%。并通过菌种的细胞形态、生理生化特征和16S rDNA序列等实验数据综合确定该菌株属于乳杆菌属，最终确定为布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）。

将以上获得的布氏乳杆菌HEW-A666于2017年08月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101），保藏编号为CGMCC NO. 14508。

实施例2 布氏乳杆菌HEW-A666在全株玉米青贮中的应用

试验组：刈割后的全株玉米秸秆（无腐烂变质），切至2-3cm段，作为青贮原料，经布氏乳杆菌HEW-A666菌泥用灭菌生理盐水稀释，均匀地喷洒在青贮原料上，使布氏乳杆菌HEW-A666为10⁵CFU/g青贮原料，填装压实，要确保青贮桶的周围及边角充分压实，封膜并踩实封严，25℃厌氧发酵4个月，得青贮饲料。

对照组：用等量的灭菌生理盐水做对照。

青贮结束后，观察青贮饲料品质，检测青贮饲料中各营养成分（干物质、可溶性碳水化合物、淀粉、粗蛋白、中性和酸性洗涤纤维、氨态氮）含量、有机酸含量、霉菌、酵母菌含量及有氧稳定性（表5）。

表5布氏乳杆菌HEW-A666对全株玉米青贮营养成分的影响

由表5可知，与对照组相比，试验组全株玉米青贮品质更佳，有较弱的酸味，淡淡的芳香味，柔软松散不粘手，黄绿色。在青贮中添加布氏乳杆菌HEW-A666可消耗淀粉，提高中性洗涤纤维的含量，有利于奶牛等瘤胃动物维持瘤胃正常发酵功能。

青贮结束，开封第0和7天，检测全株玉米有氧变败的饲料品质，结果如表6所示，可知，添加布氏乳杆菌HEW-A666的青贮饲料在接触氧气第7天时，pH值仍然很低，与对照组相比，仍有较多的乳酸和乙酸，提高了饲料品质；添加布氏乳杆菌HEW-A666的全株玉米青贮刚开封时未检出霉菌，在第7天时仍未超过10⁴CFU/g（表6）。

表6布氏乳杆菌HEW-A666对全株玉米青贮饲料品质的影响

综上所述，添加布氏乳杆菌HEW-A666可有效提高全株玉米青贮的感官品质和有氧稳定性，且营养成分高。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 北京好实沃生物技术有限公司

<120> 一株布氏乳杆菌HEW-A666及其应用

<130> 171497-I-CP-NZJ

<141> 2017-08-09

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1481

<212> DNA

<213> 布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)

<400> 1

agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgaac 60

gcgtctccgt cgtctccgtt ratgayttta rgtgcttgcg ayttgaaaga tttaacattg 120

agacgagtgg cgaactngtg agggtaacct gcccttgaag taggggataa cacttggaaa 180

caggtgctaa taccgtataa caaccaaaac cacctggttt tggtttaaaa gacggcttcg 240

gctgtcactt taggatggac ccgcggcgta ttagcttgtt gtagcttgtt ggtaaggtaa 300

cggcctacca aggcgatgat acgtagccga cctgagaggg taatcggcca cagacacggc 360

ccaaactcct acgggaggca gcagtaggga atcttccaca atggacgaaa gtctgatgga 420

gcaacgccgc gtgagtgatg aagggtttcg gctcgtaaaa ctctgttgtt ggagaagaac 480

aggtgtcaga gggtgtcaga gyaactgttg acatcttgac ggtatccaac cagaaagcca 540

cggctaacta cgtgccagca gacgtaggtg gcaagcgttg tccggattta ttgggcgtaa 600

agcgagcgca ggcggttttt taggtctgat gtgaaagcct tcggcttaac cggagaaagt 660

gcatcggaaa ccgggagact tgagtgcaga agaggacagt ggaggacagt ggaactccat 720

gtgtagcggt gaaatgcgta gatatatgga agaaacacca gtggcgaagg cggtgtaact 780

gacgctgagg ctcgaaagca tgggtagcga acaggattag ataccctggt agtccattgc 840

tgtaaacgat gagtgctaag tgttggaggg tttccgccct tcagtgctgc agctaacgca 900

ttaagcactc cgccgcactc cgcctgggga gtacgaccgc aaggttgaaa ctcaaaggaa 960

ttgacggggg ccngcacaag cggtgtttaa ttcgatgcta cgcgaagaac cttaccaggt 1020

cttgacatct tctgccaacc taagagatta ggcgttccct tcggggacag aatgacaggt 1080

ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagttggg ttacagtccc 1140

gcaacgagcg caacccttat tgttagttgc cagcattcat gttgggcact ctagcatgac 1200

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agccgttctc agttcgtctc agttcggatt gtaggctgca actcgcctac atgaagttgg 1380

aatcgctagt aatcgtggat cagcatatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca 1440

caccatgaga gtttgtaaca cccaaagccg gtgaggtaac c 1481

Claims (8)

1.一株布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)HEW-A666，于2017年08月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO.14508；所述布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)HEW-A666的生长适宜温度范围为4℃-45℃，最佳生长温度为20℃-35℃，生长pH为3.0-9，最适pH为4-8；对核糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖和葡萄糖酸盐的反应呈阳性。

2.权利要求1所述的布氏乳杆菌HEW-A666的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将菌株HEW-A666在平板上划线培养，30℃，48h，从平板上挑取单菌落于100mL种子培养基中，30℃，180r/min震荡培养24h，获得HEW-A666一级种子液，活性达4.0×10⁹CFU/mL；

2)将HEW-A666一级种子液按照0.5％-5％(V/V)的接种量接种于50L发酵罐中，进行二级发酵，发酵4-12h获得HEW-A666二级种子液；

3)将HEW-A666二级种子液按照0.5％-5％(V/V)接种于5000L发酵罐中，进行三级发酵，发酵18-30h获得菌株HEW-A666发酵液，活菌数可达2.0×10¹⁰CFU/mL。

3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述种子培养基按重量百分比计由下述组分组成：葡萄糖0.5-2.5％，乳糖0.5-2.5％，酵母提取物0.2-2.0％，蛋白胨0.5-2.0％，硫酸镁0.01-1.0％，磷酸氢二钾0.01-0.5％，碳酸钙0.05-0.5％，氯化钠0.05-1.0％，硫酸锰0.01-0.5％，余量为水；pH6.8±0.2。

4.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，所述种子培养基按重量百分比计由下述组分组成：葡萄糖1.5％，乳糖0.5％，酵母提取物0.4％，蛋白胨1.5％，硫酸镁0.05％，磷酸氢二钾0.02％，碳酸钙0.15％，氯化钠0.2％，硫酸锰0.02％，余量为水；pH6.8±0.2。

5.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述二级发酵、三级发酵培养共同的条件如下，装液量为30％-65％(V/V)，发酵温度为25-40℃，搅拌转速为80-150r/min。

6.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，所述二级和三级发酵的培养基相同，按重量百分比计均由下述组分组成：葡萄糖2％，乳糖1％，酵母粉1.6％，胰蛋白胨0.8％，硫酸镁0.04％，磷酸氢二钾0.01％，碳酸钙0.1％，氯化钠0.3％，硫酸锰0.05％，余量为水；pH6.8±0.2。

7.根据权利要求1-6任一项所述的布氏乳杆菌HEW-A666在青贮中的应用。

8.含有权利要求1-6任一项所述的布氏乳杆菌HEW-A666的动物饲料。

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