CN109423467B - 一种植物乳杆菌及其在食品和饲料领域的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种乳酸高产的植物乳杆菌及其在食品和饲料领域的用途。

Description

一种植物乳杆菌及其在食品和饲料领域的用途

技术领域

本发明涉及微生物领域，特别是乳酸菌的分离纯化及其在食品和饲料领域的用途。

背景技术

乳酸菌是能利用碳水化合物发酵产生大量乳酸的一类细菌的总称，乳酸菌一般为无芽孢的革兰氏阳性细菌。大量研究表明，乳酸菌发酵饲料具有明显的促生长作用，饲喂猪饲料中添加10％和20％的乳酸菌发酵饲料，日增重分别提高14.38％和24.04％，且每1kg增重所需饲料分别减少11.36％和15.91％，因此大大降低饲料喂养成本。乳酸菌发酵饲料还能增强家畜的免疫力和抗病能力。饲喂发酵饲料的小猪发病率降低7.8％～16.7％，死亡率降低6.7％～10％。其主要原因在于，乳酸菌在发酵过程中产生乳酸，乳酸可以降低胃内pH值，从而活化消化酶并改善氨基酸消化能力，还对肠道上皮的生长有益。哺乳期的小猪会感染由大肠杆菌和沙门氏菌引起的疾病，饲喂乳酸菌发酵饲料能防止小猪胃肠道病原菌的生长。

在食品发酵领域，乳酸菌发酵通过产乳酸降低发酵产物的pH值，同时将蛋白质水解成具有生物活性的多肽，不仅利于吸收而且能赋予产品特殊风味和口感。发酵结束后乳酸菌仍能以活菌形式存在，具有益生作用的乳酸菌有利于维持肠道菌群平衡。

目前乳酸菌发酵的主要瓶颈在于，乳酸菌乳酸产量低，发酵速度慢；特定应用领域的乳酸菌只适于一种发酵基质，一旦发酵基质发生变化，则出现发酵适应期长、发酵不稳定等情况。

本领域已报道对发酵乳制品中的乳酸菌进行研究，以期寻找新的适用于发酵的新的乳酸菌种属或株系。例如，《自然发酵乳制品中乳酸菌的生物多样性》总结了不同地区和动物源乳制品的发酵产品中分离的乳酸菌种类和优势菌种(《生命科学》2015年7月)。《酸驼乳发酵乳酸菌菌株的筛选及其发酵特征研究》从新疆自然发酵骆驼乳中分离鉴定了五种乳酸菌，其中包括植物乳杆菌a4。

目前，本领域仍存在筛选对发酵培养条件适用范围较宽、发酵用时短、活菌数量多的乳酸菌的需求，以解决发酵条件严苛的问题，并希望该菌粉和发酵产物同时满足食品和饲料等多种用途。

发明内容

在第一方面，本发明提供了一种植物乳杆菌L-1菌株，其分类名称为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，CGMCC编号为CGMCCNo.15013，保藏日期为2017年12月4日。

在第二方面，本发明提供了第一方面所述的植物乳杆菌L-1菌株的冻干菌粉。

在第三方面，本发明提供了制备第二方面所述的冻干菌粉的方法，所述方法包含如下步骤：

(1)将第一方面所述的植物乳杆菌L-1菌株接种至MRS液体培养基中，37℃、200rpm培养12-24h，得到种子培养液；

(2)将步骤(1)获得的所述种子培养液接种至置于发酵罐中的灭菌后的发酵培养基中，将发酵液的pH维持6～7，转速200rpm、37℃下连续发酵24h，得到菌种发酵液，其中，以1～2v/v％将所述种子培养液接种至发酵培养基；其中，所述发酵培养基为MRS液体培养基。

(3)对步骤(2)获得的菌种发酵液进行离心并收集菌泥，按照菌泥与保护剂为1:(3-5)的体积比加入保护剂，混合后在-80℃预冻，并经真空冷冻干燥制成所述菌粉。

在第四方面，本发明提供了第一方面所述的植物乳杆菌L-1菌株或第二方面所述的菌粉在饲料或食品中的用途。

具体实施方式

本发明的植物乳杆菌L-1菌株分离自新疆牧民传统发酵的酸驼乳，并经点种方法对产酸能力进行筛选。植物乳杆菌L-1菌株在MRS固体培养基上呈白色圆形凸起不透明菌落，显微镜下呈直或弯的杆状，单个或成对呈链状排列。对该菌株的16s rDNA进行测序并对结果进行分析发现，该菌株属于植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，亲缘关系最接近于植物乳杆菌CAU:225菌株。经实验证实，该植物乳杆菌在饲料或牛乳发酵中均能够较快产酸，且活菌数较高，可短时间完成发酵，节省生产成本。另外，该菌株不含毒力基因，属于安全菌株，是适用于饲料和食品发酵领域的一种新型驼源植物乳杆菌。

可利用植物乳杆菌的标准培养方法制备本发明菌种的种子液和种子发酵液。例如，所述种子液可通过如下过程制备：从平板上挑取植物乳杆菌单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃、200rpm培养12～24h，即得发酵种子液。可通过如下过程对种子培养液进行发酵：将种子培养液接种至置于发酵罐中的灭菌后的发酵培养基中，将发酵液的pH维持6～7，转速200rpm、37℃下连续发酵24h，得到菌种发酵液，其中，以1～2v/v％将所述种子培养液接种至发酵培养基；其中，所述发酵培养基为MRS液体培养基。

该种子培养液具有较高的活菌数，可直接将其真空冷冻干燥，获得冻干菌粉。优选地，在4000-5000rpm的转速下对菌种发酵液离心10-15min并收集菌泥，按照菌泥与保护剂为1:(3-5)的体积比加入保护剂，混合后置于-80℃预冻过夜(例如8-12h)，经真空冷冻干燥制成所述菌粉。优选地，所述保护剂可为如下的一种或多种：海藻糖，谷氨酸钠，脱脂乳和甘油。优选地，所述保护剂为等体积的海藻糖、谷氨酸钠、脱脂乳和甘油的混合物。

本发明的植物乳杆菌L-1可用于对多种底物进行发酵，所述底物包括但不限于牛乳等。在饲料的用途中，优选地，以2v/v％(活菌数10⁹cfu/mL)的浓度将所述植物乳杆菌L-1直接添加到饲料产品中。所述饲料包括猪饲料和禽饲料。优选地，以0.02g菌粉/100mL的浓度将所述植物乳杆菌L-1添加到酸奶中，使得活菌数为10¹¹cfu/mL。

实施例

实施例使用的MRS液体培养基为：蛋白胨10.0g、酵母浸粉5.0g、牛肉膏10.0g、葡萄糖20.0g、磷酸氢二钾2.0g、柠檬酸二铵2.0g，无水乙酸钠5.0g、硫酸锰0.25g、硫酸镁0.58g、吐温80 1.0mL，蒸馏水1000mL，pH 6.5，121℃灭菌15～20min。MRS固体培养基为：在MRS液体培养基中添加琼脂18g，调节pH后高压灭菌。

实施例采用新疆山区牧民传统制作的酸驼乳作为样品来源，该酸驼乳采集自新疆福海牧区牧民家自制酸驼乳，保存于-80℃。

1.植物乳杆菌L-1菌株的分离、筛选和鉴定

采用梯度稀释法，将酸驼乳稀释液涂布于MRS固体培养基上，37℃培养24h，通过平板划线法纯化，获得多个单菌落。在MRS液体培养基中对每个单菌落进行培养活化，取2μL活化好的菌液，点种至含1w/v％碳酸钙的MRS固体培养基表面，观察融钙圈直径的大小，筛选产乳酸能力高的菌株。随后，采用梯度稀释涂布法，挑取溶钙圈较大的单菌落反复划线，并在37℃培养24-48h，直至菌落在颜色，大小和形态完全一致，将纯化好的单菌落转接至MRS液体培养基中扩大培养，将该纯化培养获得的菌株命名为L-1。

提取L-1的基因组，对16s rDNA序列进行测序，测序结果为SEQ ID NO.1。与NCBI数据库进行比对，最终鉴定其属于植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum L-1)，且与Lactobacillus plantarum CAU:225(GenBank：MF369877.1)同源性最高(L-1第9-1118位核苷酸序列与Lactobacillus plantarum CAU:225第10-1119位核苷酸的一致性为100％)。

SEQ ID NO：1

GGCGGGGGGGGGTGCTATACATGCAGTCGAACGAACTCTGGTATTGATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGCTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAAATCTAAGAGATTAGACGTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTATCAGTTGC

2.植物乳杆菌L-1菌粉的制备

菌种发酵种子液的制备：挑取单菌落接种至MRS液体培养基中，37℃培养24～48h，转速200rpm，得到发酵种子液。

扩大培养：发酵罐中加入MRS培养基，121℃灭菌20min，灭菌完成后冷却至30～37℃，加入1～2v/v％发酵种子液，37℃连续发酵24h，控制发酵液pH在6～7，转速200rpm，即得到菌种发酵液。

菌粉的制备：以4000-5000rpm对菌种发酵液离心10-15min，收集菌泥，加菌液离心前称量空的离心管的质量m0，离心后称量离心管和菌泥的总质量m1，二者差值(m1-m0)即为菌泥质量，按菌泥的3～5倍重量添加保护剂(海藻糖、谷氨酸钠、脱脂乳和甘油的等体积混合物)。充分混匀后置于-80℃预冻过夜，经真空冷冻干燥制成菌粉。

3.植物乳杆菌L-1产酸能力的测定

菌种活化：挑取单菌落接种至MRS液体培养基中，37℃培养24h，转速200rpm，得到菌液。

产酸能力的检测：采用点种法，将2μL菌液点种至含有1w/v％碳酸钙的MRS固体培养表面，37℃培养24～48h，测量溶钙圈直径以评价菌株的产酸能力。植物乳杆菌L-1的融钙圈直径可达24mm。

4.植物乳杆菌L-1在发酵饲料中的用途

将中粮安徽生化工业副产物按如下比例混匀：1.4重量份玉米淀粉渣、0.08重量份甜菜糖蜜、0.72重量份DDGS(可溶性的溶解物在内的干燥酒糟饲料)、0.6重量份DDS(DDGS滤渣干燥后)、0.24重量份玉米粉、0.4重量份喷浆玉米皮，添加水，将含水量调至35％，分装成400g/袋，备用。将植物乳杆菌L-1、筛自大曲的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)和购自中国工业微生物菌种保藏管理中心产朊假丝酵母CICC 1314(Candida utilis)分别活化，分别以0.8v/v％(植物乳杆菌和地衣芽孢杆菌)和0.4v/v％(假丝酵母)比例接种至发酵底物，乳杆菌在37℃发酵24～48h，地衣芽孢杆菌和产朊假丝酵母分别30℃发酵12～24h，转速菌为150～200rpm。检测发酵前后饲料的pH值、滴定酸度(GB/T 12456)、粗蛋白(GB/T6432)、粗纤维(GB/T 6434)、中性洗涤纤维(GB/T 20806-2006)、酸性洗涤纤维(NY/T 1459-2007)和活菌数。将购自中国工业微生物菌种保藏管理中心类干酪乳杆菌CICC 20290(Lactobacillus paracasei)、筛自大曲的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)和购自中国工业微生物菌种保藏管理中心产朊假丝酵母CICC 1314(Candida utilis)分别活化，分别以0.8v/v％(植物乳杆菌和地衣芽孢杆菌)和0.4v/v％(假丝酵母)比例接种至发酵底物，乳杆菌在37℃发酵24～48h，地衣芽孢杆菌和产朊假丝酵母分别30℃发酵12～24h，转速菌为150～200rpm。检测发酵前后饲料的pH值、滴定酸度(GB/T 12456)、粗蛋白(GB/T6432)、粗纤维(GB/T 6434)、中性洗涤纤维(GB/T 20806-2006)、酸性洗涤纤维(NY/T 1459-2007)和活菌数。检测结果如表1所示，发酵后pH值明显降低。

表1 饲料发酵的结果

5.植物乳杆菌L-1在发酵食品中的用途

将三元全脂乳在95℃下灭菌5min，分装成100mL/瓶，按0.02w/v％添加植物乳杆菌L-1菌粉，辅以筛自酸牛奶的乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)共同发酵，发酵温度为37℃，酸乳pH为4.5时停止发酵，记录发酵时间，测定酸乳的滴定酸度(GB5413.34-2010)和质构，并进行感官评价(乌雪岩.酸奶感官评价与质构的相关性研究[J].中国乳品工业,2015,43(10):52-54.)。结果见表2，发酵时间为4h，滴定酸度为81.3°T，活菌数可达1.7×10¹¹cfu/mL，与市售的两种竞品相比，经植物乳杆菌L-1发酵后，发酵乳有果香味，使酸乳口感更丰富。

表2 酸乳发酵的结果

序列表

<110> 吉林中粮生化有限公司，中粮营养健康研究院有限公司，中粮生物化学（安徽）股份有限公司

<120> 一种乳酸高产的植物乳杆菌及其在食品和饲料领域的用途

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1118

<212> DNA

<213> Lactobacillus plantarum

<400> 1

ggcggggggg ggtgctatac atgcagtcga acgaactctg gtattgattg gtgcttgcat 60

catgatttac atttgagtga gtggcgaact ggtgagtaac acgtgggaaa cctgcccaga 120

agcgggggat aacacctgga aacagatgct aataccgcat aacaacttgg accgcatggt 180

ccgagcttga aagatggctt cggctatcac ttttggatgg tcccgcggcg tattagctag 240

atggtggggt aacggctcac catggcaatg atacgtagcc gacctgagag ggtaatcggc 300

cacattggga ctgagacacg gcccaaactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttcca 360

caatggacga aagtctgatg gagcaacgcc gcgtgagtga agaagggttt cggctcgtaa 420

aactctgttg ttaaagaaga acatatctga gagtaactgt tcaggtattg acggtattta 480

accagaaagc cacggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt 540

tgtccggatt tattgggcgt aaagcgagcg caggcggttt tttaagtctg atgtgaaagc 600

cttcggctca accgaagaag tgcatcggaa actgggaaac ttgagtgcag aagaggacag 660

tggaactcca tgtgtagcgg tgaaatgcgt agatatatgg aagaacacca gtggcgaagg 720

cggctgtctg gtctgtaact gacgctgagg ctcgaaagta tgggtagcaa acaggattag 780

ataccctggt agtccatacc gtaaacgatg aatgctaagt gttggagggt ttccgccctt 840

cagtgctgca gctaacgcat taagcattcc gcctggggag tacggccgca aggctgaaac 900

tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagctac 960

gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatact atgcaaatct aagagattag acgttccctt 1020

cggggacatg gatacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt 1080

taagtcccgc aacgagcgca acccttatta tcagttgc 1118

Claims (9)

1.一种植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）L-1菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 15013。

2.由权利要求1所述的植物乳杆菌L-1菌株制备的冻干菌粉。

3.制备权利要求2所述的冻干菌粉的方法，所述方法包含如下步骤：

（1）将权利要求1所述的植物乳杆菌L-1菌株接种至MRS液体培养基中，37℃、200rpm培养12-24h，得到种子培养液；

（2）将步骤（1）获得的所述种子培养液接种至置于发酵罐中的灭菌后的MRS液体培养基中，将发酵液的pH维持6~7，转速200rpm、37℃下连续发酵24h，得到菌种发酵液，其中，以1~2v/v%将所述种子培养液接种至发酵培养基；

（3）对步骤（2）获得的菌种发酵液进行离心并收集菌泥，按照菌泥与保护剂为1:(3-5)的体积比加入保护剂，混合后在-80℃预冻，并经真空冷冻干燥制成所述菌粉。

4.如权利要求3所述的方法，其中，步骤（3）中，所述离心在4000-5000rpm的转速下进行10-15 min。

5.如权利要求3或4所述的方法，其中，步骤（3）中，所述保护剂可为如下的一种或多种：海藻糖，谷氨酸钠，脱脂乳和甘油。

6.如权利要求5所述的方法，其中，所述保护剂为等体积的海藻糖、谷氨酸钠、脱脂乳和甘油的混合物。

7.权利要求1所述的植物乳杆菌L-1菌株或权利要求2所述的冻干菌粉在饲料或食品中的用途。

8.如权利要求7所述的用途，其中，将权利要求1所述的植物乳杆菌L-1菌株或权利要求2所述的冻干菌粉添加到饲料产品中，使得在所述饲料产品中活菌数为10⁹cfu/mL。

9.如权利要求7所述的用途，其中，将权利要求1所述的植物乳杆菌L-1菌株或权利要求2所述的冻干菌粉添加到酸奶中，使得在所述酸奶中活菌数为10¹¹cfu/mL。