CN112574922B

CN112574922B - 一株具有益生作用的贝莱斯芽胞杆菌及应用

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Publication number: CN112574922B
Application number: CN202011597074.XA
Authority: CN
Inventors: 张遨然; 尹望; 周航; 周桂莲; 蔡姬姮; 王红梅; 李敬先; 郭建强; 李巍
Original assignee: Chengdu Fenglan Science And Technology Co ltd; SICHUAN NEW HOPE ANIMAL HUSBANDRY TECHNOLOGY CO LTD; New Hope Liuhe Co Ltd
Current assignee: Chengdu Fenglan Science And Technology Co ltd; SICHUAN NEW HOPE ANIMAL HUSBANDRY TECHNOLOGY CO LTD; New Hope Liuhe Co Ltd
Priority date: 2020-12-29
Filing date: 2020-12-29
Publication date: 2021-09-28
Anticipated expiration: 2040-12-29
Also published as: CN112574922A

Abstract

本发明提供了一株具有益生作用的贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)及其应用，该菌分离自白羽肉鸡肠道，该菌株命名为NHB‑BvF5001，保藏编号为CGMCC No.21191。本发明的贝莱斯芽胞杆菌NHB‑BvF5001具有显著的益生性，可有效抑制肠道致病大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌属、产气荚膜杆菌、彭氏变形杆菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌等病原菌的生长繁殖。本发明的贝莱斯芽胞杆菌NHB‑BvF5001可有效调节动物肠道微生物平衡，抑制有害微生物生长，促进动物对营养的吸收，提高饲料转化率，提高动物生产性能。

Description

一株具有益生作用的贝莱斯芽胞杆菌及应用

技术领域

本发明属于微生物学领域，具体地说，涉及一株具有益生作用的贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001及应用。

背景技术

2019年7月9日中华人民共和国农业农村部公告第194号公告指出，自2020年 7月1日起，饲料生产企业停止生产含有促生长类药物饲料添加剂(中药类除外) 的商品饲料。因此，寻找抗生素的替代品和替代方案已经成为了畜牧业的重要研究内容，作为抗生素的替代品，益生菌越来越多的应用于动物营养和饲料中。益生菌是一类能改善动物胃肠道微生态平衡，有益于动物健康和生产性能发挥的微生物添加剂。其主要作用效果体现在改善动物新陈代谢，提高营养物质吸收和利用，提高免疫力，减少环境污染等方面发挥重要作用。

目前，饲用益生菌主要包括乳酸菌类、芽胞类、光合细菌、酵母类、霉菌类。由于芽胞杆菌对干燥、高温、高压、氧化等不良环境抵抗力很强，这种稳定性增加了它作为益生菌的潜力。因此，获得新型具有益生特性的芽胞杆菌的研究具有重大意义。贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)是一种广泛存在于环境中的多功能细菌。近年来，国内外研宄学者己经从多种环境介质中分离得到大量该菌株并且对其在工业、农业及环境修复等方面的作用进行了大量研究探索。贝莱斯芽胞杆菌是芽胞杆菌属中一种新兴的功能性菌种，已经有很多研究证明，贝莱斯芽胞杆菌在植物促生功能和抗植物病原菌方面能够发挥重要作用。另外，由于其具有将外界一氧化碳物转化为自身营养物质这一特性，贝莱斯芽胞杆菌被广泛应用于食品发酵领域，同时在环境保护、工业应用、养殖及医药等领域都具有相应的功能研究。分离和筛选抗病原菌且具有益生效果的贝莱斯芽胞杆菌，可以更好的应用于饲料添加剂，以代替抗生素。但贝莱斯芽胞杆菌作为益生菌制剂或饲料添加剂的研究与应用较少，尤其是在替代饲养抗生素和促进动物对营养的吸收，提高动物生产性能等方面。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有益生作用的贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001及其应用。

为了实现本发明的目的，本发明的贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001(Bacillusvelezensis)是从健康白羽肉鸡肠道内容物中分离的芽胞杆菌菌株，通过菌落形态观察、抑菌性能检测、16S rDNA基因序列分析和体外益生效果评价得到，该菌株广谱抑菌、产酶丰富、益生性更加显著。其16S rDNA序列如SEQ ID NO.1 所示。该菌株已于2020年11月16日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)，保藏编号为CGMCC No.21191。

本发明提供的贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)NHB-BvF5001具有以下微生物学特征：贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001是革兰氏阳性杆菌，在营养琼脂培养基上生长良好，培养24h，菌落呈圆形，灰白色，无光泽，表面不光滑有褶皱，边缘整齐，中间有平坦凹陷。菌落直径4～6mm，菌落形态如图1，显微镜下菌体呈直杆状，好氧生长，经革兰氏染色后菌株形态如图2；贝莱斯芽胞杆菌 NHB-BvF5001生长适宜温度范围：15℃-50℃，最适生长温度：25℃-45℃；生长适宜pH5.5-10，最适pH值为6-8。部分生理生化特性如表1。

本发明提供了含有保藏编号为CGMCC No.21191的贝莱斯芽胞杆菌 NHB-BvF5001的液体菌剂。

本发明提供了含有保藏编号为CGMCC No.21191的贝莱斯芽胞杆菌 NHB-BvF5001的动物饮水用饲料添加剂。

饲料添加剂中贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001的活菌数为1.0×10⁶-1.0× 10¹⁰CFU/g。优选地，饲料添加剂中贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001的活菌数为1 ×10⁷CFU/g。

本发明提供了含有保藏编号为CGMCC No.21191的贝莱斯芽胞杆菌 NHB-BvF5001的药物，所述药物为预防或治疗动物腹泻的药物。

本发明提供了含有保藏编号为CGMCC No.21191的贝莱斯芽胞杆菌 NHB-BvF5001或含有其的菌剂在提高饲料转化率，提高动物生产性能中的应用。

本发明提供了含有保藏编号为CGMCC No.21191的贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001或含有其的菌剂在制备预防或治疗动物腹泻的药物中的应用。

本发明提供了含有保藏编号为CGMCC No.21191的贝莱斯芽胞杆菌 NHB-BvF5001或含有其的菌剂在制备广谱抗菌剂中的应用。

所述广谱抗菌剂的抗菌谱包括抗以下菌：肠道致病大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌属、产气荚膜杆菌、彭氏变形杆菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌。

本发明提供了含有保藏编号为CGMCC No.21191的贝莱斯芽胞杆菌 NHB-BvF5001或含有其的菌剂在食品制造中的应用。优选地，所述的食品为动物用食品。

本发明中所述贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001的培养方法如下：

取贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001(保藏编号为CGMCC No.21191)种子液(活菌浓度为10⁹CFU/mL)3mL，接种于300mL摇瓶发酵培养基中进行摇瓶发酵培养。

所述摇瓶发酵培养基由下述组分组成：玉米粉1-5％，蔗糖0.1-3％，酵母浸粉1-5％，硫酸铵0.5-5％，磷酸氢二钾0.1-5％，硫酸镁0.1-4％，氯化钠0.1-4％，余量为水，pH6-8。其中，优选为：玉米粉1.5％，蔗糖0.5％，酵母浸粉2.5％，硫酸铵1.5％，磷酸氢二钾0.5％，硫酸镁0.4％，氯化钠0.2％，余量为水，pH7.5。

所述摇瓶发酵条件为：接种量0.5-10％，发酵温度20-45℃，发酵时间8-24h， pH值6.0-8.0，转速为100-300r/m；优选为：接种量1％，发酵温度为37℃、pH7.5、 180r/min，发酵时间10h。

10L种子罐罐培养基与摇瓶发酵培养基相同，10L发酵罐发酵条件为：罐压 0.01-0.10MPa，装液量为5-7.5L培养基，接种量为25-750mL摇瓶种子液，发酵温度为20-45℃，发酵时间5-20h，pH值6.0-8.0，搅拌转速100-300r/min，通气量5-50L/min。其中，优选为：罐压0.03-0.05MPa，装液量为7L培养基，接种量为70mL，发酵温度为37℃，发酵时间14h，pH值7.5，搅拌转速200r/min，通气量10L/min。

100L发酵罐的培养基成分及发酵条件为：1-30％麸皮浸出液、1-15％豆粕粉 (粉碎过60目筛)、1-5％玉米浆干粉、1-5％酵母粉、1-10％硫酸铵、0.1-5％磷酸氢二钾，0.1-1％硫酸镁，0.1-2.0％氯化钠，0.1-1.0％碳酸钙，余量为水， pH6.0-8.0，装液量为50-75L培养基，罐压0.01-0.10MPa，接种量为5-7.5L，发酵温度为20-45℃，发酵时间10-48h，pH值5-8，搅拌转速120-220r/min，通气量5-70L/min。其中，优选为：装液量为70L培养基，罐压0.03-0.05MPa，接种量为7L，发酵温度为37℃，发酵时间18h，pH值8.0，搅拌转速200r/min，通气量30L/min。

本发明贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001的益生性的检验方法如下：

在无菌操作台上，将浓度为10⁹CFU/mL的病原菌(肠道致病大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌属、产气荚膜杆菌、彭氏变形杆菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌)菌悬液加入冷却至45℃的营养琼脂(产气荚膜梭菌则将培养基换成胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂，培养条件则需要严格厌氧条件)培养基(灭菌后)中混匀，制备成4mm左右的病原菌琼脂平板，琼脂平板中病原菌的浓度为10⁹CFU/mL。将灭菌的牛津杯放置在培养基上，轻轻加压，使其与培养基接触无空隙，待10分钟后，分别向各小管中滴加200μL保存好的实施例2制备的发酵液，勿使其外溢，37℃培养36-96h。

其中，所述病原菌琼脂平板是将121℃高温灭菌后的病原菌琼脂培养基与病原菌菌悬液混匀后，倒入灭菌后的平板，冷却后形成表面光滑的4mm厚的病原菌NA平板。所述营养琼脂培养基的配方按重量百分比计由下述组分组成：蛋白胨1％；牛肉膏0.3％；NaCl0.5；余量为水，pH 7.2±0.2。所述胰胨-亚硫酸盐 -环丝氨酸琼脂培养基的配方按重量百分比计由下述组分组成：胰胨1.5％，大豆胨0.5％，酵母粉0.5％，焦亚硫酸钠0.1％，柠檬酸铁铵0.1％，琼脂2％，余量为水，pH 7.6±0.2，使用时冷却至50℃时加入过滤除菌的0.5％D-环丝氨酸溶液 20ml/250mL。

本发明贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001产酶性能检验方法如下：

将活化好的菌种接种到产酶(蛋白酶、纤维素酶、β-甘露聚糖酶、木聚糖酶、脂肪酶、淀粉酶)检测培养基上，37℃培养24h后，通过不同的染色液染色后根据颜色的变化来确定是否产生该种酶，蛋白酶根据培养基状态是否改变来确定是否产蛋白酶。

所诉蛋白酶检测培养基配方按重量百分比计由下述组分组成：蛋白胨0.5％，明胶15％，余量为水，pH 7.2±0.2，观察是否液化来确定是否产生蛋白酶。

所诉纤维素酶检测培养基配方按重量百分比计由下述组分组成：蛋白胨1.0％，羧甲基纤维素钠1.0％，柠檬酸钠0.5％，磷酸氢二钾0.2％，乙酸钠0.2％，硫酸镁0.02％，硫酸锰0.005％，琼脂1.5％，余量为水，pH 7.2±0.2。培养结束后，加入刚果红试剂染色5min，用2mol/L氯化钠洗去刚果红试剂。若菌株产纤维素酶，即可见到水解圈。

所诉β-甘露聚糖酶检测培养基配方按重量百分比计由下述组分组成：刺槐豆胶1.0％，磷酸三钾0.3％，磷酸氢二钾0.1％，硫酸镁0.02％，硫酸铵0.2％，酵母提取物0.3％，琼脂1.5％，余量为水，pH 7.2±0.2。培养结束后加入刚果红或者碘液染色2min。若菌株产β-甘露聚糖酶，即可见到水解圈。

所诉木聚糖酶检测培养基配方按重量百分比计由下述组分组成：木聚糖 0.3％，硫酸铵0.1％，磷酸氢二钾0.1％，氯化钠0.5％，氯化钙0.1％，亚硫酸钠0.001％，琼脂1.5％，余量为水，pH 7.2±0.2。若菌株产木聚糖酶，即可见到水解圈。

所诉脂肪酶检测培养基配方按重量百分比计由下述组分组成：蛋白胨1.0％，牛肉浸粉0.5％，香油或花生油1.0％，氯化钠0.5％，1.6％中性红水溶液1mL，琼脂 1.5％，余量为水，pH 7.2±0.2。若菌株产木聚糖酶，即可见到水解圈。

所诉淀粉酶检测培养基配方按重量百分比计由下述组分组成：蛋白胨1.0％，氯化钠0.5％，可溶性淀粉0.2％，琼脂1.5％，余量为水，pH 7.2±0.2。将菌株接种于淀粉平板表面，培养24h后，加入碘液染色2min。若菌株产淀粉酶，即可见到水解圈。

本发明贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001预防和治疗腹泻的检验方法：

选取普通昆明小白鼠60只，雌性，13-15g，常规饲养。随机分为三组，每个处理饲喂基础日粮，饲喂1周，使小鼠尽快适应。开始正式试验，正式试验分两个阶段。第一阶段生长性能观察试验，实验组在饮水中添加贝莱斯芽胞杆菌菌悬液，添加浓度为1×10⁷CFU/mL。对照组和负对照组饮用未加贝莱斯芽胞杆菌的纯净水，连续饮水两周。试验前后分别称重1次，试验期间观察小鼠生长情况，计算各组体重平均增长率。第二阶段致病性大肠杆菌攻毒试验，对负对照组和试验组进行致病性大肠杆菌攻毒，攻毒方式采用灌胃的方式，具体为灌胃0.3mL/只浓度为0.2％的碳酸氢纳溶液，5min后灌胃浓度为10⁷数量级的大肠杆菌0.5mL/只，对照组则灌胃0.5mL/只生理盐水。攻毒后测粪便潜血及观察小白鼠精神状态，攻毒前后一天取小鼠粪便用大肠菌群测试片检测粪便中大肠菌群数量检测是否攻毒成功。攻毒后试验组继续饮用1×10⁷CFU/mL浓度的贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001，对照组和负对照组正常饮用自来水。试验期间小鼠同室分笼饲养，自然光照，自由采食。环境温度控制在25±2℃，湿度60％，

本发明的有益效果体现在：

(1)本发明的贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001抑菌性能强；产酶丰富；发酵力强、生长旺盛；经发酵培养基和工艺优化，37℃发酵18h，发酵液活菌数可达到1.1×10¹⁰CFU/mL，更加适合饲料工业和畜禽养殖业发展，在畜牧养殖可大大降低生产成本、提高经济效益，为以后发展奠定了坚实的菌种基础。

(2)本发明的贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001具有显著的益生性，能显著抑制肠道致病大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌属、产气荚膜杆菌、彭氏变形杆菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌等病原菌的生长繁殖，具有广谱抑菌性。

(3)本发明的贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001具有产酶丰富的特性，能产蛋白酶、纤维素酶、β-甘露聚糖酶、木聚糖酶、脂肪酶、淀粉酶，可用于饲料及饲料原料发酵生产。

(4)本发明中贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001可有效维持动物肠道菌群平衡，改善肠道性能，提高动物生产性能。经小鼠攻毒试验，NHB-BvF5001试验组小鼠体重平均增长率显著高于对照组(P<0.05)；致病性大肠杆菌攻毒后，试验组小鼠精神状态和存活率明显高于负对照组，粪便潜血恢复明显快于负对照组。表明饲喂NHB-BvF5001可有效预防和治疗小鼠腹泻，提高小鼠受病原菌攻毒的存活率，并能够促进小鼠生长。

附图说明

图1是贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001在营养琼脂培养基上的菌落形态。

图2是贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001经革兰氏染色显微镜下的菌株形态。

图3是贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001系统发育树。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001的分离筛选和鉴定

1、芽胞杆菌的分离纯化：

将健康白羽肉鸡屠宰取肠道后迅速在无菌条件下采集肠道内容物2.5克，置于盛有22.5mL灭菌生理盐水的三角瓶中，于37℃下恒温震荡1h后，于80℃水浴锅中水浴10分钟，然后采用10倍倍比稀释的方法依次稀释至10万倍，选择1000 倍、1万倍和10万倍三个稀释度，吸取0.1mL涂布于营养琼脂平板上，平板涂布后37℃倒置培养24h，用接种环挑取疑似芽胞杆菌的菌落在营养琼脂平板上进行划线分离培养，经24h培养后，挑取分离效果较好的菌落，用接种环转接于营养琼脂斜面上作纯培养，重复传代纯培养3次，而后将菌种细胞悬浮于20％甘油溶液中，于-80℃冰箱保存备用。

2、菌落形态的观察：

将步骤1保存的甘油管菌种，经营养琼脂平板2-3次活化，然后接种于营养肉汤培养基中，37℃恒温180转/分钟震荡培养18～20h，取干净的载玻片进行革兰氏染色，镜检，观察菌株显微形态，选取革兰氏染色为阳性的产芽胞杆菌作为备用。

3、抑菌性芽胞杆菌的筛选：

取致病菌(肠道致病大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌属、产气荚膜杆菌、彭氏变形杆菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌) 浓度为10⁹CFU/mL的菌悬液2mL，加入装有200mL灭菌后冷至45℃左右的营养琼脂培养基中，然后吸取10mL未凝固的带菌培养基，转入倒有10mL底层平板的营养琼脂平板上，制备成致病菌平板若干个(致病菌产气荚膜梭菌则将培养基换成胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂，培养条件则需要严格厌氧条件)。在超净工作台上每个病原菌营养琼脂平板用无菌镊子夹取1个灭菌牛津杯(内径6mm、外径 8mm、高10mm的圆形小管，管中可加入200μL液体，管的两端要光滑)放在平皿上，使其与培养基接触无空隙，待数分钟后，分别吸取200μL疑似芽胞杆菌菌株发酵液于牛津杯中，于37℃下恒温培养24h。每个菌株至少做3个重复，观察并测量抑菌圈大小，其中抑菌圈大的菌株有6株，并分别标号为F2801、F3801、 F4001、F5001、F5002、F5003。选择抑菌圈最大的菌株F5001进行下一步研究。

4、菌株属的鉴定：

对菌株F5001进行生理生化鉴定，氧化酶、接触酶、明胶液化试验、吲哚试验和淀粉水解均为阳性，表明F5001菌株为芽胞杆菌属。

表1菌株F5001部分生理生化特性

鉴定项目	F5001	鉴定项目	F5001
				革兰氏染色	+	淀粉水解	+
接触酶	+	纤维素水解	+
				明胶液化	+	硝酸盐还原	+
氧化酶	+	乳糖	+
				厌氧生长	-	蔗糖	+
65℃生长	+	葡萄糖	+
				耐6.5％NaCl	+	D-甘露聚糖	+
V-P	+	木聚糖	+

注：“+”表示反应阳性；“-”表示反应阴性。

6、16S rDNA测序测定

采用细菌DNA提取的试剂盒提取F5001菌株基因组DNA。通过引物F和R对 F5001菌株的16S rDNA基因片段进行测序，所得序列如SEQ ID NO.1所示，将所测得的序列与GenBank中的16S rDNA序列进行BLAST分析比对，可以看出菌株F5001与贝莱斯芽胞杆菌的同源性达到99.93％。通过菌株F5001的形态特征、生理生化特征、16S rDNA特征，确定菌株F5001为贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)，并正式标号为NHB-BvF5001。

7.菌株保藏：

上述经分离、纯化、筛选得到的贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis) NHB-BvF5001已于2020年11月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏编号为CGMCC NO.21191，分类命名为贝莱斯芽胞杆菌(Bacillusvelezensis)。

所述营养琼脂培养基组成为：蛋白胨1％，牛肉膏0.3％，琼脂2％，NaCl 0.5％，余量为水，pH 7.2±0.2。

所述营养肉汤培养基组成为：蛋白胨1％，牛肉膏0.3％，NaCl 0.5％，余量为水，pH7.2±0.2。

所述胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂培养基组成为：胰胨1.5％，大豆胨0.5％，酵母粉0.5％，焦亚硫酸钠0.1％，柠檬酸铁铵0.1％，琼脂2％，余量为水，pH 7.6 ±0.2，使用时冷却至50℃时加入过滤除菌的0.5％D-环丝氨酸溶液20ml/250mL。

实施例2贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001发酵液的制备

取贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001(保藏编号为CGMCC No.21191)种子液(活菌浓度为10⁹CFU/mL)3mL，接种于300mL摇瓶发酵培养基中进行摇瓶发酵培养；摇瓶发酵结束后进行发酵罐一级种子培养，取70mL摇瓶发酵种子液接种到10L发酵罐中装液量为7L的一级种子培养基中发酵培养；一级种子培养结束后将10L发酵罐中的一级种子液全部转种至100L发酵罐中的发酵培养基中进行发酵培养，100L发酵罐装液量为70L发酵培养培养基。发酵结束后，检测发酵液活菌数为1.1 ×10¹⁰CFU/mL，芽胞率达到93％，发酵液于4℃保存在冰箱内备用。

所述摇瓶发酵培养基和一级种子培养组分相同，由下述组分组成：玉米粉 1.5％，蔗糖0.5％，酵母浸粉2.5％，硫酸铵1.5％，磷酸氢二钾0.5％，硫酸镁0.4％，氯化钠0.2％，余量为水，pH7.5。

所述摇瓶发酵条件为：接种量1％(体积比)，发酵温度为37℃、pH7.5、 180r/min，发酵时间10h。

所述一级种子发酵条件为：控制罐压0.03-0.05MPa，接种量为70mL，发酵温度为37℃，发酵时间14h，pH值7.5，搅拌转速200r/min，通气量10L/min。

所述，100L发酵罐的培养基成分及发酵条件为：1-30％麸皮浸出液、1-15％豆粕粉(粉碎过60目筛)、1-5％玉米浆干粉、1-5％酵母粉、1-10％硫酸铵、0.1-5％磷酸氢二钾，0.1-1％硫酸镁，0.1-2.0％氯化钠，0.1-1.0％碳酸钙，余量为水， pH6.0-8.0，装液量为70L培养基，控制罐压0.03-0.05MPa，接种量为7L，发酵温度为37℃，发酵时间18h，pH值8.0，搅拌转速200r/min，通气量30L/min。

实施例3贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001益生性验证

在无菌操作台上，将浓度为10⁹CFU/mL的病原菌(肠道致病大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌属、产气荚膜杆菌、彭氏变形杆菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌)菌悬液加入冷却至45℃的营养琼脂(产气荚膜梭菌则将培养基换成胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂，培养条件则需要严格厌氧条件)培养基(灭菌后)中混匀，制备成4mm左右的病原菌琼脂平板，琼脂平板中病原菌的浓度为10⁹CFU/mL。将灭菌的牛津杯放置在培养基上，轻轻加压，使其与培养基接触无空隙，待10分钟后，分别向各小管中滴加200μL保存好的实施例2制备的发酵液，勿使其外溢，37℃培养36-96h，然后测量抑菌圈直径。每个实验三个重复，取平均值，结果如表2。

其中，所述病原菌琼脂平板是将121℃高温灭菌后的病原菌琼脂培养基与病原菌菌悬液混匀后，倒入灭菌后的平板，冷却后形成表面光滑的4mm厚的病原菌NA平板。所述营养琼脂培养基的配方按重量百分比计由下述组分组成：蛋白胨1％；牛肉膏0.3％；NaCl0.5；余量为水，pH 7.2±0.2。所述胰胨-亚硫酸盐- 环丝氨酸琼脂培养基的配方按重量百分比计由下述组分组成：胰胨1.5％，大豆胨0.5％，酵母粉0.5％，焦亚硫酸钠0.1％，柠檬酸铁铵0.1％，琼脂2％，余量为水， pH 7.6±0.2，使用时冷却至50℃时加入过滤除菌的0.5％D-环丝氨酸溶液 20ml/250mL。

表2贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001对病原菌的抑菌效果

病原菌	抑菌直径(mm)
		肠道致病大肠杆菌Escherichia coli	18.21
金黄色葡萄球菌StBphylococcus Bureus	33.15
		伤寒沙门氏菌Salmonella typhimurium	21.22
沙门氏菌Salmonella	18.53
		志贺氏菌属Shigella Castellani	21.34
产气荚膜梭菌Clostridium perfringen	32.36
		彭氏变形杆菌Proteus penneri	14.41
嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila	24.22
		副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus	27.72

实施例4贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001产酶性能验证

在无菌操作台上，取甘油保藏的贝₁₀莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001(保藏编号为CGMCCNo.21191)活化在营养琼脂平板上活化，将活化好的菌种接种到产酶 (蛋白酶、纤维素酶、β-甘露聚糖酶、木聚糖酶、脂肪酶、淀粉酶)检测培养基上，37℃培养24h后，通过不同的染色液染色后根据颜色的变化来确定是否产生该种酶，蛋白酶根据培养基状态是否改变来确定是否产蛋白酶，结果如表2。

所诉纤维素酶检测培养基配方按重量百分比计由下述组分组成：蛋白胨 1.0％，羧甲基纤维素钠1.0％，柠檬酸钠0.5％，磷酸氢二钾0.2％，乙酸钠0.2％，硫酸镁0.02％，硫酸锰0.005％，琼脂1.5％，余量为水，pH 7.2±0.2。培养结束后，加入刚果红试剂染色5min，用2mol/L氯化钠洗去刚果红试剂。若菌株产纤维素酶，即可见到水解圈。

表3贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001产酶特性

实施例5贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001急性毒性试验

贝莱斯芽胞杆菌的安全性评价采用急性毒性试验，参照国标 GB15193.3-2003最大耐受剂量法进行。取普通昆明小白鼠60只，雌雄各半，18-20g，常规饲养1周后，一日分三次对小白鼠进行灌胃，0.25g/mL贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001菌液(相当于15000mg/kg体重)，连续灌服2周，观察小鼠是否有中毒或死亡的现象。

试验期间，小鼠精神状态良好，无中毒和死亡现象，因此本发明菌株的急性毒性试验最大耐受剂量MTD＞15000mg/kg，根据分级标准，可确定该菌种为无毒级，具有较高的安全性。

实施例6小鼠攻毒试验

选取普通昆明小白鼠60只，雌性，13-15g，常规饲养。随机分为三组，每个处理饲喂基础日粮，饲喂1周，使小鼠尽快适应。开始正式试验，正式试验分两个阶段。第一阶段生长性能观察试验，实验组在饮水中添加贝莱斯芽胞杆菌菌悬液，添加浓度为1×10⁷CFU/mL。对照组和负对照组饮用未加贝莱斯芽胞杆菌的纯净水，连续饮水两周。试验前后分别称重1次，试验期间观察小鼠生长情况，计算各组体重平均增长率，结果如表4。第二阶段致病性大肠杆菌攻毒试验，对负对照组和试验组进行致病性大肠杆菌攻毒，攻毒方式采用灌胃的方式，具体为灌胃0.3mL/只浓度为0.2％的碳酸氢纳溶液，5min后灌胃浓度为10⁷数量级的大肠杆菌0.5mL/只，对照组则灌胃0.5mL/只生理盐水。攻毒后测粪便潜血及观察小白鼠精神状态，攻毒前后一天取小鼠粪便用大肠菌群测试片检测粪便中大肠菌群数量检测是否攻毒成功。攻毒后试验组继续饮用1×10⁷CFU/mL浓度的贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001，对照组和负对照组正常饮用自来水。试验期间小鼠同室分笼饲养，自然光照，自由采食。环境温度控制在25±2℃，湿度60％，

所述贝莱斯芽胞杆菌菌悬液为实施例2制备的发酵液，然后通过离心收集菌体，收集获得的菌体用生理盐水洗涤3-5次除去发酵液。

致病性大肠杆菌攻毒后，通过检测粪便中大肠菌群数量，发现攻毒组粪便中大肠杆菌数量呈数量级增加，表明攻毒成功。通过每日观察，小鼠的发病症状有：精神萎靡不振、不活泼；表现呆滞、颤抖；蜷缩在一起，毛色不光泽，且背毛凌乱；食欲不佳、背部弓起突出。攻毒后，第1天，负对照组开始有发病症状，且死亡2只，并且第2、3、4天各死亡7、3、1只，其他存活的也不同程度的出现了发病症状，四处逃窜，精神不振。试验组在第1、3天各死亡1只，其它小鼠3天内，精神不佳、不食、聚堆，之后逐渐恢复正常。

攻毒后各组死亡时间、死亡数及存活率如表5所示，粪便潜血情况如表6所示，试验组小鼠攻毒后中毒现象不严重，表明贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001对大肠杆菌感染有一定的免疫预防效果，有效地降低了小白鼠受大肠杆菌感染时的发病率，延缓攻毒后的发病时间，从而有效提高了存活率。

表4小鼠增重情况

分组	平均始重(g/只)	平均末重(g/只)	平均增长率(％)
				对照组	16.32±1.34	31.85±1.43	95.15<sup>b</sup>
负对照组	16.21±0.51	31.92±0.78	96.91<sup>b</sup>
				试验组	16.29±0.87	37.75±1.33	131.73<sup>a</sup>

表5攻毒前、后的小鼠死亡情况

表6攻毒前后小鼠粪便潜血情况

实施例7肉鸡生长性能试验

选取7400只1日龄的白羽肉鸡，随机分成2组，每组10个重复，每重复370只鸡。试验处理分别为：(1)对照组基础日粮(CON)；(2)试验组基础日粮+ 饮水中添加浓度为1×10⁷CFU/mL的贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001。试验组和对照组饲料配方(表7所示)和饲喂量一样，试验鸡自由采食和饮水，饲养管理和免疫程序参照肉鸡饲养管理手册。

本试验结果如表8所示，结果显示，贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001可提高白羽肉鸡的生产性能及存活率，与对照组相比，料肉比降低18.54％，存活率提升 3.9％。

表7基础日粮组成及营养水平(风干基础％)

表8贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001对肉鸡生长性能的影响

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 新希望六和股份有限公司

<120> 一株具有益生作用的贝莱斯芽胞杆菌及应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1404

<212> DNA

<213> Bacillus velezensis

<400> 1

tgcagtcgag cggacagatg ggagcttgct ccctgatgtt agcggcggac gggtgagtaa 60

cacgtgggta acctgcctgt aagactggga taactccggg aaaccggggc taataccgga 120

tggttgtttg aaccgcatgg ttcagacata aaaggtggct tcggctacca cttacagatg 180

gacccgcggc gcattagcta gttggtgagg taacggctca ccaaggcgac gatgcgtagc 240

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gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa tggacagaac 1200

aaagggcagc gaaaccgcga ggttaagcca atcccacaaa tctgttctca gttcggatcg 1260

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ccgaagtcgg tgaggtaacc ttta 1404

Claims

1.一株贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001，分类命名为贝莱斯芽胞杆菌(Bacillusvelezensis)NHB-BvF5001，于2020年11月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.21191，保藏地址为中国北京。

2.权利要求1所述的贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001在饲料添加剂中的应用。

3.根据权利要求2所述的贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001在饲料添加剂中的应用，其特征在于饲料添加剂中贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001的活菌数为1.0×10⁶-1.0×10¹⁰CFU/g。

4.根据权利要求2所述的贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001在饲料添加剂中的应用，其特征在于饲料添加剂中贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001的活菌数为1×10⁷CFU/g。

5.权利要求1所述的贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001在动物饲料中的应用。

6.权利要求1所述的贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001在制备预防或治疗动物腹泻的药物中的应用。

7.权利要求1所述的贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001或含有其的菌剂在提高饲料转化率中的应用。

8.权利要求1所述的贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001或含有其的菌剂在制备广谱抗菌剂中的应用,所述广谱抗菌剂的抗菌谱为抗以下菌：肠道致病大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌属、产气荚膜杆菌、彭氏变形杆菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌。

9.权利要求1所述的贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001或含有其的菌剂在食品制造中的应用。

10.根据权利要求9所述的贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001或含有其的菌剂在食品制造中的应用，其特征在于所述的食品为动物用食品。