CN111534446A - 罗伊氏乳杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体而言，提供了一种罗伊氏乳杆菌及其应用。本发明提供的保藏编号为CCTCC NO:M 2018943的罗伊氏乳杆菌是发明人首次从健康成年蓝狐后肠内容物中分离获得的犬科动物源罗伊氏乳杆菌菌株。该菌株具有良好的生长性能，对胃液、肠液的耐受性强以及对小肠上皮细胞具有良好黏附性能，而且还能够促进犬肠道有益菌的增殖，抑制有害菌的增长，增强宠物犬机体免疫功能，效果优于市场同类产品，可作为益生菌制剂的备选菌株，应用前景十分广阔。

Description

罗伊氏乳杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体而言，涉及一种罗伊氏乳杆菌及其应用。
背景技术
益生菌通过改善宿主动物的肠道微生态平衡而有益地影响宿主动物健康，很多有益的益生菌菌株被成功开发和验证，其中大多来源与人类肠道、乳制品或植物表面，已在食品或饲料中被广泛应用。2013年，我国农业部批准罗伊氏乳杆菌作为益生菌可用作饲料添加剂应用于动物养殖。罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)广泛存在于人和动物肠道中，可抑制胃肠道病原菌繁殖，调节动物免疫机能，降低动物应激，减少动物发病率，调节肠道菌群，预防或减轻腹泻，同时还具有提高饲料利用效率，促进动物生长，降低料重比等重要作用。
益生菌饲料添加剂是添加到日粮中以对宿主产生有益作用的微生物制剂。选择益生菌饲料添加剂的一个重要标准是宿主特异性。主要原因在于益生菌对上皮细胞的粘附具有宿主特异性，定植后的益生菌通过诱导后肠中短链脂肪酸(SCFA)的生成来实现最佳的粘膜免疫效果，同时促进宿主营养物质吸收以及抑制致病性微生物的定植，从而在肠道屏障功能中发挥重要的健康促进作用。同时，添加的微生物不应干扰肠道原籍菌，因为原籍菌已经适应了胃肠道环境，与宿主互惠共生。不同种属动物肠道微生物组成与食物属性高度相关，在大多数发展中国家宠物犬主要依靠不同成分的自制食物饲养，对犬科动物源有益微生物开发研究非常有限。目前在犬科动物，包括宠物犬饲养方面广泛使用的益生菌主要是非犬源益生菌，菌种主要依赖进口，应用效果差异巨大且不稳定。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种罗伊氏乳杆菌ZJF036及其应用。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种罗伊氏乳杆菌ZJF036，所述罗伊氏乳杆菌于2018年12月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2018943。
一种菌剂，所述菌剂包括本发明的罗伊氏乳杆菌ZJF036。
本发明的罗伊氏乳杆菌ZJF036或菌剂在制备用于调节肠道菌群的产品中的应用。
一种用于调节肠道菌群的产品，活性成分包括本发明的罗伊氏乳杆菌ZJF036或菌剂。
进一步地，所述调节肠道菌群包括如下(a)-(c)中任一种：
(a)抑制大肠杆菌；
(b)抑制鼠伤寒沙门氏菌；
(c)抑制金黄色葡萄球菌。
本发明的罗伊氏乳杆菌ZJF036或菌剂在制备抗菌药物中的应用。
进一步地，所述菌为细菌或真菌；
优选地，所述细菌为革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌；
优选地，所述细菌包括大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌或金黄色葡萄球菌中的至少一种。
本发明的罗伊氏乳杆菌ZJF036或菌剂在制备食品添加剂或动物饲料添加剂中的应用。
本发明的罗伊氏乳杆菌ZJF036或菌剂在制备对小肠上皮细胞具有粘附定植能力的产品中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的保藏编号为CCTCC NO:M 2018943的罗伊氏乳杆菌是发明人首次从健康成年蓝狐后肠内容物中分离获得的犬科动物源罗伊氏乳杆菌菌株。该菌株具有良好的生长性能，对胃液、肠液的耐受性强以及对小肠上皮细胞具有良好黏附性能，而且还能够促进犬肠道有益菌的增殖，抑制有害菌的增长，增强宠物犬机体免疫功能，效果优于市场同类产品，可作为益生菌制剂的备选菌株，应用前景十分广阔。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1中罗伊氏乳杆菌ZJF036菌落形态图；
图2为本发明实施例1中罗伊氏乳杆菌ZJF036细胞形态图；
图3为本发明实施例1中罗伊氏乳杆菌ZJF036基于16S rRNA基因序列比对结果以Escherichia coli AK108(AY098487.1)为外枝构建的Neighbor-Joining系统发育树；
图4为本发明实施例3中罗伊氏乳杆菌ZJF036生长曲线和产酸曲线；
图5为本发明实施例7中罗伊氏乳杆菌ZJF036胆盐耐受结果(**：p＜0.01)；
图6为本发明实施例8中罗伊氏乳杆菌ZJF036的疏水性能结果(P＞0.05)；
图7为本发明实施例8中罗伊氏乳杆菌ZJF036的自凝聚率结果(**：p＜0.01)；
图8为本发明实施例9中罗伊氏乳杆菌ZJF036的黏附细胞图(1000×)；
图9为本发明实施例11中Alpha多样性指数ACE组间差异箱形图(注：L0对照组，L1添加组)；
图10为本发明实施例11中Alpha多样性指数Chao1组间差异箱形图(注：L0对照组，L1添加组)；
图11为本发明实施例11中门水平肠道菌群相对丰度图(注：L0对照组，L1添加组)；
图12为本发明实施例11中属水平肠道菌群相对丰度图(注：L0对照组，L1添加组)；
图13为本发明实施例11中组间的差异物种图(注：L0对照组，L1添加组)。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
本发明提供的罗伊氏乳杆菌ZJF036于2018年12月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号为CCTCC NO:M 2018943，拉丁名：Lactobacillus reuteri。
本发明提供的罗伊氏乳杆菌ZJF036在人工胃液、人工肠液以及胆盐环境中均具有较强的耐受性，同时，该菌株具有很强的胃肠道定植能力，可以满足在机体内发挥作用的基本要求。此外，发明人研究发现，该菌株对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌均具有良好的抑制作用，可以降低犬血脂含量，减少犬发生高血脂等心脑血管疾病的风险，同时改善肝脏功能，同时，可以显著增加犬肠道有益菌数量，可以作为调节肠道菌群、改善肠道功能的益生菌应用于食品和药物等领域，应用前景十分广阔。
本发明的一种菌剂，包括本发明的罗伊氏乳杆菌ZJF036。
本发明的罗伊氏乳杆菌ZJF036或菌剂在制备用于调节肠道菌群的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明还保护一种用于调节肠道菌群的产品，活性成分包括本发明的罗伊氏乳杆菌ZJF036或菌剂。例如用于调节肠道菌群的产品具有如下(a)-(c)中任一种功能：(a)抑制大肠杆菌；(b)抑制鼠伤寒沙门氏菌；(c)抑制金黄色葡萄球菌。
本发明还保护罗伊氏乳杆菌ZJF036或菌剂在制备抗菌药物中的应用。其中，菌为细菌或真菌；例如细菌为革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。
进一步地，细菌包括大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌或金黄色葡萄球菌中的至少一种。
进一步地，抗菌药物中除了罗伊氏乳杆菌还包括辅料。辅料的作用可为赋形、充当载体、提高稳定性、增溶、助溶、缓释等等。
本发明还保护罗伊氏乳杆菌ZJF036或菌剂在制备食品添加剂或动物饲料添加剂中的应用，以及，罗伊氏乳杆菌ZJF036或菌剂在制备对小肠上皮细胞具有粘附定植能力的产品中的应用。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1犬科动物源罗伊氏乳杆菌的分离鉴定
(Ⅰ)分离用培养基：MRS培养基，培养基成分如下：
成分 重量 成分 重量
蛋白胨 10.0g K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> 2.0g
牛肉膏 10.0g NaAc 2.0g
酵母提取物 5.0g MnSO<sub>4</sub>·4H<sub>2</sub>O 0.25g
葡萄糖 20.0g MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 0.58g
吐温80 1.0ml 琼脂 20.0g
柠檬酸二铵 2.0g 蒸馏水 1000mL
pH 6.2～6.5，121℃灭菌30min。
(Ⅱ)分离方法：
(1)样品的采集与微生物分离：选择中国农业科学院特产研究所毛皮动物饲养基地的健康成年蓝狐，采取后肠内容物，迅速放入装有液体培养基的灭菌螺口具盖试管中，带回实验室后立即进行梯度稀释，每梯度三个平板，倾注法分离培养，于37℃倒置培养。
(2)分离纯化：取以上长有各种细菌的平板，选取乳酸菌单菌落，采用连续划线法进行分离纯化。将有不同菌落形态的单菌落均进行纯化。重复3-4次，镜检，直至获得纯种。
(3)观察菌落特征，利用革兰氏染色、镜检，观察细菌形态。
(4)DNA提取按照大连宝生物公司DNA提取试剂盒(akaRa 2.0)说明书方法提取细菌DNA，利用细菌的通用引物：27f，1492r对所获得乳酸菌保守序列进行扩增并测序，引物合成及测序送检上海生工生物工程技术服务有限公司完成，对16S rRNA序列进行同源性比较。16S rDNA的扩增体系如下，扩增体系的总体积为50μl：
ddH<sub>2</sub>O 22μl
Taq mix 25μl
DNA plate 1μl
Primer F 1μl
Primer R 1μl
PCR反应程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，52℃退火45s，72℃延伸1min 30s，25个循环，72℃延伸8-10min，4℃保存。
(Ⅲ)罗伊氏乳杆菌的分离筛选鉴定：
经形态学观察，显微镜检，酶学分析以及碳水化合物利用实验，结合16S rRNA测序比对，鉴定为罗伊氏乳杆菌，命名为ZJF036，16S rRNA基因序列如下SEQ ID NO.1所示。菌株培养24h后，菌落中间凸起，边缘整齐，表面光滑；兼性厌氧，革兰氏阳性，细胞呈杆状。ZJF036的菌落形态如图1所示，显微镜检形态如图2所示。
对罗伊氏乳杆菌ZJF036的16S rRNA基因进行系统发育分析，确定它与罗伊氏乳杆菌的亲缘关系密切。罗伊氏乳杆菌ZJF036基于16S rRNA基因序列比对结果以Escherichiacoli AK108(AY098487.1)为外枝构建的Neighbor-Joining系统发育树如图3所示。
罗伊氏乳杆菌ZJF036的16S rRNA基因序列：
TGCAGTCGTACGCACTGGCCCAACTGATTGATGGTGCTTGCACCTGATTGACGATGGATCACCAGTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGTAACCTGCCCCGGAGCGGGGGATAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACAAAAGCCACATGGCTTTTGTTTGAAAGATGGCTTTGGCTATCACTCTGGGATGGACCTGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCGATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACAATGGAACTGAGACACGGTCCATACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGGCGCAAGCCTGATGGAGCAACACCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGTTGGAGAAGAACGTGCGTGAGAGTAACTGTTCACGCAGTGACGGTATCCAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTGCTTAGGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTTAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACCGGGCGACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTGCGCTAACCTTAGAGATAAGGCGTTCCCTTCGGGGACGCAATGACAGGTGGTGCATGGTCGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTACTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAGATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAACGAGTCGCAAGCTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCGTTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTTGTAACGCCCAAAGTCGGTGGCCTA(SEQ ID NO.1)。
将罗伊氏乳杆菌ZJF036于2018年12月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2018943。
实施例2生理生化特性
利用biolog微生物鉴定仪对菌株进行生理生化特性以及酶活性进行检测，结果见表1和表2。
表1菌株ZJF036生理生化特性—利用碳源产酸
Figure BDA0002313529330000081
Figure BDA0002313529330000091
+：阳性反应；-：阴性反应。
表2菌株ZJF036生理生化特性-酶活
Figure BDA0002313529330000092
Figure BDA0002313529330000101
+：阳性反应；-：阴性反应；W：弱阳性反应。
实施例3生长特性及产酸性能测定
取对数生长期菌液，按2.0％(V/V)接种量接种于MRS培养液中，以未接菌MRS培养液为空白，37℃静置培养24h，每隔2h取一次培养液分别采用酶标仪和pH计测定600nm下的吸光度值(OD600)和pH值，以时间为横坐标，培养液的OD600和pH为纵坐标，绘制生长曲线和产酸曲线，结果如图4所示。
ZJF036在24h内生长曲线分为滞缓，快速生长期，稳定期，未进入衰亡期，符合一般细菌生长规律。通过OD600值发现，接种后0-4h内菌液OD600变化较小，细菌生长缓慢，为生长滞缓期；4h后OD600值变化较大，进入对数生长期，生长迅速；10-24h以后细菌OD600值稳定在1.41左右，处于稳定期；与此对应的是，随着培养时间的延长，细菌OD600值的增长发酵液pH下降，在接种4h内培养液pH值变化较小，对应生长滞缓期，而在4-10h内pH从6.13左右下降至3.83左右，变化幅度较大处在快速生长期，10-24h培养液pH值稳定在3.80左右，对应稳定期。
实施例4抗生素敏感试验
采用K-B药敏纸片琼脂扩散法。取对数生长期菌液按2.0％接种量接种于MRS培养液中，37℃180rpm/min震荡培养12h，6000rpmpm/min，4℃离心10min，收集菌体，并用生理盐水洗涤2次，洗涤后用生理盐水重悬约为108cfu/mL，涂板，贴药敏片，每种药敏片三个重复，37℃静置培养24h，测量药敏圈直径，与CLSI标准作比较判定菌株抗生素敏感性，结果如表3所示。
由表3可知，ZJF036对麦迪霉素、头孢曲松、多粘菌素B和素氯霉4种抗生素敏感，氯霉素抑菌圈直径最大达23.0±1.00mm，对青霉素和新霉素中度敏感，对环丙沙星、氨苄西林、丁胺卡那和万古霉素四种抗生素不敏感。
表3罗伊氏乳杆菌ZJF036药敏试验结果
Figure BDA0002313529330000111
Figure BDA0002313529330000121
注：R：不敏感；I：中度敏感；S：敏感。
实施例5发酵上清液抑菌试验
取对数生长期菌液按2.0％接种量接种于MRS培养液中，37℃180rpm/min震荡培养24h，6000rpm/min，4℃离心10min，取上清液，0.2μm无菌滤膜过滤，备用，采用牛津杯法(牛津杯外径×内径×高度＝8mm×6mm×10mm)测定抑菌活性，每杯150μL上清液，取大肠杆菌ATCC25922，金黄色葡萄球菌ATCC 25923，沙门氏菌ATCC 14028，37℃培养24h，测量抑菌圈直径，结果如表4所示。
可知ZJF036无菌上清对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌具有不同的抑制作用。其中对大肠杆菌的抑菌能力最强，抑菌圈直径达22.3±1.15mm；对金黄色葡萄球菌抑制能力相对最弱，但抑菌圈直径仍有14.3±0.58mm。
表4 ZJF036抑菌试验结果
组别 抑菌活性
E.coli ATCC 25922 +++
Staphylococcus aureus ATCC 25923 +
Salmonella ATCC 14028 ++
+++：抑菌圈直径＞20mm；++：抑菌圈直径介于15mm和20mm之间；+：抑菌圈直径介于10mm和15mm之间。
实施例6人工胃液耐受和人工肠液耐受试验
按2013版《中国药典》配制pH＝3.0的人工胃液和pH＝6.8的人工肠液，均以0.22μm微孔无菌滤膜过滤备用。新鲜过夜培养菌液，离心洗涤重悬，按重悬液：人工胃液或人工肠液＝1：9混合均匀，37℃孵育1.5h，3h，分别取0h，1.5h和3h混合液涂板进行活菌计数，重复三次取平均值，计算细菌存活率，结果如表5所示：
Figure BDA0002313529330000131
其中No为0h活菌数，Nt为t(t＝1.5或3)h活菌数。
ZJF036在人工胃液中分别处理1.5h和3h，存活率为94.55％和93.26％；ZJF036在人工肠液中分别处理1.5h和3h，存活率在96.58％和94.22％。ZJF036在人工胃液和肠液中处理后活菌数目均高于1.0×108CFU/mL，说明罗伊氏乳杆菌ZJF036对人工胃肠液耐受性能良好。
表5罗伊氏乳杆菌ZJF036在人工胃肠液中的活菌数
Figure BDA0002313529330000141
**：P＜0.01。
实施例7胆盐耐受试验
在MRS液体培养基中加入胆盐(胆酸含量≥65％)，使其浓度分别为0(空白对照)、0.2％和0.4％。ZJF036按4.0％接种于上述不同浓度胆盐的MRS液体培养基中，37℃培养12h，每隔6h测定培养液OD600，每个时间点三个重复，结果如图5所示。
在6h，对照组OD600值为1.32±0.01，0.2％和0.4％胆盐组OD600分别为0.89±0.01和0.68±0.02(P＜0.01)，分别占对照组吸光度的67.42％和51.52％；在12h，对照组OD600值为1.38±0.01，0.2％和0.4％胆盐组OD600分别为1.07±0.01和0.51±0.02(P＜0.01)，分别占对照组的77.54％和36.96％。说明罗伊氏乳杆菌ZJF036能够耐受浓度为0.2％和0.4％的胆盐。
实施例8表面疏水性及自凝聚力
采用细菌碳烃化合物黏着法，通过乳酸菌对碳烃化合物的亲和力来测定菌株疏水性能。PBS洗涤过夜培养的新鲜菌液并调节菌液OD600＝0.25±0.05(A0)作为待测液，取3mL待测液与等体积二甲苯混合，涡旋振荡3min，在37℃下分别孵育1h和2h，吸取水相(形成两相体系，水相在下层)，测量OD600(At)，每个时间点3个重复。疏水率计算公式如下：
疏水率(CSH)＝[(A0-At)/A0]×100％
式中：At为1h或2h的吸光度；A0为t为0时的吸光度。
取37℃过夜培养16h新鲜菌液，4℃，6000rmp离心10min，PBS洗涤两次，2倍体积PBS重新悬浮细菌，取2mL上述待测液，涡旋振荡10s，测其在600nm处吸光度(A0)，37℃分别静置2h和4h，小心吸取上清液200μl，测其吸光度(At)。每个时间点3个重复。自凝聚率计算公式如下：
自凝聚率＝[(A0-At)/A0]×100％
式中：At为2h或4h的吸光度；A0为t为0时的吸光度。
罗伊氏乳杆菌ZJF036的疏水性能结果如图6所示，ZJF036经过二甲苯处理1h和2h，其表面疏水性分别为82.27％和82.70％，差异不显著(P＞0.05)。
罗伊氏乳杆菌ZJF036的自凝聚率结果如图7所示，ZJF036在2h和4h自凝聚率分别为32.47％和41.70％，差异极显著(P＜0.01)，发现随着培养时间的增加自凝聚率提高。
实施例9细胞黏附能力
将狐狸小肠上皮细胞(本实验室保存)按常规传代方法培养于DMEM培养液中，10％CO2培养箱37℃培养，每2d换液一次。将培养好的细胞制成细胞悬液(5×104个/mL)，向已放置玻璃爬片的24孔板中加入2mL细胞悬液，10％CO2培养箱37℃培养。待玻璃爬片上形成单层细胞后，吸出孔内旧的细胞培养液，用PBS清洗3次后每孔加入1mL培养24h的新鲜菌液(菌液浓度调节为1×108CFU/mL)和1mL细胞培养液，37℃厌氧培养2h。吸出孔内的混合液体，用PBS漂洗3次后每孔加入适量的高聚甲醛固定30min。吸出孔内的高聚甲醛，用PBS漂洗3次后进行革兰氏染色，显微镜下每孔随机计数30个视野，每个视野选择单个分布的细胞，通过计数黏附在30个细胞上的菌体个数，来判断黏附能力的大小，结果如图8所示。ZJF036在比格犬小肠上皮细胞上黏附数为77.0±8.0CFU/cell，显示出ZJF036拥有良好的细胞黏附能力，可在犬科动物肠道定植。
实施例10动物安全性试验
参考GB15193.3-2014设计试验。小鼠10只，适应期7天，随机分为二组，对照组每只灌服生理盐水0.2mL；试验组每只灌服109CFU/mL发酵菌液0.2mL，连续七天定时灌胃，每天记录小鼠状态。7天后处死，观察内脏有无异常，无菌取肝、脾、肾涂布MRS，37℃培养24h，观察是否有菌落生长。
在灌胃期间，小鼠全部健康存活，没有出现任何不良反应。解剖后，心、肝、肺、脾和肾脏均正常；肠道正常，无充血及出血点，无菌环境下肝、脾、肾涂布的MRS未见菌落生长。表明菌株ZJF036对健康小鼠是安全的，无毒副作用。
实施例11对比格犬生长性能及肠道菌群多样性的影响
实验动物及分组：选取4月龄～7月龄的比格犬8只，平均体重4.51±0.47kg，随机分为2组，每组4只，饲喂市场采购商品狗粮，预饲期7天，正式期42天。根据是否添加益生菌分为两组：I)对照组(0添加)；II)试验组(添加ZJF036，1×109cfu/kg)。每天早8：00和晚16：30两次饲喂，自由饮水。实验最后1天，后肢静脉采血，检测血清生化指标及免疫指标；收集新鲜粪便检测粪便中微生物组成与多样性。
数据经Excel初步处理，采用spss17.0中单因素方差分析对数据进行显著性分析，结果以平均数±标准差表示，其中**表示极显著，P＜0.01；*表示显著，P＜0.05，P＞0.05表示不显著。
罗伊氏乳杆菌ZJF036对比格犬体重的影响结果如下表6所示，给比格犬饲喂21天犬源罗伊氏乳杆菌，添加组平均增重和平均日增重与对照组相比差异不显著，但有增加的趋势，分别增加14.01％，14.23％。说明饲喂犬源罗伊氏乳杆菌具有增加比格犬体增重的趋势。
表6添加罗伊氏乳杆菌对比格犬体重的影响
Figure BDA0002313529330000161
Figure BDA0002313529330000171
罗伊氏乳杆菌ZJF036对比格犬血清生化指标的影响结果如下表7所示，添加犬科动物源罗伊氏乳杆菌可降低血清胆固醇、甘油三酯、葡萄糖等指标的含量，各项指标均在正常范围内，可显著降低血清中低密度脂蛋白和碱性磷酸酶含量，由此说明日粮中添加罗伊氏乳杆菌可以降低比格犬血脂含量，减少犬发生高血脂等心脑血管疾病的风险，同时改善肝脏功能。
表7添加犬科动物源罗伊氏乳杆菌对比格犬血清生化指标的影响
Figure BDA0002313529330000172
对比格犬肠道菌群进行分析，Alpha多样性指数ACE、Chao1组间差异箱形图分别如图9和图10所示(注：L0对照组，L1添加组)，表明添加犬源罗伊氏乳杆菌不改变比格犬肠道菌群组成，但增加了比格犬肠道乳酸杆菌丰度(P<0.05)。
根据物种注释结果，选取每个分组在纲和属分类水平上最大丰度排名前10的物种，生成物种相对丰度柱形累加图，以便直观观察各组比格犬肠道菌群门水平、属水平肠道菌群相对丰度。
门水平肠道菌群相对丰度图如图11所示(注：L0对照组，L1添加组)，在门分类水平，比格犬肠道细菌主要归类于厚壁菌门(Firmicutes，添加组vs对照组，0.58vs 0.61)，梭杆菌门(Fusobacteria，添加组vs对照组，0.15vs0.13)，拟杆菌门(Bacteroidetes，添加组vs对照组，0.16vs 0.14)，放线菌门(Actinobacteria，添加组vs对照组，0.09vs 0.08)，占所有细菌门分类水平的98.44％vs 96.89％。
属水平肠道菌群相对丰度图如图12所示(注：L0对照组，L1添加组)，在属分类水平，Turicibacter(添加组vs对照组，0.02vs 0.11)，乳酸杆菌组(Lactobacillus，添加组vs对照组，0.19vs 0.05)，Cetobacterium(添加组vs对照组，0.06vs 0.08)，消化链球菌(Peptostreptococcus，添加组vs对照组，0.08vs 0.08)，梭菌属(添加组vs对照组，0.09vs0.05)，此外还有Romboutsia，Alloprevotella，Bifidobacterium，Blautia，Peptoclostridium等，分别占肠道所有细菌属的60.96％，60.65％。
比格犬肠道菌群属分类水平下组间的差异物种分析，结果如图13所示(注：L0对照组，L1添加组)。通过组间的T-test检验，发现添加组乳酸杆菌属，韦荣球菌属(veillonella)丰度显著高于对照组(P<0.05)，对照组芽孢杆菌属明显高于添加组(P<0.05)，由结果可知，在比格犬日粮中添加犬源罗伊氏乳杆菌可以显著增加犬肠道有益菌数量。乳酸菌是对身体健康有益的细菌，可以维持肠道菌群的自然平衡，对宿主的营养代谢及肠道免疫具有积极的作用。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院特产研究所
<120> 罗伊氏乳杆菌及其应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1423
<212> DNA
<213> 罗伊氏乳杆菌ZJF036 16s rRNA
<400> 1
tgcagtcgta cgcactggcc caactgattg atggtgcttg cacctgattg acgatggatc 60
accagtgagt ggcggacggg tgagtaacac gtaggtaacc tgccccggag cgggggataa 120
catttggaaa cagatgctaa taccgcataa caacaaaagc cacatggctt ttgtttgaaa 180
gatggctttg gctatcactc tgggatggac ctgcggtgca ttagctagtt ggtaaggtaa 240
cggcttacca aggcgatgat gcatagccga gttgagagac tgatcggcca caatggaact 300
gagacacggt ccatactcct acgggaggca gcagtaggga atcttccaca atgggcgcaa 360
gcctgatgga gcaacaccgc gtgagtgaag aagggtttcg gctcgtaaag ctctgttgtt 420
ggagaagaac gtgcgtgaga gtaactgttc acgcagtgac ggtatccaac cagaaagtca 480
cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgtta tccggattta 540
ttgggcgtaa agcgagcgca ggcggttgct taggtctgat gtgaaagcct tcggcttaac 600
cgaagaagtg catcggaaac cgggcgactt gagtgcagaa gaggacagtg gaactccatg 660
tgtagcggtg gaatgcgtag atatatggaa gaacaccagt ggcgaaggcg gctgtctggt 720
ctgcaactga cgctgaggct cgaaagcatg ggtagcgaac aggattagat accctggtag 780
tccatgccgt aaacgatgag tgctaggtgt tggagggttt ccgcccttca gtgccggagc 840
taacgcatta agcactccgc ctggggagta cgaccgcaag gttgaaactc aaaggaattg 900
acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagctacgc gaagaacctt 960
accaggtctt gacatcttgc gctaacctta gagataaggc gttcccttcg gggacgcaat 1020
gacaggtggt gcatggtcgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa 1080
cgagcgcaac ccttgttact agttgccagc attaagttgg gcactctagt gagactgccg 1140
gtgacaaacc ggaggaaggt ggggacgacg tcagatcatc atgcccctta tgacctgggc 1200
tacacacgtg ctacaatgga cggtacaacg agtcgcaagc tcgcgagagt aagctaatct 1260
cttaaagccg ttctcagttc ggactgtagg ctgcaactcg cctacacgaa gtcggaatcg 1320
ctagtaatcg cggatcagca tgccgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc 1380
cgtcacacca tgggagtttg taacgcccaa agtcggtggc cta 1423

Claims (10)

1.一种罗伊氏乳杆菌ZJF036，其特征在于，所述罗伊氏乳杆菌于2018年12月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2018943。
2.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂包括权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌ZJF036。
3.权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌ZJF036或权利要求2所述的菌剂在制备用于调节肠道菌群的产品中的应用。
4.一种用于调节肠道菌群的产品，其特征在于，活性成分包括权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌ZJF036或权利要求2所述的菌剂。
5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于，所述调节肠道菌群包括如下(a)-(c)中任一种：
(a)抑制大肠杆菌；
(b)抑制鼠伤寒沙门氏菌；
(c)抑制金黄色葡萄球菌。
6.权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌ZJF036或权利要求2所述的菌剂在制备抗菌药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述菌为细菌或真菌。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述细菌为革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌；
优选地，所述细菌包括大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌或金黄色葡萄球菌中的至少一种。
9.权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌ZJF036或权利要求2所述的菌剂在制备食品添加剂或动物饲料添加剂中的应用。
10.权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌ZJF036或权利要求2所述的菌剂在制备对小肠上皮细胞具有粘附定植能力的产品中的应用。
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