CN105543126A - 一种植物乳杆菌jm113及其应用 - Google Patents

一种植物乳杆菌jm113及其应用 Download PDF

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Abstract

一种植物乳杆菌(Lactobacillus？plantarum)JM113，所述菌株JM113保藏中国典型培养物保藏中心，其简称为JM113，保藏编号为CCTCC？M2015680，保藏日期为2015年11月18日。本发明之植物乳杆菌JM113可以较好地耐受胃肠道中不利于细菌生长的因素如酸、胆盐并且对肠道致病菌有很好的抑制作用；本发明植物乳杆菌JM113具有较好的可发酵性，具有大量生产的潜力。本发明由植物乳杆菌JM113制备成乳酸球菌菌粉添加到肉鸡日粮中，可以显著提高肉鸡的生产性能。

Description

一种植物乳杆菌JM113及其应用
技术领域
本发明涉及一种植物乳杆菌JM113及其应用。
背景技术
随着抗生素在畜牧生产中大量使用所带来的种种弊端的日益凸显,如导致动物肠道正常菌群失调,动物整体免疫低下,产生耐药性细菌甚至发生抗生素在畜禽产品中的残留,开发替代抗生素的新型环保安全高效的绿色饲料添加剂已成为必然趋势。
近年来，益生菌替代抗生素来促生长、预防和治疗炎症性肠病成为研究的热点，益生菌因其益生特性在畜牧生产中应用前景非常广阔，但不是所有菌株都可以作为益生菌，可作为益生菌的菌株应具有以下特征：(1)正确的益生菌菌株来源；已有研究表明，理想的益生菌菌株最好来自本源动物；(2)对动物健康无负面影响，很多细菌在代谢过程中会产生毒素或类毒素等，而这些有毒的物质会影响动物的健康，因此安全性是决定一株菌能否成为益生菌的必要条件；(3)对胃肠道酸、胆盐等抑制因素有较强的耐受性，因为益生菌的使用方式多为口服，先到达胃再安全到达肠道才能发挥作用，所以益生菌首先必须具有较强的耐酸、耐胆盐和耐胰蛋白酶的特性，保证到达后肠道前不被抑制或杀死，才能发挥有益作用；(4)具有良好的抑菌活性，可抑制肠道中常见病原微生物的生长和繁殖；(5)能用于生产加工并保持较强活力，性能较好的益生菌不仅在经过饲料添加剂的各种加工程序之后仍具有较好活性，还能在储存和运输过程中保持活力等；(6)用于生产的菌株还要必需符合我国农业部规定的《饲料添加剂品种目录》。目前，乳酸菌是应用最早、最广泛的益生菌，是一类能在利用碳水化合物发酵过程中产生大量乳酸的细菌的总称，通常为厌氧或兼性厌氧菌,在动物饲料中常用的有乳酸杆菌属、双歧杆菌属和肠球菌属。其中，肉鸡饲喂乳酸杆菌的研究越来越多，尤其乳酸菌制剂在肉鸡生产中得到广泛的应用，它作为一种活性制剂能够提高肉鸡生产性能和改善肠道环境。例如现有罗伊氏乳杆菌单一菌剂、卷曲乳杆菌单一菌剂及其它们的复合制剂，每克活菌含量仅为107cfu，肉鸡日增重均在50～52g；北京中农颖泰生物技术有限公司研制的高端乳酸菌微生态制剂，商品名康福特100，饲喂42天肉鸡日增重为51.97±4.75g；CN201010527172.6公开了一株植物乳杆菌及其应用，该植物乳杆菌对大肠杆菌、沙门氏菌以及金黄球菌等抑菌圈直径均在12.36～14.92之间，抑菌作用较小。同时由于饲养环境的差异，益生菌结果不一致性变得越来越复杂因此，寻找一种效果稳定、抑制效果良好、具有最佳肉鸡日增重特点、可制备活性制剂的优良乳酸菌菌种成为进一步研究的课题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种优良的植物乳杆菌JM113及其应用。
本发明解决其技术问题采用的技术方案是，从西藏林芝八一镇散养藏鸡盲肠内容物中分离得到一批乳酸菌，并从中发现一株植物乳杆菌，该菌对肠道中常见致病菌有很好的抑制作用并且对胃肠道中的酸、胆盐有一定的耐受性。此外，将该菌制成菌粉添加到肉鸡日粮中，可以显著提高肉鸡生产性能，并且与抗生素具有相似的促生长效果。将其命名为植物乳杆菌LactobacillusplantarumJM113，该菌株JM113已保藏于中国典型培养物保藏中心，其简称为JM113，保藏编号为CCTCCM2015680，保藏日期为2015年11月18日。保藏地址：湖北省武汉市武昌珞珈山，武汉大学保藏中心。邮编：430072。
本发明之一种乳酸球菌菌粉，包括植物乳杆菌JM113。
本发明之一种乳酸球菌菌粉的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备植物乳杆菌JM113的种子液；
(2)制备发酵液：将步骤(1)中制备的种子液转接到液体培养基中，在36～38℃培养12～24h,作为发酵用菌种；
(3)扩大培养：在发酵罐中加入液体培养基，119～125℃灭菌15～30min；灭菌完成后降温降至36～38℃；将步骤(2)中制备的发酵液以体积比为0.5～2％的比例接种到液体培养基中；在温度36～38℃，转速100～300rpm，pH6～7，连续发酵12～24h，即得发酵菌液；
(4)制备菌粉：将步骤(3)中所得的发酵菌液用超高速离心机以转速6000～8000rpm/min离心15～25min；弃上清液，收集菌泥，在菌泥中加入保护剂，加入量为菌泥重的8～12％，然后搅拌均匀，冷冻干燥20～30h后研成粉末状，即得植物乳杆菌JM113菌粉。
进一步，包括以下步骤：
(1)制备种子液：从平板上挑植物乳杆菌菌株JM113的单菌落接种到MRS液体培养基，在37℃培养箱培养16h；
(2)制备发酵液：将步骤(2)中制备的种子液以体积比为1％的比例转接到MRS液体培养基中，37℃培养16h,作为发酵用菌种；
(3)扩大培养：在发酵罐中加入MRS液体培养基，121℃灭菌20min；灭菌完成后，降温降至37℃；将步骤(2)中制备的发酵液以体积比为1％的比例接种到MRS液体培养基中；在温度37℃，转速200rpm，pH6.5，连续发酵16h，即得发酵菌液。
(4)制备菌粉：用超高速离心机将发酵菌液以转速为8000rpm/min离心20min，弃上清液，收集菌泥，在菌泥中加入保护剂，加入量为菌泥重的10％，然后搅拌均匀，冷冻干燥24h后研成粉末状，，即得乳酸球菌M23菌粉。
进一步，所述保护剂为脱脂奶粉与甘油以比例5：1的混合物。
本发明之植物乳杆菌JM113在制备肉鸡日粮中的应用。
进一步，每千克日粮中含109cfu所述植物乳杆菌JM113。
本发明之植物乳杆菌菌粉在制备肉鸡日粮中的应用。
进一步，每千克日粮中添加1克所述植物乳杆菌菌粉。
本发明之植物乳杆菌JM113可以较好地耐受胃肠道中不利于细菌生长的因素如酸、胆盐；对肠道致病菌大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、巴氏杆菌以及金黄色葡萄球菌的生长均有很好的抑制作用；具有较好的可发酵性，具有大量生产的潜力。本发明由植物乳杆菌JM113制备成菌粉添加到肉鸡日粮中，可以显著提高肉鸡的生产性能。
实验证明，本发明植物乳杆菌JM113在pH2.5、胆盐浓度为0.2％的MRS培养基中成活率分别为67.7％和100％；同时，本发明植物乳杆菌JM113对肠道致病大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、巴氏杆菌以及金黄色葡萄球菌抑菌圈直径可达17～20mm。本发明植物乳杆菌JM113在PH6.5、温度37℃、转速200rpm/min的条件下，可大量生长，发酵菌液经过低温高速离心得到菌体，经过24小时冷冻干燥，研磨制成菌粉，每克菌粉的活菌数高达1010cfu。肉鸡日粮中添加本发明植物乳杆菌菌粉可使肉鸡平均日增重可达58.2±1.6g，饲料转化率可达1.65±0.04％。
附图说明
图1为植物乳杆菌JM113系统发育树。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步加以说明。
实施例1：植物乳杆菌JM113的分离
1、菌株样品：西藏的藏鸡目前主要是以传统的散养方式为主，其抗病力强，在生长过程中没有接触过抗生素，可以作为一种理想的益生菌来源。样品是从陕西杨凌地区散养肉鸡肠道中采集的，取肠道内容物以及粘膜于4℃保存。
2、培养基：MRS培养基(ManRogosaSharp,MRS),乳酸杆菌选择性培养基，组成如下：胰蛋白10g/L，酵母提取物5g/L，牛肉膏10g/L，三水合乙酸钠5g/L，葡萄糖20g/L，吐温801ml/L,磷酸氢二钾2.0g/L，柠檬酸三胺2.0g/L，七水合硫酸镁0.58g/L,一水硫酸锰0.25g/L,碳酸钙20g/L，琼脂15g/L，蒸馏水1L。
3、菌株的分离纯化：采用倍比稀释法涂布,37℃培养24h,挑取平板上有明显溶钙圈的单菌落，在平板上划线，多次纯化直到菌落的颜色、大小、形态完全一致；将纯化的菌落在平板上于4℃保存，菌液与50％的甘油1：1混合均匀后保存于-80℃冰箱。
4、菌株形态特征及生理生化鉴定：将该植物乳杆菌在MRS固体培养基平板上37℃培养24h,形成乳白色的圆形菌落,边缘整齐光滑。经鉴定,植物乳杆菌的生理生化特征为:革兰氏染色阳性、杆状,H2S反应、过氧化氢酶、硝酸盐还原、明胶液化均为阴性。
5、活性菌株的分子鉴定：提取植物乳杆菌菌株的基因组，参照天根的DNA提取试剂盒，PCR引物为细菌16SrRNA序列通用引物：
正向引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)，如SEDIDNO：1所示；
反向引物1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)，如SEDIDNO：2所示；
扩增菌株16SrRNA基因，PCR反应体系：20微升体系，mix10微升，上下游引物各1微升，基因组1微升，灭菌水7微升。PCR反应条件为：95℃10min；95℃30s；55℃30s；72℃90s；30个循环，72℃延伸10min。PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳检测，用全式金的胶回收试剂盒回收片段，样品送南京金丝瑞测序公司测序。将测序的结果输入NCBI网站上的BLAST程序进行比对，结果显示植物乳杆菌JM113与GenBank基因库中植物乳杆菌属中的Lactobacillusplantarum，Lactobacillusplantarum的16SrRNA序列同源度最高，同源率达96.06％。
6、菌株系统发育分析：将菌株的16SrRNA序列与从GenBank数据库中获得的植物乳杆菌16SrRNA序列作比较，DNAStar100软件包进行多序列匹配排列并进行系统进化树构建，见图1。从该菌16SrRNA构建的系统发育树上看，菌株JM113与植物乳杆菌Lactobacillus发育关系最近，分在同一类群中，序列同源性为96.06％。根据生物学领域的通常认知，16SrRNA基因序列同源性小于93％～95％,可认为属于不同属，同源性低于98％，可以认为属于不同种。因此，基于系统发育树和16SrRNA同源性角度，菌株JM113是乳杆菌属中的一个新成员，将其命名为LactobacillusplantarumJM113。
综上，根据形态学特性、生理生化特征、分子生物学鉴定，并结合文献报道，确定菌株JM113为植物乳杆菌JM113。
实施例2：植物乳杆菌JM113耐酸、耐胆盐的研究
1、首先配制pH为2.5的MRS培养基和胆盐浓度为0.2％的MRS培养基，121℃灭菌20min；接着挑取乳杆菌单菌落加到2ml胆盐浓度为0.2％的MRS培养基中，37℃培养过夜；然后将乳酸菌菌液涡旋30s，取150μl相同的菌液接到4850μl灭菌生理盐水中，用灭菌生理盐水做10倍梯度稀释(第1管取出500μl，加到4500μl灭菌生理盐水中，即稀释10倍，每个管再取液体之前都要涡旋30s)，逐渐稀释到10-6，取500μl涂板，每个菌做3个重复，平板放37℃培养箱培养24h，培养结束后统计菌落数M，成活率可达67.7％。同时取150μl相同菌液分别接种到4850μlpH为2.5和浓度为0.2％胆盐的液体MRS培养基中，放37℃培养箱培养2h；培养结束后，做10倍梯度稀释(稀释方法同上)，逐渐稀释到10-6，取500μl涂板，每个菌做3个重复；分别统计各组的菌落形成单位N，成活率高达100％。
2、植物乳杆菌JM113耐酸、耐胆盐结果：说明该植物乳杆菌JM113有较好的耐酸、耐胆盐特性。
实施例3：植物乳杆菌JM113耐胰蛋白酶的研究
(1)配制胰蛋白酶浓度为1mg/ml的MRS液体培养基(MRS培养基高温灭菌，冷却后加入胰蛋白酶，胰蛋白酶溶于无菌水中，并用滤膜过滤)
(2)取过夜培养的乳酸菌菌液150微升，用生理盐水10倍梯度稀释后，涂板计数，菌落数记为M；另取150微升菌液加入到胰蛋白酶浓度为1mg/ml的MRS液体培养基中，37℃培养4小时，生理盐水10倍梯度稀释后涂板计数，菌落数记为N。
(3)计数植物乳杆菌113的成落率n＝M/N
(4)实验结果：初始菌落数M为1.83×108CFU
胰蛋白酶处理4小时以后的菌落数N＝1.61×108CFU
成活率n＝88％
由此说明这株植物乳杆菌可以很好地耐受胰蛋白酶。
实施例4：植物乳杆菌JM113对热的稳定性
过夜培养的乳酸菌菌液涡旋均匀后取1ml接种于100mlMRS培养基中，放37℃培养，2小时后稀释涂板计菌落数M；另取1ml接种于100mlMRS培养基中，放45℃培养箱，2小时后稀释涂板计菌落数N。
结果：在37摄氏度培养的菌约为3.5×107CFU
在45摄氏度培养箱培养的菌约为1.6×107CFU。
实验结果表明，与37℃培养的菌相比，在45℃培养2小时，菌的数量级是一样的，说明该菌对45℃的耐受性较好。
实施例5：植物乳杆菌JM113的安全性评价
植物乳杆菌JM113菌落过夜培养，划线到血平板培养基(购自索莱宝)，24小时以后观察现象，为溶血酶阴性菌。
实施例6：植物乳杆菌抑菌试验的研究
1、将固体LB培养基配好后，121℃高压灭菌20min，灭菌完成后放65℃烘箱保温；挑取MRS平板上的乳杆菌单菌落接种到液体MRS培养基中，放37℃培养箱培养16h；取0.5ml菌液转接到50ml新鲜的MRS培养基中，37℃培养箱培养16h；指示菌(大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、巴氏杆菌)接到液体LB培养基中，放37℃摇床，培养15h；在洁净的平板上等距离放上2个灭菌的牛津杯，固体LB降到45℃后加入指示菌(100mlLB加如100μl的指示菌菌液)，摇匀后每个平板上倒入20ml混有指示菌的LB培养基；待培养基凝固后，用灭菌的镊子轻轻转动牛津杯并取出，两个孔各加入200微升菌液，每种菌做3个重复；对照组加入200微升的灭菌MRS；菌液加好后，室温放置2h，待菌液扩散完毕后放入放37℃过夜培养；并用游标卡尺测量抑菌圈直径(单位：mm)。、
3、植物乳杆菌的抑菌试验结果：见表1。
由表1可知，MRS培养基对各种肠道致病菌均没有抑菌效果，而植物乳杆菌对5种致病菌均有较强的抑菌效果，抑菌圈直径可达17mm以上。
表1-植物乳杆菌JM113抑菌圈直径(mm)
处理 鼠伤寒沙门氏菌 巴氏杆菌 大肠杆菌K88 金黄色葡萄球菌 肠炎沙门氏菌
植物乳杆菌 19.65±0.36 18.24±0.32 17.24±0.26 17.47±0.14 17.10±0.08
MRS 0 0 0 0 0
实施例7：植物乳杆菌菌粉的制备
1、菌液的发酵
(1)制备种子液：从平板上挑乳杆菌单菌落接种到MRS液体培养基，放37℃培养箱培养16h；
(2)制备发酵液：取1ml新鲜乳酸菌菌液转接到100mlMRS液体培养基中，37℃培养16h,作为发酵用菌种；
(3)扩大培养：配好4LMRS培养基，加入到发酵罐中，在碱瓶中装入10mmol的碱液100ml，按要求装好发酵罐，121℃灭菌20min；灭菌完成后，温度降至不烫手时装到发酵设备上，打开循环水浴降温降至37℃；用50ml无菌注射器吸取40ml菌种，通过接种口点火接种；在温度37℃，转速200rpm，pH6.5，连续发酵16h，即得发酵菌液。
4、菌粉的制备：将发酵菌液8000g用超高速离心机以转速8000rpm/min离心20min；弃上清液，收集菌泥，在菌泥中加入脱脂奶粉和甘油作为保护剂，保护剂按菌泥重的10％添加，搅拌均匀；菌泥加在冻干盘上并抹平，冷冻干燥24h；冻干后研成粉末状，称取0.1g菌粉用灭菌生理盐水分别稀释到10-6、10-7、和10-8涂板计活菌数，每批菌粉重复3次，测得每克菌粉的活菌数可达1010CFU发酵菌粉放-20℃冰箱保存。
3、结论：上述研究表明在PH6.5、温度37℃、转速200rpm/min的条件下，该菌株可大量生长，发酵菌液经过低温高速离心得到菌体，经过24小时的冷冻干燥，研磨制成菌粉，每克菌粉的活菌数高达1010CFU。由此说明该菌株具有较好的可发酵性，具有大量生产的潜力。
实施例8：植物乳杆菌对肉鸡生产性能的影响
1、试验采用单因素完全随机设计，288只健康1日龄AA肉仔鸡随机分成3个处理，每个处理6个重复，每个重复16只鸡。日粮选用无抗生素的基础日粮，0-21天饲喂育雏期日粮，22-42天饲喂育成期日粮，试验日粮见表:2。在42日龄统计肉鸡生产性能见表3，包括平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和饲料转化率(FCR)以及42日龄体重。
表2-试验日粮
组别(group) 添加类别(addition agent) 添加剂量(additional dose)
对照1(control 1) ---- ----
对照2(control 2) 金霉素(chlorotetracycline) 50mg/kg日粮(50mg/kg diet)
处理3(treatment 3) 植物乳杆菌(L.planetariumJM113) 109cfu/k日粮(109cfu/kg diet)
表3-植物乳杆菌JM113对肉鸡生产性能的影响(单位:g)
注：同一行数字肩注有不同小写英文字母时表示差异显著(P<0.05)
2、试验结果：由表3可知，植物乳杆菌JM113可以显著提高肉鸡的平均日增重和42日龄体重，并且与抗生素具有相似的效果；此外，植物乳杆菌JM113也显著改善了肉鸡饲料转化率，并且与抗生素具有相似的效果。

Claims (9)

1.一种植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)JM113，其特征在于，所述菌株JM113保藏于中国典型培养物保藏中心，其简称为JM113，保藏编号为CCTCCM2015680，保藏日期为2015年11月18日。
2.一种植物乳杆菌菌粉，其特征在于，包括权利要求1所述的植物乳杆菌JM113。
3.一种如权利要求2所述的植物乳杆菌菌粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备植物乳杆菌M23的种子液；
(2)制备发酵液：将步骤(1)中制备的种子液转接到液体培养基中，在36～38℃培养12～24h,作为发酵用菌种；
(3)扩大培养：在发酵罐中加入液体培养基，119～125℃灭菌15～30min；灭菌完成后降温降至36～38℃；将步骤(2)中制备的发酵液以体积比为0.5～2％的比例接种到液体培养基中；在温度36～38℃，转速100～300rpm，pH6～7，连续发酵12～24h，即得发酵菌液；
(4)制备菌粉：将步骤(3)中所得的发酵菌液用超高速离心机以转速6000～8000rpm/min离心15～25min；弃上清液，收集菌泥，在菌泥中加入保护剂，加入量为菌泥重的8～12％，然后搅拌均匀，冷冻干燥20～30h后研成粉末状，即得植物乳杆菌JM113菌粉。
4.根据权利要求3所述的植物乳杆菌菌粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备种子液：从平板上挑植物乳杆菌JM113的单菌落接种到MRS液体培养基，在37℃培养箱培养16h；
(2)制备发酵液：将步骤(2)中制备的种子液以体积比为1％的比例转接到MRS液体培养基中，37℃培养16h,作为发酵用菌种；
(3)扩大培养：在发酵罐中加入MRS液体培养基，121℃灭菌20min；灭菌完成后，降温降至37℃；将步骤(2)中制备的发酵液以体积比为1％的比例接种到MRS液体培养基中；在温度37℃，转速200rpm，pH6.5，连续发酵16h，即得发酵菌液。
(4)制备菌粉：用超高速离心机将发酵菌液以转速为8000rpm/min离心20min，弃上清液，收集菌泥，在菌泥中加入保护剂，加入量为菌泥重的10％，然后搅拌均匀，冷冻干燥24h后研成粉末状，，即得植物乳杆菌JM113菌粉。
5.根据权利要求3或4所述的的植物乳杆菌菌粉的制备方法，其特征在于，所述保护剂为脱脂奶粉与甘油以比例5：1的混合物。
6.根据权利要求1所述的植物乳杆菌JM113在制备肉鸡日粮中的应用。
7.根据权利要求6所述的植物乳杆菌JM113在制备肉鸡日粮中的应用，其特征在于，每千克日粮中含109cfu所述植物乳杆菌JM113。
8.根据权利要求2所述的植物乳杆菌菌粉在制备肉鸡日粮中的应用。
9.根据权利要求8所述的植物乳杆菌菌粉在制备肉鸡日粮中的应用，其特征在于，每千克日粮中添加1克所述植物乳杆菌菌粉。
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