CN109234181B - 植物乳杆菌zjuf hn9及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZJUF HN9及其应用，属于生物技术领域。植物乳杆菌ZJUF HN9分离自传统发酵剂酸面团，保藏号为CCTCC NO:M 2017341。本发明提供的植物乳杆菌ZJUF HN9具有耐受高含量胆盐的能力，有利于其在肠道中存活和繁殖；在胃肠道环境中具有较高生存率、较强的胃肠粘附力，能显著抑制胃肠道致病菌的繁殖，尤其是鼠伤寒沙门氏菌；此外，该植物乳杆菌具有制备发酵乳的潜力。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZJUF HN9及其 应用。
背景技术
植物乳杆菌是一种常见的乳酸菌，广泛存在于发酵食品中，如酸面团、泡菜、酸乳、葡 萄酒等，因此其在食品领域应用广泛。植物乳杆菌与其他益生乳杆菌一样，具有降低胆固醇、 调节免疫以及维持健康肠道菌群等功能(Seddik et al.,2017)。
益生菌发挥益生作用的前提是顺利通过胃的酸性环境以及十二指肠高胆盐环境，以活菌 的状态到达小肠和大肠，进而发挥微生态调整的功能(Hood&Zottola,1988)。而肠道是乳酸菌 最终定值部位，正常生理情况下胆盐的残留量约为0.05％-2.0％(Ruiz etal.,2013)。因此在益生 菌筛选工作中，对胆盐的耐受是益生菌必备的生理特征。
胆盐是肝细胞分泌的胆汁酸分别与钠或钾结合形成的盐类，如甘氨胆酸钠、牛磺胆酸钠 等。胆盐是胆汁的主要成分之一，在人体中可以促进脂肪的消化和吸收、促进胆固醇代谢、 激活胰酶等。胆盐是一种阴离子表面活性剂，对细胞膜的磷脂双分子层有很强的破坏作用， 改变细胞的通透性，从而造成细胞损害或者死亡(Begley et al.,2005)。
现有研究表明，从生境中筛选得到的野生型乳酸菌，绝大多数对胆盐的耐受性能较差， 从胃肠道或阴道中筛选得到的乳酸菌的耐受能力相对较好。从传统发酵食品中筛选得到的对 胆盐耐受能力较好的，有发酵乳杆菌(Bao et al.,2010)、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌(Guo et al., 2009)，耐受较高浓度胆盐的植物乳杆菌仍未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZJUF HN9，该植物乳杆 菌具有优异的耐受高含量胆盐的能力，其耐受胆盐浓度达到0.3％-1.8％，可以确保其在肠道 中的生存、繁殖，为提高益生菌胆盐耐受性提供研究基础。
本发明从北方做馒头用的传统发酵剂酸面团中分离筛选得到一菌株HN9，经16SrRNA 基因比对，鉴定该菌株为植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌ZJUF HN9(LactobacillusplantarumZJUF HN9)。植物乳杆菌ZJUF HN9的16S rRNA的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。将植物乳杆菌ZJUF HN9于2017年6月16日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国， 武汉，武汉大学)，保藏号为：CCTCC NO:M 2017341。
体外实验证明，植物乳杆菌ZJUF HN9具有耐受胃肠道转运液的能力，在模拟人工胃肠 道环境中具有很高的生存率，而且能耐受较高浓度(1.8％)的胆盐，有利于其在胃肠道中存活 或繁殖。植物乳杆菌ZJUF HN9自凝率24小时达到84％，能够选择性粘附革兰氏阴性菌(特 指大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌)，其在肠道中与致病菌凝集，并顺利排出体外，有利于肠道健 康。植物乳杆菌ZJUF HN9能够显著抑制胃肠道致病菌的繁殖，如大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏 菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌。因此，植物乳杆菌ZJUF HN9可用于预防或调节胃肠道菌 群失衡。
本发明的另一个目的是提供植物乳杆菌ZJUF HN9在制备抑制胃肠道致病菌的药物或食 品中的应用。
作为优选，所述胃肠道致病菌为大肠杆菌或鼠伤寒沙门氏菌。
作为优选，所述药物由植物乳杆菌ZJUF HN9菌剂与在药学上可接受的载体组成。
所述植物乳杆菌ZJUF HN9菌剂为将含有所述植物乳杆菌ZJUF HN9的菌液通过冷冻干 燥制得的粉剂，其中含有＞1011CFU/g的活性植物乳杆菌ZJUF HN9。
作为优选，所述药物的剂型为颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液剂型。
本发明的另一个目的是提供植物乳杆菌ZJUF HN9在生产发酵乳制品中的应用。所述植 物乳杆菌ZJUF HN9具有发酵乳的潜力，作为发酵剂添加到脱脂乳中，24h发酵过程中，可 以降低pH值到4.3；增加TTA值到108；显著增加发酵乳中蛋白水解程度，丝氨酸含量可达到22mg/mL；发酵过程和4℃保存过程中能保持较高活菌率。
优选地，植物乳杆菌ZJUF HN9按照1.5-2×107cfu/mL添加到经灭菌处理的脱脂乳培养基 (脱脂乳11.5％，葡萄糖0.75％，蔗糖5％(w/v))中，37℃条件下发酵24h。
本发明具备的有益效果：
本发明提供的植物乳杆菌ZJUF HN9具有耐受高含量胆盐的能力，有利于其在胃肠道中 存活和繁殖；在胃肠道环境中具有较高生存率、较强的胃肠粘附力，能显著抑制胃肠道致病 菌的繁殖，尤其是鼠伤寒沙门氏菌；此外，该植物乳杆菌具有制备发酵乳的潜力。
附图说明
图1为Lactobacillus plantarum ZJUF HN9在模拟人工胃液中的耐受。
图2为Lactobacillus plantarum ZJUF HN9在模拟人工胃肠液转运中的耐受。
图3为Lactobacillus plantarum ZJUF HN9自凝集特性。
图4为Lactobacillus plantarum ZJUF HN9发酵乳24小时内pH变化。
图5为Lactobacillus plantarum ZJUF HN9发酵乳4℃放置2周内pH变化。
图6为Lactobacillus plantarum ZJUF HN9发酵乳24小时内TTA变化。
图7为Lactobacillus plantarum ZJUF HN9发酵乳4℃放置2周内TTA变化。
图8为Lactobacillus plantarum ZJUF HN9发酵乳24小时内丝氨酸浓度变化情况。
图9为Lactobacillus plantarum ZJUF HN9发酵乳4℃放置2周内丝氨酸浓度变化情况。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
1、菌株的筛选及分离
材料：酸面团，北方做馒头用的传统发酵剂，本发明采用来自河南的样品。
称取5g酸面团加入到45mL 0.85％的灭菌生理盐水中，振荡制成悬液，进行系列梯度稀 释，稀释后取10-5、10-6、10-7三个梯度涂布于MRS培养基上，每个梯度做三个平行。将涂布后的平板放入37℃厌氧培养箱中培养24-48h。挑选差异明显的菌落进行MRS培养基上划线分离，将平板放入37℃厌氧培养箱中培养24-48h。连续划线3-5次后，取一滴现配的5％的过氧化氢滴于载玻片上，挑取固体培养基上单菌落接入5％的过氧化氢液滴中并混匀，产生 气泡为过氧化氢酶试验阳性，未产生气泡为过氧化氢酶试验阴性，过氧化氢酶试验阴性菌株 为疑似益生菌株。
将筛选得到的疑似益生菌株分别以1％接种量接入MRS-THIO液体培养基(MRS中添加 0.2％的巯基乙酸钠)和含0.3％(w/v)的猪胆盐的MRS-THIO培养基中上述处理放置在37℃厌氧 培养箱中培养24h，取样在620nm下测定吸光值，计算24h的OD值差值，检测菌株的生长 能力。
将上述筛选得到的疑似益生菌株以1％接种量接种到pH3.0的MRS培养基中，37℃厌氧 培养箱中培养24h，取样在600nm下测定吸光值，计算24h的OD值差值，检测菌株的生长能力，筛选得到了HN9。
2、菌株的鉴定
将HN9进行革兰氏染色，并进行了16S rRNA基因菌种鉴定，此鉴定送样上海派森诺生 物有限公司进行，经过16S rRNA基因比对，HN9为一株植物乳杆菌，命名为Lactobacillus plantarum ZJUF HN9。将植物乳杆菌ZJUF HN9于2017年6月16日保藏于中国典型培养物 保藏中心(地址：中国，武汉，武汉大学)，保藏号为：CCTCC NO:M 2017341。
3、最高胆盐浓度耐受性实验
配制含不同胆盐浓度(0.3％、0.4％、0.6％、0.8％、1.0％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％)的 MRS液体培养基，以不加胆盐的培养基作为对照，按1％的接种量接入培养基中，37℃厌氧 培养24h，在0h和24h时测定620nm下测定吸光值，计算差值。培养基调整pH值为7.0。
OD值差值>0说明在此胆盐浓度下Lactobacillus plantarum ZJUF HN9可以生长，下表1 所示，在0.3-1.8％的胆盐浓度下，Lactobacillus plantarum ZJUF HN9均可以生长，说明其可 以耐受0.3-1.8％的胆盐。
表1 Lactobacillus plantarum ZJUF HN9对不同胆盐耐受情况
与未添加胆盐的培养基比较，HN9在0.3％的胆盐的培养基中的生长状况与未添加胆盐的 培养基的生长状况基本相同(相对百分比均在96％以上)，说明此菌株HN9在0.3％胆盐浓度下 可以正常生长。人体胃肠道中肠液胆盐浓度一般在0.3％浮动，此性能可以较好得维持菌株在 肠液中的活力。
虽然随着浓度的增加，HN9的OD值增加低于未添加胆盐的，但OD值24h的增加也都在1.000以上，说明HN9具有良好的生长能力。除了胆盐浓度为0.6％时，在其余浓度下的HN9生长的相对百分比均在85％以上，确定了菌株HN9在较高浓度胆盐下的耐受能力，显 示了良好的生长能力。
4、模拟人工胃肠液耐受性
人工胃液：NaCl 0.2g/100mL，胃蛋白酶(pepsin)0.35g/100mL，用1mol/L HCl调整pH为 2.0，2.5，3.0，4.0，过滤除菌备用(0.22um膜)。
取0.5mL的供试菌液加入到4.5mL的人工胃液中，震荡10s后放入37℃厌氧培养，在处 理0h、1h、2h、3h取样，测活菌数(total viable counts)。
人工肠液：NaHCO3 1.1g/100mL，NaCl 0.2g/100mL，胰蛋白酶(trypsin)0.1g/100mL，猪胆 盐1.8g/100mL，调整pH值为8.0，过滤除菌备用。
取0.5mL的上述3h人工胃液反应液加入到4.5mL的人工肠液中，震荡10s后放入37℃ 厌氧培养，在处理0h、3h、8h、24h取样，测活菌数(total viable counts)。
N0：处理前的活菌数；
N1：用PBS或人工胃肠液处理过的活菌数。
结果如下图1所示，Lactobacillus plantarum ZJUF HN9可耐受pH4.0和3.0胃液，3h处 理结束时，能保持99％的存活率；对pH2.5的胃液，处理3h后，能保持60％的存活率；pH2.0 的胃液处理能使其存活率将至20％，几乎不能存活。
如图2所示，将菌株从胃液转运至肠液中处理24h，耐受不同pH胃液的HN9均有不同程度的活菌损失，除pH4.0胃液转运外，pH3.0、2.5和2.0胃液转运后，24h均有15％左右的活菌损失。
总体讲，HN9能较好的耐受pH4.0和3.0的胃肠液转运，对pH2.5的胃肠液转运有一定 的耐受能力。
5、黏附能力测定(凝集特性)
取108cfu/mL的菌悬液4ml加入无菌离心管中，在4、8、18和24h静置状态下取上层清 液150uL加入到96孔板中，测定OD600nm值。
A0：0h时样品的OD值；At：不同时间段样品的OD值。
相同体积(500uL)的植物乳杆菌和病原菌混合，放置在室温下(勿摇动)，在4h静置状态下 取上层清液150uL加入到96孔板中，测定OD600nm值。
Apat：病原菌0h时OD值；
Aprobio：植物乳杆菌0h时OD值；
Amix：病原菌和植物乳杆菌混匀4h的OD值。
如图3所示，植物乳杆菌ZJUFHN9的自凝集率随着时间的增加逐步上升，从4h的36.65％ 升至24h的83.92％。
与肠道致病菌之间的交互凝集作用如下表2所示。
表2 Lactobacillus plantarumZJUF HN9与不同病原菌交互凝集率
HN9对革兰氏阴性菌(大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌)有相对较高的凝集特性，对革兰氏阳 性菌(金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌)的交互凝集作用较弱，仅有23％和15％的凝集率。
植物乳杆菌ZJUF HN9的选择性交互凝集作用能使其在肠道中与革兰氏阴性致病菌(特指 大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌)较好的凝集，排出体外，有利于肠道健康。
6、抑菌特性研究
使用琼脂孔扩散法(Well-diffiision Agar Assay)测定菌株的抑菌能力。取20mL灭菌冷却45℃ 的TSA培养基与200uL致病菌液(1-2*107cfu/mL)—起倒入平板混匀，待凝固后于平板上打孔， 孔径为7mm。将已制备好的无菌上清液(将培养好的菌液离心，取上清液用0.22um的微孔滤 膜过滤除菌，置于-80℃备用)100uL分别加入孔中，以等体积已灭菌的PBS为对照，置于4℃ 下扩散12h，取出放入37℃培养24h。测量其抑菌圈直径。
表3 Lactobacillus plantarum ZJUF HN9抑制致病菌能力
由上表可知，Lactobacillus plantarum ZJUF HN9对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色 葡萄球菌和李斯特菌4种常见致病菌具有一定的抑制能力，其中对鼠伤寒沙门氏菌的抑制能 力最强。
7、Lactobacillus plantarum ZJUF HN9发酵乳能力
活化后的HN9和LGG(鼠李糖乳杆菌，对照菌株)调整菌浓度并用生理盐水进行清洗2次， 加入到200mL的脱脂乳培养基(脱脂乳11.5％，葡萄糖0.75％，蔗糖5％(w/v))中，使最终菌浓 度为1.5-2*107cfu/mL脱脂乳，每种处理做3个平行，放置在37℃中培养，并于0、6、12、 18、24h取样测定发酵指标，随后放置在4℃冰箱中，于1周、2周后取样测定，结果参见图4-9和表4。
如图4、5所示，Lactobacillus plantarum ZJUF HN9发酵乳过程中，使pH从6.6降低到 4.3左右，且在保存过程中抑制维持4.3左右。与阳性对照菌株LGG相比，Lactobacillus plantarum ZJUF HN9降低pH相对较缓慢，保存过程维持在4.3左右。
如图6、7所示，发酵乳过程中TTA从18增加到108。与阳性对照菌株LGG相比，Lactobacillus plantarum ZJUF HN9前期增加比TTA缓慢，但18h后增速比LGG快，最后均维持在112左右。
如图8、9所示，发酵乳过程中，Lactobacillus plantarum ZJUF HN9具有相对LGG较高 的蛋白水解能力。从整个发酵周期及保存周期来看，Lactobacillus plantarum ZJUFHN9分解 得到的丝氨酸含量均显著高于LGG(p<0.05)，说明此Lactobacillus plantarumZJUF HN9具 有较高的分解蛋白的能力。
表4 Lactobacillus plantarum ZJUF HN9发酵乳菌落分析
由上表可知，37℃发酵24h结束时，Lactobacillus plantarum ZJUF HN9活菌数显著低于 LGG，在后期4℃保存中，虽然两种菌的活菌都有所下降，但Lactobacillusplantarum ZJUF HN9 活菌数仍低于LGG。
序列表
<110> 浙江大学，浙江全植生物科技有限公司
<120> 植物乳杆菌ZJUFHN9及其应用
<141> 2017-12-22
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1490
<212> DNA
<213> Lactobacillus plantarum ZJUFHN9
<400> 1
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Claims (5)
1.一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZJUF HN9，该植物乳杆菌的保藏号为CCTCC NO:M 2017341。
2.如权利要求1所述的植物乳杆菌ZJUF HN9在制备抑制胃肠道致病菌的药物或食品中的应用，其特征在于，所述胃肠道致病菌为鼠伤寒沙门氏菌或大肠杆菌。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物由植物乳杆菌ZJUF HN9菌剂与在药学上可接受的载体组成。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述植物乳杆菌ZJUF HN9菌剂为将含有所述植物乳杆菌ZJUF HN9的菌液通过冷冻干燥制得的粉剂，其中含有＞1011CFU/g的活性植物乳杆菌ZJUF HN9。
5.如权利要求1所述的植物乳杆菌ZJUF HN9在生产发酵乳制品中的应用。
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