CN116396894A - 一株具有抑制多种常见致病菌生长作用的植物乳植杆菌 - Google Patents
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Abstract
本发明是一株具有抑制多种常见致病菌生长作用的植物乳植杆菌，所述植物乳植杆菌为植物乳植杆菌TG008，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：【CCTCC M 20221458】，保藏时间为【2022年09月20日】。本发明具有显著的抑制抑制多种常见致病菌生长作用。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，特别涉及一株具有抑制多种常见致病菌生长作用的植物乳植杆菌。
背景技术
人体肠道中肠道菌群的平衡对人体的健康发挥着重大的作用。若有害菌群的数量超出菌群的动态平衡，将会对人体的不同器官发挥作用，进而人体产生各种各样的疾病，危害人体的健康。微生物不同种之间具有共处、互生、共生、拮抗、竞争、寄生和捕食的关系。通过益生菌来抑制或杀灭有害病菌对人体的健康将产生巨大的作用，且这种方式没有毒副作用，是一项具有良好应用前景的方式。在不久的将来会出现越来越多的益生菌药物上市。
乳酸菌是人和动物肠道正常菌群中的优势菌，具有许多对人和动物健康有益的生理功能，常应用于发酵食品中，还有抑菌的作用。抑菌机理主要表现在以下几个方面：(1)是乳酸菌产生乙酸、乳酸和丙酸等有机酸，使环境保持酸性，抑制不耐酸有害菌的生长繁殖；(2)是乳酸菌产生抗生素或细菌素的蛋白质类物质，对有害菌有抑制或杀灭功能；(3)是乳酸菌产生的过氧化氢能激活过氧化氢酶—硫氰酸系统，抑制或杀灭有害菌；(4)是乳酸菌通过拮抗作用与有害菌竞争营养物质，从而达到抑菌作用
植物乳杆菌菌是一种具有较强的加工性能，且已经广泛应用于食品生产中，并且其在调节人体免疫系统，对肠黏膜具有很强的黏附能力和优异的抗胃肠道消化液耐受能力，能够在人体肠道中定植并繁殖，可改善肠道菌群分布，拮抗有害菌定植，避免罹患肠道疾病等调节人体肠道环境，并抑制多种致病菌生长的优越性能。
然而，目前并无植物乳植杆菌具有抑制多种常见致病菌生长作用的报道。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一株具有抑制多种常见致病菌生长作用的植物乳植杆菌，该植物乳植杆菌具有抑制多种常见致病菌生长的作用，在体外显著抑制多种常见致病菌生长，特别是对脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、福氏志贺菌(Shigella flexneri)及鲍氏志贺菌(Shigella boydii)的生长具有抑制作用。
为达到此目的，本发明采用如下技术方案：
一株具有抑制多种常见致病菌生长作用的植物乳植杆菌植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)，所述植物乳植杆菌为植物乳植杆菌TG008，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：【CCTCC NO：M 20221458】，保藏时间为【2022年09月20日】。
所述植物乳植杆菌TG008的基因序列为：
CCGGGGGGGGGCGTGCCTATACATGCAAGTCGAACGAACTCTGGTATTGATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGTTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAAATCTAAGAGATTAGACGTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAACTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTAGGAACCAGCCGCCTAAGGTGAACCCAAA。
上述的一株植物乳杆菌TG008是从国内健康人体粪便样中筛选获得，革兰氏阳性，不生芽孢，表面菌落菌落直径3mm左右、凸起、呈圆形、表面光滑、细密和色白。最适生长环境条件为37℃、pH 7和厌氧环境。
上述的一株植物乳杆菌TG008具有显著的抑制抑制多种常见致病菌生长作用。
所述多种常见致病菌包括：脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、福氏志贺菌(Shigella flexneri)及鲍氏志贺菌(Shigella boydii)。
脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)---是一种条件致病菌，主要为内源性感染，可引起女性生殖系统、胸腔和颅内感染。
产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)---产气夹膜梭菌分成A、B、C、D、E5个毒素型。5型中对人致病的主要是A型和C型，A型最常见，引起气性坏疽和胃肠炎型食物中毒；C型能引起坏死性肠炎。
肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)---可以引起的急性肺部炎症，多见于老年、营养不良、慢性酒精中毒、慢性支气管-肺疾病及全身衰竭的患者。
福氏志贺菌(Shigella flexneri)导致痢疾等胃肠道疾病，并发症通常为溶血性尿毒症，表现为血便；和肾衰竭(通常由于病原菌的毒素通过血液循环流入肾内)；中枢神经系统失调。
鲍氏志贺菌(Shigella boydii)---主要引起人类细菌性痢疾。近年来因为其耐药性逐年上升。
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
(1)本发明的植物乳杆菌TG008从国内健康人体粪便样本中筛选获得，具有良好的应用安全性和功能适应性。
(2)本发明的植物乳杆菌TG008具有具有抑制多种常见致病菌生长作用。可以在体外显著抑制多种常见致病菌生长，包括：脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、肺炎克雷伯(Klebsiella pneumoniae)、福氏志贺菌(Shigella flexneri)及鲍氏志贺菌(Shigella boydii)。
(3)本发明所述的具有抑制具有抑制多种常见致病菌的植物乳杆菌命名为植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)TG008，该菌株已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：【CCTCC NO：M 20221458】，保藏时间为【2022年09月20日】。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明实施例1中植物乳杆菌TG008的平板表型。
图2为本发明实施例1中植物乳杆菌TG008的革兰氏染色结果。
图3为本发明实施例1中植物乳杆菌TG008的系统发育树。
图4为本发明实施例2中植物乳杆菌TG008的生长曲线。
图5(1)为本发明实施例2中植物乳杆菌TG008的最适温度曲线，图5(2)为本发明实施例2中植物乳杆菌TG008的最适pH曲线。
图6为本发明实施例3中植物乳杆菌TG008对脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)的牛津杯抑菌结果。
图7为本发明实施例4中植物乳杆菌TG008对产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)的牛津杯抑菌结果。
图8为本发明实施例5中植物乳杆菌TG008对肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)的牛津杯抑菌结果。
图9为本发明实施例6植物乳杆菌TG008对福氏志贺菌(Shigella flexneri)的牛津杯抑菌结果。
图10为本发明实施例7植物乳杆菌TG008对鲍氏志贺菌(Shigella boydii)的牛津杯抑菌结果。
图11为本发明实施例8植物乳杆菌TG008对HCT-8细胞的抑制作用结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明为一株具有抑制多种常见致病菌生长作用的植物乳植杆菌植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)，所述植物乳植杆菌为植物乳植杆菌TG008，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：【CCTCC NO：M 20221458】，保藏时间为【2022年09月20日】。
所述植物乳植杆菌TG008的基因序列为：
CCGGGGGGGGGCGTGCCTATACATGCAAGTCGAACGAACTCTGGTATTG
ATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAG
TAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACA
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CCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTAGGAACCAGCCGCCTAAGGTGAACCCAAA。
上述的一株植物乳杆菌是从国内健康人体粪便样中筛选获得，革兰氏阳性，不生芽孢，表面菌落菌落直径3mm左右、凸起、呈圆形、表面光滑、细密和色白。最适生长环境条件为37℃、pH 7和厌氧环境。
上述的一株植物乳杆菌TG008具有显著的抑制抑制多种常见致病菌生长作用。
实施例1：植物乳杆菌TG008的筛选和鉴定。
以来源于福建厦门地区的健康人体粪便为样本，将样本接种于人体肠道菌群血清培养瓶中富集培养，于1、3、6、9天吸取富集培养液，使用无菌生理盐水梯度稀释涂布BHI琼脂平板(BHI培养基配方：幼牛脑(提取浸出粉)200g/L；牛心(提取浸出粉)250g/L；葡萄糖2.0g/L；氯化钠5g/L；蛋白胨10g/L；磷酸氢二钠2.5g/L；最终pH 5.7±0.2，115℃灭菌25min)，于37℃厌氧培养箱中培养48h后，挑取单菌落在BHI琼脂平板上进行3轮划线纯化。将纯化后的单菌落接种至BHI液体培养基中，于37℃，200rpm摇床培养24-48h后，利用细菌基因组DNA快速抽提试剂盒(T5 Direct PCR Kit)提取基因组DNA。
以提取获得的基因组DNA为模板，使用16S rDNA全长引物对，27F：5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3'；1492R：5’TACGGCTACCTTGTTACGACTT 3'，进行PCR扩增，将扩增获得的PCR产物送样测序，将测序获得的序列经NCBI网站Blast比对，结果显示该菌为一株植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)，其16S rDNA序列如SEQ ID No.1所示，且该菌株的平板形态如图1所示，菌落表面菌落直径3mm左右、凸起、呈圆形、表面光滑、细密和色白。
该菌株经革兰氏染色后呈现蓝紫色，表明该菌株为革兰氏阳性菌。革兰氏染色结果如图2所示。
该菌株与市面上已有的植物乳杆菌的亲缘关系如图3系统发育树图所示，该株植物乳杆菌命名为植物乳杆菌TG008。
实施例2：植物乳杆菌TG008的生理特征
生长曲线测定方法：菌种活化：将植物乳杆菌TG008从-80℃冰箱取出，在BHI琼脂平板上划线活化，于厌氧培养箱中37℃培养至生长出单菌落。接种子液：利用一次性接种环(1ul)蘸取BHI琼脂板上的单菌落，接入BHI液体培养基中，摇晃均匀，放入37℃，200rpm摇床培养至OD600达到0.6-1.0的范围。接培养液：按照1-5％的接种量，接入不同时间点的BHI液体培养基中。接种完成后放入37℃，200rpm摇床进行培养，每隔2h取出一组进行测定OD600，直到完成24h实验组的测定。植物乳杆菌TG008的生长曲线如图4所示。
最适温度测定：菌种活化：将植物乳杆菌TG008从-80℃冰箱取出，在BHI琼脂平板上划线活化，于37℃厌氧培养箱培养至生长出单菌落。接种子液：利用接种环蘸取BHI琼脂上的单菌落，接入BHI液体培养基中，摇晃均匀，放入37℃，200rpm摇床培养至OD600达到0.6-1.0的范围。接培养液：按照1-5％的接种量，接入BHI液体培养基中，放入不同温度梯度(27、32、37、42、47℃)摇床，进行厌氧培养，并于合适时间点取出测定OD600，植物乳杆菌TG008的最适温度如图5(1)所示。
最适pH测定：菌种活化：将植物乳杆菌TG008从-80℃冰箱取出，在BHI琼脂平板上划线活化，于37℃厌氧培养箱培养至生长出单菌落。接种子液：利用接种环蘸取BHI琼脂上的单菌落，接入BHI液体培养基中，摇晃均匀，放入37℃，200rpm摇床培养至OD600达到0.6-1.0的范围。接培养液：按照1-5％的接种量，接入不同pH梯度(pH5、6、7、8、9)的BHI液体培养基中，放入摇床，37℃，200rpm厌氧培养，并于合适时间点取出测定OD600，植物乳杆菌TG008的最适pH如图5(2)所示。
实施例3：植物乳杆菌TG008对脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)的牛津杯抑制结果。
活化：将植物乳杆菌TG008和脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)从-80℃冰箱取出，在BHI琼脂平板上划线活化，于37℃厌氧培养箱培养至生长出单菌落。发酵培养：将BHI琼脂平板上生长的植物乳杆菌TG008和脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)单菌落分别接种至BHI发酵培养基中，37℃，200rpm/min摇床培养适宜时间。牛津杯实验：使用马克笔于平板背面标记阳性对照(抗生素)、阴性对照(培养基)和植物乳杆菌，并在对应位置放置牛津杯。将致病菌与融化的固体培养基(琼脂浓度应为1.4％)混合，致病菌占比为1％，最终培养基中致病菌的浓度为106cfu/ml，在15ml离心管中混合均匀后倒平板，每个平板的菌量为20ml。待平板充分晾干后，使用镊子拔出牛津杯，形成孔洞。向每个孔洞中分别加入对应的试剂，包括阳性组抗生素(如200μl 50mg/ml Kan)，阴性组(如200μl BHI培养基)，实验组(如200μl植物乳杆菌的菌液或菌体离心上清液)。离心封口膜将平板密封以防止水汽蒸发，放置于37℃严格厌氧箱正置培养，逐天观察平板致病菌生长情况和抑菌圈大小。
植物乳杆菌TG008对脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)具有明显的抑制作用，但是，欸有抗生素的抑制效果强。如图6所示。
实施例4：植物乳杆菌TG008对产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)的牛津杯抑菌结果。
活化：将植物乳杆菌TG008和产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)从-80℃冰箱取出，在BHI琼脂平板上划线活化，于37℃厌氧培养箱培养至生长出单菌落。发酵培养：将BHI琼脂平板上生长的植物乳杆菌TG008和产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)单菌落分别接种至BHI发酵培养基中，37℃，200rpm/min摇床培养适宜时间。牛津杯实验：使用马克笔于平板背面标记阳性对照(抗生素)、阴性对照(培养基)和植物乳杆菌，并在对应位置放置牛津杯。将致病菌与融化的固体培养基(琼脂浓度应为1.4％)混合，致病菌占比为1％，最终培养基中致病菌的浓度为106cfu/ml，在15ml离心管中混合均匀后倒平板，每个平板的菌量为20ml。待平板充分晾干后，使用镊子拔出牛津杯，形成孔洞。向每个孔洞中分别加入对应的试剂，包括阳性组抗生素(如200μl 50mg/ml Kan)，阴性组(如200μl BHI培养基)，实验组(如200μl植物乳杆菌的菌液或菌体离心上清液)。离心封口膜将平板密封以防止水汽蒸发，放置于37℃严格厌氧箱正置培养，逐天观察平板致病菌生长情况和抑菌圈大小。
植物乳杆菌TG008对产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)具有明显的抑制作用，比抗生素的抑制效果强1倍左右。如图7所示。
实施例5：植物乳杆菌TG008对肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)的牛津杯抑菌结果。
活化：将植物乳杆菌TG008和肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)从-80℃冰箱取出，在BHI琼脂平板上划线活化，于37℃厌氧培养箱培养至生长出单菌落。发酵培养：将BHI琼脂平板上生长的植物乳杆菌TG008和肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)单菌落分别接种至BHI发酵培养基中，37℃，200rpm/min摇床培养适宜时间。牛津杯实验：使用马克笔于平板背面标记阳性对照(抗生素)、阴性对照(培养基)和植物乳杆菌，并在对应位置放置牛津杯。将致病菌与融化的固体培养基(琼脂浓度应为1.4％)混合，致病菌占比为1％，最终培养基中致病菌的浓度为106cfu/ml，在15ml离心管中混合均匀后倒平板，每个平板的菌量为20ml。待平板充分晾干后，使用镊子拔出牛津杯，形成孔洞。向每个孔洞中分别加入对应的试剂，包括阳性组抗生素(如200μl 50mg/ml Kan)，阴性组(如200μl BHI培养基)，实验组(如200μl植物乳杆菌的菌液或菌体离心上清液)。离心封口膜将平板密封以防止水汽蒸发，放置于37℃严格厌氧箱正置培养，逐天观察平板致病菌生长情况和抑菌圈大小。
植物乳杆菌TG008对肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)具有明显的抑制作用，与抗生素的抑制效果基本相同。如图8所示。
实施例6：植物乳杆菌TG008对福氏志贺菌(Shigella flexneri)的牛津杯抑菌结果。
活化：将植物乳杆菌TG008和福氏志贺菌(Shigella flexneri)从-80℃冰箱取出，在BHI琼脂平板上划线活化，于37℃厌氧培养箱培养至生长出单菌落。发酵培养：将BHI琼脂平板上生长的植物乳杆菌TG008和福氏志贺菌(Shigella flexneri)单菌落分别接种至BHI发酵培养基中，37℃，200rpm/min摇床培养适宜时间。牛津杯实验：使用马克笔于平板背面标记阳性对照(抗生素)、阴性对照(培养基)和植物乳杆菌，并在对应位置放置牛津杯。将致病菌与融化的固体培养基(琼脂浓度应为1.4％)混合，致病菌占比为1％，最终培养基中致病菌的浓度为106cfu/ml，在15ml离心管中混合均匀后倒平板，每个平板的菌量为20ml。待平板充分晾干后，使用镊子拔出牛津杯，形成孔洞。向每个孔洞中分别加入对应的试剂，包括阳性组抗生素(如200μl 50mg/ml Kan)，阴性组(如200μl BHI培养基)，实验组(如200μl植物乳杆菌的菌液或菌体离心上清液)。离心封口膜将平板密封以防止水汽蒸发，放置于37℃严格厌氧箱正置培养，逐天观察平板致病菌生长情况和抑菌圈大小。
植物乳杆菌TG008对福氏志贺菌(Shigella flexneri)具有明显的抑制作用，比抗生素的抑制效果强。如图9所示。
实施例7：植物乳杆菌TG008对鲍氏志贺菌(Shigella boydii)的牛津杯抑菌结果。
活化：将植物乳杆菌TG008和鲍氏志贺菌(Shigella boydii)从-80℃冰箱取出，在BHI琼脂平板上划线活化，于37℃厌氧培养箱培养至生长出单菌落。发酵培养：将BHI琼脂平板上生长的植物乳杆菌TG008和鲍氏志贺菌(Shigella boydii)单菌落分别接种至BHI发酵培养基中，37℃，200rpm/min摇床培养适宜时间。牛津杯实验：使用马克笔于平板背面标记阳性对照(抗生素)、阴性对照(培养基)和植物乳杆菌，并在对应位置放置牛津杯。将致病菌与融化的固体培养基(琼脂浓度应为1.4％)混合，致病菌占比为1％，最终培养基中致病菌的浓度为106cfu/ml，在15ml离心管中混合均匀后倒平板，每个平板的菌量为20ml。待平板充分晾干后，使用镊子拔出牛津杯，形成孔洞。向每个孔洞中分别加入对应的试剂，包括阳性组抗生素(如200μl 50mg/ml Kan)，阴性组(如200μl BHI培养基)，实验组(如200μl植物乳杆菌的菌液或菌体离心上清液)。离心封口膜将平板密封以防止水汽蒸发，放置于37℃严格厌氧箱正置培养，逐天观察平板致病菌生长情况和抑菌圈大小。
植物乳杆菌TG008对鲍氏志贺菌(Shigella boydii)具有明显的抑制作用,比抗生素的抑制效果要强1倍左右。如图10所示。
实施例8：植物乳杆菌TG008代谢上清液对结直肠癌细胞HCT-8的生长抑制。
菌株培养：将培养的植物乳杆菌TG008，取500μl接种于,10mL BHI液体培养基中，置于厌氧箱中培养24-48h后，测OD600值，取OD600值在1.5-2.5左右的1mL菌株混悬液进行离心(4℃，5000rpm,8min)后，小心将上清液转移至无菌的EP管中；上清液过滤：将离心的上清液和BHI通过0.22μm除菌过滤器转移到新的EP管中；按0、0.3％、0.6％、1.2％、2.5％、5％、10％、20％、30％和40％的比例用细胞培养基稀释细菌上清液/BHI液体培养基，PBS缓冲液稀释FBS-1640培养基，配好，备用。观察：镜下观察HCT-8细胞生长状态，细胞状态良好后，吸掉旧培养液，用PBS或平衡盐溶液洗涤细胞一至二次；向T25培养皿中加入胰酶溶液2mL，37℃水浴锅作用1-2min，于倒置显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆粒状时，轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落，加入适量含血清的新鲜培养基终止胰酶作用，离心后再吸掉上清液；制备细胞悬液：加入适量的新鲜培养基，用移液管上下吸放数次以打散细胞团块，混合均匀；接种细胞：接种至96孔板中，铺板时调整待测细胞密度调至2×104个/孔，边缘孔用无菌PBS填充(保湿)，每个浓度点做3个复孔；接种后置于37℃，5％CO2培养箱中培养6小时使细胞贴壁，在96孔板中将旧的培养基弃掉，加入150uL待测菌株上清液；将培养板在培养箱中孵育48小时；再向板中每孔加入10μL的CCK8溶液(注意不要产生气泡)；将培养板置于37℃、5％ CO2培养箱中孵育2h；用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
植物乳杆菌TG008菌液上清对结直肠癌细胞HCT-8生长的抑制作用如图11所示，植物乳杆菌TG008菌液上清液对结直肠癌细胞HCT-8细胞具有抑制作用，随着菌液上清浓度越高，对结直肠癌细胞HCT-8的生长抑制效果更强。在菌液上清添加量为40％时，对结直肠癌细胞HCT细胞的生长抑制率为50％左右。如图11所示。
利用植物乳杆菌的抑菌作用，可以对部分的人体致病菌产生作用，因为抗生素不光对致病菌有作用也对人体的有益菌也有杀灭作用，抗生素的使用破坏人体的菌群平衡，危害人体的健康；植物乳杆菌TG008的上清液对结直肠癌细胞HCT-8具有抑制作用。该菌株具有抑制人体部分致病菌生长又可作为治疗结直肠癌的微生态药物潜在菌株资源。使用益生菌进行治疗相关疾病可以减少抗生素的使用，避免产生耐药性致病菌的产生、提高人们的健康指数和减少人们的健康费用的支出。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一株具有抑制多种常见致病菌生长作用的植物乳植杆菌，其特征在于所述植物乳植杆菌为植物乳植杆菌TG008，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：【CCTCC NO：M20221458】，保藏时间为【2022年09月20日】。
2.根据权利要求1所述的具有抑制多种常见致病菌生长作用的植物乳植杆菌，其特征在于所述植物乳植杆菌TG008的基因序列为：
CCGGGGGGGGGCGTGCCTATACATGCAAGTCGAACGAACTCTGGTATTGATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGTTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAAATCTAAGAGATTAGACGTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAACTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTAGGAACCAGCCGCCTAAGGTGAACCCAAA。
3.根据权利要求2所述的具有抑制多种常见致病菌生长作用的植物乳植杆菌，其特征在于上述的一株植物乳杆菌TG008是从国内健康人体粪便样中筛选获得，革兰氏阳性，不生芽孢，表面菌落菌落直径3mm左右、凸起、呈圆形、表面光滑、细密和色白。
4.根据权利要求1所述的具有抑制多种常见致病菌生长作用的植物乳植杆菌，其特征在于上述的一株植物乳杆菌TG008具有显著的抑制抑制多种常见致病菌生长作用。
5.根据权利要求4所述的具有抑制多种常见致病菌生长作用的植物乳植杆菌，其特征在于所述多种常见致病菌包括：脆弱拟杆菌、产气荚膜梭菌、肺炎克雷伯氏菌、福氏志贺菌及鲍氏志贺菌。
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