CN116019842B

CN116019842B - 嗜酸乳杆菌la85的抑菌新用途及其在制备缓解eiec腹泻的药物方面的用途

Info

Publication number: CN116019842B
Application number: CN202310133073.7A
Authority: CN
Inventors: 方曙光; 左慧玉; 朱明明; 黄琴琴; 朱建国
Original assignee: WeCare Probiotics Co Ltd
Current assignee: WeCare Probiotics Co Ltd
Priority date: 2023-02-20
Filing date: 2023-02-20
Publication date: 2023-08-25
Anticipated expiration: 2043-02-20
Also published as: CN116019842A

Abstract

本发明嗜酸乳杆菌LA85的抑菌新用途及其在制备缓解EIEC腹泻的药物方面的用途属于微生物技术领域。本发明提供保藏编号为CGMCC No.21802的嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）菌株LA85在抑制EIEC、表兄链球菌、艰难梭菌、空肠弯曲菌，和/或，制备缓解EIEC腹泻的药物方面的用途。本发明首次提出嗜酸乳杆菌在抑制EIEC、表兄链球菌、艰难梭菌、空肠弯曲菌方面的新用途，并获得高效的抗菌效果。

Description

嗜酸乳杆菌LA85的抑菌新用途及其在制备缓解EIEC腹泻的药物方面的用途

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及嗜酸乳杆菌LA85的抑菌新用途及其在制备缓解EIEC腹泻的药物方面的用途。

背景技术

腹泻（diarrhea）一般指正常大便习惯的改变，包括排便次数增加和或粪便粘稠度降低，并同时伴有或不伴有发热和呕吐，还可能会造成酸碱平衡紊乱，是多种肠道功能紊乱的共同症状。而且腹泻也可能会引起呕吐、发热和脱水等并发症，如果没能及时的进行干预、纠正和治疗，大概率会对儿童的身体健康造成不良影响，比如儿童营养不良，进而可能会影响生活质量以及儿童生长发育，尤其是对于一些体质敏感的儿童，更不能忽视腹泻对机体的影响。

腹泻最常见的原因是胃肠道感染，包括病毒性、细菌性和寄生虫性肠道感染。大肠杆菌是人类肠道正常菌群中最著名的成员，也是一种胃肠道病原体。大肠杆菌会引起旅行者腹泻、持续性腹泻和婴儿水样腹泻等。而肠道侵袭性大肠杆菌(EIEC)是引起动物肠道疾病的著名食源性病原体，容易造成大规模腹泻，以及食物中毒。但是，目前EIEC引发疫病的治疗方法主要是抗生素治疗，但此法易引起肠道菌群失调、二重感染、抗生素残留、会产生的耐药性等问题，使得该疗法在腹泻的应用中受到限制。

益生菌是公认的肠道功能调节剂，可以恢复肠道上皮细胞成熟的肠道微生物组组成，促进肠道生态系统的有利功能，从而能够有效缓解腹泻症状。嗜酸乳杆菌可以发酵糖产生乳酸，是目前最常使用的益生菌，在功能上与改善健康有关，并可能发挥其对抗肠道有害微生物攻击的功能，一些也可以通过产生一些消化酶、有机酸以及抗菌物质来发挥益生特性。虽然嗜酸乳杆菌已被报道具有缓解腹泻的作用，但未见报道嗜酸乳杆菌具有缓解肠侵袭性大肠杆菌导致的腹泻。

发明内容

基于本领域现有技术存在的上述需求，本发明提供一种嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）菌株缓解腹泻及其应用。

本发明的技术方案如下：

保藏编号为CGMCC No.21802的嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）菌株LA85在抑制EIEC、表兄链球菌、艰难梭菌、空肠弯曲菌，和/或，制备缓解EIEC腹泻的药物方面的用途。

所述EIEC腹泻指，EIEC感染引起的腹泻。

所述缓解EIEC腹泻选自：由降低EIEC腹泻的死亡率、抑制EIEC黏附肠上皮细胞、抑制EIEC的生长、减弱EIEC导致的体重下降、调节EIEC感染的肠道菌群、增加EIEC感染的肠道微生物多样性、提高EIEC感染的机体免疫力组成的组。

所述降低EIEC腹泻的死亡率指EIEC腹泻的死亡率降低至0。

所述调节EIEC感染的肠道菌群指：提升有益菌的含量，降低有害菌的含量。

所述有益菌选自：乳杆菌和/或双歧杆菌；所述有害菌选自：由肠杆菌、肠球菌、产气荚膜梭菌组成的组。

增加EIEC感染的肠道微生物多样性指：EIEC感染的肠道内的香农多样性指数和/或辛普森指数升高。

所述提高EIEC感染的机体免疫力指：降低EIEC感染的结肠组织中的促炎因子的含量、和/或，提高EIEC感染的结肠组织中的降炎因子的含量。

所述促炎因子选自TNF-α和/或IL-6，所述抗炎因子为IL-10。

菌株LA85抑制EIEC的抑菌圈为21-35mm；

优选地，菌株LA85抑制表兄链球菌的抑菌圈为15mm；

优选地，菌株LA85抑制艰难梭菌的抑菌圈为23mm；

优选地，菌株LA85抑制空肠弯曲菌的抑菌圈为14.5mm；

优选地，EIEC或表兄链球菌或艰难梭菌的菌浓度为10⁸CFU/mL；

优选地，菌株LA85的菌数为10⁸CFU。

本发明提供保藏编号为CGMCC No.21802的嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）菌株LA85在缓解EIEC腹泻方面的用途。

本发明发现了嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）菌株LA85在抑制EIEC方面的显著作用，同时基于该抑制作用进一步验证了菌株LA85在缓解EIEC腹泻方面的效果，实验证实，本发明的菌株LA85可有效提升EIEC感染的小鼠肠道内的香农多样性指数和/或辛普森指数，增加其肠道内的微生物多样性，提高有益菌：乳杆菌/双歧杆菌的含量，降低有害菌：肠杆菌、肠球菌、产气荚膜梭菌的含量，通过降低EIEC感染小鼠结肠组织中的促炎因子TNF-α、IL-6的含量、提升降炎因子IL-10的含量来提升EIEC感染小鼠的免疫力；同时，菌株LA85还能抑制EIEC黏附肠上皮细胞、抑制EIEC的生长、减弱EIEC感染导致的体重下降，最重要的是，菌株LA85能使EIEC腹泻小鼠的死亡率从10%降低至0。

同时，本发明还首次提出保藏编号为CGMCC No.21802的嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）菌株LA85在拮抗/抑制表兄链球菌、艰难梭菌、空肠弯曲菌方面的新用途，并取得高效的抗菌效果。

本发明的嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）菌株LA85的保藏信息如下：

菌株名称：LA85；

保藏号：CGMCC No.21802；

分类命名：嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus；

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；

保藏日期：2021年02月01日。

附图说明

图1为本发明实验例4的嗜酸乳杆菌LA85与EIEC共培养的活菌数测定图。

图2为本发明实验例7的嗜酸乳杆菌LA85干预对EIEC感染小鼠体重的影响图。

图3为本发明实验例8的肠道微生物α多样性的香农多样性指数与辛普森指数。

图4为本发明实验例9的小鼠结肠组织细胞因子测定图。

图2-图4中的标记列示如下：CK组代表正常对照组小鼠，MC组代表模型组小鼠，LA85组代表LA85干预组小鼠。

具体实施方式

下面结合具体实施例、实验例来进一步描述本发明的详细内容和技术效果，但并不以此限制本发明的保护范围。

生物材料的来源

肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）ATCC43893的来源是美国典型培养物保藏中心。

保藏编号为CGMCC No.21802的嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）菌株LA85记载于专利202110285880.1中，系申请人实验室保存。申请人承诺自本发明申请日起20年内向公众发放用于验证本发明的技术效果。

本发明的所有实施例提供保藏编号为CGMCC No.21802的嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）菌株LA85在抑制EIEC、表兄链球菌、艰难梭菌、空肠弯曲菌，和/或，制备缓解EIEC腹泻的药物方面的用途。

在具体的实施例中，所述EIEC腹泻指，EIEC感染引起的腹泻。

在更具体的实施例中，所述缓解EIEC腹泻选自：由降低EIEC腹泻的死亡率、抑制EIEC黏附肠上皮细胞、抑制EIEC的生长、减弱EIEC导致的体重下降、调节EIEC感染的肠道菌群、增加EIEC感染的肠道微生物多样性、提高EIEC感染的机体免疫力组成的组。

在一些实施例中，所述降低EIEC腹泻的死亡率指EIEC腹泻的死亡率降低至0。

在具体的实施例中，所述调节EIEC感染的肠道菌群指：提升有益菌的含量，降低有害菌的含量。

在更具体的实施例中，所述有益菌选自：乳杆菌和/或双歧杆菌；所述有害菌选自：由肠杆菌、肠球菌、产气荚膜梭菌组成的组。

在另一些实施例中，增加EIEC感染的肠道微生物多样性指：EIEC感染的肠道内的香农多样性指数和/或辛普森指数升高。

在一些具体的实施例中，所述提高EIEC感染的机体免疫力指：降低EIEC感染的结肠组织中的促炎因子的含量、和/或，提高EIEC感染的结肠组织中的降炎因子的含量。

在另一些实施例中，所述促炎因子选自TNF-α和/或IL-6，所述降炎因子为IL-10。

在具体的实施例中，所述缓解EIEC腹泻的药物以保藏编号为CGMCC No.21802的嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）菌株LA85为药效活性成分。

在进一步的实施例中，所述缓解EIEC腹泻的药物还包括：药用辅料。

在更具体的实施例中，所述药用辅料选自：溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂、反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂等。

根据本发明的内容，出于实际生产应用中的不同需求，再结合药物制备领域的常规技术手段（例如，《制剂技术百科全书》、《药物制剂技术》等），本领域技术人员可对上述药用辅料进行选择和调配，并将保藏编号为CGMCC No.21802的嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）菌株LA85制成不同的剂型，例如粉剂、片剂、注射剂、口服液等。

在具体的实施例中，所述药物的剂型选自：粉剂、片剂、液体剂、胶囊剂中的一种或一种以上。

在优选的实施例中，菌株LA85及其上清液抑制EIEC的抑菌圈为35mm，21mm；

优选地，菌株LA85抑制表兄链球菌的抑菌圈为15mm；

优选地，菌株LA85抑制艰难梭菌的抑菌圈为23mm；

优选地，菌株LA85抑制空肠弯曲菌的抑菌圈为14.5mm；

优选地，EIEC或表兄链球菌或艰难梭菌的菌浓度为10⁸CFU/mL；

优选地，菌株LA85的菌数为10⁸CFU；

优选地，所述EIEC腹泻指，感染EIEC引起的腹泻。

实验例1、嗜酸乳杆菌LA85的生理生化实验

嗜酸乳杆菌LA85的生理生化特征进行鉴定。生理生化特征结果显示如下：

过氧化氢酶阴性，纤维二塘、麦芽糖、水杨苷、蔗糖、棉籽糖和七叶苷阳性。七叶苷水解阳性，可以水解七叶苷为葡萄糖和七叶素。

实验例2、嗜酸乳杆菌LA85对致病菌的抑制作用

将表兄链球菌，艰难梭菌接种到BHI液体培养基中，37℃过夜培养，将MRS培养基冷却至55℃左右，与表兄链球菌，艰难梭菌按一定比例混匀，调节指示菌浓（10⁸CFU/mL），然后迅速倾注于预先放置牛津杯的平板中，待培养基冷却凝固后，取出牛津杯，在每孔中分别加入100μL拮抗菌液（10⁸CFU），静置数分钟后，放入37℃恒温培养箱中，培养结束后，用游标卡尺测量抑菌圈直径，三次重复试验。

将空肠弯曲杆菌接种在添加5%马血清的哥伦比亚琼脂培养基上，在微需氧条件下，42℃培养48h，挑取菌落至生理盐水中。将营养琼脂培养基冷却至55℃左右，与空肠弯曲杆菌菌悬液按一定比例混匀，调节指示菌浓度（10⁸CFU/mL），然后迅速倾注于预先放置牛津杯的平板中，待培养基冷却凝固后，取出牛津杯，在每孔中分别加入100μL拮抗菌液（10⁸CFU），静置数分钟后，放入37℃恒温培养箱中，培养结束后，用游标卡尺测量抑菌圈直径，三次重复试验。

结果如表1，可以看到，嗜酸乳杆菌LA85对表兄链球菌，艰难梭菌及空肠弯曲菌，均有较好的抑制效果，抑菌圈直径分别为：15mm，23mm，14.5mm。

表1. 嗜酸乳杆菌LA85对致病菌的抑菌圈直径

。

实验例3、嗜酸乳杆菌LA85对大肠杆菌EIEC的体外抑制实验

菌悬液制备：将肠侵袭性大肠杆菌EIEC，接种到TSA平板培养基上活化，37℃培养24h，挑取菌落至生理盐水中。将嗜酸乳杆菌LA85按1%接种量接种至MRS液体培养基中，37℃过夜厌氧培养。

将含有1.5%琼脂的MRS琼脂培养基冷却至55℃左右，与大肠杆菌菌悬液按一定比例混匀，调节指示菌浓度（10⁸CFU/mL），然后迅速倾注于预先放置牛津杯的平板中，待培养基冷却凝固后，取出牛津杯，在每孔中分别加入100μL拮抗菌液（10⁸CFU）以及在每孔中注入100μL无细胞上清液，静置数分钟后，放入37℃恒温培养箱中，培养结束后，用游标卡尺测量抑菌圈直径，三次重复试验。结果如下表，可以看到，嗜酸乳杆菌LA85及其无细胞上清液对EIEC有较好的抑制效果。

表2. 嗜酸乳杆菌LA85对大肠杆菌EIEC的抑制作用

。

实验例4、嗜酸乳杆菌LA85与肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）共培养生长的测定

将甘油管中保存的嗜酸乳杆菌LA85先在MRS平板上活化2-3次，随后挑取单菌落接种到MRS液体培养基中，于37℃下厌氧培养，得到种子液；将种子液以2%的比例接种至MRS液体培养基中，于37℃下培养18-24h得到培养液，调整浓度至10⁸CFU/mL即得菌悬液。

将活化三代后的EIEC接种于TSA液体试管中，加入10%的嗜酸乳杆菌活细胞，EIEC的初始接种浓度为1×10⁵CFU/mL，培养至8h，16h，24h分别取样，计数。EIEC活菌数利用LB培养基进行标准平板计数，以EIEC在正常条件下的生长状况作为阳性对照。由图1可以看出，共培养条件下，培养8h，EIEC活菌数显著降低至6.8，在培养16h，24h略有增加，但共培养条件下的EIEC活菌数，仍显著低于正常培养条件下的活菌数。这表明，嗜酸乳杆菌LA85对EIEC的生长具有明显的抑制作用。

实验例5、嗜酸乳杆菌LA85降低EIEC对肠上皮细胞的黏附率

用DMEM完全培养液（含10%胎牛血清，1%青霉素和链霉素溶液）将CaCO-2细胞培养于37℃含5% CO₂恒温细胞培养箱中，细胞贴壁生长至80%，消化传代至24 孔板中约10⁵个细胞/孔，长至单层后，更换不含抗生素的新鲜培养基。

采用两种不同的入侵抑制试验，即共孵育、预孵育处理，以研究竞争、排斥对EIEC的影响。以未加益生菌处理的CaCO-2细胞和致病菌为对照。实验所用 EIEC为10⁷CFU/ml，嗜酸乳杆菌为10⁸CFU/ml。实验分三组进行，每组做3个平行，进行3次重复实验：（1）阳性对照组：仅加入EIEC孵育3 h；（2）竞争组：同时加入EIEC和嗜酸乳杆菌LA85共孵育3 h；（3）排斥组：先加入嗜酸乳杆菌LA85孵育1.5h，后加入EIEC继续孵育1.5 h。孵育完毕后，将单层细胞用PBS洗涤3次后，加入0.5%的TritonX-1000.5mL，在冰水浴中解析5min，从细胞上解析下来的菌体进行梯度稀释后，用LB平板计数阳性对照组和实验组中EIEC数量。用相对黏附率（相对黏附率=处理组菌落数/阳性对照组菌落数×100％）表示嗜酸乳杆菌LA85对EIEC的粘附CaCO-2细胞的抑制程度。

表3. 嗜酸乳杆菌LA85降低EIEC对CaCO-2细胞黏附率结果表

。

从表中可以看出，与阳性对照组相比，竞争组和排斥组相对黏附率均显著降低，表明嗜酸乳杆菌LA85可以降低EIEC对CaCO-2细胞的黏附率，其中排斥组效果较好，表明嗜酸乳杆菌能有效抑制EIEC黏附于肠上皮细胞。

实验例6、嗜酸乳杆菌LA85对EIEC所致小鼠死亡率的影响

EIEC菌悬液的制备：EIEC在TSA固体平板培养基上活化后，挑取单菌落接种到TSA液体培养基，连续转接二代后，离心，收集菌体。菌体用无菌生理盐水制备菌悬液，调整菌悬液浓度。

取SPF级C57BL/6雄性小鼠60只，体重约在17-23g之间。饲养室温温度 23±2℃，湿度50%±10%，自由进食及饮水的条件下，适应饲养3周后随机分为正常对照组（CK组）、模型组（MC组）和LA85干预组（LA85组），每组20只。造模第1-3天，在小鼠饮用水中加入庆大霉素（35 mg/L）、万古霉素（45 mg/L）、甲硝唑（215 mg/L）和粘菌素（850 U/mL）的抗生素混合物，以消除肠道正常菌群。模型组：造模第4-9天，每天灌胃200μL大肠杆菌菌悬液（1×10⁸CFU），其余时间灌胃生理盐水200μL。正常对照组：每天灌胃生理盐水200μL。干预组：造模第4-9天灌胃EIEC菌悬液，之后每天连续灌胃12天嗜酸乳杆菌LA85菌悬液（1×10⁹CFU/day）。实验过程中每天记录小鼠的一般健康状况，包括毛发、行为、死亡、腹泻等，粪便呈水样，肛门周围潮湿处即为腹泻，并记录小鼠死亡数量，计算死亡率。

在大肠杆菌感染前，各组小鼠均未发生死亡、腹泻等疾病。所有小鼠的行为、采食量和粪便质地均无显著差异。每组小鼠在感染大肠杆菌后表现出不同的症状。模型组小鼠感染大肠杆菌后出现严重腹泻，呈稀水样，且粘附于肛门，且出现部分死亡病例，死亡率为10%。同时，观察到这组小鼠精神萎靡、消瘦严重。而LA85干预组小鼠腹泻症状较轻，未没有出现死亡病例。

实验例7、嗜酸乳杆菌LA85对EIEC感染小鼠体重的影响

试验造模期第0d，5d，12d，17d对所有试验小鼠进行称重，测定不同组对小鼠增重的影响。如图2所示，在干预期内，正常对照组（CK组）小鼠体重增长，结束时增长124%，模型组（MC组）和LA85干预组（LA85组）小鼠在第3天体重呈下降趋势，模型组下降幅度大于LA85干预组，在干预结束后，小鼠体重均有小幅增加，但LA85干预组增加幅度大于模型组，表明嗜酸乳杆菌LA85干预能一定程度减弱EIEC感染导致的小鼠体重下降，且有利于体重的回升。

实验例8、嗜酸乳杆菌LA85对腹泻小鼠肠道菌群的影响

取造模结束最后一天，以及实验最后一天小鼠的粪便，进行活菌计数，检测乳杆菌，双歧杆菌，肠杆菌，肠球菌，产气荚膜梭菌的活菌数，将粪便样品稀释至合适梯度后，取100μL分别涂布在LBS，BBL，EMB，EC，TSC琼脂培养基上进行培养。每个稀释度做3个平行，并选择菌落数在30-300之间的培养基进行计数，并在计数前对细菌进行镜检鉴定。

如表4所示，造模结束后，可以明显看到模型组，乳杆菌，双歧杆菌含量显著降低，而肠杆菌，肠球菌以及产气荚膜梭菌含量升高。与模型组相比，嗜酸乳杆菌LA85干预后，乳杆菌含量显著增加，双歧杆菌也有明显的增殖，而肠杆菌，肠球菌以及产气荚膜梭菌含量显著降低，其中肠杆菌，肠球菌含量基本接近空白组菌群数量。

表4. EIEC感染腹泻模型小鼠肠道菌群活菌数均值（lg CFU/g）

。

实验结束后，以颈椎脱臼法处死小鼠，腹部消毒后解剖，取各组小鼠盲肠内容物。对小鼠盲肠内容物进行16S测序和分析，结果如图3显示，与正常对照组（CK组）相比，EIEC所致腹泻组（模型组）小鼠的肠道微生物α多样性中的香农多样性指数（shannon指数）与辛普森指数（simpson指数）均有降低，说明EIEC会造成小鼠肠道菌群α多样性指数的下降；与正常对照组相比，LA85干预组的肠道微生物α多样性中的香农多样性指数与辛普森指数均有升高，表明嗜酸乳杆菌LA85干预会造成小鼠肠道菌群α多样性指数的升高，能增加小鼠肠道中微生物多样性。

实验例9、嗜酸乳杆菌LA85对腹泻小鼠免疫能力的影响

实验结束后，以颈椎脱臼法处死小鼠，取各组小鼠结肠组织，采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定小鼠结肠组织匀浆中细胞因子TNF-α、IL-6、IL-10的含量。实验结果如图4所示，与正常对照组相比，模型组结肠组织中IL-6和TNF-α的含量显著升高，IL-10的含量显著降低。与模型组相比，LA85干预组结肠组织中TNF-α和IL-6含量显著下降，LA85干预组结肠组织中IL-10含量显著提高；实验结果表明，嗜酸乳杆菌LA85能够有效调节小鼠细胞因子水平，降低小鼠结肠组织中促炎因子的含量，提高抗炎因子的含量，从而缓解肠侵袭性小鼠肠道炎症，调节小鼠免疫能力。

实验例10、嗜酸乳杆菌LA85菌粉制备

1）嗜酸乳杆菌LA85菌粉发酵工艺：

将保存于甘油管中的嗜酸乳杆菌菌株接入10mL种子培养基中，37℃静置培养6-8h即为一级种子；

将一级种子以5%的接种量接种于200mL种子培养基中，37℃静置培养5-6h即为二级种子；

发酵罐培养：发酵罐体积为15L，装入发酵培养基10L，灭菌温度为115℃，20min，以2%（v/v）的接种量将培养获得的二级种子全部接种到发酵罐，在发酵温度为35℃、搅拌转速100rpm、初始pH调节为6.5的条件下开始发酵，发酵过程中用23%（m/v）碳酸钠维持pH为5.8，维持罐压为0.03MPa，培养10h。

所述的种子培养基的配方为：20g/L葡萄糖，10g/L牛肉浸粉，5g/L酵母粉，10g/L蛋白胨，5g/L乙酸钠，2g/L柠檬酸钠，3g/L磷酸氢二钾，0.5g/L酸镁，0.1g/L硫酸锰，1g/L吐温80，1g/LL-半胱氨酸盐酸盐，115℃灭菌20min。

所述发酵培养基配方为：50g/L乳糖，15g/L酵母粉，20g/L蛋白胨，5g/L牛肝浸粉，5g/L乙酸钠，3g/L柠檬酸钠，3g/L磷酸氢二钾，0.5g/L硫酸镁，0.1g/L硫酸锰，1g/L吐温80，1g/LL-半胱氨酸盐酸盐，115℃灭菌20min。

2）所述的嗜酸乳杆菌LA85菌粉制备工艺：

（1）将通过上述嗜酸乳杆菌高密度发酵的方法得到的发酵液离心，去上清，收集菌泥。所述的离心的方法优选为4℃、8000rpm离心10min。

（2）按照菌泥与冻干保护剂质量比1:1-1.2将两者混合均匀，进行真空冷冻干燥得到嗜酸乳杆菌冻干菌粉。所述的真空冷冻干燥的条件为：预冻温度为-42~-45℃，真空度10-20pa，时间24-28h。

所述的冻干保护剂包含如下按质量百分比计的组分：15%海藻糖，5%脱脂奶粉，2%蔗糖，2%甘油，0.5%山梨醇。

实验例11、嗜酸乳杆菌LA85在苹果酵素产品制备过程中的应用

（1）取浓缩果汁与纯净水按1:6进行稀释，然后加入葡萄糖，混合均匀后将果汁调到6.0，然后95℃灭菌20min，然后自然冷却，得到原料液。

（2）发酵剂制备

用接种环取一环在MRS平板活化得到的单菌落，并接入MRS肉汤培养基中，37℃恒温培养12h，得到培养液。

（3）发酵培养

将发酵剂与原料液按2:100的比例进行发酵，其中发酵剂所含嗜酸乳杆菌活菌数不低于10⁹cfu/mL，然后控制37℃培养30小时，所得发酵液即为含嗜酸乳杆菌LA85的苹果酵素产品。

Claims

1.保藏编号为CGMCC No.21802的嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）菌株LA85在体外同时抑制EIEC、表兄链球菌、艰难梭菌、空肠弯曲菌方面的用途。