CN113604398B - 一株益生植物乳杆菌及其在饲料添加剂方面的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一株乳杆菌，特别涉及一株益生植物乳杆菌及其在饲料添加剂方面的应用，属于微生物技术领域。一株植物乳杆菌RGC10，该乳酸菌为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）菌株RGC10，于2019年9月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院，中科院微生物研究所，邮编100101），保藏编号为CGMCC NO.18625。该菌株对常见抗生素敏感，耐受胃肠道环境，能够在4.0mmol/L的过氧化氢环境中增殖。

Description

一株益生植物乳杆菌及其在饲料添加剂方面的应用
技术领域
本发明涉及一株乳杆菌，特别涉及一株益生植物乳杆菌及其在饲料添加剂方面的应用，属于微生物技术领域。
背景技术
抗生素在畜牧业中被大量使用，不仅作为疾病的预防、治疗手段，也应用为畜禽的促生长剂。近年来，抗生素滥用导致抗生素抗性病原体的传播和抗生素在食物中残留等生物安全问题得到了越来越多的关注，严重威胁畜禽与人类的健康安全。欧盟、日本等国家自2006年起相继禁止将抗生素用作饲料添加剂。克服抗生素的弊端、寻求抗生素的替代物成为动物营养与健康相关研究的热点。众多研究表明，益生乳酸菌制剂能够调节畜禽肠道菌群结构、物质代谢和肠道免疫稳态，提升其健康状态及生产效率。
活性氧对动物细胞信号转导具有重要的调节功能，但是过量的活性氧会引起细胞脂质、蛋白质和DNA的氧化损伤，致使畜禽处于亚健康状态。动物肠道氧化损伤会引起肠道屏障功能障碍，降低营养成分的吸收、利用效率。近期的研究成果进一步表明，益生菌的补充能够减少宿主肠道内活性氧的积累、提高动物的抗氧化能力，进而改善动物的健康状态和生产效率，是潜力巨大的候选抗氧化剂。
尽管益生菌在在药品、保健品、动物饲料等行业中的应用日渐广泛，但FAO/WHO指出，部分益生菌具有感染宿主机体、有害代谢活动、对敏感个体的过度免疫刺激以及基因转移等副作用。而畜用益生菌属于微生物饲料添加剂，在我国国内尚未建立完善的筛选标准和评价规程。畜用益生菌除了直接影响畜禽健康与生产状态，更会随着畜禽活动及动物产品进入到人类生活，与人类健康及安全密切相关。因此，在开发和应用畜用益生菌过程中，对其进行更为全面的安全性评估至关重要，需要借鉴多方人用益生菌的相关规定，应用严格的安全性及有效性筛选标准。自然界中植物表面天然附着有大量的乳酸菌，而其中绝大部分尚未得到充分的开发利用，是个潜力巨大的菌种资源库。
发明内容
本发明的目的在于提供一株益生植物乳杆菌，该菌株对常见抗生素敏感，耐受胃肠道环境，能够在4.0mmol/L的过氧化氢环境中增殖。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一株植物乳杆菌RGC10，该乳酸菌为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株RGC10，于2019年9月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院，中科院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC NO.18625。
作为优选，该菌株可在4mmol/L以内的过氧化氢环境中增殖。
一种编码所述植物乳杆菌菌株的植物乳杆菌基因，其16S rDNA核苷酸全序列如SEQ ID No.1所示。
含有本发明所述植物乳杆菌RGC10菌株的菌剂。
一种所述植物乳杆菌RGC10菌株在抑制大肠杆菌K99或都柏林沙门氏菌方面的应用。
一种饲料添加剂，所述饲料添加剂包含所述的植物乳杆菌RGC10菌株和/或所述的菌剂。
一种动物饲料，包含所述的添加剂。所述的动物包括猪、家禽及反刍动物。本发明中，植物乳杆菌RGC10能够耐受高浓度过氧化氢环境，能够在4.0mmol/L的过氧化氢环境中增殖，同时能够在体外显著提升牛小肠上皮细胞的抗氧化能力，益生效果突出。
一种由所述菌株制得的食品或动物药品。
本发明提供的植物乳杆菌Lactobacillus plantarum RGC10，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.18625。该菌株分离自菠萝果废青贮，革兰氏阳性，过氧化氢酶阴性，对常见抗生素敏感，耐受胃肠道环境。在体外能够显著抑制大肠杆菌K99和都柏林沙门氏菌的生长，具有高细胞表面疏水性，并对牛小肠上皮细胞表现出良好的粘附性，够促进幼龄犊牛的肠道健康，降低犊牛断奶前后腹泻发生率，是具有高益生潜力的新型益生乳酸菌菌株。
此外，植物乳杆菌RGC10能够耐受高浓度过氧化氢环境，能够在4.0mmol/L的过氧化氢环境中增殖，高于已报道的植物乳杆菌MA2和植物乳杆菌AR113，同时能够在体外显著提升牛小肠上皮细胞的抗氧化能力，具有提升犊牛健康状态与生产效率的巨大潜力。该菌株可作为牛用益生菌制剂的备选菌株，适用于开发为饲用益生菌添加剂和具有益生特性的抗氧化剂，应用前景广阔。
附图说明
图1为植物乳杆菌RGC10革兰氏染色的菌体形态图；
图2为植物乳杆菌RGC10抗生素敏感性的平板结果；
图3为植物乳杆菌RGC10无菌上清抑制大肠杆菌K99和都柏林沙门氏菌的平板结果图；
图4为植物乳杆菌RGC10的粘附细胞图(1000×)；
图5为植物乳杆菌RGC10在不同过氧化氢浓度下的生长曲线；
图6为植物乳杆菌RGC10减少牛小肠上皮细胞内活性氧(ROS)积累；
图7为植物乳杆菌RGC10增加牛小肠上皮细胞总抗氧化能力(T-AOC)。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例1：植物乳杆菌的分离和鉴定
1.1菌株分离和纯化
本发明提供的植物乳杆菌菌株分离自菠萝果废青贮。取10g菠萝果废青贮样品加入90mL灭菌PBS中，置于摇床低速震荡1h充分混匀。取清液，进行梯度稀释(1×10-3-1×10-5)后，涂布在MRS固体培养基上，37℃培养24h，挑取边缘整齐、光滑的单菌落进行进一步纯化培养。
将挑选的得到的菌株进行革兰氏染色、过氧化氢酶测定，保留革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性的菌株，以30％甘油冻存于-80℃。
植物乳杆菌RGC10革兰氏染色后的菌体形态如图1所示。
1.2菌株鉴定
提取细菌DNA，以细菌DNA为模板，使用细菌通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)对候选菌株DNA进行PCR扩增，应用琼脂糖(1.5％)凝胶电泳对扩增产物进行检测。产物约为1400bp，送至生工生物公司进行测序，结果如SEQ ID NO.1所示，将所得序列提交GenBank进行Blast对比分析。Blast比对结果显示RGC10的序列结果与植物乳杆菌的16S rDNA序列同源性超过99％。
将植物乳杆菌RGC10于2019年9月27日保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.18625。
实施例2：菌株益生性能检测
2.1抗生素敏感性试验
采用药敏纸片琼脂扩散法进行评价。取过夜培养的乳酸菌菌液以5000rpm的速度离心10min收集菌体，并用灭菌PBS洗涤2次，洗涤后用PBS重悬为107CFU/mL的菌液。取200μL菌液均匀涂布于MRS琼脂，在表面放置抗生素药敏纸片，分别为利福平(5μg/片)、万可霉素(30μg/片)、庆大霉素(10μg/片)、链霉素(10μg/片)、卡那霉素(30μg/片)、红霉素(15μg/片)、阿莫西林(30μg/片)、氨苄青霉素(10μg/片)、四环素(30μg/片)、氯霉素(30μg/片)，在37℃厌氧条件下培养24h。用游标卡尺测量药敏圈直径，比对表1判定菌株抗生素敏感性，结果如表2所示。图2为植物乳杆菌RGC10抗生素敏感性的平板结果。
由表2可知，植物乳杆菌RGC10对利福平、庆大霉素、红霉素、阿莫西林、氨苄西林及氯霉素敏感，对四环素中度敏感，对万古霉素、链霉素、卡那霉素不敏感。大量研究普遍认为，益生乳杆菌对万古霉素、链霉素、卡那霉素的耐药性本身不构成安全问题。一些具有固有抗生素抗性的益生菌菌株可用于恢复抗生素治疗后紊乱的肠道菌群。
表1用于药敏试验的抗生素及其抑制圈直径对应的敏感性
Figure BDA0003229769590000041
Figure BDA0003229769590000051
注：R：不敏感；MS：中度敏感；S：敏感。
表2植物乳杆菌RGC10药敏试验结果
Figure BDA0003229769590000052
2.2胃肠道环境耐受试验
2.2.1耐酸试验
取10mL过夜培养的乳酸菌菌液以5000rpm离心5min，收集菌体，用灭菌PBS漂洗沉淀两次，再用10mL新鲜的MRS液体培养基重新悬浮菌体，并进行菌落计数。用1M盐酸分别调节MRS液体培养基的pH值至4.0、3.0、2.0，分别取10mL不同pH值的培养基，接种100μL上述菌液，37℃厌氧培养3h，以未进行pH调节的MRS为对照。对各组处理前后的活菌数进行平板菌落计数，测定乳酸菌的存活率。存活率的计算公式如下：
存活率(％)＝Nt/N0×100
上式中，N0为测试菌株0h的活菌数(CFU/mL)；Nt为测试菌株处理3h的活菌数(CFU/mL)。
试验结果如表3所示。植物乳杆菌RGC10在pH为4.0的MRS培养基中的存活率高达235.8％，在pH为3.0的MRS培养基中的存活率为135.3％，在pH为2.0的MRS培养基仍有一定的存活率，说明其对酸性环境的耐受性良好。
2.2.2耐胆盐试验
方法与上述相同。试验组MRS培养基中胆盐含量分别为0.1％，0.5％，1％。试验结果如表3所示。植物乳杆菌RGC10在胆盐浓度为0.1％、0.5％、1.0％的MRS培养基的存活率分别为111.8％、69.6％、21.7％，说明其对胆盐的耐受性良好。
2.2.3模拟胃肠液的耐受试验
将胃蛋白酶(3g/L)溶解于10ml无菌PBS中，pH值调节至3.0制备模拟胃液。接种100μL上述菌液，37℃培养3h，对培养前后培养液中乳酸菌活菌数进行平板菌落计数，测定乳酸菌在模拟胃液中的存活率。
将胆盐(1.0％)和胰蛋白酶(1g/L)溶解于10mL无菌生理盐水中，pH值调节至8.0制备模拟肠液。接种100μL上述菌液，37℃培养6h，对培养前后培养液中乳酸菌活菌数进行平板菌落计数，测定乳酸菌在模拟肠液中的存活率。
试验结果如表3所示。植物乳杆菌RGC10在模拟胃液处理3h、模拟肠液处理6h后仍有较高的活菌数，在模拟胃肠液中具备一定的存活能力。
整体而言，植物乳杆菌RGC10能够耐受模拟胃肠液环境，具备较高的胃肠道生存能力。
表3植物乳杆菌RGC10对模拟胃肠道环境耐受性结果
Figure BDA0003229769590000061
Figure BDA0003229769590000071
2.3病原菌活性抑制试验
取过夜培养的乳酸菌菌液以12000rpm的速度离心5min，收集上清液，0.22μm无菌滤膜过滤，得到无菌上清备用。在培养皿中倒入约5mL灭菌LB固体培养基，待其凝固后在其上方放置牛津杯，在牛津杯外围倒入混有107CFU/mL病原菌(大肠杆菌K99BNCC-186358与都柏林沙门氏菌BNCC-12578)的冷却至45℃的灭菌LB固体培养基。培养基凝固后，取下牛津杯，在每孔中加入150μL无菌上清液，同时设置添加无菌MRS液体培养基的孔作为阴性对照。培养皿在37℃恒温培养箱内培养16-18h，观察有无抑菌圈，并用游标卡尺测量抑菌圈直径，结果如表3所示。图3为植物乳杆菌RGC10无菌上清抑制大肠杆菌K99和都柏林沙门氏菌的平板结果图。
可知植物乳杆菌RGC10无菌上清在体外对大肠杆菌K99和都柏林沙门氏菌具有较强的抑制作用。
表4植物乳杆菌RGC10抑菌试验结果
Figure BDA0003229769590000072
2.4细胞粘附能力
2.4.1细胞表面疏水性
取过夜培养的乳酸菌菌液以5000rpm离心10min，收集菌体，用灭菌PBS漂洗沉淀两次。用PBS重悬菌体，调节初始吸光度至在600nm为0.7(A0)。将3mL细胞悬液与0.6mL正十六烷混合，涡旋2min，再在室温下温育1h。水油分离后，小心分离出水相，在600nm下测定其吸光值(A1)。疏水率的计算公式如下：
疏水率(％)＝(1-A1/A0)×100
植物乳杆菌RGC10的疏水率为66.9±2.93％。
2.4.2对牛小肠上皮细胞的粘附力
过夜培养的乳酸菌菌液以5000rpm的速度离心10min收集菌体，用PBS洗涤2次后悬浮于无抗生素、无血清的DMEM中，调整浓度至108CFU/mL。将牛小肠上皮细胞(本试验室保存)接种于放置了细胞爬片的12孔板内，5％CO2培养箱37℃培养至细胞覆盖80％以上。吸出孔内旧培养液，用灭菌PBS清洗2次，加入2mL无抗生素、无血清的DMEM，于37℃温育0.5h。加入100μL上述悬浮菌液，再于5％CO2培养箱37℃温育2h。温育后，吸出孔内培养液，每个孔用无菌PBS洗涤5次，充分除去未粘附的细菌。取出细胞爬片，置于65℃的培养箱内干燥使细胞固定，然后用番红染色，置于油镜下观察测试菌株粘附细胞情况并拍照。图4为植物乳杆菌RGC10的粘附细胞图(1000×)，显示出植物乳杆菌RGC10拥有良好的细胞粘附能力，能够粘附于犊牛肠道定植以发挥作用。
植物乳杆菌RGC10对常见抗生素敏感，耐受胃肠道环境，在体外能够显著抑制大肠杆菌K99和都柏林沙门氏菌的生长，具有高细胞表面疏水性，并对牛小肠上皮细胞表现出良好的粘附性，是具有高益生潜力的新型益生乳酸菌菌株。
实施例3：菌株提升牛小肠上皮细胞抗氧化能力
3.1菌株过氧化氢耐受试验
取10mL过夜培养的乳酸菌菌液以5000rpm离心5min，收集菌体，用灭菌PBS漂洗沉淀两次，再用10mL新鲜的MRS液体培养基重新悬浮菌体，并进行菌落计数。用过氧化氢溶液分别调节MRS液体培养基内过氧化氢浓度至2、4、6、8、10mmol/L，分别取10mL不同过氧化氢浓度的培养基，接种100μL上述菌液，37℃厌氧培养3h，以不添加过氧化氢的MRS为对照。对各组处理前后的活菌数进行平板菌落计数，测定乳酸菌的存活率。存活率的计算公式如下：
存活率(％)＝Nt/N0×100
上式中，N0为测试菌株0h的活菌数(CFU/mL)；Nt为测试菌株处理3h的活菌数(CFU/mL)。试验结果如表5所示。植物乳杆菌RGC10在2mmol/L的过氧化氢浓度下培养3h存活率高达182.7％，在4mmol/L的过氧化氢浓度下培养3h存活率为12.7％，在过氧化氢浓度为10mmol/L的培养基环境中仍具备一定的生存能力，说明其能够耐受含有较高浓度过氧化氢的环境。
表5植物乳杆菌RGC10不同过氧化氢浓度的耐受结果
Figure BDA0003229769590000091
3.2菌株在不同过氧化氢浓度下的生长曲线测定
取过夜培养的乳酸菌菌液以5000rpm离心5min，收集菌体，用灭菌PBS漂洗沉淀两次，分别接种到含不同浓度过氧化氢(0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5mmol/L)的MRS液体培养基内，调整OD600至0.4，再分别以每孔250μL的体积接种至96孔板内，每个浓度三个重复。96孔板置于37℃下孵育，每隔30min用酶标仪振动10s并测定各孔OD600，分析乳酸菌菌株在不同过氧化氢浓度下的生长曲线。
结果如图5所示。植物乳杆菌RGC10在0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0mmol/L的过氧化氢浓度下都出现了OD值增长，说明其能够耐受最高4.0mmol的过氧化氢环境并生长，高于已报道的植物乳杆菌MA2(最高能够在2.0mmol/L的过氧化氢环境中增殖)和植物乳杆菌AR113(最高能够在3.5mmol/L过氧化氢环境中增殖)。
3.3菌株影响牛小肠上皮细胞抗氧化能力试验
取过夜培养的乳酸菌菌液以5000rpm的速度离心10min收集菌体，用PBS洗涤2次后悬浮于无抗生素、无血清的DMEM中，调整浓度至108CFU/mL。
将牛小肠上皮细胞(本试验室保存)接种于6孔板内，5％CO2培养箱37℃培养至细胞覆盖80％以上。吸出孔内旧培养液，用灭菌PBS清洗2次，加入2mL无抗生素、无血清的DMEM，于37℃温育0.5h。
3.3.1菌株影响牛小肠上皮细胞内活性氧(ROS)积累试验
3.3.1.1常规条件下
向每孔细胞内加入100μL悬浮菌液，再于5％CO2培养箱37℃温育4h。温育后，吸出孔内培养液，每个孔用无菌PBS洗涤3次。用胰蛋白酶消化收集细胞，用Thermo FisherScientific的CellRox Deep Red Flow Cytometry Assay试剂盒测定细胞内ROS含量。
结果如图6A所示，体外添加植物乳杆菌RGC10能够显著减少牛小肠上皮细胞内ROS的积累。
3.3.1.2过氧化氢刺激下
向每孔细胞内加入100μL悬浮菌液，于5％CO2培养箱37℃温育1h，再向每孔细胞内加入过氧化氢至终浓度为200μmol/L，于5％CO2培养箱37℃温育3h。温育后，吸出孔内培养液，每个孔用无菌PBS洗涤3次。用胰蛋白酶消化收集细胞，用Thermo Fisher Scientific的CellRox Deep Red Flow Cytometry Assay试剂盒测定细胞内ROS含量。
结果如图6B所示，在过氧化氢刺激下，体外添加植物乳杆菌RGC10能够显著减少牛小肠上皮细胞内ROS的积累。
3.3.2菌株影响牛小肠上皮细胞总抗氧化能力(T-AOC)试验
3.3.2.1常规条件下
向每孔细胞内加入100μL悬浮菌液，再于5％CO2培养箱37℃温育4h。温育后，吸出孔内培养液，每个孔用预冷至4℃的无菌PBS洗涤3次。添加200μL预冷PBS，在冰上用细胞刮刀收集细胞至2mL离心管内。向管内加入小钢珠，用珠磨仪以65Hz震荡30s，中断10s，重复三次以破碎细胞。充分破碎细胞后，在4℃下以14000rpm离心10min收集上清，用南京建成生物研究所的T-AOC测试盒测定上清的T-AOC，用碧云天生物的BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，计算全细胞裂解物内平均每毫克蛋白的T-AOC活性。
结果如图7A所示，体外添加植物乳杆菌RGC10对牛小肠上皮细胞的T-AOC没有显著性影响。
3.3.2.2过氧化氢刺激下
向每孔细胞内加入100μL悬浮菌液，于5％CO2培养箱37℃温育1h，再向每孔细胞内加入过氧化氢至终浓度为200μmol/L，于5％CO2培养箱37℃温育3h。温育后，吸出孔内培养液，每个孔用预冷至4℃的无菌PBS洗涤3次。添加200μL预冷PBS，在冰上用细胞刮刀收集细胞至2mL离心管内。向管内加入小钢珠，用珠磨仪以65Hz震荡30s，中断10s，重复三次以破碎细胞。充分破碎细胞后，在4℃下以12000rpm离心10min收集上清，用南京建成生物研究所的T-AOC测试盒测定上清的T-AOC，用碧云天生物的BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，计算全细胞裂解物内平均每毫克蛋白的T-AOC活性。
结果如图7B所示，在过氧化氢刺激下，体外添加植物乳杆菌RGC10能够显著增加牛小肠上皮细胞的T-AOC。
综上所述，植物乳杆菌RGC10能够耐受高浓度过氧化氢环境，能够在4.0mmol/L的过氧化氢环境中增殖，同时能够在体外显著提升牛小肠上皮细胞的抗氧化能力，可被开发为兼具益生特性的抗氧化剂，应用前景广阔。
实施例4：菌株菌粉的制备
利用发酵罐技术，在MRS液体培养基中富集得到大量的高浓度的植物乳杆菌RGC10菌液，将菌液分装至250ml离心管并充入CO2，在24000×g条件下高速离心20min沉淀菌体。弃去上清液后，加入1000ml冻干保护剂重悬沉淀，置于-80℃硬化2h。使用真空冷冻干燥机(Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH，奥斯特罗德，德国)冻干后，得到植物乳杆菌RGC10的菌粉。
本实施例提供的冻干保护剂的制备方法：100g脱脂奶粉溶于1000ml煮沸蒸馏水，微波炉中再次冒泡去除溶氧，在血清瓶中(液面以上)持续通入CO2冷却备用。
实施例5：菌株的应用
植物乳杆菌被列为中国饲料添加剂目录(2013)微生物制剂之一，其适用范围为养殖动物。本发明所提供的植物乳杆菌RGC10可作为饲料添加剂应用到动物养殖中，应用方式为：将菌株菌粉混合于动物常规饲料、代乳料、饮用水等，进而饲喂动物，这里的动物指的是猪、家禽及反刍动物。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其它实施例的不同之处，各个实施例之间相同或相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
以上对本发明所提供的一株益生植物乳杆菌及其在饲料添加剂方面的应用进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一株益生植物乳杆菌及其在饲料添加剂方面的应用
<130> ZJWL-WJK202103
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1525
<212> DNA
<213> 植物乳杆菌RGC10(Lactobacillus plantarum RGC10)
<400> 1
agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgaac 60
gaactctggt attgattggt gcttgcatca tgatttacat ttgagtgagt ggcgaactgg 120
tgagtaacac gtgggaaacc tgcccagaag cgggggataa cacctggaaa cagatgctaa 180
taccgcataa caacttggac cgcatggtcc gagcttgaaa gatggcttcg gctatcactt 240
ttggatggtc ccgcggcgta ttagctagat ggtggggtaa cggctcacca tggcaatgat 300
acgtagccga cctgagaggg taatcggcca cattgggact gagacacggc ccaaactcct 360
acgggaggca gcagtaggga atcttccaca atggacgaaa gtctgatgga gcaacgccgc 420
gtgagtgaag aagggtttcg gctcgtaaaa ctctgttgtt aaagaagaac atatctgaga 480
gtaactgttc aggtattgac ggtatttaac cagaaagcca cggctaacta cgtgccagca 540
gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgttg tccggattta ttgggcgtaa agcgagcgca 600
ggcggttttt taagtctgat gtgaaagcct tcggctcaac cgaagaagtg catcggaaac 660
tgggaaactt gagtgcagaa gaggacagtg gaactccatg tgtagcggtg aaatgcgtag 720
atatatggaa gaacaccagt ggcgaaggcg gctgtctggt ctgtaactga cgctgaggct 780
cgaaagtatg ggtagcaaac aggattagat accctggtag tccataccgt aaacgatgaa 840
tgctaagtgt tggagggttt ccgcccttca gtgctgcagc taacgcatta agcattccgc 900
ctggggagta cggccgcaag gctgaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg 960
tggagcatgt ggtttaattc gaagctacgc gaagaacctt accaggtctt gacatactat 1020
gcaaatctaa gagattagac gttcccttcg gggacatgga tacaggtggt gcatggttgt 1080
cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttattatc 1140
agttgccagc attaagttgg gcactctggt gagactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt 1200
ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg ctacaatgga 1260
tggtacaacg agttgcgaac tcgcgagagt aagctaatct cttaaagcca ttctcagttc 1320
ggattgtagg ctgcaactcg cctacatgaa gtcggaatcg ctagtaatcg cggatcagca 1380
tgccgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca tgagagtttg 1440
taacacccaa agtcggtggg gtaacctttt aggaaccagc cgcctaaggt gggacagatg 1500
attagggtga agtcgtaaca aggta 1525
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 细菌通用引物(27F)
<400> 2
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 细菌通用引物(1492R)
<400> 3
ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (7)

1.一株植物乳杆菌，其为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）菌株RGC10，于2019年9月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.18625。
2.含有权利要求1所述植物乳杆菌的菌剂。
3.一种权利要求1所述植物乳杆菌在制备抑制大肠杆菌(Escherichia coli)K99或都柏林沙门氏菌(Salmonella dublin)制剂方面的应用。
4.一种饲料添加剂，其特征在于，所述饲料添加剂包含权利要求1所述的植物乳杆菌和/或权利要求2所述的菌剂。
5.一种动物饲料，其特征在于，包含权利要求4所述的饲料添加剂。
6.根据权利要求5所述的动物饲料，其特征在于：所述的动物包括猪、家禽及反刍动物。
7.一种由权利要求1所述植物乳杆菌制得的食品或动物药品。
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