CN113249259A - 一种具有抑菌和降低病毒血凝价功能的枯草芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及功能微生物筛选与应用技术领域，提供了一种具有抑菌和降低病毒血凝价功能的枯草芽孢杆菌及其应用。所述枯草芽孢杆菌已于2020年11月16日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2020744。所述枯草芽孢杆菌能有效抑制多种病原菌，同时能显著降低禽流感、新城疫等病毒的血凝价，可作为饲料添加剂广泛应用于畜禽常发疾病的防控。

Description

一种具有抑菌和降低病毒血凝价功能的枯草芽孢杆菌及其 应用

技术领域

本发明涉及功能微生物筛选与应用技术领域，具体涉及一种具有抑菌和降低病毒血凝价功能的枯草芽孢杆菌及其应用。

背景技术

抗生素在养殖业中的不合理应用，不仅危害动物健康，也带来诸多弊端，如耐药性、药物残留和食品安全等问题。益生菌是一类具有生物活性和对宿主健康有益的微生物，并因其无污染、无毒及无不良反应、抗菌保健和促生长等特点，成为继抗生素之后的新型添加剂。在家禽生产中，应用益生菌能对家禽肠道微生态健康发挥多种作用，其中最直接的是优化肠道菌群，改善肠道微生态环境。由于家禽生长尤其是早期生长易受环境和营养应激等因素的影响，家禽肠道微生态平衡很容易受到破坏，导致家禽免疫机能降低，造成肠道菌群失衡进而降低其生产性能，引发各种疾病，甚至导致死亡。

益生菌作为一种绿色饲料添加剂，被广泛应用于动物生产中，特别是对于消化道较短的家禽，其具有特殊的生理作用。益生菌可直接饲喂，也可制成微生态制剂，与其他植物性添加剂联用(黄芪多糖和辣椒素等)；将益生菌制成活菌片，活菌片中益生菌能黏附于肠黏膜，并能明显抑制致病菌黏附，可提高肠道微生态的稳定性；微胶囊技术也是用来保护益生菌的重要手段，可将双歧杆菌制备成微胶囊，提高双歧杆菌在不良环境中的存活率并实现双歧杆菌在肠道释放，以提高双歧杆菌在肠道内的利用率。

益生菌能使家禽在早期就表现出优良的生产性能，促进蛋白质在体内的沉积；同时，可以提高家禽十二指肠和空肠相关酶的酶活和盲肠VFA含量，改善肠道微生物菌群数量和结构，调节家禽肠道的微生物平衡，提高饲料消化率，降低环境污染；另外，还能增强家禽对环境不良刺激的抵抗能力以及抗病毒能力。

随着我国养殖业的迅速发展，人们对绿色、安全和环保意识的不断增强，微生态制剂的应用前景会更加广阔，在明确不同动物肠道菌群功能、不同生理时期宿主肠道有益菌的组成和演替规律等基础上，应加强复合菌制剂的探寻，筛选出专一和高效的益生菌菌株。

发明内容

本发明为解决现有技术问题，提供了一种具有抑菌和降低病毒血凝价功能的枯草芽孢杆菌及其应用。所述枯草芽孢杆菌能有效抑制多种病原菌，同时能显著降低禽流感、新城疫等病毒的血凝价，可作为饲料添加剂广泛应用于畜禽常发疾病的防控。

本发明一方面提供了一株枯草芽孢杆菌DB2572(Bacillus subtilis DB2572)，已于2020年11月16日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2020744。

本发明一方面提供了所述枯草芽孢杆菌DB2572在制备具有抗病毒功能的制品中的应用。

所述病毒为禽流感病毒。

所述病毒为新城疫病毒。

本发明一方面提供了所述枯草芽孢杆菌DB2572在制备预防和治疗畜禽腹泻的制品中的应用。

本发明还提供了一种饲料添加剂，包含上述枯草芽孢杆菌DB2572。

所述饲料添加剂还包含地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌，凝结芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、丁酸梭菌、屎肠球菌、乳酸菌、粪肠球菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌中的任意一种或多种的组合。

所述饲料添加剂为菌粉。

所述饲料添加剂中枯草芽孢杆菌DB2572的活菌量不低于10⁹CFU/g。

本发明还提供了所述饲料添加剂在畜禽养殖中的应用。

本发明筛选到的枯草芽孢杆菌DB2572对鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌等多种病原菌均具有显著的抑菌效果，尤其是对鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌的抑菌效果最强，抑菌圈直径达到22mm。该菌株能够有效抑制新城疫、禽流感等病毒在鸡胚中的复制，显著降低病毒的血凝价，抗病毒能力强。与对照组相比，添加枯草芽孢杆菌DB2572的实验组鸡胚尿囊液中新城疫病毒和禽流感病毒的血凝价均大幅下降至2⁰，取得了意料不到的技术效果。

枯草芽孢杆菌DB2572能够在短时间内显著抑制肠道内病原菌，促进有益菌的生长，明显改善肉鸡的腹泻症状。其中，使用枯草芽孢杆菌DB2572一天后，鸡的稀粪数能够减少到10％，粪便逐渐成形，且吐水症状得以改善；使用三天后，稀粪数不足1─2％，且血便现象消失，粪便整体干燥成型，治疗效果显著。

本发明提供的枯草芽孢杆菌DB2572能有效减少禽流感病毒的排出率，抗病毒效果明显。与对照组相比，通过饮水饲喂枯草芽孢杆菌DB2572的实验组鸡感染H9亚型禽流感病毒的数量减少了60％，取得了意料不到的技术效果。

枯草芽孢杆菌DB2572可作为饲料添加剂广泛应用于畜禽养殖领域，有效防控常见疾病的发生，提高养殖效益，应用前景广阔。

说明书附图

图1为DB2572菌株的菌落形态图；

图2为DB2572菌株蛋白质谱峰图；

图3为DB2572菌株基因指纹图谱；

图4为DB2572菌株使用前后腹泻肉鸡的粪便对比图。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明。对于实施例中所用到的具体方法或材料，本领域技术人员可以在本发明技术思路的基础上，根据已有的技术进行常规的替换选择，而不仅限于本发明实施例的具体记载。

本发明所选用的设备和试剂可以选自市售任意一种。

实施例1菌株来源与鉴定

1、样品来源：山东省青岛市平度养殖场鸭肠粘膜。

2、菌株分离与筛选：

用载玻片刮取鸭肠道粘膜，置于无菌离心管中，加入灭菌生理盐水，得到菌悬液，将菌悬液置于80℃水浴锅中，处理10min，取出，迅速冷却；将处理过菌悬液以10倍梯度稀释至合适浓度，取100uL于营养琼脂平板上，涂抹均匀，37℃培养16-24h；挑取营养琼脂平板上已培养好的不同单菌落，进一步划线3次，纯化获得单菌株。申请人从中选取了5株单菌，分别命名为A、B、C、D、E。

将5株菌分别接种到营养肉汤培养基中，37℃，220r/min培养14h；将菌液10000r/min离心5分钟，取上清液，过0.22μm滤器备用。

将稀释后的禽流病毒分别与5株菌的菌液上清等体积混合后，取0.1mL尿囊腔接种到9日龄的SPF鸡胚中，封蜡，置于37℃孵化中，早晚照胚，弃去24内死胚。收获72-96h活胚尿囊液，进行血凝价(HA)测定。具体结果见表1。

血凝价(HA)试验，又称病毒血凝试验，有些病毒如鸡新城疫、禽流感病毒等，具有能凝集禽红细胞的特性，称之为病毒的血凝反应，是病毒的一种生物学特性，依此特性建立的检测方法称为病毒的血凝试验。

一般认为病毒的血凝价越高，则对应的病毒含量越高。血凝价越高说明病毒凝集红细胞的能力越强，因此相应的病毒含量也越高。

表1不同菌株对禽流感病毒血凝价(HA)的影响

菌株	禽流感病毒血凝价
		A	2<sup>9</sup>
B	2<sup>9</sup>
		C	2<sup>9</sup>
D	2<sup>6</sup>
		E	2<sup>9</sup>

从表1的结果来看，在本发明筛选到的5株菌中，D菌株与禽流感病毒等体积混合接种鸡胚后，尿囊液中禽流感病毒的血凝价HA测定值最低。从而说明D菌株能有效降低鸡胚中禽流感病毒的含量，取得了意料不到的技术效果。

申请人将D菌株命名为DB2572，并对其进一步评价。

实施例2 DB2572菌株的鉴定

2.1菌落形态鉴定

如图1所示，DB2572菌株在营养琼脂培养基上的呈微黄色，表面光滑透明，有粘液。

2.2 16S rRNA分子鉴定

采用试剂盒提取菌株DB2572的基因组。然后以该基因组为模板，利用特异性引物对其16S rRNA进行扩增。PCR体系包括：0.7μl 27F，0.7μl 1492R，4μl模板DNA，17.5μlSuperMiX和12.1μl水。PCR反应条件设置为：(1)94℃5min；(2)94℃预变性30s；(3)55℃30s；(4)72℃1min；执行步骤(2)至(4)35循环；(5)72℃10min。PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测并测序得到该菌株16S rRNA序列SEQ ID NO:1。

通过将SEQ ID NO:1在NCBI数据库中进行BLAST比对，发现其与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的相似性最高。因此，初步确定DB2572菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

2.3 MALDI-TOF-MS蛋白质谱鉴定

取少量DB2572单菌落以薄膜的形式涂布于靶板上；加1μL质谱样本预处理试剂盒中的裂解液，室温下自然晾干；加1μL质谱样本预处理试剂盒中的基质溶液覆盖样品，室温下自然晾干；将样品靶放入质谱仪进行鉴定。鉴定结果显示，DB2572菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，其蛋白质谱峰图如图2所示。

2.4 RiboPrinter全自动微生物基因指纹鉴定

根据全自动微生物基因指纹鉴定系统操作说明对菌株DB2572进行了上机鉴定，得到其rRNA基因指纹图，如图3所示，通过与已知标准菌株库指纹图进行比对，发现DB2572菌株与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的相似度最高，达90％以上。因此，鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

综上，申请人利用16S rRNA测序、MALDI-TOF-MS蛋白质谱、RiboPrinter全自动微生物基因指纹鉴定系统三种分子生物学手段对DB2572菌株进行鉴定，鉴定结果一致。再结合DB2572菌株的菌落形态特征，申请人确定该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，命名为枯草芽孢杆菌DB2572(Bacillus subtilis DB2572)。

申请人已于2020年11月16日将上述枯草芽孢杆菌DB2572(Bacillus subtilisDB2572)保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2020744。

实施例2枯草芽孢杆菌DB2572的抑菌能力

1、抑菌能力评价

将枯草芽孢杆菌DB2572先在平板上培养，将培养好的枯草芽孢杆菌DB2572取1接种环接种到营养肉汤培养基中，37℃，220r/min培养14h，制备成供试菌液，菌量为10⁸～10⁹CFU/ml备用。

2、病原菌的准备

将收集到的鸭疫里默氏杆菌血清1型、血清2型接种含胎牛血清的TSB培养基中，37℃，220r/min培养24h后备用；将大肠杆菌、沙门氏菌病原菌甘油管或斜面接种于营养肉汤培养基中，37℃，220r/min培养16～18h后备用；产气荚膜梭菌接种于营养肉汤培养基中，37℃厌氧培养24h后备用。

取无菌平皿，倾注无菌营养琼脂培养基18～20mL，使其在平皿内均匀摊布，放置水平台面上使凝固，作为底层，将平板倒置平均划分区域并标记待添加物。另取适量无菌半固体营养琼脂培养基(鸭疫里默氏杆菌用TSA培养基)，放冷至48～50℃，每50～100mL培养基加入病原菌菌悬液1～2mL，在每个平皿中分别加入5mL半固体营养琼脂培养基，使其在底层上均匀摊布，作为菌层。放置在水平台上冷却后，在每1平皿中以等距离均匀安置牛津杯4～6个。每个双层平皿中的牛津杯中分别滴装扩培好的枯草芽孢杆菌DB2572菌液0.2mL，37℃培养24h后，测量各抑菌圈直径，枯草芽孢杆菌DB2572对5种病原菌的抑菌效果如表2所示。

表2枯草芽孢杆菌DB2572对不同病原菌的抑菌效果

病原菌	抑菌圈直径mm
		鸭疫里默氏杆菌血清1型	22±1.0
鸭疫里默氏杆菌血清2型	22±1.0
		大肠杆菌O78	22±1.0
沙门氏菌	21±1.0
		鸡源产气荚膜梭菌	20±1.0

从表2的结果可以看出，本发明筛选到的枯草芽孢杆菌DB2572对鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌等多种病原菌均具有显著的抑菌效果，尤其是对鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌的抑菌效果最强，抑菌圈直径达到22mm，效果非常显著。

实施例3枯草芽孢杆菌DB2572降低病毒血凝价能力的评价

1、供试菌液离心液的制备

将枯草芽孢杆菌DB2572取1接种环接种到LB培养基中，37℃，220r/min培养48h，镜检成孢率在90％以上；将菌液10000r/min离心5分钟，取菌液上清，过0.22μm滤器备用。

2、禽流感病毒、新城疫病毒稀释液的制备

H9N2禽流感种毒、VGGA新城疫种毒，用无菌PBS做5000倍稀释备用。

3、枯草芽孢杆菌DB2572降低禽流感病毒、新城疫病毒HA效果的评价

将稀释后禽流感种毒、新城疫种毒分别与枯草芽孢杆菌DB2572菌液上清等体积混合后，取0.1mL尿囊腔接种到9日龄的SPF鸡胚中，封蜡，置于37℃孵化中，早晚照胚，弃去24内死胚。收获72-96h活胚尿囊液，进行血凝价(HA)测定。

表3枯草芽孢杆菌DB2572对病毒血凝价的影响

从表3可以看出，与对照组相比，添加枯草芽孢杆菌DB2572的实验组鸡胚尿囊液中新城疫病毒和禽流感病毒的血凝价均大幅下降至2⁰。从而说明，枯草芽孢杆菌DB2572能够有效抑制病毒在鸡胚中的复制，降低病毒的血凝价，具有很强的抗病毒能力，取得了意料不到的技术效果。

实施例4枯草芽孢杆菌DB2572产酶能力评价

1、供试菌液的制备

将枯草芽孢杆菌DB2572先在平板上培养，将培养好的枯草芽孢杆菌DB2572取1接种环接种到LB培养基中，37℃，220r/min培养14h，制备成供试菌液备用。

2、枯草芽孢杆菌DB2572产淀粉酶能力评价

将培养好的枯草芽孢杆菌DB2572的菌液接种到含有淀粉的琼脂培养基上，37℃培养48h，可以看到菌株DB2572周围有透明圈产生，透明圈直径为20mm，枯草芽孢杆菌DB2572可以产生一定的淀粉酶。

实施例5枯草芽孢杆菌DB2572对家禽肠炎腹泻的治疗试验

(1)试验地点：河北沧州

(2)试验设计：

个体养殖户，两栋鸡舍，其中一栋32日龄鸡群开始出现吐水、水样腹泻现状，采食、鸡群整体状态皆正常，用青霉素治疗2天，呕吐、腹泻现状有所改善，稀便数约占30％，存在少量血便。

34日龄开始按照鸡舍饮水量添加枯草芽孢杆菌DB2572菌粉(10¹¹CFU/g)，250克/吨水，2─3小时集中饮用，连用4天。

(3)试验结果及分析

结果如图4所示，使用枯草芽孢杆菌DB2572前，鸡为水样腹泻，稀便数约占30％；使用枯草芽孢杆菌DB2572一天后，鸡的稀粪数能够减少到10％，粪便逐渐成形，且吐水症状得以改善；使用三天后，稀粪数不足1─2％，且血便现象消失，粪便整体干燥成型。推荐养殖户继续使用2天，加以巩固肠道优势菌群，修复肠道粘膜，强化营养物质的消化吸收，促进肉鸡生长。

上述结果表明，本发明提供的枯草芽孢杆菌DB2572能够在短时间内显著抑制肠道内病原菌，促进有益菌的生长，明显改善肉鸡肠道腹泻症状，取得了意料不到的技术效果。

实施例6枯草芽孢杆菌DB2572对H9亚型禽流感病毒的排毒抑制试验

1、试验地点：青岛农业大学动物医学院实验基地

2、试验设计：

20只SPF鸡，10只作为实验组，10只作为对照组，分别饲养于隔离器内，28日龄进行H9亚型禽流感攻毒，0.2mL/只翅静脉注射，其中实验组于攻毒前7天、攻毒后5天，饮水饲喂枯草芽孢杆菌DB2572菌粉(10¹¹CFU/g)，250克/吨水。于攻毒后的第5d采集每只鸡的泄殖腔棉拭子，检测攻毒后的排毒情况。

将分离的棉拭子样品各尿囊腔接种5枚10日龄SPF鸡胚，0.2mL/枚，置37℃孵育。每日照胚，弃去24h内死胚，之后随时取出死亡鸡胚放4℃冷藏，孵化至120h。收获每枚鸡胚尿囊液，测定红细胞血凝价，HA在2⁴以上判为感染。每组5枚鸡胚中有1枚感染即判为分离阳性。

3、试验结果及分析

表4枯草芽孢杆菌DB2572对H9亚型禽流感排毒能力的评价

从表4的结果来看，与对照组相比，通过饮水饲喂枯草芽孢杆菌DB2572的实验组鸡感染H9亚型禽流感病毒的数量减少了60％，从而说明，本发明提供的枯草芽孢杆菌DB2572能有效减少禽流感病毒的排出率，抗病毒效果明显。

综上，本发明所述枯草芽孢杆菌DB2572可广泛应用于大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌等常见畜禽病菌的防控，同时可有效对抗新城疫、禽流感等含有血凝素的病毒，效果显著，应用前景广阔。

序列表

<110> 山东蔚蓝生物科技有限公司

山东康地恩生物科技有限公司

<120> 一种具有抑菌和降低病毒血凝价功能的枯草芽孢杆菌及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1437

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400> 1

aatcatctgt cccaccttcg gcggctggct cctaaaaggt tacctcaccg acttcgggtg 60

ttacaaactc tcgtggtgtg acgggcggtg tgtacaaggc ccgggaacgt attcaccgcg 120

gcatgctgat ccgcgattac tagcgattcc agcttcacgc agtcgagttg cagactgcga 180

tccgaactga gaacagattt gtgggattgg cttaacctcg cggtttcgct gccctttgtt 240

ctgtccattg tagcacgtgt gtagcccagg tcataagggg catgatgatt tgacgtcatc 300

cccaccttcc tccggtttgt caccggcagt caccttagag tgcccaactg aatgctggca 360

actaagatca agggttgcgc tcgttgcggg acttaaccca acatctcacg acacgagctg 420

acgacaacca tgcaccacct gtcactctgc ccccgaaggg gacgtcctat ctctaggatt 480

gtcagaggat gtcaagacct ggtaaggttc ttcgcgttgc ttcgaattaa accacatgct 540

ccaccgcttg tgcgggcccc cgtcaattcc tttgagtttc agtcttgcga ccgtactccc 600

caggcggagt gcttaatgcg ttagctgcag cactaagggg cggaaacccc ctaacactta 660

gcactcatcg tttacggcgt ggactaccag ggtatctaat cctgttcgct ccccacgctt 720

tcgctcctca gcgtcagtta cagaccagag agtcgccttc gccactggtg ttcctccaca 780

tctctacgca tttcaccgct acacgtggaa ttccactctc ctcttctgca ctcaagttcc 840

ccagtttcca atgaccctcc ccggttgagc cgggggcttt cacatcagac ttaagaaacc 900

gcctgcgagc cctttacgcc caataattcc ggacaacgct tgccacctac gtattaccgc 960

ggctgctggc acgtagttag ccgtggcttt ctggttaggt accgtcaagg tgccgcccta 1020

tttgaacggc acttgttctt ccctaacaac agagctttac gatccgaaaa ccttcatcac 1080

tcacgcggcg ttgctccgtc agactttcgt ccattgcgga agattcccta ctgctgcctc 1140

ccgtaggagt ctgggccgtg tctcagtccc agtgtggccg atcaccctct caggtcggct 1200

acgcatcgtc gccttggtga gccgttacct caccaactag ctaatgcgcc gcgggtccat 1260

ctgtaagtgg tagccgaagc caccttttat gtctgaacca tgcggttcaa acaaccatcc 1320

ggtattagcc ccggtttccc ggagttatcc cagtcttaca ggcaggttac ccacgtgtta 1380

ctcacccgtc cgccgctaac atcagggagc aagctcccat ctgtccgctc gactgca 1437

Claims (10)

1.一株枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌的保藏编号为CCTCC NO：M2020744。

2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在制备具有抗病毒功能的制品中的应用。

3.如权利要求2所述的病毒为禽流感病毒。

4.如权利要求2所述的病毒为新城疫病毒。

5.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在制备预防和治疗畜禽腹泻的制品中的应用。

6.一种饲料添加剂，其特征在于，所述的饲料添加剂包含权利要求1所述的枯草芽孢杆菌。

7.如权利要求6所述的饲料添加剂，其特征在于，所述的饲料添加剂还包含地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌，凝结芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、丁酸梭菌、屎肠球菌、乳酸菌、粪肠球菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌中的任意一种或多种的组合。

8.如权利要求6或7所述的饲料添加剂，其特征在于，所述的饲料添加剂为菌粉。

9.如权利要求6-8任一所述的饲料添加剂，其特征在于，所述的饲料添加剂中枯草芽孢杆菌的活菌量不低于10⁹CFU/g。

10.权利要求6-9任一所述的饲料添加剂在畜禽养殖中的应用。

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