CN110573606A

CN110573606A - 改善动物性能参数的枯草芽孢杆菌菌株

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Publication number: CN110573606A
Application number: CN201880026305.6A
Authority: CN
Inventors: D·山特维安; T·施第里施维
Original assignee: Section Hansen Co ltd
Current assignee: Section Hansen Co ltd
Priority date: 2017-03-14
Filing date: 2018-03-14
Publication date: 2019-12-13
Anticipated expiration: 2038-03-14
Also published as: BR112019019014A2; MX2019010805A; WO2018167171A1; KR20190128200A; CA3056482A1; CO2019010014A2; PH12019502073A1; KR102631247B1; ZA201905962B; US20200222472A1; PE20200178A1; AU2018234953A1; US20220218763A1; EP3596238A1; US11291695B2; CN110573606B; AU2018234953B2

Abstract

本发明提供了枯草芽孢杆菌菌株，其选自a)作为DSM32324保藏的菌株，b)作为DSM32325保藏的菌株，和c)(a)或(b)的对氨苄青霉素、万古霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、红霉素、克林霉素、四环素和氯霉素具有敏感性，并且对大肠杆菌和产气荚膜梭菌具有抑制活性的突变菌株。本发明还涉及作为直接饲喂微生物(DFM)、预混物、动物饲料添加剂或动物饲料的芽孢杆菌组合物，其包含至少一种本发明的枯草芽孢杆菌菌株，优选枯草芽孢杆菌菌株DSM32324和/或枯草芽孢杆菌菌株DSM32325。本发明提供了通过将本发明的菌株或组合物饲喂给动物来改善一种或多种动物性能参数的方法，所述动物性能参数选自：i)增强的体重增加(WG)，ii)较低的饲料转化率(FCR)，iii)较低的坏死性肠炎病变评分，iv)较低的坏死性肠炎频率，v)较低的坏死性肠炎死亡率，vi)增加的欧洲生产效率因子(EPEF)，和vii)较低的死亡率。

Description

改善动物性能参数的枯草芽孢杆菌菌株

技术领域

本发明提供了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株，其选自由以下组成的组：a)作为DSM32324保藏的菌株，b)作为DSM32325保藏的菌株，和c)(a)或(b)的突变菌株，所述突变菌株对氨苄青霉素、万古霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、红霉素、克林霉素、四环素和氯霉素具有敏感性；并且对大肠杆菌(Escherichia coli)和产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)具有抑制活性。

本发明还涉及作为直接饲喂微生物(Direct Fed Microbial,DFM)、预混物、动物饲料添加剂或动物饲料的芽孢杆菌(Bacillus)组合物，其包含至少一种本发明的枯草芽孢杆菌菌株，优选枯草芽孢杆菌菌株DSM32324和/或枯草芽孢杆菌菌株DSM32325。

本发明提供了通过向动物饲喂本发明的菌株或组合物改善一种或多种动物性能参数的方法，所述动物性能参数选自由以下组成的组：i)增强的体重增加(WG)，ii)较低的饲料转化率(FCR)，iii)较低的坏死性肠炎病变评分，iv)较低的坏死性肠炎频率，v)较低的坏死性肠炎死亡率，vi)增加的欧洲生产效率因子(EPEF)，和vii)较低的死亡率。

背景技术

2006年欧盟逐步淘汰抗生素生长促进剂导致对具有高效率和对人类和兽医重要的抑制剂易感性的具有成本效益的饲料添加剂的需求增加。

已知基于芽孢杆菌(Bacillus)的益生菌饲料添加剂对猪和家禽的健康和生产具有积极作用。这些产品与饲料行业相关，因为孢子具有热稳定性，并且能够在高达90-95℃温度下的制粒过程中存活。形成内生孢子的细菌枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)通常被美国食品和药物管理局(FDA)认为是安全的(GRAS)，并且美国饲料管理官员协会(AAFCO)接受其包括在动物饮食或水中。

WO2013/153159描述了选择具有抗生素敏感性、大肠杆菌和产气荚膜梭菌抑制活性以及高孢子形成的芽孢杆菌菌株的方法。

筛选的许多分离物表现出高于欧洲食品安全局(EFSA)定义的折点的不良抗生素抗性，并且由于安全顾虑而被放弃。几种所述分离物显示抑制产气荚膜梭菌，而只有少数分离物抑制大肠杆菌。对病原体具有最佳抑制作用的菌株主要是解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)。

WO2016/060934在表7中显示了10种芽孢杆菌菌株的抗E.coli活性。六种解淀粉芽孢杆菌菌株中的五种显示出抗大肠杆菌活性，而两种枯草芽孢杆菌菌株中的仅一种，即从Kemin产品clostat中分离的菌株，证明了抗大肠杆菌活性。有趣的是，后来发现该菌株是解淀粉芽孢杆菌，参见WO2016/118840(第46页，第23行)。

WO2016118840描述了用于改善生产动物的健康和性能的各种芽孢杆菌菌株，特别是两种解淀粉芽孢杆菌菌株和两种枯草芽孢杆菌菌株(参见表3.1)。仅发现两种菌株，即作为DSM29870保藏的枯草芽孢杆菌菌株和作为DSM29869保藏的解淀粉芽孢杆菌菌株，对所有八种测试的抗生素都是敏感的。未提供氨苄青霉素的结果。

发现作为DSM29870保藏的枯草芽孢杆菌菌株在体外抑制大肠杆菌菌株ATCC10535和ATC25922的生长(实施例4)。实施例7提供了三种产气荚膜梭菌攻击试验的结果。对于在这些试验中测量的所有参数，DSM29870饲喂组(T4)和杆菌饲喂组(T3)之间没有显著差异。BWG、FCR和具有坏死性肠炎病变的禽死亡率的结果介于未感染的未处理组(T1)和感染的未处理组(T2)之间。

然而，仍然需要可用于改善生产动物的健康和性能的益生菌菌株。

发明内容

本发明提供了枯草芽孢杆菌菌株，其选自由以下组成的组：a)作为DSM32324保藏的菌株，b)作为DSM32325保藏的菌株，和c)(a)或(b)的突变菌株，所述突变菌株对氨苄青霉素、万古霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、红霉素、克林霉素、四环素和氯霉素具有敏感性；并且对大肠杆菌和产气荚膜梭菌具有抑制活性。

细菌菌株是指在生长或繁殖时遗传上保持不变的细菌。当提及菌株时，包括大量这种相同的细菌。

可以将包含至少一种本发明的枯草芽孢杆菌菌株的组合物，例如作为直接饲喂微生物(DFM)、动物饲料添加剂或预混物或动物饲料饲喂给动物。

可以在供应商生产期间、在生产之后或由饲喂动物的人，恰好在向动物提供饲料之前，将本发明的至少一种枯草芽孢杆菌菌株添加到饲料中。用于本文所述方法和组合物的枯草芽孢杆菌特别合适，因为它们能够在生产干燥颗粒饲料产品的过程的热和压力条件下存活(作为孢子)。

由产气荚膜梭菌引起的坏死性肠炎已成为现代家禽生产中的严重经济问题。实施例中描述的一些体内研究的目的是探讨包含本发明的枯草芽孢杆菌菌株的饲料添加剂对肉鸡笼研究中坏死性肠炎(NE)发病机理的影响。家禽中的其他体内研究主要针对产气荚膜梭菌攻击或不攻击情况下的性能。

已经进行了单个层架式鸡笼/地面围栏研究，以评估枯草芽孢杆菌DSM32324和DSM32325对亚临床坏死性肠炎发展的影响。已经使用了两个不同的独立研究设施，一个位于欧洲(实施例3，DSM32324)，另一个在美国(实施例4，DSM32325)，这意味着使用略微不同的评估参数来评估两种菌株的效果。

对于枯草芽孢杆菌DSM3234，在考虑枯草芽孢杆菌DSM3234作为饲料添加剂时，与未处理的感染对照组相比，在第21天、第35天和第42天测量的性能参数即饲料转化率(FCR)和平均体重增加(AWG)对于所有数据点表现出显著改善。令人惊讶的是，芽孢杆菌处理组与未感染的非加药对照组没有显示出任何显著差异，即使后者没有接受该攻击并且被认为是健康的(表7)。

在诱导的亚临床肠炎体内攻击试验中，枯草芽孢杆菌DSM3234降低了鸡的坏死性肠炎病变评分并显著降低了坏死性肠炎死亡率(表8)。

当结合第25天和第26天的数据时，与感染的未处理对照相比，枯草芽孢杆菌DSM32325以统计学上显著的方式降低了鸡的坏死性肠炎频率。令人惊讶的是，芽孢杆菌处理组的坏死性肠炎频率甚至低于阿莫西林处理对照组(表9)。

此外，当组合第25天和第26天的数据时，与感染的未处理对照相比，枯草芽孢杆菌DSM32325以统计学上显著的方式降低了坏死性肠炎严重性(平均评分)。令人惊讶的是，芽孢杆菌处理组的平均得分甚至低于阿莫西林处理组(表10)。

还在两个性能饲喂试验即实施例5(DSM32324和DSM32325)和实施例6(DSM32324)中评估了两种枯草芽孢杆菌菌株。

实施例5提供了1800只Ross 308雄性肉鸡的试验结果，发现在全局肥育期(0-42日龄)，补充了芽孢杆菌菌株DSM32324或DSM32325的肉鸡比对照动物生长更显著。与对照动物相比，所有补充了DSM19489、DSM32324和DSM32325的肉鸡的饲料转化率(FCR)和EPEF均显著改善。

实施例6提供了每个处理组1300只Ross 308雄性肉鸡的试验结果，并证明DSM19489具有降低死亡率的趋势(p＝0.096)，且枯草芽孢杆菌DSM32324具有明显且显著降低的死亡率，尤其是在育肥期(finisher period)，其也用作全部试验的死亡率的统计学意义。

实施例7探讨三种选择的芽孢杆菌菌株(DSM32324、DSM32325和DSM25840)对性能和表观回肠消化率的影响，并得出所有三种菌株都显示出令人惊讶的良好且显著改善的结果这一结论。

与未补充的禽相比，补充了DSM32324的禽在起始期显示出更高的日增重(表16)、每日采食量和饲料转化率(数据未显示)，并在第42天显示出更高的蛋白质消化率(表17)。

与未补充的禽相比，补充了DSM25840的禽在起始期显示出更高的日增重(表16)和每日采食量(数据未显示)，并在第42天显示出更高的体重(表16)和在第42天更高的灰分、蛋白质和能量消化率(表17)。

与未补充的禽相比，补充了DSM32325的禽在起始期显示出更高的日增重(表16)和每日采食量(数据未显示)，并在第42天显示出更低的Ca和磷消化率(表17)。

总之，这些研究已经证明，作为DSM32324和DSM32325保藏的枯草芽孢杆菌菌株在体内攻击试验中显示出对降低坏死性肠炎的作用，并且对家禽的性能参数的积极作用。重要发现是，体重增加(WG)显著增强，饲料转化率(FCR)显著降低，死亡率显著降低和欧洲生产效率因子(EPEF)显著增加。

实施例8表明，本发明的芽孢杆菌组合物EPB5，其包含比例为8:3:5的DSM32324、DSM25840和DSM32325，与饲喂相应饮食而不添加益生菌的禽相比，改善了肉鸡的性能。在饲料转化率和平均体重增加方面证实了积极的响应。令人惊讶的是，与用芽孢杆菌单菌株处理的组相比，EBP5处理组显示出一些性能参数的显著改善，其再次证明了与非加药感染对照组在性能参数方面的显著差异。此外，单菌株枯草芽孢杆菌DSM32234、枯草芽孢杆菌DSM32235和解淀粉芽孢杆菌DSM25840以及组合EBP5二者均在体内攻击试验中显著降低了鸡的坏死性肠炎病变评分并显著降低了坏死性肠炎死亡率。

实施例9表明，与饲喂相应饮食而不添加益生菌的禽相比，本发明的芽孢杆菌组合物在250mg/kg-2000mg/kg的剂量水平改善了1-147日龄火鸡的性能(147天的饲喂期)。在体重增加、饲料转化率和排泄物干物质含量方面证实了积极响应。

实施例10表明，本发明的芽孢杆菌组合物可以与诸如活鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)疫苗等疫苗组合，而不影响疫苗的最初沙门氏菌定殖及其随后在肉鸡中防御海德堡沙门氏菌(Salmonella Heidelberg)攻击的能力。该研究表明，同时具有疫苗和芽孢杆菌组合物甚至可具有累加效应(表20)。

定义

总体上，本文使用的术语和短语具有本领域公认的含义，其可以通过参考标准文本、期刊文献和本领域技术人员已知的内容找到。为了阐明它们在本公开的上下文中的具体用途，提供以下定义。

如本文所用，除非上下文另有明确说明，单数形式“a(一)”，“an(一)”和“所述”旨在也包括复数形式。

动物饲料：术语“动物饲料”是指适合于或旨在被动物摄取的任何化合物、制剂或混合物。用于单胃动物的动物饲料包含浓缩物以及例如维生素、矿物质、酶、氨基酸和/或其他饲料成分(例如在预混物中)。动物饲料还可包含草料(forage)。实施例3-7给出了家禽饲料的实例。

组合物：术语“组合物”是指包含载体和至少一种本文所述的细菌菌株的组合物。本文所述的组合物可以是直接饲喂微生物(DFM)、动物饲料添加剂或预混物或动物饲料。

浓缩物：术语“浓缩物”是指具有高蛋白质和能量浓度的饲料，例如鱼粉、糖蜜、寡糖、高粱、种子和谷物(整体或通过由例如玉米、燕麦、黑麦、大麦、小麦等碾碎、碾磨等制备)、油料压榨饼(例如来自棉籽、红花、向日葵、大豆(如豆粕)、油菜籽/卡诺拉(canola)、花生或落花生)、棕榈仁饼、酵母衍生材料和酒糟(如湿酒糟(WDS)和具有可溶物的干酒糟(DDGS))。

控制产气荚膜梭菌感染和/或坏死性肠炎：术语“控制产气荚膜梭菌感染和/或坏死性肠炎”是指部分或完全抑制动物中产气荚膜梭菌感染和/或坏死性肠炎的方法和/或组合物。因此，术语“控制产气荚膜梭菌感染和/或坏死性肠炎”是指产气荚膜梭菌感染和/或坏死性肠炎降低或完全消除。

直接饲喂微生物：术语“直接饲喂微生物”或“DFM”是指当以足够的量施用时赋予宿主诸如消化或健康改善等益处的活微生物，包括孢子。

厌氧条件下的酶活性：术语“厌氧条件下的酶活性”是指芽孢杆菌菌株在厌氧条件下生长期间产生的酶的活性。WO2013/153159的实施例4描述了测试芽孢杆菌菌株产生酶木聚糖酶、纤维素和蛋白酶的方法。

欧洲生产效率因子(EPEF)：欧洲生产效率因子是比较鸡群活禽性能的方式。这个单一数字有助于比较农场内部和农场之间的性能，并可用于评估环境、气候和管理变量。EPEF计算为[(存活率(％)×活体重(kg))/(耗尽年龄(天)×FCR)]×100，其中存活率是研究结束时存活的禽的百分比，活体重是研究结束时禽的平均体重增加，耗尽年龄是研究结束时禽的年龄，FCR是研究结束时的饲料转化率。

有效量/浓度/剂量：术语“有效量”、“有效浓度”或“有效剂量”定义为足以改善动物的消化或产率的细菌菌株的量、浓度或剂量。绝对数量的实际有效剂量取决于以下因素，包括：所讨论动物的健康状况、存在的其他成分。细菌菌株的“有效量”、“有效浓度”或“有效剂量”可通过本领域技术人员已知的常规测定来确定。实施例3、4、5、6和7给出了家禽有效量的实例。

饲料转化率(FCR)：FCR是动物将饲料质量转换为所需产出增加的效率的量度。为了肉类而饲喂的动物-例如猪、家禽、牛、绵羊和鱼-产出是动物获得的质量。具体而言，FCR是在指定的时间段内所食用的食物的质量除以产出。可以根据实施例7的描述测定FCR。FCR的改善意味着FCR值的降低。

饲喂动物：术语“饲喂动物”或“饲喂至动物”是指将本发明的组合物以有效量口服施用于动物。例如，在指定的时间段内，例如几天、一周、几周、一个月或几个月，口服施用可以每天重复一次或多次。饲喂家禽可以例如如实施例3、4、5、6和7中所述进行。因此，术语“饲喂(feeding)”或“饲喂(fed)”是指任何类型的口服施用，例如通过动物饲料或通过饮用水施用，或者在某些情况下，通过口灌或气溶胶喷雾施用。

草料(forage)：如本文所定义的术语“草料”还包括粗饲料。草料是来自草料植物、草和其他草料植物、海藻、发芽谷物和豆类或其任何组合的新鲜植物材料，例如干草和青贮饲料(silage)。草料植物的实例是苜蓿(Alfalfa)(苜蓿(lucerne))、百脉根、芸苔(例如羽衣甘蓝、油菜籽(卡诺拉)、芜菁甘蓝(芜菁)、萝卜)、三叶草(例如杂三叶草(alsikeclover)、红三叶草、地下三叶草、白三叶草)、草(例如百慕大草、雀麦、假燕麦草、牛毛草、石南草、草地草、果园草、黑麦草、梯牧草(Timothy-grass))、玉米(corn)(玉米(maize))、小米、大麦、燕麦、黑麦、高粱、大豆和小麦以及甜菜等蔬菜。草料还包括来自谷物生产的作物残余物(例如玉米秸秆，小麦、大麦、燕麦、黑麦和其他谷物的秸秆)、甜菜顶部等蔬菜残留物、油料生产中的残留物，例如大豆、油料和其他豆类的茎叶，以及来自用于动物或人类消费的谷物精制的部分或来自燃料生产或其他工业的部分。

对产气荚膜梭菌的抑制活性：术语“对产气荚膜梭菌的抑制活性”是指产气荚膜梭菌的生长受到抑制和/或一些或所有产气荚膜梭菌被杀死。这可以通过实施例1所述的测定来测定。

对大肠杆菌的抑制活性：术语“对大肠杆菌的抑制活性”是指E.coli的生长受到抑制和/或一些或所有大肠杆菌被杀死。这可以通过实施例1所述的测定来测定。

分离的：术语“分离的”是指本文所述的细菌菌株处于天然不存在的形式或环境中，即该菌株至少部分地从天然与之伴生的一种或多种或所有天然存在的成分中除去。

颗粒(pellet)：术语“颗粒”和/或“制粒(pelleting)”是指实心圆形、球形和/或圆柱形片剂或丸粒，以及形成这种固体形状，特别是饲料颗粒和固体挤出动物饲料的方法。如本文所用，术语“挤出(extrusion)”或“挤出(extruding)”是本领域熟知的术语，并且是指在压力下迫使如本文所述的组合物通过孔的方法。

家禽：术语“家禽”是指人类为其生产的蛋和/或其肉和/或其羽毛而饲养的家养的禽。家禽包括种禽(breeder)、肉禽和蛋禽(layer)。家禽包括总目鸡雁小纲(Galloanserae)(飞禽)的成员，特别是鸡形目(Galliformes)(包括鸡、珍珠鸡(Guineafowls)、鹌鹑和火鸡)和雁形目(Anseriformes)中的雁鸭科(Anatidae)，通常称为“水禽”，包括家养鸭和家养鹅。家禽还包括其他因肉类而被杀死的鸟类，如鸽子和鸵鸟。家禽的实例包括鸡(包括蛋鸡、肉鸡和雏鸡)、鸭、鹅、鸽子、火鸡和鹌鹑。

预防产气荚膜梭菌感染和/或坏死性肠炎：术语“预防产气荚膜梭菌感染和/或坏死性肠炎”是指防止动物发展产气荚膜梭菌感染和/或坏死性肠炎的方法和/或组合物。

还原性糖：还原性糖是具有反应性醛基或能够形成糖以使糖充当还原剂的任何糖。还原性末端通过酶促切割聚合碳水化合物之间的糖苷键而形成。还原性糖包括葡萄糖、甘油醛和半乳糖以及二糖，例如乳糖和麦芽糖，并且可以通过Nelson-Somogyi(NS)或二硝基水杨酸(DNS)方法测量。DNS是可与还原性糖和其他还原分子性反应形成在540nm处强烈吸收光的3-氨基-5-硝基水杨酸的芳香化合物。该测定模拟饲料被动物摄取并在消化道中消化的情形。实施例2研究了不同芽孢杆菌菌株将非淀粉多糖(NSP)降解为还原性糖的能力。

粗饲料：术语“粗饲料”是指具有高水平纤维的干植物材料，例如来自种子和谷物的纤维、麸皮、外皮和作物残余物(例如干草、椰子核、稻草、谷壳、甜菜废物)。

对抗生素敏感：术语“对抗生素敏感”是指细菌菌株的表型特性，即在细菌菌株本来会生长的条件下所述细菌菌株的生长受到抑制。在这种情况下，根据CLSI指南(M07-A8和M45-A2)测试对抗生素的敏感性。如果仅在等于或低于EFSA Journal 2012；10(6):2740规定的万古霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、红霉素、克林霉素、四环素和氯霉素的折点浓度检测到生长，则认为芽孢杆菌菌株是敏感的。对于氨苄青霉素，EFSA没有给出芽孢杆菌的折点；已选择折点4mg/L用于视为敏感的菌株。

青贮饲料：术语“青贮饲料”是指，可饲喂马等食草动物和骆驼、羊驼、牛以及绵羊等反刍动物，或用作厌氧消化池的生物燃料原料的发酵的高水分储存饲料。它在称作青贮(ensilage)、青贮(ensilinge)或者青贮(silaging)的过程中被发酵和储存，通常由草或谷物(例如玉米、高粱、燕麦、黑麦、梯牧草、饲草植物)或例如三叶草(clover)/三叶草(trefoils)、苜蓿、野豌豆等豆类作物，使用整个绿色植物(不仅仅是谷物)制成。青贮饲料可以由许多大田作物制成，并且可以根据类型使用特殊术语(用于燕麦的燕麦青贮，用于苜蓿的半干青贮)。青贮饲料通过以下方式制成：将切好的绿色植被放入筒仓，将其堆放在覆盖着塑料薄膜的大堆中，或者将大捆裹在塑料膜中。

孢子：术语“孢子”和“内生孢子”可互换，并具有本领域技术人员熟知和理解的正常含义。如本文所用，术语孢子是指处于休眠、受保护的非繁殖状态的微生物。

稳定：术语“稳定”是本领域已知的术语，并且在优选的方面，稳定旨在表示微生物在被施用于动物以改善动物健康之前保持活体形式的能力。

猪(swine)：术语“猪(swine)”或“猪(pig)”是指人类为了食物例如肉而饲养的家养的猪。猪包括猪属(Sus)的成员，例如家猪(Sus scrofa domesticus)或家猪(Susdomesticus)，并且包括仔猪、断奶仔(weaner)、雏猪(growers)、育成猪(finisher)、hocks、polts、小母猪(gilts)、母猪(sow)和妊娠母猪(gestation sow)。

植物蛋白质：术语“植物蛋白质”是指包含至少一种衍生自或源自植物的蛋白质的任何化合物、制剂或混合物，包括修饰的蛋白质和蛋白质衍生物。

植物蛋白质可以源自植物蛋白质源，例如豆类和谷类，例如来自以下各科植物的材料：蝶形花科(Fabaceae)(豆科(Leguminosae))，例如大豆、羽扇豆、豌豆或豆类；十字花科(Cruciferaceae)，藜科(Chenopodiaceae)，例如甜菜(beet)、甜菜(sugar beet)、菠菜或藜麦；和禾本科(Poaceae)。植物蛋白质源的其他实例是谷物，例如大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉米(玉米)、大米和高粱。

体重增加：动物的体重增加是动物在指定时间段内体重的增加。实施例3中给出了平均体重增加测定的实例，实施例7给出了每日体重增加测定的实例。

具体实施方式

本发明提供了枯草芽孢杆菌菌株，其选自由以下组成的组：作为DSM32324保藏的菌株，作为DSM32325保藏的菌株，以及DSM32324或DSM32325的突变菌株，所述突变菌株对氨苄青霉素、万古霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、红霉素、克林霉素、四环素和氯霉素具有敏感性，并且对大肠杆菌和产气荚膜梭菌具有抑制活性。

分离本文所述的细菌菌株，即以天然不存在的形式存在或在天然不存在的环境中存在。

“突变细菌”或“突变菌株”是指在基因组(DNA)中包含一个或多个在亲本菌株DNA中不存在的突变的天然(自发的、天然存在的)突变细菌或诱导的突变细菌。“诱导突变体”是其中突变是通过人类处理诱导的细菌，例如用任何常规使用的诱变处理进行处理，包括用化学诱变剂处理，例如选自以下的化学诱变剂：(i)与DNA结合或掺入DNA的诱变剂，例如碱基类似物，例如2-氨基嘌呤，或嵌入剂例如ICR-191，(ii)与DNA反应的诱变剂，包括烷基化试剂，例如亚硝基胍或羟胺，或甲基磺酸乙酯(EMS)或N-甲基-N'-硝基-N-硝基胍(NTG)，UV-或γ-辐射等。相比之下，“自发突变体”或“天然存在的突变体”尚未被人工诱变。

突变体可能已进行了几次诱变处理(单一处理应理解为一个诱变步骤，然后进行筛选/选择步骤)，但目前优选进行不超过20次或不超过10次或不超过5次处理(或筛选/选择步骤)。在目前优选的突变体中，与母株相比，细菌基因组中少于1％，少于0.1％，少于0.01％，少于0.001％或甚至少于0.0001％的核苷酸被另一个核苷酸替换或缺失。

上述突变细菌是非GMO(非转基因的)，即未通过重组DNA技术修饰。作为通过随机诱变提供突变体的上述优选方法的替代方案，也可能的是通过定点诱变提供这种突变体，例如通过使用适当设计的克隆技术。

当突变体作为自发发生的突变体提供时，对菌株进行选择步骤而不进行任何前述诱变处理。

在一个实施方案中，本发明的枯草芽孢杆菌菌株与DSM32324的核苷酸序列具有至少98％(例如至少98.5％，例如至少99％，例如至少99.5％，例如至少99.6％，例如至少99.7，例如至少99.8％，例如至少99.9％)的序列同一性。

在一个实施方案中，本发明的枯草芽孢杆菌菌株与DSM32324的氨基酸序列具有至少98％(例如至少98.5％，例如至少99％，例如至少99.5％，例如至少99.6％，例如至少99.7％，例如至少99.8％，例如至少99.9％)的序列同一性。

在一个实施方案中，本发明的枯草芽孢杆菌菌株与DSM32325的核苷酸序列具有至少98％(例如至少98.5％，例如至少99％，例如至少99.5％，例如至少99.6％，例如至少99.7％，例如至少99.8％，例如至少99.9％)的序列同一性。

在一个实施方案中，本发明的枯草芽孢杆菌菌株与DSM32325的氨基酸序列具有至少98％(例如至少98.5％，例如至少99％，例如至少99.5％，例如至少99.6％，例如至少99.7％，例如至少99.8％，例如至少99.9％)的序列同一性。

如果抑菌圈至少为0.5mm(低抑制)，则认为芽孢杆菌菌株对大肠杆菌表现出了抑制活性。优选，抑菌圈在至少0.5mm和2mm(中等)之间，更优选大于2mm(高)。对于各种大肠杆菌菌株，抑菌圈可以不同。根据本发明被视为对大肠杆菌表现出抑制活性的菌株，对于所有测试的大肠杆菌菌株，它应该表现出至少0.5mm的抑菌圈。优选，两种、三种、四种或甚至更优选所有五种大肠杆菌菌株的抑菌圈至少介于0.5mm和2mm之间。甚至更优选，两种、三种、四种或甚至更优选所有五种大肠杆菌菌株的抑菌圈超过2mm。

如果抑菌圈至少为0.5mm(低抑制)，则认为芽孢杆菌菌株对产气荚膜梭菌表现出抑制活性。优选，抑菌圈介于至少0.5mm和2mm(中等)之间，更优选大于2mm(高)。对于各种产气荚膜梭菌菌株，抑菌圈可以不同。根据本发明被视为对产气荚膜梭菌表现出抑制活性的菌株，对于所有测试的产气荚膜梭菌菌株，它应该表现出至少0.5mm的抑菌圈。优选，两种、三种、四种或甚至更优选所有五种产气荚膜梭菌菌株的抑菌圈至少介于0.5mm和2mm之间。甚至更优选地，两种、三种、四种或甚至更优选所有五种产气荚膜梭菌菌株的抑菌圈超过2mm。

优选，芽孢杆菌菌株还应该能够增加来自非淀粉多糖(NSP)降解的还原性糖的量。实施例2研究了不同芽孢杆菌菌株将NSP降解为还原性糖的能力，结果在表4中提供。当如实施例所述测试时，能将可用糖的量增加至至少500kJ/kg饲料的菌株，被视为优选的。

基于详细的测定描述，本领域普通技术人员能够重复这些测定以确定特定芽孢杆菌菌株是否符合抗生素敏感性、抑制活性和降解NSP的能力。以这种方式，本领域普通技术人员应当能够始终产生具有所述特性的菌株。优选，本领域技术人员还将包括测定营养细胞在pH4下的敏感性，并测定胆汁抗性，以确保菌株能够在胃肠道中以足够的程度存活，例如如WO2013/153159所述。显然，可以以任何顺序进行这些测定，并且如果一些菌株不满足要求，则可以在过程中将其排除。

本发明进一步提供了包含至少一种本发明的枯草芽孢杆菌菌株的芽孢杆菌组合物。在一个实施方案中，芽孢杆菌组合物包含一种本发明的枯草芽孢杆菌菌株。在另一个实施方案中，芽孢杆菌组合物包含两种本发明的枯草芽孢杆菌菌株，例如枯草芽孢杆菌DSM32324和枯草芽孢杆菌DSM32325的组合。

本发明的芽孢杆菌组合物可包含至少一种本发明的枯草芽孢杆菌菌株和至少一种其他芽孢杆菌菌株的组合。芽孢杆菌组合物可包含至少两种菌株，例如至少三种，例如至少四种，例如至少五种芽孢杆菌菌株，其中至少一种是本发明的枯草芽孢杆菌菌株。

芽孢杆菌菌株可以在芽孢杆菌组合物中以任何组合使用。例如，芽孢杆菌组合物可包含至少一种本发明的枯草芽孢杆菌菌株和/或至少一种地衣芽孢杆菌菌株和/或至少一种解淀粉芽孢杆菌菌株，例如两种本发明的枯草芽孢杆菌菌株和至少一种解淀粉芽孢杆菌菌株。组合物可包含枯草芽孢杆菌DSM32324和/或枯草芽孢杆菌DSM32325与解淀粉芽孢杆菌DSM25840和/或地衣芽孢杆菌DSM17236和/或枯草芽孢杆菌DSM19489的组合。还可以制备本发明的芽孢杆菌菌株与其他芽孢杆菌菌株的任何其他可能的组合。作为具体实例，芽孢杆菌组合物包含枯草芽孢杆菌DSM32324、枯草芽孢杆菌DSM32325和解淀粉芽孢杆菌DSM25840。作为另一具体实例，芽孢杆菌组合物包含枯草芽孢杆菌DSM32324、枯草芽孢杆菌DSM32325和地衣芽孢杆菌DSM17236。在又一个具体实例中，芽孢杆菌组合物包含枯草芽孢杆菌DSM32324、枯草芽孢杆菌DSM32325和枯草芽孢杆菌DSM19489。

如果使用不止一种菌株，则预期组合物中每种菌株的比例将为以CFU/g组合物计算的细菌分离物总量的1-99％，例如20-80％，例如30-70％，更特别是20％、33％、40％或50％。各个菌株可以以大约相等的数量或不等的数量存在。

本发明目前优选的实施方案是包含比例为8:3:5的DSM32324、DSM25840和DSM32325的芽孢杆菌组合物。

以本领域技术人员已知的商业相关形式提供相关的一种或多种芽孢杆菌菌株。因此，在实施方案中，组合物的一种或多种芽孢杆菌菌株以干燥(例如喷雾干燥)或冷冻形式存在。组合物可以任何合适的形式提供，例如以液体例如凝胶、浆液、粉末或颗粒的形式提供。

在优选的实施方案中，芽孢杆菌组合物在组合物中包含10⁵至10¹²CFU/g，例如5×10⁵至10¹²CFU/g，更优选10⁶至10¹²CFU/g，最优选10⁷至10¹²CFU/g，例如10⁸-10¹¹CFU/g，例如10⁹至10¹⁰CFU/g每种细菌菌株。芽孢杆菌组合物包含每克所述组合物至少5×10⁴CFU的每种菌株，这将本发明的组合物与例如具有天然菌株的动物饲料区分开来。

术语“CFU/g”涉及组合物的克重，所述组合物包括载体例如碳酸钙、抗结块剂例如硅酸铝和硅藻土(kieselgur)(硅藻土(diatomaceous earth))，以及组合物中存在的其他组分。

本发明的组合物包括至少一种本发明的芽孢杆菌菌株和至少一种使所述组合物适于饲喂动物或作为饮用水的添加剂的载体和/或其他组分。

如本文所用，术语“预混物”是指添加到载体中以制备预混物的芽孢杆菌菌株，所述预混物然后将以所需的包含率被添加到动物饲料中。

或者，本发明的至少一种芽孢杆菌菌株可以与如下文详细讨论的动物饲料成分一起配制。这种组合可以是通过标准制粒工艺挤出的颗粒形式。

本发明还提供了生产动物饲料、动物饲料添加剂或预混物的方法,包括将至少一种本发明的芽孢杆菌菌株添加到动物饲料或其相关组分中。

芽孢杆菌以可分裂产生更多的营养细胞的孢子和营养细胞的形式存在。当在本文中提及芽孢杆菌时，除非上下文另有说明，否则这涉及孢子和营养细胞。

在本发明的芽孢杆菌组合物中，优选以孢子形式提供一种或多种芽孢杆菌菌株。孢子形成的主要功能通常是确保细菌活过环境胁迫期。因此，它们对紫外线和γ辐射、干燥、溶菌酶、温度、饥饿和化学消毒剂具有抗性。孢子外壳对许多有毒分子是不可渗透的，并且还可能含有与萌发有关的酶。核心具有正常的细胞结构，例如DNA和核糖体，但孢子是代谢惰性的。

营养形式的细菌产生可以减少动物胃肠道中的细菌病原体或具有其他有益效果的效应物。因此，施用于动物后，孢子的再活化和萌发是重要的。

由文献可知，胆汁对动物GIT中营养细胞的存活和萌发及生长具有一些负面影响。因此，益生菌通常应当能够通过耐受低pH和耐胆汁盐而在动物肠道中存活和增殖，以便用作益生菌芽孢杆菌组合物添加到动物饲料中。实施例在这方面提供了有用的体外试验。对低pH(模拟胃条件)敏感性的测试集中在营养细胞对pH 4的抗性。众所周知，孢子在pH值为2-3时具有抗性，营养细胞在pH 2时会死亡。但是，胃pH值可能具有高达4的pH值，尤其是在进食条件下。这可能导致孢子萌发，因此在pH 4下测试营养细胞的敏感性是中肯的。所选菌株应优选耐受pH 4。

已经测试了作为DSM32324和DSM32325保藏的枯草芽孢杆菌菌株在pH 4下营养细胞的敏感性和胆汁抗性下，以确保菌株是合适的。

芽孢杆菌组合物可包含一种或两种不同的枯草芽孢杆菌菌株和/或一种或两种地衣芽孢杆菌菌株和/或一种或两种解淀粉芽孢杆菌菌株，其中独立地选择每种菌株以发挥特定作用和/或功能。这些菌株的组合可以与诸如家禽饲料等动物饲料组合，并最终用于改善农业动物(例如家畜和/或家禽)的健康和生产力。例如，菌株和/或组合菌株可以减少家禽中肠道病原体并增强商业家禽的体重增加。

在另一个实施方案中，本发明的芽孢杆菌组合物可以与诸如活鼠伤寒沙门氏菌疫苗等疫苗组合，以减少沙门氏菌的感染和/或增加FCR。

一方面，本发明提供一种动物饲料、动物饲料添加剂或预混物，其包含本发明的至少一种枯草芽孢杆菌菌株，并且还包含一种或多种浓缩物、维生素、矿物质、酶、氨基酸和/或其他饲料成分。在一个实施方案中，动物饲料、动物饲料添加剂或预混物包含枯草芽孢杆菌菌株DSM32324。在另一个实施方案中，动物饲料、动物饲料添加剂或预混物包含枯草芽孢杆菌菌株DSM32325。动物饲料、动物饲料添加剂或预混物可包含枯草芽孢杆菌DSM32324和枯草芽孢杆菌DSM32325。

在具体实施方案中，动物饲料包含草料。通常，草料包含植物蛋白质源。在具体实施方案中，植物蛋白质源是来自蝶形花科(Fabaceae)的一种或多种植物的材料。在另一个具体实施方案中，植物蛋白质源是来自藜科(Chenopodiaceae)的一种或多种植物的材料。植物蛋白质源的其他实例是油菜籽和卷心菜。在另一个具体实施方案中，大豆是优选的植物蛋白质源。例如，草料包含0-80％的玉米；和/或0-80％的高粱；和/或0-70％小麦；和/或0-70％大麦；和/或0-30％燕麦；和/或0-40％豆粕；和/或0-10％的鱼粉；和/或0-20％乳清。

在一个实施方案中，将草料和至少一种本发明的枯草芽孢杆菌菌株与浓缩物混合。在另一个实施方案中，将草料和至少一种本发明的枯草芽孢杆菌菌株与预混物混合。在另一个实施方案中，将草料和至少一种本发明的枯草芽孢杆菌菌株与维生素和/或矿物质混合。在另一个实施方案中，将草料和至少一种本发明的枯草芽孢杆菌菌株与一种或多种酶混合。在另一个实施方案中，将草料和至少一种本发明的枯草芽孢杆菌菌株与其他饲料成分混合，例如着色剂、稳定剂、生长改善添加剂和芳香化合物/调味剂、多不饱和脂肪酸(PUFA)、产生活性氧的物质、抗微生物肽、抗真菌多肽和氨基酸。

在具体实施方案中，动物饲料由乳(例如来自母猪、牛、山羊、绵羊)组成或包含所述乳，例如用于饲喂仔猪。在另一个具体实施方案中，动物饲料由乳替代品组成或包含所述乳替代品，例如用于饲喂仔猪。

在另一个实施方案中，动物饲料可包含一种或多种维生素，例如一种或多种脂溶性维生素和/或一种或多种水溶性维生素。在另一个实施方案中，动物饲料可任选地包括一种或多种矿物质，例如一种或多种微量矿物质和/或一种或多种常量矿物质。通常，脂溶性维生素和水溶性维生素以及微量矿物质构成用于添加到饲料中的所谓预混物的一部分，而通常单独将常量矿物质添加到饲料中。脂溶性维生素的非限制性实例包括维生素A、维生素D3、维生素E和维生素K，例如维生素K3。水溶性维生素的非限制性实例包括维生素B12、生物素和胆碱、维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸、叶酸和泛酸盐，例如D-泛酸钙。微量矿物质的非限制性实例包括硼、钴、氯化物、铬、铜、氟化物、碘、铁、锰、钼、硒和锌。常量矿物质的非限制性实例包括钙、镁、钾和钠。

本发明的动物饲料、动物饲料添加剂或预混物还可以包含选自下组的至少一种酶，所述组包含植酸酶(EC 3.1.3.8或3.1.3.26)；木聚糖酶(EC 3.2.1.8)；半乳聚糖酶(EC3.2.1.89)；α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)；蛋白酶(EC 3.4)；磷脂酶A1(EC 3.1.1.32)；磷脂酶A2(EC 3.1.1.4)；溶血磷脂酶(EC 3.1.1.5)；磷脂酶C(3.1.4.3)；磷脂酶D(EC 3.1.4.4)；淀粉酶例如α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)；溶菌酶(EC 3.2.1.17)；和β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4或EC 3.2.1.6)或其任何混合物的酶。

本发明的动物饲料、动物饲料添加剂或预混物还可以包含一种或多种添加的氨基酸。用于动物饲料的氨基酸的实例是赖氨酸、丙氨酸、β-丙氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸和色氨酸。本发明的动物饲料、动物饲料添加剂或预混物还可以包含着色剂、稳定剂、生长改善添加剂和芳香化合物/调味剂、多不饱和脂肪酸(PUFA)；产生活性氧的物质、抗微生物肽和抗真菌多肽。着色剂的实例是类胡萝卜素，例如β-胡萝卜素、虾青素和叶黄素。芳香化合物/调味剂的实例是甲氧甲酚、茴香脑，十、十一-和/或十二内酯，紫罗兰酮、鸢尾酮、姜辣醇、哌啶、亚丙基苯酞、亚丁基苯酞、辣椒素和单宁。多不饱和脂肪酸的实例是C18、C20和C22多不饱和脂肪酸，例如花生四烯酸、二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸和γ-亚油酸。产生活性氧的物质的实例是诸如过硼酸盐、过硫酸盐或过碳酸盐的化学品；和酶，例如氧化酶、加氧酶或合成酶。

在一个实施方案中，动物饲料、动物饲料添加剂或预混物包含一种或多种抗球虫药。

动物饲料、动物饲料添加剂或预混物还包含载体。载体可包含一种或多种下列化合物：水、甘油、乙二醇、1,2-丙二醇或1,3-丙二醇、氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、硫代硫酸钠、碳酸钙、柠檬酸钠、糊精、麦芽糊精、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、乳糖、乳清、乳清渗透物、小麦粉、麦麸、玉米蛋白粉、淀粉以及纤维素。

在一个实施方案中，当经受用于制粒的挤出过程中施加/实现的压力时，所述一种或多种细菌菌株是稳定的。在具体实施方案中，所述一种或多种细菌菌株在1巴(bar)至40巴的压力下是稳定的。

在具体实施方案中，所述一种或多种细菌菌株在高温下是稳定的。特别是，当经受用于制粒的挤出过程期间达到的温度时，细菌菌株是稳定的。在甚至更具体的实施方案中，所述一种或多种细菌菌株在70℃至120℃的温度下是稳定的。

在实施方案中，动物饲料、动物饲料添加剂或预混物还包含一种或多种另外的微生物。在具体实施方案中，动物饲料、动物饲料添加剂或预混物还包含来自以下一个或多个属的细菌：乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、链球菌属(Streptococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、片球菌属(Pediococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、肉杆菌属(Carnobacterium)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、梭菌属(Clostridium)和巨球形菌属(Megasphaera)或其任何组合。

在具体实施方案中，动物饲料、动物饲料添加剂或预混物还包含来自一种或多种以下菌株的细菌：解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、单芽孢杆菌(Bacillus simplex)、摩加夫芽孢杆菌(Bacillus mojavensis)、沙福芽孢杆菌(Bacillussafensis)、单芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)、甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)、西姆芽孢杆菌(Bacillus siamensis)、死谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)、特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)或其任何组合。

在具体实施方案中，动物饲料、动物饲料添加剂或预混物还包含一种或多种类型的酵母。所述一种或多种类型的酵母可选自由以下组成的组：酵母菌科(Saccharomycetaceae)酵母菌属(Saccharomyces)(例如酿酒酵母(S.cerevisiae)和/或布拉氏酵母(S.boulardii))、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)(例如马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)和乳酸克鲁维酵母(K.lactis))、假丝酵母属(Candida)(例如产朊假丝酵母(C.utilis)，又称串酵母属(Torula)酵母)、毕赤酵母属(Pichia)(例如巴斯德毕赤酵母(P.pastoris))、孢圆酵母属(Torulaspora)(例如德尔布有孢圆酵母(T.delbrueckii))、法夫酵母属(Phaffia)酵母和担子菌门(Basidiomycota)。

可以将动物饮食制造成例如粉状饲料(非颗粒饲料)或颗粒饲料。通常，混合磨碎的饲料，并根据所讨论物种的规格添加足量的必需维生素和矿物质。细菌培养物和任选的酶可以作为固体或液体制剂添加。例如，对于粉状饲料，可以在成分混合步骤之前或期间添加固体或液体培养物制剂。对于颗粒饲料，还可以在饲料成分步骤之前或期间添加(液体或固体)芽孢杆菌组合物。通常，本发明的液体芽孢杆菌组合物包含所述细菌菌株，任选地具有多元醇，例如甘油、乙二醇或丙二醇，并且在制粒步骤之后添加，例如通过将液体制剂喷雾到颗粒上。还可以将细菌掺入动物饲料添加剂或预混合物中。

本发明的组合物可用于预防或控制细菌定殖或感染，例如，大肠杆菌和/或诸如艰难梭菌(Clostridium difficile)、诺维氏梭菌(Clostridium novyi)、产气荚膜梭菌或败血梭菌(Clostridium septicum)等梭菌属的细菌定殖和感染。

另一方面，本发明涉及预防或控制细菌定殖或感染的方法，例如，大肠杆菌和/或诸如艰难梭菌、诺维氏梭菌、产气荚膜梭菌或败血梭菌等梭菌属的细菌定殖或感染，所述方法包括向有需要的动物施用有效量的本发明的菌株或本发明的组合物。

本发明的另一方面涉及饲喂动物，特别是单胃动物的方法，包括向动物施用本发明的芽孢杆菌组合物。

单胃动物包括但不限于家禽，例如肉鸡、种禽、蛋禽、火鸡、鸵鸟、鹌鹑、鸭和鹅，食草动物，例如马，和反刍动物，例如骆驼、羊驼、牛和绵羊、小牛，猪，例如仔猪、断奶仔、雏猪、育成猪、hocks、polts、小母猪、母猪和妊娠母猪，啮齿动物，例如兔子，宠物，例如猫、狗和鱼(包括但不限于鲑鱼、鳟鱼、罗非鱼、鲶鱼和鲤鱼)；以及甲壳类动物(包括但不限于海虾(shrimp)和淡水虾(prawn))。猪和/或家禽是优选的单胃动物。

另一方面，本发明涉及至少一种本发明的枯草芽孢杆菌菌株或包含至少一种本发明的枯草芽孢杆菌菌株的动物饲料、动物饲料添加剂或预混物改善动物特别是单胃动物性能的用途。

如实施例中所证明的，与对照相比，施用本发明的枯草芽孢杆菌菌株改善了动物的胃肠健康，例如，预防或控制肠炎，并为处理的动物提供改善的动物性能参数。动物性能参数包括但不限于体重增加(WG)、饲料转化率(FCR)、死亡率降低和欧洲生产效率因子(EPEF)增加。

本发明还提供了提高动物饲料消化率，例如蛋白质消化率的方法，所述方法包括向动物饲喂本发明的菌株或本发明的组合物。

因此，本发明涉及本发明的菌株或本发明的组合物用于改善选自由以下组成的组的一种或多种动物性能参数的用途：

i)增强的体重增加(WG)，

ii)较低的饲料转化率(FCR)，

iii)较低的坏死性肠炎病变评分，

iv)较低的坏死性肠炎频率，

v)较低的坏死性肠炎死亡率，

vi)增加的欧洲生产效率因子(EPEF)，和

vii)较低的死亡率。

在本发明的优选实施方案中，“动物性能”由动物的体重增加和/或饲料转化率决定。“改善的动物性能”是指，与不含本发明的动物饲料、动物饲料添加剂或预混物的动物饲料相比，由于使用本发明的动物饲料、动物饲料添加剂或预混物，导致增强的体重增加和/或降低的饲料转化率，和/或提高的饲料和/或可代谢能量中营养物或可消化能量的消化率，和/或提高的饲料效率。优选，“改善的动物性能”是指增强的体重增加和/或降低的饲料转化率。

“增强的体重增加”是指，与饲喂没有本发明饲料组合物的饲料的动物相比，饲喂包含所述饲料组合物的饲料的动物体重增加。具体而言，动物的体重增加(WG)是指在特定时间段内动物体重的增加。在一个实施方案中，体重增加的改善为至少0.5％，例如至少1％，例如至少2％，例如至少2.5％，例如至少3％，例如至少4％，例如至少5％，例如至少6％，例如至少7％，例如至少8％，例如至少9％，例如至少10％。

在一个实施方案中，体重增加的改善导致体重增加至少0.5％，例如至少0.8％，例如至少1.2％，例如至少1.5％，例如至少1.8％，例如至少2.0％，例如至少2.5％，例如至少3.0％，例如至少4.0％，例如至少5.0％，例如至少6.0％，例如至少7.0％。在优选的实施方案中，体重增加的改善导致选自由以下组成的组的体重增加：1.8％至2.0％，2.0％至2.2％，2.2％至2.4％，2.4％至2.6％，2.6％至2.8％，2.8％至3.0％，3.0％至3.2％，3.2％至3.4％，3.4％至3.6％，3.6％至3.8％，3.8％至4.0％，4％至5％，5％至7％，7％至10％或其任何组合。

“较低的饲料转化率”或“改善的饲料转化率”是指，在饲料中使用所述饲料添加剂组合物使得将动物体重增加特定量所需饲喂给动物的饲料的量低于当所述饲料不包含所述饲料添加剂组合物时，将所述动物体重增加相同的量所需的饲料的量。

在一个实施方案中，饲料转化率(FCR)的改善导致FCR为-2.5％或小于-2.5％，例如小于-2.6％，例如小于-2.7％，例如小于-2.8％，例如小于-2.9％，例如小于-3.0％。在优选的实施方案中，FCR的改善导致FCR为-5％至-2％，例如FCR为-4％至-2％，例如FCR为-3.5％至-2.5％。在具体实施方案中，FCR的改善导致FCR在选自由以下组成的组的区间内：-5％至-4.5％，-4.5％至-4％，-4％至-3.8％，-3.8％至-3.6％，-3.6％至-3.4％，-3.4％至-3.2％，-3.2％至-3.0％，-3.0％至-2.8％以及-2.8至-2.5％，或这些区间的任何组合。

本文所用的营养物消化率是指从胃肠道或胃肠道的特定区段例如小肠消失的营养物的分数。营养物消化率可以测量为施用于个体的与个体的粪便中产生的之间的差异，或施用于个体的与胃肠道特定区段例如回肠上的消化物中残留的之间的差异。本文所用的营养物消化率可以通过在一段时间内凭借排泄物的总收集的营养物的摄入量和排泄的营养物之间的差异来测量；或者使用不被动物吸收的惰性标记物，并且允许研究人员计算在整个胃肠道或胃肠道区段中消失的营养物的量。这种惰性标记物可以是二氧化钛、氧化铬或酸不溶性灰分。消化率可以表示为饲料中营养物的百分比，或者表示为饲料中每质量单位营养素的可消化营养物的质量单位。本文所用的营养物质消化率包括淀粉消化率、脂肪消化率、蛋白质消化率、矿物质消化率和氨基酸消化率。

在另一个实施方案中，本发明涉及改善选自由以下组成的组的一种或多种动物性能参数的方法

i)增强的体重增加(WG)，

ii)较低的饲料转化率(FCR)，

iii)较低的坏死性肠炎病变评分，

iv)较低的坏死性肠炎频率，

v)较低的坏死性肠炎死亡率，

vi)增加的欧洲生产效率因子(EPEF)，和

vii)较低的死亡率

所述方法包括向动物饲喂本发明的菌株或本发明的组合物。

本发明的组合物还可以用于柔性饲料制剂(FFF)，其中向动物饲喂具有代谢能降低的饲料和本发明的组合物，由此获得可接受的动物性能和/或饲料转化率，尽管饲料中代谢能降低。对于所讨论的动物，降低的可代谢能量可以是标准饲料的97％至99％的水平，例如97％至98％或98％至99％。

保藏和专家解决方案

地衣芽孢杆菌菌株DSM17236已于2005年4月7日由丹麦科·汉森有限公司(Chr.Hansen A/S)保藏于DSMZ(德国微生物保藏中心，布伦瑞克因霍芬街7B D-38124(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Inhoffenstrasse7B,D-38124 Braunschweig))。保藏是根据有关国际认可的用于专利程序目的微生物保藏的布达佩斯条约进行的。

枯草芽孢杆菌菌株DSM19489已于2007年6月27日由丹麦科·汉森有限公司保藏于DSMZ(德国微生物保藏中心，布伦瑞克因霍芬街7B D-38124)。保藏是根据有关国际认可的用于专利程序目的微生物保藏的布达佩斯条约进行的。

摩加夫芽孢杆菌菌株DSM25839已于2012年4月3日由丹麦科·汉森有限公司保藏于DSMZ(德国微生物保藏中心，布伦瑞克因霍芬街7B D-38124)。保藏是根据有关国际认可的用于专利程序目的微生物保藏的布达佩斯条约进行的。

解淀粉芽孢杆菌菌株DSM25840已于2012年4月3日由丹麦科·汉森有限公司保藏于DSMZ(德国微生物保藏中心，布伦瑞克因霍芬街7B D-38124)。保藏是根据有关国际认可的用于专利程序目的微生物保藏的布达佩斯条约进行的。

枯草芽孢杆菌菌株DSM25841已于2012年4月3日由丹麦科·汉森有限公司藏于DSMZ(德国微生物保藏中心，布伦瑞克因霍芬街7B D-38124)。保藏是根据有关国际认可的用于专利程序目的微生物保藏的布达佩斯条约进行的。

解淀粉芽孢杆菌菌株DSM27032已于2013年3月21日由丹麦科·汉森有限公司保藏于DSMZ(德国微生物保藏中心，布伦瑞克因霍芬街7B D-38124)。保藏是根据有关国际认可的用于专利程序目的微生物保藏的布达佩斯条约进行的。

枯草芽孢杆菌菌株DSM32324已于2016年6月8日由丹麦科·汉森有限公司保藏于DSMZ(德国微生物保藏中心，布伦瑞克因霍芬街7B D-38124)。保藏是根据有关国际认可的用于专利程序目的微生物保藏的布达佩斯条约进行的。

枯草芽孢杆菌菌株DSM32325已于2016年6月8日由丹麦科·汉森有限公司保藏于DSMZ(德国微生物保藏中心，布伦瑞克因霍芬街7B D-38124)。保藏是根据有关国际认可的用于专利程序目的微生物保藏的布达佩斯条约进行的。

对于所有上述确定的保藏微生物，适用以下附加说明：

关于各指定国家的相应专利局，申请人要求上述保藏微生物的样品仅供请求者指定的专家使用，直至本专利授权日或本申请被驳回、撤回或视为撤回日。

体外实施例

实施例1

筛选病原体抑制和抗生素敏感性

材料

小牛肉浸液肉汤(VIB)(Difco,234420)

小牛肉浸液肉汤(VIB)琼脂(VIB+1.5％细菌学琼脂(1号琼脂),Oxoid LP0011)

Muller Hinton肉汤2，阳离子调节的(Fluka)

T3琼脂板(每升：3g胰蛋白胨、2g胰蛋白1.5g酵母膏、0.05M磷酸二氢钠和0.005g MnCl2[pH 6.8]和15g琼脂)

Laura-Bertani(LB)肉汤(g/L：细菌用胰蛋白胨10(Difco 0123)、酵母膏5(OxoidL21)、NaCl 10(Merck nr.106404))

脑心浸液(BHI)琼脂(Oxoid CM375)

胆汁盐(胆汁提取物，猪；Sigma B8631)

生物测定培养皿(Nunc 240845)

皮氏培养皿(Procudan 140096，具有肋板的皮氏培养皿)

具有蛋白胨的生理盐水(0.9％氯化钠，1％蛋白胨)FKP

ISO-SENSITEST肉汤(Oxoid CM0473)

微量滴定板(MTP)NUNC,丹麦

Omni托盘/单孔板N 242811 Thermo Scientific/NUNC丹麦

深孔微滴定96孔托盘(DW)无Rnase/DNase(Thermo Fisher Science)

氨苄青霉索(Sigma,A9518-5G)

万古霉素(Sigma,V1764-250MG)

庆大霉素(Sigma,G1264-50MG)

卡那霉素(Sigma,K1377-1G)

链霉素(Sigma,S6501-5G)

红霉素(Sigma E-5389)

克林霉素(Sigma,C2569-10MG)

四环素(Sigma T-7660)

氯霉素(Sigma,C0378-5G)

大肠杆菌O101 H-,K99 F5(丹麦，哥本哈根，国家血清研究所(State SerumInstitute,Copenhagen,Denmark))

大肠杆菌O147:K89 F4 H19(丹麦，哥本哈根，国家血清研究所)

大肠杆菌O149:k91,k88a,c,h10 NCTC10650,(英格兰国家典型培养物保藏中心(National Collection of Type Cultures,England))

大肠杆菌ATCC11775(美国典型培养物保藏中心(American type culturecollection))

大肠杆菌Cp6salp3(哥本哈根兽医大学(Copenhagen Veterinary University))

A型产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens type A)DSM756,莱布尼茨研究所DSMZ-德国微生物保藏中心

C型产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens type C),NCTC3180,国家典型培养物保藏中心(英格兰)

产气荚膜梭菌CCUG2036(瑞典哥德堡大学典型培养物保藏中心(CultureCollection,University of Gothenburg,Sweden))

产气荚膜梭菌CCUG2037(瑞典哥德堡大学典型培养物保藏中心)

产气荚膜梭菌CCUG44727(瑞典哥德堡大学典型培养物保藏中心)

将所有上述病原体菌株都在-80℃保持于在BHI中含有20％甘油的LB中。

芽孢杆菌培养物

将从粪便、土壤、食物源分离和从菌株库收集物收集的芽孢杆菌菌株在-80℃下保持于MTP母板中的具有在MTP中的20％甘油的VIB中。

使形成细菌孢子的好氧分离株进行16S核糖体序列和gyrB鉴定(Wang et al.,2007)，根据下文所述的“Guidance on the assessment of bacterial susceptibilityto inhibitorys of human and veterinary importance.(评估细菌对人和兽医重要的抑制剂的敏感性的指南)”EFSA Journal 2012；10(6):2740筛选抗生素敏感性，并如WO2013/153159所述，筛选胆汁抗性和对低pH的敏感性、酶促活性、不同培养基中的生长、耐热性和孢子形成。

通过MIC测量抗生素敏感性

通过测量许多抗生素的最小抑制浓度(MIC)分析芽孢杆菌菌株的抗生素敏感性。使用的方法是如CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute M07-A8 andM45-A2(临床和实验室标准研究所M07-A8和M45-A2))标准所概述的肉汤微稀释方法。

将待测菌株过夜培养物的悬浮液以约10⁵CFU/ml(菌落形成单位/ml)的浓度接种于微量滴定板中的ISO-SENSITEST肉汤(Oxoid CM0473)中，于两倍系列稀释的待测抗生素中(总体积100μl/孔)，并在37℃有氧温育20-24小时。温育20小时后记录结果，作为抗生素抑制可见生长的最低浓度。该测试重复进行两次，作为两个独立的生物学重复。

只有根据EFSA指南对抑制剂敏感的芽孢杆菌菌株被包括在抑制致病性大肠杆菌和产气荚膜梭菌的筛选中。

筛选抑制致病性大肠杆菌的芽孢杆菌菌株

将来自MTP母板的50μl体积的芽孢杆菌菌株加入到DW板中的700μl VIB中，并在37℃和175rpm温育过夜。使大肠杆菌菌株在LB中于30℃生长过夜。将2ml大肠杆菌过夜培养物与200ml液体VIB琼脂在50℃下混合，并倒入每个生物测定培养皿中。将培养皿在无菌工作台中干燥。将过夜芽孢杆菌培养物每种2μl点在生物测定培养皿中与大肠杆菌混合的VIB琼脂表面上，并在37℃下温育1天。

测量芽孢杆菌周围澄清抑菌圈的半径并记录为“3＝高”-大于2mm，“2＝中等”-介于0.5-2mm和“1＝低”-小于0.5mm和0＝无抑制。

通过琼脂斑点试验对产气荚膜梭菌的抑制

将VIB琼脂倒入生物测定培养皿(每皿200ml)中，并在无菌台中彻底干燥。将过夜的芽孢杆菌培养物每种2μl点在VIB琼脂培养皿的表面上，并在37℃下温育过夜。使产气荚膜梭菌菌株在BHI琼脂上于37℃厌氧生长过夜。将体积为2ml的产气荚膜梭菌的过夜培养物加入至200ml的液体BHI琼脂中，混合并轻轻覆盖在具有芽孢杆菌斑点的生物测定培养皿中。将培养皿在37℃下厌氧温育1天。

所有数据都在不同的日期重复。

结果

表1

选择的芽孢杆菌菌株抑制大肠杆菌的结果

表2

选择的芽孢杆菌菌株抑制梭菌的结果

表1和表2中抑制大肠杆菌和梭菌的结果表明，测试的地衣芽孢杆菌菌株和许多枯草芽孢杆菌菌株都未显示出任何大肠杆菌抑制且梭菌抑制不良。然而，两种枯草芽孢杆菌菌株DSM32324和DSM32325在大肠杆菌抑制和梭菌抑制方面都显示出令人印象深刻的结果。

实施例2

用芽孢杆菌组合物温育的饲料中还原性糖的量的测量

本实验的目的是检测不同芽孢杆菌菌株在商业家禽开口饲料(starter feed)中降解NSP并增加可用糖量的能力。

表3

测定所用的配合饲料的组成

成分	日量％
		玉米粉	30.0
小麦	27.0
		豆粕	22.5
油菜籽	6.0
		向日葵	5.0
燕麦	4.0
		鱼粉	2.0
石灰岩	1.24
		磷酸二氢钙(Monocalciumfosfat)	0.78
植物油	0.54
		碳酸氢钠	0.28
维生素、矿物质、氨基预混合物	0.25
		氯化钠(0,17％)；	0.17

将基于小麦-玉米-大豆的配合饲料(表3)在121℃下高压灭菌15分钟，进行灭菌。然后用磷酸钠缓冲液将饲料样品稀释20倍，以确保在整个实验过程中pH值为约6-6.5。通过在小牛肉浸液肉汤(VIB)(Difco,234420)中生长的芽孢杆菌菌株的2％过夜培养物接种来获得芽孢杆菌产物。取样用于分析还原性糖(DNS)(T＝0)。在37℃下温育24小时后，取样进行CFU测定。将另一样品离心并将上清液用于测定DNS。

按如下通过3.5-二硝基水杨酸(DNS)分析还原性糖：

将乙酸钠缓冲液(100mM,pH 6)与无菌过滤的芽孢杆菌样品上清液混合，并在40℃下温育10分钟。将DNS试剂加入测试管中，混合并在沸水浴中温育5分钟。冷却后，在分光光度计中测量在540nm处的吸光度。

用葡萄糖储备溶液建立标准曲线，用于呈现还原性糖或酶单位的结果(每单位时间释放1ml的1μmol还原性葡萄糖当量所需的酶量)。

结果如表4所示。

结果

表4

表4显示了许多不同芽孢杆菌菌株的结果，并且显示所有所测试的芽孢杆菌菌株通过递送比对照更多的还原性糖而向动物提供更多营养物，但是还显示各个菌株之间存在相当大的变化。

基于大肠杆菌和产气荚膜梭菌抑制的结果结合提供增加量的还原性糖的能力的结果，选择两种表现最佳的菌株，即枯草芽孢杆菌菌株DSM32324和DSM32325用于体内研究。

体内实施例

实施例3

枯草芽孢杆菌菌株DSM32324在产气荚膜梭菌体内攻击试验中的功效

表5

根据饲养员推荐，包括甲硫氨酸MHA、L-赖氨酸、微量矿物质、维生素预混合物和L-苏氨酸。

使用基于非加药玉米/豆粕的饮食(表5)。将枯草芽孢杆菌DSM32324 1.2 10⁶CFU/g加入其中一组的饲料中。在所有试验中自由提供饲料和水。所有饲料都是通过围栏。从第0天到第21天饲喂开口饲料。在第21天，称重并丢弃未消耗的开口料。饲喂育成期饲料(grower feed)直至第35天，称重并丢弃未消耗的育成期饲料。同样，喂食育肥期饲料直到第42天，称重并丢弃未消耗的育肥期饲料。

表6

该实验从每个围栏40只雄性Ross 308肉鸡开始。处理在8个区块中重复，在每个6个围栏的区块内随机化。

在第19天、第20天和第21天，除了未加药未感染的处理1组之外，所有围栏都用产气荚膜梭菌CP-6的肉汤培养物进行攻击(Knap I,et al.,2010)。该菌株是产气荚膜梭菌的田间分离物，已知其引起来自商业肉鸡操作的NE并且在本研究中用作攻击生物。每天使用新鲜接种物。每个围栏接受相同量的接种物，对应于约1x10⁸至1x10⁹ CFU的产气荚膜梭菌CP-6。通过混合到管式给料机(tube feeder)底部的饲料中来施用接种物。

在第21天，从每个围栏中选择三只肉鸡，处死，组称重，并检查坏死性肠炎病变的存在程度。得分基于0-3分，0表示正常，3表示最严重。评分如下：正常肠道为0，轻微粘液覆盖和失去色调为1，严重坏死性肠炎为2，腔内有血液存在的极度坏死性肠炎为3。

在第31、35和42天对所有肉鸡进行称重，以观察坏死性肠炎对性能参数的影响：计算所有围栏的活体重平均值、平均体重增加(AWG)、饲料消耗、饲料转化率(FCR)、坏死性肠炎病变评分、和死亡率(总数和NE)。

统计数据分析在SAS Stat Version 9.2中使用ANOVA分析和完全随机设计进行，以建立处理组之间的差异。在饮食作为固定效果的情况下，围栏视为统计实验单位。结果报告为最小二乘平均值，并且在P<0.05时被认为是不同。

结果

表7

结果所附的字母代表处理组在统计学上显著不同于未加药对照(P≤0.05)或彼此不同。

表8

结论：

对于在第21天、第35天和第42天测量的性能参数即饲料转化率(FCR)和平均体重增加(AWG)，当考虑将枯草芽孢杆菌DSM3234作为饲料添加剂时，与未处理的感染对照组相比，观察到所有数据点均显著改善。令人惊讶的是，芽孢杆菌处理组没有显示出与未感染的未加药对照组的任何显著差异，即使后者没有接受攻击并且被认为是健康的(表7)。

关于在体内攻击试验中诱导的亚临床肠炎，结果显示枯草芽孢杆菌DSM3234降低鸡的坏死性肠炎病变评分，并显著降低坏死性肠炎死亡率(表8)。

实施例4

枯草芽孢杆菌菌株DSM32325在产气荚膜梭菌体内攻击试验中的功效

进行本研究是为了评估枯草芽孢杆菌菌株DSM32325对鸡的坏死性肠炎频率和坏死性肠炎病变评分的影响。

雄性Ross 308肉鸡分为三组，每组48只鸡：

感染，未处理对照；感染，抗生素处理组20mg阿莫西林/kg体重；和感染的枯草芽孢杆菌DSM32325 1.2 10⁶CFU/g饲料处理组。

在所有阶段自由饲喂所有动物，并在抵达研究设施时(第1天，D1)喷雾接种疫苗预防传染性支气管炎和新城疫。直到D9，给鸡饲喂在商业饲料厂(Cibus,Kaaistraat 49；8800Roeselare，比利时)购买的开口饲料“Kip 1-3”。除了在每组中包含相应产物外，所有动物开口饲料的定量组成都相同。从D9直到D26，这些鸡接受高蛋白质含量和包括40％鱼粉的育成期饲料。所述育成期饲料“Teler2”购自商业饲料厂(Cibus,Kaaistraat 49；8800Roeselare，比利时)。除了在每组中包括相应的产品之外，用于不同处理组的育成期饲料的组成完全相同。饲料接收组代码，随后将处理预混物与针对每个饲料批次的饲料量混合。

在第19天、第20天、第21天和第22天，如Timbermont等人2009所述，向所有鸡口服施用大约10⁹CFU产气荚膜梭菌菌株56(Timbermont et al.2009)，每天三次。在第25天和第26天确定坏死性肠炎病变(0-6分)(Johnson&Reid 1970)。分别使用逻辑回归模型和线性回归模型分析NE和NE评分的频率。在P≤0.05时评估统计学显著性。

结果

每个采样日对肉眼可见的坏死性肠炎病变(病变评分≥2)阳性的鸡的百分比如下表所示。对于每一天，拟合线性回归模型来分析处理组和IUC之间的差异。另一个模型拟合第25天和第26天结合的数据。在该模型中，添加第25天和第26天以及组，作为固定效果。

表9

**标记的数字代表处理组与未处理的对照IUC在统计学上显著不同(P≤0.05)。

以类似的方式计算按组和日计算的平均NE得分。

表10

结果表明，当结合第25天和第26天的数据时，与感染的未处理对照相比，枯草芽孢杆菌DSM32325以统计学上显著的方式降低了鸡的坏死性肠炎频率。令人惊讶的是，芽孢杆菌处理组的坏死性肠炎频率甚至低于阿莫西林处理组(表9)。

此外，当结合第25天和第26天的数据时，与感染的未处理对照相比，枯草芽孢杆菌DSM32325以统计学上显著的方式降低坏死性肠炎严重性(平均评分)。令人惊讶的是，芽孢杆菌处理组的平均得分甚至低于阿莫西林处理组(表10)。

实施例5

性能饲喂试验

动物：

将一日龄的Ross 308雄性肉鸡随机分配到72个地面围栏中，每个围栏含有25只鸡，由此每次处理重复12次。

实验组是阴性对照(NC)、枯草芽孢杆菌DSM19489、枯草芽孢杆菌DSM32324和枯草芽孢杆菌DSM32325。

饮食:

自由提供不含任何抗生素化合物、抑制剂、性能增强剂、其他益生菌、酶或酸化剂的三阶段粉料(1-14天、15-28天和29-42天)。饮食基于玉米、小麦、大麦、黑麦和豆粕。

表11

基础饮食的组成含量

测试物：

在整个42天试验期间以1.2 10⁶CFU/g饲料的剂量，饲喂测试物即枯草芽孢杆菌DSM19489、枯草芽孢杆菌DSM32324和枯草芽孢杆菌DSM32325。

观察结果：

测量在1、14、28、35和42日龄时的平均日增重(ADG)、体重(BW)，采食量、作为平均每日采食量(ADFI)和饲料效率的采食量；饲料转化率(FCR)。每日评估总体健康、医疗处理和死亡率。计算欧洲生产效率因子(EPEF)：[(存活率，％×BW增加，kg)/(以天表示的研究持续时间×FCR)]×100。

统计分析和解释：

方差分析是应用的基本统计技术。数据作为完全随机化的设计由SPSS v.19.0的GLM进行分析，然后进行Tukey平均检验。P<0.05被认为是统计学上显著的差异，而0.05<P<0.10被认为是接近显著的趋势。

结果

在整个研究中，动物的健康被认为是正常的，并且没有发现不良事件。0-14天有23只鸡死亡/剔除(1.27％)，14-28天有19只鸡死亡/剔除(1.07％)，28-42天有16只鸡死亡/剔除(0.91％)，他们与处理无关。42天时58/1800只鸡(3.22％)的总死亡率/剔除率被认为是正常的。

表12

动物的性能符合试验条件(雄性肉鸡饲喂粉饲料并在地面围栏中饲养)。在28日龄时，接受DMS32324的肉鸡比对照肉鸡重3.77％(P<0.05)。在35和42日龄时，补充有芽孢杆菌菌株DSM32324或DSM32325的肉鸡显著比对照动物重，表明DSM19489肉鸡组具有中等体重。在开食期(0-14日龄)期间，在生长、采食量或饲料转化方面没有观察到处理之间的显著差异。在生长中期(15-28日龄)，接受DSM32324的鸡比对照肉鸡生长得显著更多。与对照动物相比，补充了益生菌的所有肉鸡的饲料转化率显著提高。在试验的最后一周(35-42日龄)，在生长、采食量或饲料转化率方面没有观察到处理之间的显著差异。

对于总体肥育期(0-42日龄)，补充有芽孢杆菌菌株DSM32324或DSM32325的肉鸡比对照动物生长显著更多。与对照动物相比，补充了益生菌的所有肉鸡的饲料转化率(FCR)和EPEF显著改善。

实施例6

性能饲喂试验

本研究的目的是评估在肉鸡饮食中添加枯草芽孢杆菌DSM32324和商业产品枯草芽孢杆菌DSM19489。目的是在包括抗球虫药和饲用酶的基于小麦的饮食中评估产品对生产参数的影响。

每次处理有1300只日龄小鸡(雄性)ROSS 308-分成10个130只小鸡的围栏。在所有阶段向鸡自由饲喂颗粒形式的三阶段饲料，并且通过乳头式饮水器自由提供饮用水。饮食的组成如下表所示。饲料由Mezinárodní testovánís.p.(服务提供商),feedmill Lysá nad Labem提供。

益生菌饲料添加剂分配如下：

T1：未补充的对照组；

T2：枯草芽孢杆菌DSM19489 1.2×10⁶CFU/g饲料；

T3：枯草芽孢杆菌DSM32324 1.2×10⁶CFU/g饲料。

表13

饮食配方

在第1天(每个围栏中的所有鸡整体称重)、第13天和第28天(所有鸡只单独称重，不禁食)和第42天(所有鸡在禁食12小时后单独称重)测量活重。

在第13、28和42天，记录每个围栏每1kg活重的饲料消耗，并计算饲料转化率。

统计分析：

使用处理Dunnett试验的单因素ANOVA模型主要效果(所有补充的饮食对比未补充的对照(T1))以统计方式评估第13天、第28天和第42天的活重的性能结果和死亡率。

结果

饲料转化和饲料转化率的变异系数(CV)平均为2.7％。最终体重和体重增加的CV为3.7％，并且最终BW的围栏变化内的处理平均值(作为鸡群均匀性的量度)为10.3-15.3％。

鸡群的死亡率低(未补充的鸡为总体3.4％)，并且前13天的死亡率出乎意料地低。

表14

结论：

DSM19489具有降低死亡率的趋势(p＝0.096)，并且枯草芽孢杆菌DSM32324具有标记的且显着降低的死亡率，尤其是在育肥期，其也用于整体试验死亡率的统计学显著性。

实施例7

不同芽孢杆菌菌株对肉鸡生长性能、消化率和肠道健康的影响

从D1开始，直到试验结束(第42天)，将每15只动物圈养在1.2m×0.8m的围栏中。每个围栏的地面上覆盖着厚约5厘米的刨花。一个带有饲料储器的商用盘式送料器悬挂在围栏的内侧，并且四个饮水嘴安装在围栏的侧面。

给鸡饲喂次优饮食，其包括黑麦作为非淀粉蛋白质源并且没有饲用酶。直到D22，给这些鸡饲喂开口饲料。从D22到D42，给鸡饲喂育成期饲料。除了在每组中包含相应的菌株外，所有动物的饲料定量组成都是相同的。关于饲料组成的细节显示在表15中。将待测菌株(DSM32324、DSM25840和DSM32325)以1.2×10⁶CFU/克饲料的比例混合到饲料中。

表15

基础饮食的组成含量

在开始(D1)时，将960只动物置于64个围栏中(即每个围栏15只动物)。如上所述，从D1到D22对所有鸡施用开口饲料。从D22到D42，对所有鸡施用育成期饲料。

在第12天、第22天和第42天，从每个围栏的1只鸡的十二指肠、空肠和回肠中采集组织样品。

在第1天、第12天、第22天、第33天和第42天，对鸡和饲料进行称重以分析益生菌对不同时期生长性能(体重增加、采食量和饲料转化率)的影响。

在第22天和第42天，每个围栏的6只鸡被安乐死。每个围栏汇集回肠和盲肠内容物。将回肠和盲肠内容物的其他样品冷冻并储存在-80℃。

在第19-22天和第40-42天，每天每个围栏收集3次落下的粪便(faecaldropling)。汇集每个围栏的粪便。

每天记录健康状况。从第1天到第42天研究结束，由经验丰富的库管人员每天进行一般健康观察并记录。如果动物出现疾病迹象，则每天至少进行两次一般健康观察。每天记录死亡率。

在第1天测量每个围栏的体重(BW)。在第12天、第22天、第33天和第42天，单独测量动物BW体重。在第1天至第12天、第1天至第22天和第1天至第42天期间，计算每个围栏的每日体重增加(DWG)。在第12天至第22天、第22天至第33天、第33天至第42天和第22天至第42天期间，计算每只动物的每日体重增加(DWG)。

每个研究期开始和结束之间的BW差异是该期间的体重增加(WG)。每日体重增加(DWG)计算为WG除以相应时期的天数。考虑到鸡的死亡日期作为该鸡的研究期结束，在计算每组的平均DWG时，包括死亡动物的DWG。

在围栏水平计算时间段第1天至第12天、第12天至第22天、第1至第22天、第22至第33天、第33天至第42天、第22天至第42天和第1天至第42天的每日饲料消耗(FC)和饲料转化率(FCR)。

在第1天、第12天、第22天和第33天，将提供给动物的饲料(“Feed IN”)称重。当在任何其他日子，围栏用完饲料并且需要提供更多饲料时，还称量添加的饲料并记录为“FeedIN”。在第12天、第22天、第33天和第42天将每个围栏中的剩余饲料(“Feed OUT”)称重。计算每个研究期开始和结束时的饲料重量差异以定义每个围栏的饲料消耗(FC)。每个研究期间开始和结束之间饲料重量的差异(“Feed IN”-“Feed OUT”)是该期间相应围栏的FC。每只鸟的平均每日FC计算为FC除以相应期间的天数乘以相应围栏中该期间吃过的动物的数量。

干物质、粗蛋白、粗脂肪、Ca、P、能量和二氧化钛含量是根据在第22天和第42天收集的汇集的回肠和盲肠内容物以及根据饲料确定的。将氧化钛作为惰性标记物添加到饲料(0.3％)中。如Waititu等人，2014所述计算表观回肠消化率。

样品在Leon de Jonge的监督下在Department of Animal Sciences,Subdivision Animal Nutrition of Wageningen University(瓦赫宁根大学动物科学系动物营养分部)进行分析。使用以下方法：

干物质：根据ISO 6496(1999)在103℃下干燥3小时

灰分：根据ISO 5984(2002)在550℃加热3小时

蛋白质：基于ISO 5983(2005)的凯氏定氮法

脂肪：根据ISO 6492(1999)用酸处理后用石油醚萃取

钙：基于ISO 6869(2000)的吸收光谱

磷：基于ISO 6869(2000)的光谱测定

能量：基于ISO 9831(1998)的炸弹量热法

钛：基于凯氏定氮破坏(Kjeldahl destruction)的光谱测定，然后用过氧化物着色并在408nm处测量吸收

测定在第19-22天和第40-D42天收集的汇集粪便和饲料的干物质、粗蛋白、粗脂肪、Ca、能量和二氧化钛含量。将氧化钛作为惰性标记物加入到进料(0.3％)中。如Waititu等人2014所述计算总肠道表观保留。

用RStudio(版本0.99.467,RStudio,Inc.)分析数据。使用线性回归模型分析除了鸡水平下的体重和每日体重增加之外的所有数据，其中处理组作为固定效应(核心包的lm程序)。使用线性混合回归模型分析鸡水平下的体重和每日体重增加，其中处理组作为固定效应，围栏作为随机效应，以校正围栏内鸡的聚类(软件包nlme的lme程序)(方案偏离n°1)。在P≤0.05时评估统计学显著性。

结果

研究期间有8只鸡死亡(0.8％)。

下表显示了每个研究日和处理的平均体重。使用线性混合回归模型分析差异，其中处理作为分类固定效应，围栏作为随机效应，以解释在围栏中鸡的聚集。

表16

平均体重

表17显示了每一营养物和处理的平均表观回肠消化率(AID)。使用线性回归模型分析差异，其中处理作为分类固定效应(核心包的程序lm)。

结论：

本研究的目的是评估不同芽孢杆菌菌株对肉鸡生长性能和消化率的影响。

测试的菌株显示出对性能和表观回肠消化率的显著影响：

与未补充的鸡相比，补充有DSM32324的鸡在起始期表现出较高的日增重(表16)、每日采食量和饲料转化率(数据未显示)，并在第42天显示出较高的蛋白质消化率(表17)。

与未补充的鸡相比，补充DSM25840的鸡在起始期表现出较高的日增重(表16)和每日采食量(数据未显示)，在第42天表现出较高的体重(表16)，并在42天表现出较高的灰分、蛋白质和能量消化率(表17)。

与未补充的鸡相比，补充有DSM32325的鸡在起始期表现出较高的日增重(表16)和每日采食量(数据未显示)，并在第42天表现出较低的Ca和磷消化率(表17)。

总之，所有三种菌株都显示出令人惊讶的良好和显著改善的结果。

实施例8

4种施用于饲料用于控制肉鸡中产气荚膜梭菌引起的坏死性肠炎的不同益生菌的比较功效

本研究的目的是评估DSM32324、DSM25840和DSM32325，以及它们以8：3：5比例的组合物即EPB5对用NE攻击的Cobb 500肉鸡的性能的影响，并比较每种菌株的效果与组合物的效果。

孵化日Cobb 500雄性小鸡获自乔治亚州克里夫兰市(Cleveland,GA)CobbVantress孵化场。为这项研究分配2250只小鸡。在孵化当天，以标签推荐的剂量，给所有的小鸡喷雾接种球虫疫苗。

在整个实验中使用标准地面围栏管理实践。每天检查围栏的死亡率。在研究开始和DOT 21、35和42记录围栏的禽重(kg)。

肉鸡饮食以碎屑(开口饲料)或颗粒(育成期和育肥期)饲喂。除了处理组包括芽孢杆菌菌株或组合物之外，所有动物的饲料定量组成都是相同的。饮食配方：

表18

根据饲养员的推荐包括甲硫氨酸MHA、L–赖氨酸、微量矿物质、维生素预混合物和L-苏氨酸。

所有饲料都围栏。从DOT 0至21发放并饲喂开口饲料。在DOT 21，将未消耗的开口饲料称重并丢弃。发放并饲喂育成期饲料，直至DOT 35。在DOT 35，将未消耗的育成期饲料称重并丢弃。发放并饲喂育肥期饲料，直至DOT42。在DOT42，将未消耗的育肥期饲料称量并丢弃。

实验由45个围栏组成，以每个围栏50只雄性肉鸡开始。处理在9个区块中重复，在各5个围栏的区块中随机。

表19

在第19、20和21天，所有围栏都用产气荚膜梭菌的肉汤培养物进行攻击。用已知引起NE的产气荚膜梭菌的田间分离物作为攻击生物。每天使用新鲜接种物。滴定水平约为10⁸ ^-9CFU/围栏。每个围栏接受相同量的接种物。通过混合到管式给料机底部的饲料中来施用接种物。

在第21天，从每个围栏选择五只鸡处死、组称重，并检查坏死性肠炎病变的存在程度。评分基于0-3分，0表示正常，3表示最严重。评分如下：正常肠道为0，轻微粘液覆盖和失去色调为1，严重坏死性肠炎为2，腔内有血液存在的极度坏死性肠炎为3。

在研究期间没有使用伴随药物疗法。围栏用作统计单位。计算活重、体重增加、饲料消耗、饲料转化率(FCR)、NE病变评分和死亡率(总和NE)的平均值。使用随机完整区组设计(Random Complete Block Design)对原始数据进行统计分析(ANOVA)。当ANOVA F值显著时(p≤0.05)，使用Tukey的HSD检验(p≤0.05)来分离平均值。

线内不同的上标表示P<0.05时的显著性水平。

结果

表20

表21

表22

表23

讨论和结论

对于在第21天、第35天和第42天测量的性能参数饲料转化率(FCR)和平均体重增加(AWG)，当考虑单菌株益生菌饲料添加剂和特别是EBP5时，与未处理的感染对照组相比，所有数据点均显著改善。

令人惊讶的是，与具有芽孢杆菌单菌株处理的组相比，EBP5处理组表现出一些性能参数的显著改善，其再次表明与未加药感染对照组在性能参数方面的显著差异。

关于在体内攻击试验中诱导的亚临床肠炎，结果表明单菌株枯草芽孢杆菌DSM32234、枯草芽孢杆菌DSM32235和解淀粉芽孢杆菌DSM25840以及组合EBP5显著降低了鸡的坏死性肠炎病变评分并降低了坏死性肠炎死亡率。

实施例9

在雄性火鸡中，具有三种芽孢杆菌菌株的芽孢杆菌组合物

本试验由300只1日龄健康雄性火鸡(Kartzfehn Premium)组成，其随机分配到60个围栏中，每个围栏5只鸡(每任一处理组10次重复)。

饮食由未加药的商业型火鸡饮食组成，其具有如表24所示的成分组成，用于从第1-63日龄的火鸡，和表25所示的成分组成，用于从第64-147日龄的火鸡。除了处理组包括芽孢杆菌组合物外，所有动物的饲料定量组成都是相同的。

将包含1.6×10⁹CFU/g DSM32324、0.6×10⁹CFU/g DSM25840和1.0×10⁹CFU/gDSM32325，即比例为8:3:5的芽孢杆菌组合物EBP5混合到饲料中。

表24.火鸡饮食P1、P2和P3的成分组成

*每公斤预混料的含量：600000I.U.维生素A(醋酸酯)；120000I.U.维生素D3；6000mg维生素E(α-生育酚乙酸酯)；200mg维生素K3(MSB)；250mg维生素B1(单硝酸盐)；420mg维生素B2(结晶核黄素)；300mg维生素B6(吡哆醇-HCl)；1500μg维生素B12；3000mg烟酸(烟酰胺)；12500μg生物素(商业，饲料级)；100mg叶酸(结晶，商业，饲料级)；1000mg泛酸(D-泛酸钙)；60000mg胆碱(氯化物)；5000mg铁(碳酸铁)；5000mg锌(硫酸锌)；6000mg锰(氧化锰)；1000mg铜(氧化铜)；45mg碘(碘酸钙)；20mg硒(亚硒酸钠)；140g钠(NaCl)；55g镁(硫酸镁)；载体：碳酸钙(钙最小38％)；Monteban G100：5'833mg

表25.火鸡饮食P4、P5和P6的成分组成

体重增加

火鸡的初始体重约为61.2g，在所有处理组中几乎相似。饲喂不含EBP5的饮食的火鸡(对照组)的总体重增加总计为24.11kg；关于147天的饲喂期，每日体重增加平均达到164g。通过添加剂量水平为250或更高(250mg/kg:+2.3％；500mg/kg:+3.1％；1,000mg/kg:+4.8％；2,000mg/kg:+6.6％)的EBP5，与对照相比，总体重增加显著改善，而在饲喂含有100mg/kg剂量水平的EBP5的饲料的火鸡中，与对照相比，没有发现显著变化(+1.0％)。

饲料转化率

饲喂不使用EBP5饮食的火鸡的总饲料转化率(饲料：增重)达到2.138，这表示显著的性能水平，甚至超过了饲养员给出的目标(2.540)。由于饲喂含有EBP5的饮食的火鸡中对体重增加的益处，与对照相比，增加的剂量水平与显著降低的总饲料转化率相关(250mg/kg:2.080；500mg/kg:2.050；1,000mg/kg:2.020；2,000mg/kg:2.013)。

结论

总体死亡率(包括淘汰)总计为2.7％，表明鸡群极好的健康状况。

目前的试验表明，饲喂含有250mg/kg至2000mg/kg芽孢杆菌多菌株益生菌EBP5饮食的鸡的生产参数得到显著改善。与对照相比，EBP5显著增强直至第147日龄的体重增加高达6.6％(2,000mg/kg)。

在饲喂含有芽孢杆菌多菌株益生菌EBP5饲料的火鸡中，增加的剂量水平与相比对照显著改善的总饲料转化率相关，高达5.8％(2,000mg/kg)。

值得注意的是，在250mg/kg至2000mg/kg的剂量水平下，与对照相比，排泄物的平均总干物质含量显著增加。

实施例10

小鸡中，具有三种芽孢杆菌菌株的芽孢杆菌组合物与活减毒沙门氏菌疫苗的组合

在研究开始时将一百二十(120)只日孵化的Ross x Ross无性别肉鸡被分配到三个不同的隔离室，每个隔离室包含四十(40)只肉鸡。每个围栏含有约四(4)英寸的新鲜松木刨花、一个管式给料机和一个钟形饮水器，供自由采食和饮用。

所有的鸡在第一天接种球虫，并且没有使用伴随的药物疗法。每天检查围栏的死亡率。

开口饮食(粉碎)和从第22天的育成期饮食(颗粒)到最终制剂都由未加药的商业型肉鸡组成。除了处理组包括芽孢杆菌组合物之外，所有动物的饲料定量组成都是相同的。将包含比例为8:3:5的DSM32324、DSM25840和DSM32325的芽孢杆菌组合物以1.6×10⁶CFU/g饲料的比例混合到饲料中。

将Vac 1，由美国缅因州Lohmann Animal Health生产的活鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)疫苗，在下文称为“Megan Vac”，在1日龄时以每只鸡一剂量对T2和T3处理组进行粗喷雾，每只小鸡0.25ml。

表27

处理组(每组40只鸡)

组	Megan Vac	饮食中的芽孢杆菌组合物
			T1	否	否
T2	是	否
			T3	是	1.6×10<sup>6</sup>CFU/g饲料

在第3天，将来自每次处理的四个盲肠和四个脾称重并收集，以确认疫苗定殖。在第4天，将所有剩余的鸡用3×10⁷CFU海德堡沙门氏菌(Salmonella Heidelberg)(Alali etal.,2013)口服给药(口灌)。

在第40天，就在屠宰前，从每个围栏中取出每次处理的10只鸡，实施安乐死，并无菌取出盲肠。测试盲肠样品的沙门氏菌。

结果

在第3天从四只鸡收集的盲肠和肝/脾样品中沙门氏菌流行的结果(参见表28)证实了疫苗定殖。

表28

盲肠和肝/脾样品中的沙门氏菌流行

样品类型	处理	数目	无阳性(％)
				盲肠	T1	4	0
	T2	4	0
					T3	4	0
肝/脾	T1	4	0
					T2	4	3
	T3	4	4

Poly-O沙门氏菌特异性抗血清(MiraVista,Indianapolis,IN)证实了可疑的沙门氏菌分离物。

与未处理的鸡相比，单独的Megan Vac或与芽孢杆菌组合物一起的Megan Vac在第40天在盲肠中具有数值最低的沙门氏菌数量(数据未显示)。

如下表29所示，饲喂Megan Vac+芽孢杆菌组合物(T3)的禽的FCR低于未处理的禽(T1)和单独的Megan Vac处理的禽(T2)。

表29

在第40天时的性能

结论

目的是评估基于芽孢杆菌的益生菌对活鼠伤寒氏菌疫苗定殖的影响以及芽孢杆菌组合物随后在肉鸡中预防海德堡沙门氏菌攻击的能力。

第3天样品表明芽孢杆菌组合物不影响疫苗的最初沙门氏菌定殖。

此外，本研究表明，同时具有疫苗和芽孢杆菌组合物可具有累加效应。

参考文献

WO2013/153159

WO2016/060934

WO2016/118840

Alali,W.Q,C.L.Hofacre,G.F.Mathis and G.Faltys,2013.Effect ofessential oil compound on shedding and colonization of Salmonella entericserovar heidelberg in broilers,Poultry Science 92:836-841.

Johnson J,Reid WM.Anticoccidial drugs:lesion scoring techniques inbattery and floor-pen experiments with chicken,Exp Parasitol.,1970,Aug；28(1):30-6.

Knap I,Lund B,Kehlet AB,Hofacre C,Mathis G.:Bacillus licheniformisprevents necrotic enteritis in broiler chicken.Avian Dis.2010 Jun；54(2):931-5.

Timbermont L,et al.Lanckriet A,Gholamiandehkordi AR,Pasmans F,MartelA,Haesebrouck F,Ducatelle R,Van Immerseel F.,Origin of Clostridiumperfringens isolates determines the ability to induce necrotic enteritis inbroilers.,Comp Immunol Microbiol Infect Dis.,2009,Nov；32(6):503-12

Waititu et al.Effect of Supplementing Direct-Fed Microbials onBroiler Performance,Nutrient Digestibilities,and Immune Responses.Poult Sci,2014,93(3),625-635

Wang et al.,Comparison of gyrB gene sequences,16S rRNA gene sequencesand DNA–DNA hybridization in the Bacillus subtilis group,Int J Syst EvolMicrobiol.2007 Aug；57(Pt 8):1846-50.

Guidance on the assessment of bacterial susceptibility to inhibitorysof human and veterinary importance”,EFSA Journal 2012；10(6):2740

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由国际局填写

Claims

1.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株，其选自由以下组成的组：

a)作为DSM32324保藏的菌株，

b)作为DSM32325保藏的菌株，和

c)(a)或(b)的突变菌株，所述突变菌株：

(i)对氨苄青霉素、万古霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、红霉素、克林霉素、四环素和氯霉素具有敏感性；且

(ii)对大肠杆菌(E.coli)和产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)具有抑制活性。

2.芽孢杆菌(Bacillus)组合物，包含至少一种权利要求1所述的枯草芽孢杆菌菌株。

3.根据权利要求2所述的组合物，其包含枯草芽孢杆菌菌株DSM32324。

4.根据权利要求2或3所述的组合物，其包含枯草芽孢杆菌菌株DSM32325。

5.根据权利要求2-4中任一项所述的组合物，其包含枯草芽孢杆菌DSM32324和枯草芽孢杆菌DSM32325。

6.根据权利要求2-5中任一项所述的芽孢杆菌组合物，其中所述芽孢杆菌菌株是孢子。

7.根据权利要求2-6中任一项所述的组合物，其是直接饲喂微生物(DFM)、预混物、动物饲料添加剂或动物饲料。

8.根据权利要求2-7中任一项所述的组合物，其用于预防或控制细菌定殖或感染。

9.根据权利要求8所述的组合物，其用于预防或控制大肠杆菌和/或梭菌(Clostridium)的细菌定殖或感染。

10.预防或控制细菌定殖或感染的方法，所述方法包括将有效量的权利要求1所述的菌株或权利要求2-7中任一项的组合物施用于需要其的动物。

11.根据权利要求10所述的方法，其中大肠杆菌和/或梭菌的定殖或感染被预防或控制。

12.提高动物饲料消化率的方法，所述方法包括将权利要求1所述的菌株或权利要求2-7中任一项所述的组合物饲喂给动物。

13.改善选自由以下组成的组的一种或多种动物性能参数的方法

i)增强的体重增加(WG)，

ii)较低的饲料转化率(FCR)，

iii)较低的坏死性肠炎病变评分，

iv)较低的坏死性肠炎频率，

v)较低的坏死性肠炎死亡率，

vi)增加的欧洲生产效率因子(EPEF)，和

vii)较低的死亡率

所述方法包括将权利要求1所述的菌株或权利要求2-7中任一项所述的组合物饲喂给动物。

14.饲喂动物的方法，包括向动物施用权利要求1所述的菌株或权利要求2-7中任一项所述的组合物。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述动物是选自由以下组成的组的动物：家禽，例如肉鸡、种禽、蛋禽、火鸡、鸵鸟、鹌鹑、鸭和鹅，食草动物，例如马，和反刍动物，例如骆驼、羊驼、牛和绵羊、小牛，猪，例如仔猪、断奶仔、雏猪、育成猪、hocks、polts、小母猪、母猪和妊娠母猪，啮齿动物例如兔子，宠物例如猫和狗、鱼；以及甲壳类动物。