BR112019019014A2

BR112019019014A2 - cepas de bacillus subtilis melhorando os parâmetros de desempenho animal

Info

Publication number: BR112019019014A2
Application number: BR112019019014A
Authority: BR
Inventors: Sandvang Dorthe; Styrishave Tina
Original assignee: Chr Hansen As
Priority date: 2017-03-14
Filing date: 2018-03-14
Publication date: 2020-04-14
Also published as: KR20190128200A; ZA201905962B; EP3596238A1; US20200222472A1; CO2019010014A2; KR102631247B1; WO2018167171A1; CN110573606B; MX2019010805A; PH12019502073A1; US11291695B2; CN110573606A; AU2018234953B2; CA3056482A1; US20220218763A1; PE20200178A1; AU2018234953A1

Abstract

a presente invenção refere-se a uma cepa de bacillus subtilis selecionada a partir do grupo que consiste em a) a cepa depositada como dsm32324, b) a cepa depositada como dsm32325 e c) uma cepa mutante de (a) ou (b) que tem sensibilidade à ampicilina, vancomicina, gentamicina, canamicina, estreptomicina, eritromicina, clindamicina, tetraciclina e cloranfenicol; e tem atividade inibidora contra e. coli e clostridium perfringens. a invenção refere-se ainda a composições de bacillus compreendendo ao menos uma cepa de bacillus subtilis da invenção, preferencialmente a cepa de bacillus subtilis dsm32324 e/ou a cepa de bacillus subtilis dsm32325, como microbianos de alimentação direta (dfm), pré-mistura, aditivo para ração animal ou ração animal. a invenção fornece um método para melhorar um ou mais parâmetros de desempenho animal selecionados a partir do grupo que consiste em i) aumento do ganho de peso (wg), ii) menor taxa de conversão alimentar (fcr), iii) menor escore de lesão por enterite necrótica, iv) menor frequência de enterite necrótica, v) menor mortalidade por enterite necrótica, vi) aumento do fator europeu de eficácia da produção (epef) e vii) menor mortalidade, alimentando uma cepa ou uma composição de acordo com a invenção a um animal.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para CEPAS DE BACILLUS SUBTILIS MELHORANDO OS PARÂMETROS DE DESEMPENHO ANIMAL”.

CAMPO DA INVENÇÃO [0001] A presente invenção refere-se a uma cepa de Bacillus subtilis selecionada a partir do grupo que consiste em a) a cepa depositada como DSM32324, b) a cepa depositada como DSM32325 e c) uma cepa mutante de (a) ou (b) que tem sensibilidade à ampicilina, vancomicina, gentamicina, canamicina, estreptomicina, eritromicina, clindamicina, tetraciclina e cloranfenicol; e tem atividade inibidora contra Escherichia coll e Clostridium perfringens.

[0002] A invenção refere-se ainda a composições de Bacillus compreendendo ao menos uma cepa de Bacillus subtilis da invenção, preferencialmente a cepa de Bacillus subtilis DSM32324 e/ou a cepa de Bacillus subtilis DSM32325, como Microbianos de Alimentação Direta (DFM), pré-mistura, aditivo para ração animal ou ração animal.

[0003] A invenção fornece um método para melhorar um ou mais parâmetros de desempenho animai selecionados a partir do grupo que consiste em i) aumento do ganho de peso (WG), ii) menor taxa de conversão alimentar (FCR), iii) menor escore da lesão por entente ne~ erótica, iv) menor frequência de enterite necrótica, v) menor mortalidade por enterite necrótica, vi) aumento do fator europeu de eficácia da produção (EPEF) e vii) menor mortalidade, alimentando uma cepa ou uma composição de acordo com a invenção a um animal.

ANTECEDENTE DA INVENÇÃO [0004] A eliminação progressiva dos promotores de crescimento de antibióticos na União Européia em 2006 resultou em uma necessidade crescente de aditivos para ração com baixo custo, com alta eficácia e suscetibilidade a inibidores de importância humana e veterinária.

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2/78 [0005] Os aditivos probióticos para ração à base de bacillus são conhecidos por seus efeitos positivos na saúde e na produção de porcos e aves. Esses produtos são relevantes para a indústria de ração porque os esporos são estáveis ao calor e podem sobreviver ao processo de pelotização a temperaturas de até 90° C a 95° C. As bactérias formadoras de endósporos Bacillus subtilis e Bacillus licheniformis são geralmente consideradas seguras (GRAS) pela U.S. Food and Drug Administration (FDA) e aceitáveis para inclusão em uma dieta animal ou água pela Association of American Feed Control Officials (AAFCO).

[0006] O documento WO2013/153159 descreve um método para selecionar uma cepa de Bacillus tendo sensibilidade a antibióticos, atividade inibidora contra E coli e Clostridium perfringens, e alta esporulação.

[0007] Muitos dos isolados selecionados mostraram resistência a antibióticos indesejáveis acima dos pontos definidos pela European Food Safety Authority (EFSA) e foram descartados devido a questões de segurança. Vários dos isolados apresentaram inibição de Clostridium perfringens, enquanto apenas alguns isolados inibiram E. coli. As cepas com melhor inibição de patógenos foram principalmente da espécie B. amyloiiquefaciens.

[0008] O documento WO2016/060934 mostra na Tabela 7 a atividade anti-E coli de 10 cepas de Bacillus. Cinco das seis cepas de B. amyloiiquefaciens demonstram atividade anti-E coli enquanto apenas uma das duas linhagens de B. subtilis, a cepa isolada do produto Kemin, clostat, demonstrou atividade anti-E coli. Curiosamente, verificou-se posteriormente que esta cepa é uma B. amyloiiquefaciens cf. WO2016/118840 (página 46, linha 23).

[0009] O documento WO2016/118840 descreve várias cepas de Bacillus para melhorar a saúde e o desempenho dos animais de pro

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3/78 dução, em particular duas cepas de B. amyloliquefaciens e duas cepas de B. subtilis (ver Tabela 3.1). Apenas duas das cepas, a cepa de B. subtilis depositada como DSM29870 e a cepa de B. amyloliquefaciens depositada como DSM29869, foram consideradas sensíveis para todos os oito antibióticos testados. Resultados para ampicilina nâo foram fornecidos.

[0010] Verificou-se que a cepa de B. subtilis depositada como DSM29870 inibe o crescimento das cepas de E. coli ATCC10535 e ATC25922 in vitro (Exemplo 4). O Exemplo 7 fornece os resultados de três ensaios de provocação com Clostridium perfríngens. Não houve diferença significativa entre o grupo alimentado com DSM29870 (T4) e o grupo alimentado com bacitracina (T3) em relação a todos os parâmetros medidos nesses ensaios. Os resultados para BWG, FCR e mortalidade de aves com lesões por entente necrótica foram intermediários entre o grupo não infectado não tratado (T1) e o grupo infectado não tratado (T2).

[0011] No entanto, ainda há necessidade de cepas probióticas que podem ser usadas para melhorar a saúde e o desempenho dos animais de produção.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0012] A presente invenção fornece uma cepa de Bacillus subtilis selecionada a partir do grupo que consiste em a) a cepa depositada como DSM32324, b) a cepa depositada como DSM32325 e c) uma cepa mutante de (a) ou (b) que tem sensibilidade à ampicilina, vancomicina, gentamicina, canamicina, estreptomicina, entromicina, clindamicina, tetraciclina e cloranfenicol; e tem atividade inibidora contra E. coli e Clostridium perfríngens.

[0013] Uma cepa bacteriana refere-se a uma bactéria que permanece geneticamente inalterada quando cultivada ou multiplicada. A multiplicidade de tais bactérias idênticas é incluída quando referência é

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4/78 feita a uma cepa.

[0014] As composições compreendendo ao menos uma cepa de Bacillus subtilis de acordo com a invenção, por exemplo, como Microbianos de Alimentação Direta (DFM), um aditivo ou pré-mistura para ração animal, ou uma ração animal podem ser alimentados a um animal.

[0015] Ao menos uma cepa de Bacillus subtilis de acordo com a invenção pode ser adicionada à ração durante a produção, após a produção pelo fornecedor ou pela pessoa que alimenta o animal, imediatamente antes de fornecer a ração ao animal. As bactérias Bacillus subtilis usadas nos métodos e composições aqui descritas são particularmente adequadas porque são capazes de sobreviver (como esporos) às condições de calor e pressão do processo de produção de um produto de ração peletizada a seco.

[0016] A enterite necrótica causada por Clostridium perfrlngens tornou-se um grave problema econômico na produção avícola moderna. O objetivo de alguns dos estudos In vivo descritos nos exemplos foi investigar o efeito de aditivos para rações que compreendem uma cepa de Bacillus subtilis de acordo com a invenção na patogênese da enterite necrótica (NE) em estudos de gaiola de aves. Outros estudos In vivo em aves focaram no desempenho com ou sem provocação com Clostridium perfrlngens.

[0017] Estudos individuais de bateria/piso foram realizados para avaliar a influência de Bacillus subtilis DSM32324 e DSM32325 no desenvolvimento de enterite necrótica subclínica. Foram utilizadas duas instalações de pesquisa independentes diferentes, uma baseada na Europa (Exemplo 3, DSM32324) e outra nos Estados Unidos (Exemplo 4, DSM32325), significando que parâmetros de avaliação ligeiramente diferentes foram usados para avaliar o efeito das duas cepas.

[0018] Para Bacillus subtilis DSM3234, os parâmetros de desem

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5/78 penho taxa de conversão alimentar (FCR) e ganho de peso médio (AWG) medidos no dia 21, dia 35 e dia 42 mostraram uma melhora significativa em todos os pontos de dados quando considerando o Bacillus subtilis DSM3234 como aditivo para ração em comparação com o grupo de controle infectado não tratado. Surpreendentemente, o grupo tratado com Bacillus não mostrou diferenças significativas em relação ao grupo de controle não infectado e não medicado, mesmo que o último grupo não tenha recebido a provocação e tenha sido considerado saudável (Tabela 7).

[0019] No ensaio in vivo provocado de entente subclínica induzida, o Bacillus subtilis DSM3234 diminuiu a escore de lesão por entente necrótica em galinhas e reduziu significativamente a mortalidade por entente necrótica (Tabela 8).

[0020] O Bacillus subtilis DSM32325 diminuiu a frequência de entente necrótica em galinhas em comparação com o controle Infectado não tratado de uma maneira estatisticamente significativa quando os dados dos dias 25 e 26 foram combinados. Surpreendentemente, a frequência de entente necrótica foi ainda mais baixa no grupo tratado com Bacillus do que no grupo de controle tratado com Amoxícilina (Tabela 9).

[0021] Além disso, o Bacillus subtilis DSM32325 reduziu a gravidade de entente necrótica (escore médio) em comparação com o controle infectado não tratado de uma maneira estatisticamente significativa quando os dados dos dias 25 e 26 foram combinados. Surpreendentemente, o escore médio foi ainda menor no grupo tratado com Bacillus do que no grupo tratado com Amoxicilina (Tabela 10).

[0022] As duas cepas de B. subtilis também foram avaliadas em dois ensaios de alimentação de desempenho, o Exemplo 5 (DSM32324 e DSM32325) e o Exemplo 6 (DSM32324).

[0023] O Exemplo 5 fornece os resultados de um teste com 1800

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6/78 frangos Ross 308 machos e constatou que, durante o período de engorda global (0-42 dias de idade), os frangos suplementados com as cepas de Bacilli DSM32324 ou DSM32325 cresceram significativamente mais do que os animais de controle. A conversão alimentar (FOR) e o EPEF de todos os frangos suplementados com DSM19489, DSM32324 e DSM32325 foram significativamente melhorados quando comparados aos dos animais de controle.

[0024] O Exemplo 6 fornece os resultados de um teste de 1300 frangos Ross 308 machos por grupo de tratamento e demonstra que o DSM19489 teve uma tendência de mortalidade reduzida (p = 0,096) e Bacillus subtilis DSM32324 uma mortalidade acentuada e significativamente reduzida, especialmente no período de terminação, que também serviu para significância estatística da mortalidade para o estudo geral.

[0025] O Exemplo 7 investiga o efeito de três cepas de Bacilli selecionadas (DSM32324, DSM32325 e DSM25840) no desempenho e na digestibilidade ileal aparente e concluiu que todas as três cepas apresentaram resultados surpreendentemente bons e significativamente melhorados.

[0026] As aves suplementadas com DSM32324 apresentaram maior ganho diário de peso (Tabela 16), consumo diário de ração e taxa de conversão alimentar no período inicial (dados não mostrados) e maior digestibilidade de proteína em D42 (Tabela 17) em comparação com as aves não suplementadas.

[0027] As aves suplementadas com DSM25840 apresentaram maior ganho de peso diário (Tabela 16) e consumo diário de ração no período iniciai (dados não mostrados), maior peso corporal em D42 (Tabela 16) e maior digestibilidade de cinzas, proteínas e energia em D42 (Tabela 17) em comparação com as aves não suplementadas.

[0028] As aves suplementadas com DSM32325 apresentaram

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7/78 maior ganho de peso diário (Tabela 16) e consumo diário de ração no período inicial (dados não mostrados), e menor digestibilidade de Ca e fósforo em D42 (Tabela 17) em comparação com as aves não suplementadas.

[0029] Em conclusão, esses estudos demonstraram que as cepas de Bacillus subtilis depositadas como DSM32324 e DSM32325 mostram efeito na redução da enterite necrótica em ensaios de provocação In vivo e efeito positivo nos parâmetros de desempenho em aves domésticas. Conclusões importantes foram o aumento significativo do ganho de peso (WG), diminuição significativa da taxa de conversão alimentar (FCR), diminuição significativa da mortalidade e aumento significativo do fator de eficácia de produção europeu (EPEF).

[0030] O Exemplo 8 mostra que uma composição de Bacillus da invenção, EPB5, compreendendo DSM32324, DSM25840 e DSM32325 em uma relação de 8:3:5, melhorou o desempenho em frangos quando comparado a aves alimentadas com dietas correspondentes sem adição do probiótico. Respostas positivas foram demonstradas na taxa de conversão alimentar e no ganho médio de peso. Surpreendentemente, os grupos tratados com EBP5 mostraram melhora significativa para alguns dos parâmetros de desempenho em comparação com os grupos com o tratamento com cepa única de Bacillus, que novamente mostrou diferenças significativas nos parâmetros de desempenho para o grupo de controle infectado não medicado. Além disso, as cepas únicas de Bacillus subtilis DSM32234, Bacillus subtilis DSM32235 e Bacillus amyloliquefaciens DSM25840, bem como a combinação EBP5, reduziram a escore da lesão por enterite necrótica em frangos e reduziram a mortalidade por enterite necrótica significativamente em um ensaio in vivo.

[0031] O Exemplo 9 mostra que uma composição de Bacillus da invenção melhorou o desempenho em perus de d1 a d 147 de idade

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8/78 (período de alimentação de 147d) em níveis de dose de 250 mg/kg a 2000 mg/kg quando comparado a aves alimentadas com dietas correspondentes sem adição do probiótico. Respostas positivas foram demonstradas no ganho de peso corporal, na taxa de conversão alimentar e no teor de matéria seca dos excrementos.

[0032] O Exemplo 10 mostra que uma composição de Bacillus da invenção pode ser combinada com uma vacina, tal como uma vacina viva contra Salmonella Typhimurium, sem afetar a colonização inicial por Salmonella da vacina e sua capacidade subsequente de proteger contra uma provocação de Salmonella Heidelberg em frangos. O estudo indica que pode haver um efeito aditivo em ter tanto a vacina quanto a composição de Bacillus (Tabela 20).

DEFINIÇÕES [0033] Em geral, os termos e as frases usados aqui têm seu significado reconhecido na técnica, que pode ser encontrado por referência a textos padrão, referências de periódicos e contexto conhecido pelos versados na técnica. As seguintes definições são fornecidas para esclarecer seu uso específico no contexto da descrição.

[0034] Conforme usado aqui, as formas singulares um”, uma” e o” a” também pretendem incluir as formas plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrário.

[0035] Ração animal: O termo ração animal” refere-se a qualquer composto, preparação ou mistura adequada para ou destinada à ingestão por um animal. A ração animal para um animal monogástrico compreende concentrados, bem como, por exemplo, vitaminas, minerais, enzimas, aminoácidos e/ou outros ingredientes alimentares (tal como em uma pré-mistura). A ração animal pode ainda compreender forragem. Exemplos de rações para aves são fornecidos nos Exemplos 3 a 7.

[0036] Composição: O termo composição” refere-se a uma com

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9/78 posição compreendendo um carreador e ao menos uma cepa bacteriana como aqui descrito. As composições aqui descritas podem ser um Microbianos de Alimentação Direta (DFM), um aditivo ou pré-mistura para ração animal, ou uma ração animal.

[0037] Concentrado: o termo concentrado” significa uma ração com altas concentrações de proteínas e energia, tal como farinha de peixe, melaço, oligossacarídeos, sorgo, sementes e grãos (inteiros ou preparados por esmagamento, moagem, etc., por exemplo, de milho, aveia, centeio, cevada, trigo), torta de oleaginosas (por exemplo, de sementes de algodão, açafrão, girassol, soja (tal como farelo de soja), colza/canola, ou amendoim), torta de palma, material derivado de levedura e grãos de destilaria (tal como grãos de destilaria úmidos (WDS) e grãos de destilaria secos com solúveis (DDGS)).

[0038] Infecções por C. perfringens de controle e/ou enterite ne~ erótica: O termo infecções por C. perfringens de controle e/ou enterite necrótica” significa um método e/ou composição que inibe parcial ou completamente as infecções por C. perfringens e/ou enterite necrótica em um animal. Por conseguinte, o termo Infecções por C. perfringens de controle e/ou enterite necrótica” significa que as infecções por C. perfringens e/ou enterite necrótica são reduzidas ou completamente eliminadas.

[0039] Agentes Antimicroblanos para Inclusão Direta: o termo Agentes Antimicroblanos para Inclusão Direta” ou DFM” significa micro-organ ismos vivos, incluindo esporos que, quando administrados em quantidades adequadas, conferem um benefício, tal como melhor digestão ou saúde, ao hospedeiro.

[0040] Atividade enzimática em condições anaeróbias: O termo atividade enzimática sob condições anaeróbias” significa a atividade de enzimas produzidas por uma cepa de Bacillus durante o crescimento sob condições anaeróbias. O Exemplo 4 do documento WO2013/153159

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10/78 descreve um método para testar as cepas de Bacillus quanto à produção das enzimas xilanase, celulose e protease.

[0041] Fator de Eficácia de Produção Europeu (EPEF): O fator de eficácia de produção europeu é uma maneira de comparar o desempenho de aves vivas de bandos. Esse número facilita a comparação do desempenho dentro e entre fazendas e pode ser usado para avaliar variáveis ambientais, climáticas e de manejo. O EPEF é calculado como [(capacidade de sobrevivência (%) x peso vivo (kg))/(idade de depleção (dias) x FOR)] x 100, em que a capacidade de sobrevivência é a porcentagem de aves vivas no final do estudo, o peso vivo é o ganho de peso médio das aves no final do estudo, a idade de depleção é a idade das aves no final do estudo, e FCR é a taxa de conversão alimentar no final do estudo.

[0042] Quantidade/concentração/dosagem efetiva: Os termos quantidade efetiva”, concentração efetiva” ou dosagem efetiva” são definidos como a quantidade, concentração ou dosagem da(s) cepa(s) bacteriana(s) suficiente para melhorar a digestão ou rendimento de um animal. A dosagem efetiva real em números absolutos depende de fatores que incluem: o estado de saúde do animal em questão, outros ingredientes presentes. A quantidade eficaz”, concentração eficaz” ou dosagem eficaz” das cepas bacterianas pode ser determinada por ensaios de rotina conhecidos pelos versados na técnica. Um exemplo de uma quantidade eficaz para aves domésticas é dado nos Exemplos 3, 4, 5, 6 e 7.

[0043] Taxa de Conversão Alimentar (FCR): FCR é uma medida da eficiência de um animal na conversão da massa alimentar em aumentos da produção desejada. Animais criados para carne - tal como suínos, aves, bovinos, ovinos e peixes - a produção é a massa ganha pelo animal. Especificamente, FCR é a massa do alimento ingerido dividida pela produção, durante um período especificado. A FCR pode

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11/78 ser determinada como descrito no Exemplo 7. A melhora na FCR significa redução do valor da FCR.

[0044] Alimentando um animal: Os termos alimentando um animal” ou alimentado a um animal” significa que a composição da presente invenção é administrada oralmente ao animal em uma quantidade eficaz. A administração oral pode ser repetida, por exemplo, uma ou mais vezes ao dia durante um período especificado, tal como vários dias, uma semana, várias semanas, um mês ou vários meses. A alimentação de aves pode, por exemplo, ser realizada conforme descrito nos Exemplos 3, 4, 5, 6 e 7. Consequentemente, os termos alimentação” ou alimentado” significam qualquer tipo de administração oral, tal como administração via ração animal ou via água potável ou, em certas circunstâncias, por gavagem oral ou aspersão em aerossol.

[0045] Forragem: O termo forragem”, conforme definido aqui, também inclui fibras. A forragem é um material vegetal fresco, tal como feno e silagem de plantas forrageiras, grama e outras forrageiras, algas marinhas, grãos e leguminosas germinadas ou qualquer combinação dos mesmos. Exemplos de plantas forrageiras são: alfafa (lucerna), trevo das aves, brassica (por exemplo, couve, colza (canola), rutabaga (sueco), nabo), trevo (por exemplo, trevo semelhante, trevo vermelho, frevo subterrâneo, trevo branco), grama (por exemplo, grama das Bermudas, brome, grama de aveia falsa, festuca, grama de charneca, grama de pasto, grama de pomar, azevém, grama de Timothy), milho, milheto, cevada, aveia, centeio, sorgo, soja e trigo e vegetais tal como beterraba. A forragem Inclui ainda resíduos da colheita a partir da produção de grãos (tal como palha de milho, palha de trigo, cevada, aveia, centeio e outros grãos), resíduos de vegetais tal como beterraba, resíduos da produção de oleaginosas como caules e folhas de grãos de soja, canola e outros leguminosas, e frações do refino de grãos para consumo animal ou humano ou da produção de combustíPetição 870190091097, de 13/09/2019, pág. 44/115

12/78 vel ou de outras indústrias.

[0046] Atividade inibidora contra Clostridium perfringens: O termo atividade inibidora contra Clostridium perfringens” significa que ο crescimento de Clostridium perfringens é inibido e/ou que alguns ou todos os Clostridium perfringens são mortos. Isso pode ser determinado pelo ensaio descrito no Exemplo 1.

[0047] Atividade inibidora contra E. coli: O termo atividade inibidora contra E. coli’ significa que o crescimento de E. coii é inibido e/ou que parte ou todos os E. coli são mortos. Isso pode ser determinado pelo ensaio descrito no Exemplo 1.

[0048] Isolado: O termo isolado” significa que as cepas bacterianas descritas aqui estão em uma forma ou ambiente que não ocorre na natureza, ou seja, a cepa é ao menos parcialmente removida de um ou mais ou todos os constituintes que ocorrem naturalmente com os quais está associado na natureza.

[0049] Pélete: Os termos pélete” e/ou peletizando” referem-se a comprimidos ou péletes sólidos, arredondados, esféricos e/ou cilíndricos e aos processos para a formação de tais formas sólidas, particularmente péletes de ração e ração animal extrudada sólida. Como aqui utilizado, os termos extrusão” ou extrudando” são termos bem conhecidos na técnica e refere-se a um processo de forçar uma composição, como aqui descrito, através de um orifício sob pressão.

[0050] Aves: O termo aves” significa aves domésticas mantidas por humanos pelos ovos que produzem e/ou sua carne e/ou penas. As aves incluem galinhas, frangos de corte e matrizes. As aves incluem membros da superordem Galloanserae (aves), especialmente a ordem Galliformes (que inclui galinha, Guineafowls, codornas e perus) e a família Anatidae, na ordem Anseriformes, comumente conhecida como aves aquáticas” e incluindo patos domésticos e gansos domésticos. As aves também incluem outras aves que são mortas por sua carne,

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13/78 tal como pombos e avestruzes. Exemplos de aves incluem galinhas (incluindo matrizes, frangos de corte e pintos), patos, gansos, pombos, perus e codomas.

[0051] Prevenir infecções por C. perfringens e/ou entente necrótica: O termo prevenir infecções por C. perfringens e/ou enterite necrótica” significa um método e/ou composição que impede o desenvolvimento de uma infecção por C. perfringens e/ou enterite necrótica em um animal.

[0052] Açúcar redutor: Açúcar redutor é qualquer açúcar que tenha um grupo aldeído reativo ou que seja capaz de formar um para permitir que o açúcar atue como um agente redutor. As extremidades redutoras são formadas pela divagem enzimática da ligação glicosídica entre carboidratos poliméricos. Os açúcares redutores incluem glicose, gliceraldeído e galactose, bem como dissacarídeos, como lactose e maltose, e podem ser medidos pelo método de Nelson-Somogyi (NS) ou áddo dintrosalicílico (DNS). O DNS é um composto aromático que reage com açúcares redutores e outras moléculas redutoras para formar o ácido 3-amino-5-nitrosalicílico, que absorve a luz fortemente a 540 nm. O ensaio simula a situação quando a ração é ingerida pelo animal e digerida no trato digestivo. A capacidade de diferentes cepas de Bacillus degradarem polissacarídeos não amiláceos (NSP) em açúcares redutores foi investigada no Exemplo 2.

[0053] Fibras: O termo fibras” significa material vegetal seco com altos níveis de fibra, como fibra, farelo, cascas de sementes e grãos e resíduos de colheitas (tal como palha, copra, palha seca, joio, resíduos de beterraba).

[0054] Sensível a antibióticos: O termo sensível a antibióticos” significa a propriedade fenotípica de uma cepa bacteriana, que o crescimento da dita cepa bacteriana é inibido sob condições em que a cepa bacteriana crescería de outra maneira. Nesse contexto, a sensibili

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14/78 dade aos antibióticos é testada após as diretrizes CLSI (M07-A8 e M45-A2). Uma cepa de Bacillus é considerada sensível se o crescimento for detectado apenas na concentração crítica ou abaixo dela, especificado no EFSA Journal 2012; 10 (6): 2740 para vancomicina, gentamicina, canamicina, estreptomicina, eritromicina, clindamicina, tetraciclina e cloranfenicoi. No que diz respeito à ampicilina, não existe um ponto crítico dado por EFSA para Bacillus; o ponto crítico de 4 mg/L foi escolhido para que uma cepa seja considerada sensível.

[0055] Silagem: O termo silagem” significa forragem armazenada fermentada e com alta umidade que pode ser fornecida a herbívoros, tal como cavalos e ruminantes, por exemplo, camelos, lamas, vacas e ovelhas, ou usada como matéria-prima de biocombustível para digestores anaeróbios. Ela é fermentada e armazenada em um processo chamado ensilagem ou silagem, e geralmente é feita de culturas de grama ou cereais (por exemplo, milho, sorgo, aveia, centeio, timóteo, plantas forrageiras) ou leguminosas como trevos, alfafa, ervilhacas, usando a planta verde inteira (não apenas o grão). A silagem pode ser feita a partir de muitas culturas de campo, e termos especiais podem ser usados, dependendo do tipo (aveia-silagem para aveia, fenosilagem para alfafa). A silagem é feita colocando a vegetação verde cortada em um silo, empilhando-a em uma pilha grande coberta com folha de plástico, ou embrulhando fardos grandes em filme plástico.

[0056] Esporo: Os termos esporo” e endosporo” são intercambiáveis e têm seu significado normal que é bem conhecido e compreendido pelos versados na técnica. Como aqui utilizado, o termo esporo refere-se a um micro-organismo no seu estado não reprodutivo dormente protegido.

[0057] Estável: O termo estável” é um termo conhecido na técnica e, em um aspecto preferencial, estável significa a capacidade do micro-organismo de permanecer vivo, até que seja administrado a um

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15/78 animal para melhorar a saúde do animal.

[0058] Suínos: O termo suínos” ou porcos” significa porcos domesticados mantidos por seres humanos para alimentação, como sua carne. Os suínos incluem membros do gênero Sus, como Sus scrofa domesticus ou Sus domestícus, e incluem leitões, desmamados, em crescimento, em terminação, jarretes, polts”, marras, porcas e porcas gestantes.

[0059] Proteína vegetal: O termo proteína vegetal” refere-se a qualquer composto, preparação ou mistura que inclui ao menos uma proteína derivada ou originária de um vegetal, incluindo proteínas modificadas e derivados de proteínas.

[0060] As proteínas vegetais podem ser derivadas de fontes de proteínas vegetais, tal como legumes e cereais, por exemplo, materiais de plantas das famílias Fabaceae (Leguminosae), por exemplo, soja, tremoço, ervilha ou feijão; Cruciferaceae, Chenopodiaceae por exemplo, beterraba, beterraba sacarina, espinafre ou quinoa; e Poaceae. Outros exemplos de fontes de proteínas vegetais são cereais tal como cevada, trigo, centeio, aveia, milho, arroz e sorgo.

[0061] Ganho de peso: O ganho de peso de um animal é o aumento de peso do animal durante um período de tempo especificado. Um exemplo de determinação de ganho de peso médio é fornecido no Exemplo 3 e um exemplo de determinação de ganho de peso diário é fornecido no Exemplo 7.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [0062] A presente invenção fornece uma cepa de Bacillus subtilis selecionada a partir do grupo que consiste da cepa depositada como DSM32324, da cepa depositada como DSM32325 e de uma cepa mutante de DSM32324 ou DSM32325 que tem sensibilidade à ampicilina, vancomicina, gentamicina, canamicina, estreptomicina, eritromicina, clindamicina, tetraciclina e cloranfenicol; e tem atividade inibidora conPetição 870190091097, de 13/09/2019, pág. 48/115

16/78 tra E. coli e Clostridium perfringens.

[0063] As cepas bacterianas aqui descritas são isoladas, isto é, presentes em uma forma ou ambiente que não ocorre na natureza.

[0064] Uma bactéria mutante” ou uma cepa mutante” refere-se a uma bactéria mutante natural (espontânea, que ocorre naturalmente) ou a uma bactéria mutante induzida compreendendo uma ou mais mutações em seu genoma (DNA) que estão ausentes no DNA da cepa de origem. Um mutante induzido” é uma bactéria em que a mutação foi induzida por tratamento humano, tal como tratamento com qualquer tratamento de mutagenização convencionalmente usado, incluindo tratamento com mutagenes químicos, como um mutagene químico selecionado a partir de (i) um mutagene que se associa ou é incorporado no DNA, tal como um análogo básico, por exemplo, 2-aminopurina ou um agente interquelante tal como ICR-191, (ii) um mutagene que reage com o DNA, incluindo agentes alquilantes como nitrosoguanidina ou hidroxilamina, ou etano metil sulfonato (EMS) ou N-metil-N’-nitro-Nnitroguanidina (NTG), radiação UV ou gama etc. Por outro lado, um mutante espontâneo” ou mutante de ocorrência natural” não foi mutagenizado pelo homem.

[0065] Um mutante pode ter sido submetido a vários tratamentos de mutagenização (um único tratamento deve ser entendido uma etapa de mutagenização seguida por uma etapa de triagem/seleção), mas atualmente é preferencial que não mais do que 20, ou mais do que 10, ou mais do que 5 tratamentos (ou etapas de triagem/seleção) sejam realizados. Em um mutante atualmente preferencial, menos do que 1%, menos do que 0,1, menos do que 0,01, menos do que 0,001% ou até menos do que 0,0001% dos nucleotídeos no genoma bacteriano foram substituídos por outro nucleotídeo, ou deletado, em comparação com a cepa mãe.

[0066] As bactérias mutantes, como descrito acima, não são GMO,

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17/78 isto é, não modificadas por tecnologia de DNA recombinante. Como uma alternativa ao método preferencial acima de fornecer o mutante por mutagênese aleatória, também é possível fornecer esse mutante por mutagênese sítio-dirigida, por exemplo, usando técnicas de clonagem adequadamente projetadas.

[0067] Quando o mutante é fornecido como um mutante de ocorrência espontânea, a cepa é submetida à etapa de seleção sem qualquer tratamento de mutagenização anterior.

[0068] Em uma modalidade, a cepa de Bacillus subtilis da invenção tem ao menos 98% (tal como ao menos 98,5%, ao menos 99%, ao menos 99,5%, ao menos 99,5%, ao menos 99,6%, ao menos 99,7 %, ao menos 99,8%, ao menos 99,9%) de identidade de sequência com a sequência nucleotídica de DSM32324.

[0069] Em uma modalidade, a cepa de Bacillus subtilis da invenção tem ao menos 98% (tal como ao menos 98,5%, ao menos 99%, ao menos 99,5%, ao menos 99,5%, ao menos 99,6%, ao menos 99,7 %, ao menos 99,8%, ao menos 99,9%) de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de DSM32324.

[0070] Em uma modalidade, a cepa de Bacillus subtilis da invenção tem ao menos 98% (tal como ao menos 98,5%, ao menos 99%, ao menos 99,5%, ao menos 99,5%, ao menos 99,6%, ao menos 99,7 %, ao menos 99,8%, ao menos 99,9%) de identidade de sequência com a sequência nucleotídica de DSM32325.

[0071] Em uma modalidade, a cepa de Bacillus subtilis da invenção tem ao menos 98% (tal como ao menos 98,5%, ao menos 99%, ao menos 99,5%, ao menos 99,5%, ao menos 99,6%, ao menos 99,7 %, ao menos 99,8%, ao menos 99,9%) de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de DSM32325.

[0072] Considera-se que uma cepa de Bacilius exibe uma atividade inibidora em direção a E. coll se a zona de inibição for de ao menos

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0,5 mm (baixa inibição). Preferenciaimente, a zona de inibição está entre ao menos 0,5 mm e 2 mm (média), mais preferencialmente mais do que 2 mm (alta). A zona de inibição pode ser diferente para as várias cepas de E co//. Para que uma cepa seja considerada exibindo uma atividade inibidora contra E. coli de acordo com a presente invenção, ela deve exibir uma zona de inibição de ao menos 0,5 mm para todas as cepas de E. co//testadas. Preferencialmente, a zona de inibição de duas, três, quatro ou ainda mais preferencialmente a zona de inibição de todas as cinco cepas de E. coli está ao menos entre 0,5 mm e 2 mm. Ainda mais preferencialmente, a zona de inibição de duas, três, quatro ou ainda mais preferencialmente a zona de inibição de todas as cinco cepas de E. coli é superior a 2 mm.

[0073] Considera-se que uma cepa de Bacillus exibe uma atividade inibidora em relação a Clostridium perfringens se a zona de inibição for de ao menos 0,5 mm (baixa inibição). Preferencialmente, a zona de inibição está entre ao menos 0,5 mm e 2 mm (média), mais preferencialmente mais do que 2 mm (alta). A zona de inibição pode ser diferente para as várias cepas de Clostridium perfringens. Para que uma cepa seja considerada exibindo uma atividade inibidora contra Clostridium perfringens de acordo com a presente invenção, ela deve exibir uma zona de inibição de ao menos 0,5 mm para todas as cepas de Clostridium perfringens testadas. Preferencialmente, a zona de inibição de duas, três, quatro ou ainda mais preferencialmente a zona de inibição de todas as cinco cepas de Clostridium perfringens está ao menos entre 0,5 mm e 2 mm. Ainda mais preferencialmente, a zona de inibição de duas, três, quatro ou ainda mais preferencialmente a zona de inibição de todas as cinco cepas de Clostridium perfringens é superior a 2 mm.

[0074] De preferência, uma cepa de Bacillus também deve ser capaz de aumentar a quantidade de açúcares redutores a partir da de

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19/78 gradação de polissacarídeos não amiláceos (NSP). A capacidade de diferentes cepas de Bacillus degradarem NSP em açúcares redutores foi investigada no Exemplo 2 e os resultados são fornecidos na Tabela

4. As cepas que têm a capacidade de aumentar a quantidade de açúcar disponível para ao menos 500 kJ/kg de ração quando testadas conforme descrito no exemplo são consideradas preferenciais.

[0075] Com base nas descrições detalhadas dos ensaios, o versado na técnica é capaz de repetir esses ensaios para determinar se uma cepa específica de Bacillus está de acordo com a sensibilidade ao antibiótico, a atividade inibidora e a capacidade de degradação de NSP. Deste modo, o versado na técnica será capaz de produzir consistentemente cepas com as propriedades declaradas. De preferência, o versado na técnica também incluirá testes de sensibilidade das células vegetativas em pH 4, e testes de resistência biliar para garantir que as cepas sejam capazes de sobreviver em um grau suficiente no trato gastrointestinal, por exemplo, como descrito em WO2013/153159. Evidentemente, esses ensaios podem ser realizados em qualquer ordem e algumas cepas podem ser excluídas durante o processo se não atenderem aos critérios.

[0076] A invenção fornece ainda uma composição de Bacillus compreendendo ao menos uma cepa de Bacillus subtilis da invenção. Em uma modalidade, a composição de Bacillus compreende uma cepa de Bacillus subtilis da invenção. Em outra modalidade, a composição de Bacillus compreende duas cepas de Bacillus subtilis da invenção, por exemplo, uma combinação de Bacillus subtilis DSM32324 e Bacillus subtilis DSM32325.

[0077] As composições de Bacillus de acordo com a invenção podem compreender uma combinação de ao menos uma das cepas de Bacillus subtilis da invenção e ao menos uma outra cepa de Bacillus. A composição de Bacillus pode compreender ao menos duas cepas, tal

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20/78 como ao menos três, ao menos quatro, ao menos cinco cepas de Bacillus, ao menos uma das quais é uma cepa de Bacillus subtilis da presente invenção.

[0078] As cepas de Bacillus podem ser utilizadas em qualquer combinação nas composições de Bacillus. Por exemplo, a composição de Bacillus pode compreender ao menos uma cepa de Bacillus subtilis da invenção e/ou ao menos uma cepa de Bacillus licheniformis e/ou ao menos uma cepa de Bacillus amyloliquiefaciens, por exemplo, duas cepas de Bacillus subtilis da invenção e ao menos uma cepa de Bacillus amyloliquiefaciens. A composição pode compreender Bacillus subtilis DSM32324 e/ou Bacillus subtilis DSM32325 em combinação com Bacillus amyloliquiefaciens DSM25840 e/ou Bacillus licheniformis DSM17236 e/ou Bacillus subtilis DSM19489. Qualquer outra combinação possível das cepas de Bacillus da presente invenção com outras cepas de Bacillus também pode ser feita. Como um exemplo específico, a composição de Bacillus compreende Bacillus subtilis DSM32324, Bacillus subtilis DSM32325 e Bacillus amyloliquiefaciens DSM25840. Como outro exemplo específico, a composição de Bacillus compreende Bacillus subtilis DSM32324, Bacillus subtilis DSM32325 e Bacillus licheniformis DSM 17236. Em um exemplo ainda mais específico, a composição de Bacilius compreende Bacillus subtilis DSM32324, Bacillus subtilis DSM32325 e Bacillus subtilis DSM19489.

[0079] Se for utilizada mais do que uma cepa, considera-se que a proporção de cada cepa na composição seja de 1 a 99%, tal como de 20 a 80%, por exemplo, de 30 a 70%, mais partlcularmente de 20%, 33%, 40% ou 50% da quantidade total de isolados bacterianos calculados como CFU/g de composição. As cepas individuais podem estar presentes em números aproximadamente iguais ou em números desiguais.

[0080] Uma modalidade atualmente preferencial da invenção é

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21/78 uma composição de Bacillus compreendendo DSM32324, DSM25840 e DSM32325 em uma relação de 8:3:5.

[0081] A cepa ou cepas relevantes de Bacillus são fornecidas sob uma forma comercialmente relevante conhecida pelo versado na técnica. Por conseguinte, em uma modalidade, a cepa de Bacillus ou cepas da composição estão presentes em uma forma seca (por exemplo, seca por aspersão) ou em uma forma congelada. A composição pode ser fornecida em qualquer forma adequada, tal como na forma de um líquido, por exemplo, um gel, uma pasta fluida, um pó ou um pélete.

[0082] Em uma modalidade preferencial, a composição de Bacillus compreende de 10⁵ a 10¹² CFU/g, tal como de 5 x10⁵ a 10¹² CFU/g, mais preferencialmente de 10⁶ a 10¹² CFU/g, e mais preferencialmente de 10⁷ a 10¹² CFU/g, tal como de 10⁸ a 10¹¹ CFU/g, por exemplo, de 10⁹ a 10¹° CFU/g de cada uma das cepas bacterianas na composição. A composição de Bacillus compreende ao menos 5 x 10⁴ CFU de cada cepa por grama da composição que distingue uma composição da presente invenção, por exemplo, de ração animal com cepas de ocorrência natural.

[0083] O termo CFU/g” refere-se ao peso em gramas da composição, incluindo carreadores tal como carbonato de cálcio, agentes anti-formadores de torta tal como silicatos de alumínio e kieselgur (terra de diatomáceas), e outros componentes presentes na composição.

[0084] As composições da presente invenção incluem ao menos uma cepa de Bacillus da invenção e ao menos um carreador e/ou outro componente que torna a composição adequada para alimentar um animal ou como um aditivo para água potável.

[0085] Como usado aqui, o termo pré-mistura” refere-se a uma cepa de Bacillus adicionada a um carreador para fazer uma prémistura que é então adicionada a uma ração animal a uma taxa de inclusão desejada.

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22/78 [0086] Alternativamente, ao menos uma cepa de Bacillus da invenção pode ser formulada com ingredientes para ração animal, como discutido em detalhes a seguir. Tais combinações podem estar na forma de péletes que são extrudados através de processos padrão de peletização.

[0087] A invenção também fornece um método para a produção de ração animal, aditivo ou pré-mistura para ração animai, incluindo a adição de ao menos uma cepa de Bacillus da invenção a uma ração animal ou componentes relevantes da mesma.

[0088] As bactérias Bacillus existem como esporos e células vegetativas que podem se dividir para produzir mais células vegetativas. Quando aqui é feita referência a Bacillus, esta se refere tanto a esporos quanto a células vegetativas, a menos que o contexto indique o contrário.

[0089] Na composição de Bacillus da presente Invenção, a cepa ou cepas de Bacillus são preferencialmente fornecidas como esporos. A principal função da esporulação é geralmente garantir a sobrevivência de uma bactéria através de períodos de estresse ambiental. Elas são, portanto, resistentes à radiação ultravioleta e gama, dessecação, lisozima, temperatura, fome e desinfetantes químicos. A camada de esporos é impermeável a muitas moléculas tóxicas e também pode conter enzimas envolvidas na germinação. O núcleo tem estruturas celulares normais, tal como DNA e ribossomos, mas o esporo é metabolicamente inativo.

[0090] A forma vegetativa da bactéria produz efetores que podem reduzir patógenos bacterianos ou podem ter outros efeitos benéficos no trato gastrointestinal de um animal. Assim, a reativação e germinação dos esporos após a administração ao animal é importante.

[0091] Sabe-se na literatura que a bile tem algumas influências negativas na sobrevivência, germinação e crescimento de células ve

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23/78 getativas no GIT dos animais. Portanto, as bactérias problóticas devem geralmente sobreviver e se proliferar no intestino dos animais, sendo capazes de tolerar um pH baixo e ser resistentes ao sal biliar, a fim de serem úteis como composições probióticas de Bacillus para a adição à ração animal. Os exemplos fornecem testes in vitro úteis a este respeito. O teste de sensibilidade ao pH baixo (simulando condições gástricas) concentra-se na resistência das células vegetativas ao pH 4. Sabe-se que os esporos são resistentes em valores de pH de 23 e que as células vegetativas morrem em pH 2. No entanto, o pH gástrico pode ter valores de pH de até 4, especialmente em condições de alimentação. Isso pode resultar na germinação dos esporos e, portanto, é relevante testar a sensibilidade das células vegetativas em pH 4. As cepas selecionadas devem preferencialmente ser resistentes em pH 4.

[0092] As cepas de Bacillus subtilis depositadas como DSM32324 e DSM32325 foram analisadas quanto à sensibilidade das células vegetativas em pH 4 e resistência à bilis para garantir que as cepas são adequadas.

[0093] Uma composição de Bacillus pode compreender uma ou duas cepas diferentes de B. subtilis e/ou uma ou duas cepas de B. Ii~ cheniformis e/ou uma ou duas cepas de Bacillus amyloliquiefaciens, em que cada cepa é selecionada independentemente para desempenhar um papel e/ou função específica. A combinação dessas cepas pode ser combinada com uma ração animal, tal como ração para aves e, finalmente, usada para melhorar a saúde e a produtividade dos animais agrícolas (por exemplo, gado e/ou aves). Por exemplo, as cepas e/ou as cepas combinadas podem reduzir patógenos intestinais nas aves e aumentar o ganho de peso das aves comerciais.

[0094] Em uma outra modalidade, a composição de Bacillus da invenção pode ser combinada com uma vacina, tal como uma vacina

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24/78 viva de Salmonella Typhimurium, para reduzir a infecção por Salmonella e/ou aumentar a FCR.

[0095] Em um aspecto, a presente invenção fornece uma ração animal, aditivo ou pré-mistura para ração animal compreendendo ao menos uma cepa de Bacillus subtilis de acordo com a invenção e compreendendo ainda um ou mais concentrado(s), vitamina(s), mineral(ais), enzima(s), aminoácido(s) e/ou outro(s) ingrediente(s) de ração. Em uma modalidade, a ração animai, aditivo ou pré-mistura para ração animal compreende a cepa de Bacillus subtilis DSM32324. Em outra modalidade, a ração animai, aditivo ou pré-mistura para ração animal compreende a cepa de Bacillus subtilis DSM32325. A ração animal, aditivo para ração animai ou pré-mistura pode compreender tanto Bacillus subtilis DSM32324 quanto Bacillus subtilis DSM32325.

[0096] Em uma modalidade específica, a ração animal compreende forragem. Geralmente, a forragem compreende uma fonte de proteína vegetai. Em uma modalidade particular, a fonte de proteína vegetai é material de uma ou mais plantas da família Fabaceae. Em outra modalidade particular, a fonte de proteína vegetal é material de uma ou mais plantas da família Chenopodiaceae. Outros exemplos de fontes de proteínas vegetais são canola e couve. Em outra modalidade particular, a soja é uma fonte de proteína vegetal preferencial. Como um exemplo, a forragem compreende 0 a 80% de milho; e/ou 0 a 80% de sorgo; e/ou 0 a 70% de trigo; e/ou 0 a 70% de cevada; e/ou 0 a 30% de aveia; e/ou 0 a 40% de farelo de soja; e/ou 0 a 10% de farinha de peixe; e/ou 0 a 20% de soro de leite.

[0097] Em uma modalidade, a forragem e ao menos uma cepa de Bacillus subtilis da invenção são misturadas com um concentrado. Em outra modalidade, a forragem e ao menos uma cepa de Bacillus subtilis da invenção são misturadas com uma pré-mistura. Em uma outra modalidade, a forragem e ao menos uma cepa de Bacillus subtilis da

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25/78 invenção são misturadas com vitaminas e/ou minerais. Em uma outra modalidade, a forragem e ao menos uma cepa de Bacillus subtilis da invenção são misturadas com uma ou mais enzimas. Em uma modalidade adicional, a forragem e ao menos uma cepa de Bacillus subtilis da invenção são misturadas com outros ingredientes alimentares, tal como agentes corantes, estabilizadores, aditivos para melhorar o crescimento e compostos de aroma/flavorizantes, ácidos graxos poliinsaturados (PUFAs); espécies reativas de geração de oxigênio, peptídeos antimicrobianos, polipeptideos antifúngicos e aminoácidos.

[0098] Em uma modalidade particular, a ração animal consiste em ou compreende leite (por exemplo, de porca, vaca, cabra, ovelha), por exemplo, para alimentação de leitões. Em outra modalidade particular, a ração animal consiste em ou compreende a substituição do leite, por exemplo, para ração de leitão.

[0099] Em outra modalidade, a ração animal pode incluir uma ou mais vitaminas, tal como uma ou mais vitaminas lipossolúveis e/ou uma ou mais vitaminas hidrossolúveis. Em outra modalidade, a ração animal pode opcionalmente incluir um ou mais minerais, tal como um ou mais minerais traço e/ou um ou mais macro minerais. Normalmente, vitaminas lipossolúveis e hidrossolúveis, bem como minerais traço, fazem parte da chamada pré-mistura destinada à adição à ração, enquanto os macro minerais geralmente são adicionados separadamente à ração. Exemplos não limitantes de vitaminas lipossolúveis incluem vitamina A, vitamina D3, vitamina E e vitamina K, por exemplo, vitamina K3. Exemplos não limitantes de vitaminas solúveis em água incluem vitamina B12, biotina e colina, vitamina B1, vitamina B2, vitamina B6, niacina, ácido fólico e pantotenato, por exemplo, Ca-Dpantotenato. Exemplos não limitantes de minerais traço incluem boro, cobalto, cloreto, cromo, cobre, fluoreto, iodo, ferro, manganês, molibdênio, selênio e zinco. Exemplos não limitantes de macro minerais inPetição 870190091097, de 13/09/2019, pág. 58/115

26/78 cluem cálcio, magnésio, potássio e sódio.

[00100] A ração animal, aditivo para ração animal ou pré-mistura da invenção também pode compreender ao menos uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em fitase (EC 3.1.3.8 ou 3.1.3.26); xilanase (EC 3.2.1.8); galactanase (EC 3.2.1.89); alfa-galactosidase (EC 3.2.1.22); protease (EC 3,4); fosfolipase A1 (EC 3.1.1.32); fosfolipase A2 (EC 3.1.1.4); lisofosfolipase (EC 3.1.1.5); fosfolipase C (3.1.4.3); fosfolipase D (EC 3.1.4.4); amilase tal como, por exemplo, alfa-amilase (EC 3.2.1.1); lisozima (EC 3.2.1.17); e beta-glucanase (EC 3.2.1.4 ou EC 3.2.1.6), ou qualquer mistura dos mesmos.

[00101] A ração animal, aditivo para ração animal ou pré-mistura da invenção pode ainda compreender um ou mais aminoácidos adicionados. Exemplos de aminoácidos que são utilizados na ração animal são lisina, alanina, beta-alanina, treonina, metionina e triptofano. A ração animal, aditivo para ração animal ou pré-mistura da invenção pode ainda compreender agentes corantes, estabilizadores, aditivos para melhorar o crescimento e compostos de aroma/flavorizantes, ácidos graxos poli-insaturados (PUFAs); espécies reativas de geração de oxigênio, peptídeos antimicrobianos e polipeptídeos antifúnglcos. Exemplos de agentes corantes são carotenoides, tal como betacaroteno, astaxantina e luteína. Exemplos de compostos de aroma/flavorizantes são creosol, anetol, deca-, undeca- e/ou dodeca-lactonas, iononas, irona, gingerol, piperidina, propilideno ftalida, butilideno ftalida, capsaicina e tanino. Exemplos de ácidos graxos poli-insaturados são os ácidos graxos poli-insaturados C18, C20 e C22, tal como ácido araquidônico, ácido docosohexanoico, ácido eicosapentanoico e ácido gamalinoieico. Exemplos de espécies reativas de geração de oxigênio são produtos químicos tal como perborato, persulfato ou percarbonato; e enzimas tal como uma oxidase, uma oxigenase ou uma sintetase.

[00102] Em uma modalidade, a ração animal, aditivo ou pré-mistura

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27/78 para ração animal compreende um ou mais coccidiostatos.

[00103] A ração animal, aditivo para ração animal ou pré-mistura compreende ainda um carreador. O carreador pode compreender um ou mais dos seguintes compostos: água, glicerol, etileno glicol, 1,2-propileno glicol ou 1,3-propileno glicol, cloreto de sódio, benzoate de sódio, sorbato de potássio, sulfato de sódio, sulfato de potássio, sulfato de magnésio, tiossulfato de sódio, carbonato de cálcio, citrato de sódio, dextrina, maltodextrina, glicose, sacarose, sorbitol, lactose, soro de leite, permeado de soro de leite, farinha de trigo, farelo de trigo, farelo de glúten de milho, amido e celulose.

[00104] Em uma modalidade, as uma ou mais cepas bacterianas são estáveis quando submetidas a pressões aplicadas/obtidas durante um processo de extrusão para peletização. Em uma modalidade particular, as uma ou mais cepas bacterianas são estáveis em pressões variando de 1 bar a 40 bar.

[00105] Em uma modalidade particular, as uma ou mais cepas bacterianas são estáveis em altas temperaturas. Em particular, as cepas bacterianas são estáveis quando são submetidas a temperaturas atingidas durante um processo de extrusão para peletização. Em uma modalidade ainda mais particular, as uma ou mais cepas bacterianas são estáveis a temperaturas variando de 70° C a 120° C.

[00106] Em uma modalidade, a ração animal, aditivo ou pré-mistura para ração animal compreende ainda um ou mais micro-organismos adicionais. Em uma modalidade específica, a ração animal, aditivo ou pré-mistura para ração animal compreende ainda uma bactéria de um ou mais dos seguintes gêneros: Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Bacillus, Pediococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Carnobacterium, Propionibacterium, Bifidobacterium, Clostridium e Megasphaera ou qualquer combinação dos mesmos.

[00107] Em uma modalidade específica, a ração animal, aditivo ou

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28/78 pré-mistura para ração animal compreende ainda uma bactéria de uma ou mais das seguintes cepas de Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus pumilus, Bacillus polymyxa, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus simplex, Bacillus mojavensls, Bacillus safensls, Bacillus simplex, Bacillus atrophaeus, Bacillus methyletrephicus, Bacillus siamensis, Bacillus vallismortis, Bacillus tequilensis ou qualquer combinação das mesmas.

[00108] Em uma modalidade específica, a ração animal, aditivo ou pré-mistura para ração animal compreende ainda um ou mais tipos de levedura. Os um ou mais tipos de leveduras podem ser selecionados a partir do grupo que consiste em Saccharomycetaceae, Saccharomyces (tal como S. cerevisiae e/ou S. boulardii), Kluyveromyces (tal como K. marxianus e K. lactis), Candida (tal como C. utilis, também chamada levedura Torula), Plchia (tal como P. pastoris), Torulaspora (tal como 7, delbrueckii), leveduras Phaffia e Basidiomycota.

[00109] Dietas de animais podem, por exemplo, ser fabricadas como ração farelada (não peletizada) ou ração peletizada. Normalmente, as rações fareladas são misturadas e quantidades suficientes de vitaminas e minerais essenciais são adicionadas de acordo com as especificações para as espécies em questão. As culturas de bactérias e opcionalmente enzimas podem ser adicionadas como formulações sólidas ou líquidas. Por exemplo, para alimentação amassada, uma formulação de cultura sólida ou líquida pode ser adicionada antes ou durante a etapa de misturaçâo dos ingredientes. Para ração peletizada, a composição de Bacillus (líquida ou sólida) também pode ser adicionada antes ou durante a etapa de misturaçâo de ingredientes alimentares. Tipicamente, uma composição líquida de Bacillus da invenção compreende a(s) cepa(s) bacteriana(s) opcionalmente com um poliol, tal como gliceroi, etileno glicol ou propileno glicoi, e é adicionada após a etapa de peletizaçâo, tal como por aspersão da formulação líquida

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29/78 nos péletes. As bactérias também podem ser incorporadas em um aditivo ou pré-mistura para ração animal.

[00110] A composição de acordo com a invenção pode ser utilizada para a prevenção ou controle de uma colonização ou infecção bacteriana, por exemplo, por E. coll e/ou Clostridium, tal como Clostridium difficile, Clostridium novyi, Clostridium perfringens ou Clostridium septicum.

[00111] Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método para a prevenção ou controle de uma colonização ou infecção bacteriana, por exemplo, por E. coll e/ou Clostridium, tal como Clostridium difficile, Clostridium novyi, Clostridium perfringens ou Clostridium septicum, o método compreendendo administrar uma quantidade eficaz de uma cepa de acordo com a invenção ou de uma composição de acordo com a invenção a um animal em necessidade da mesma.

[00112] Outro aspecto da invenção refere-se a um método para alimentar um animal compreendendo administrar uma composição de Bacillus da invenção a um animal, em particular um animal monogástrico.

[00113] Os animais monogástricos incluem, mas não estão limitados a, aves tal como frangos de corte, galinhas reprodutoras, matrizes, perus, avestruzes, codornas, patos e gansos, herbívoros tal como cavalos e ruminantes, por exemplo, camelos, lhamas, gado e ovelhas, bezerros, suínos tais como leitões, desmamados, em crescimento, em terminação, jarretes, polts”, marras, porcas, porcas gestantes, roedores tal como coelhos, animais de estimação tal como gatos e cães e peixes (incluindo, mas não limitados a salmão, truta, tilápia, bagre e carpa; e crustáceos (incluindo, mas não limitados a camarões e lagostins). Porcos e/ou aves são animais monogástricos preferenciais.

[00114] Em outro aspecto, a invenção refere-se ao uso de ao menos uma cepa de Bacillus subtilis da invenção ou uma ração animal,

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30/78 aditivo ou pré-mistura para ração animal compreendendo ao menos uma cepa de Bacillus subtilis da invenção para melhorar o desempenho de um animal, em particular um animal monogástrico [00115] Como evidenciado nos exemplos, a administração de uma cepa de Bacillus subtilis da invenção melhora a saúde gastrointestinal do animal, por exemplo, previne ou controla enterite, e fornece parâmetros aprimorados de desempenho animal para os animais tratados em comparação com os controles. Os parâmetros de desempenho animal incluem, entre outros, ganho de peso (WG), taxas de conversão alimentar (FCR), diminuição da mortalidade e aumento do fator de eficácia de produção europeu (EPEF).

[00116] A invenção fornece ainda um método para aumentar a digestibilidade de uma ração animal, tal como digestibilidade de proteínas, o método compreendendo alimentar uma cepa de acordo com a invenção ou uma composição de acordo com a invenção a um animal. [00117] Por conseguinte, a invenção refere-se ao uso de uma cepa de acordo com a invenção, ou uma composição de acordo com a invenção, para melhorar um ou mais parâmetros de desempenho animal selecionados a partir do grupo que consiste em:

[00118] i) aumento do ganho de peso (WG), [00119] ii) menor taxa de conversão alimentar (FOR), [00120] iii) menor escore de lesão por enterite necrótica, [00121] iv) menor frequência de enterite necrótica, [00122] v) menor mortalidade por enterite necrótica, [00123] vi) aumento do fator de eficácia da produção europeu (EPEF) e [00124] vii) menor mortalidade.

[00125] Em uma modalidade preferencial da invenção, o desempenho animal” é determinado pelo ganho de peso corporal do animal e/ou pela relação de conversão alimentar. Por melhor desempenho

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31/78 animal”, entende-se que há aumento do ganho de peso corporal e/ou taxa de conversão alimentar reduzida e/ou digestibilidade melhorada de nutrientes ou energia digerível em uma ração e/ou energia metabolizável e/ou aumento da eficiência alimentar resultante do uso de ração animal, aditivo para ração animal ou pré-mistura da presente invenção em ração animal em comparação com ração animal que não compreende a dita ração animal, aditivo ou pré-mistura para ração animal. De preferência, por melhor desempenho animal” significa que há aumento do ganho de peso corporal e/ou redução da taxa de conversão alimentar.

[00126] Um aumento de ganho de peso” refere-se a um animal que tem um peso corporal aumentado ao ser alimentado com ração compreendendo uma composição de ração comparada com um animal sendo alimentado com uma ração sem a dita composição de ração da invenção. Especificamente, o ganho de peso (WG) de um animal é o aumento de peso do animal durante um período de tempo especificado. Em uma modalidade, a melhora no ganho de peso corporal é de ao menos 0,5%, tal como ao menos 1%, ao menos 2%, ao menos 2,5%, ao menos 3%, ao menos 4 %, ao menos 5%, ao menos 6%, ao menos 7%, ao menos 8%, ao menos 9%, ao menos 10%.

[00127] Em uma modalidade, a melhora no ganho de peso resulta em um ganho de peso corporal de ao menos 0,5%, tal como ao menos 0,8%, ao menos 1,2%, ao menos 1,5%, ao menos 1,5%, ao menos 1,8%, como ao menos 2,0%, ao menos 2,5%, ao menos 3,0%, ao menos 4,0%, ao menos 5,0%, ao menos 5,0%, ao menos 6,0%, ao menos 7,0%. Em uma modalidade preferencial, a melhora no ganho de peso resulta em um ganho de peso selecionado a partir do grupo que consiste em 1,8% a 2,0%, de 2,0% a 2,2%, de 2,2% a 2,4%, de 2,4% a 2,6%, de 2,6% a 2,8%, de 2,8% a 3,0%, de 3,0% a 3,2%, de 3,2% a 3,4%, de 3,4% a 3,6%, de 3,6% a 3,8%, de 3,6% a 3,8%, de 3,8% a

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4,0%, de 4 % a 5%, de 5% a 7%, de 7% a 10%, ou qualquer combinação dos mesmos.

[00128] Por menor taxa de conversão alimentar” ou melhor taxa de conversão alimentar”, entende-se que o uso de uma composição aditiva para ração resulta em uma menor quantidade de ração que precisa ser alimentada a um animal para aumentar o peso do animal em uma quantidade especificada em comparação com a quantidade de ração necessária para aumentar o peso do animal na mesma quantidade quando o alimento não compreende a dita composição de aditivo para ração.

[00129] Em uma modalidade, a melhora da taxa de conversão alimentar (FCR) resulta em uma FCR de -2,5% ou inferior a -2,5%, tal como inferior a -2,6%, inferior a -2,7%, inferior a -2,8 %, inferior a 2,9%, inferior a -3,0%. Em uma modalidade preferencial, a melhora da FCR resulta em uma FCR de -5% a -2%, tal como uma FCR de -4% a -2%, uma FCR de -3,5% a -2,5%. Em uma modalidade especifica, a melhora da FCR resulta em uma FCR dentro de um intervalo selecionado a partir do grupo que consiste em -5% a -4,5%, de -4,5% a -4%, de -4% a -3,8%, de -3,8% a -3,6%, de -3,6% a -3,4%, de -3,4% a 3,2%, de -3,2 a -3,0%, de -3,0% a -2,8% e de -2,8 a -2,5% ou qualquer combinação desses intervalos.

[00130] Digestibilidade de nutrientes, como aqui utilizado, significa a fração de um nutriente que desaparece do trato gastrointestinal ou de um segmento especificado do trato gastrointestinal, por exemplo, o intestino delgado. A digestibilidade dos nutrientes pode ser medida como a diferença entre o que é administrado ao indivíduo e o que sai nas fezes do indivíduo, ou entre o que é administrado ao indivíduo e o que permanece na digesta em um segmento especificado do trato gastrointestinal, por exemplo, o íleo. A digestibilidade dos nutrientes, conforme aqui utilizada, pode ser medida pela diferença entre a ingestão

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33/78 de um nutriente e o nutriente excretado por meio da coleta total de excrementos durante um período de tempo; ou com o uso de um marcador inerte que não é absorvido pelo animal e permite que o pesquisador calcule a quantidade de nutriente que desapareceu em todo o trato gastrointestinal ou em um segmento do trato gastrointestinal. Tal marcador inerte pode ser dióxido de titânio, óxido crômico ou cinza insolúvel em ácido. A digestibilidade pode ser expressa como uma porcentagem do nutriente na ração, ou como unidades de massa de nutriente digerível por unidade de massa de nutriente na ração. A digestibilidade dos nutrientes, conforme aqui utilizado, abrange a digestibilidade de amido, digestibilidade de gordura, digestibilidade de proteínas, digestsbilidade de minerais e digestibilidade de aminoácidos.

[00131] Em outra modalidade, a invenção refere-se a um método para melhorar um ou mais parâmetros de desempenho animal selecionados a partir do grupo que consiste em:

[00132] i) aumento do ganho de peso (WG), [00133] ii) menor taxa de conversão alimentar (FCR), [00134] iii) menor escore da lesão por entente necrótica, [00135] iv) menor frequência de enterite necrótica, [00136] v) menor mortalidade por enterite necrótica, [00137] vi) aumento do fator de eficácia da produção europeu (EPEF) e [00138] vii) menor mortalidade, [00139] o método compreendendo alimentar uma cepa de acordo com a invenção ou uma composição de acordo com a invenção a um animal.

[00140] Uma composição da presente invenção também pode ser usada para formulação de ração flexível (FFF), em que um animal está sendo alimentado com uma ração com uma energia metabolizável reduzida e uma composição da invenção em que é obtido um desempe

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34/78 nho animal aceitável e/ou taxa de conversão alimentar apesar da energia metabolizável reduzida na ração. A energia metabolizável reduzida pode estar no nível de 97% a 99% de ração padrão para o animal em questão, tal como de 97% a 98% ou de 98% a 99%.

DEPÓSITO E SOLUÇÃO ESPECIALIZADA [00141] A cepa de Bacillus licheniformis DSM17236 foi depositada em DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen e Zellkulturen GmbH, Inhoffenstrasse 7B, D-38124 Braunschweig) em 7 de abril de 2005 por Chr. Hansen A/S, Dinamarca. O depósito foi feito sob as condições do Tratado de Budapeste sobre o reconhecimento internacional do depósito de micro-organismos para fins de procedimento de patente.

[00142] A cepa de Bacillus subtilis DSM19489 foi depositada em DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen e Zellkulturen GmbH, Inhoffenstrasse 7B, D-38124 Braunschweig) em 27 de junho de 2007 por Chr. Hansen A/S, Dinamarca. O depósito foi feito sob as condições do Tratado de Budapeste sobre o reconhecimento internacional do depósito de micro-organismos para fins de procedimento de patente.

[00143] A cepa de Bacillus mojavensis DSM25839 foi depositada em DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen e Zellkulturen GmbH, Inhoffenstrasse 7B, D-38124 Braunschweig) em 3 de abril de 2012 por Chr. Hansen A/S, Dinamarca. O depósito foi feito sob as condições do Tratado de Budapeste sobre o reconhecimento internacional do depósito de micro-organismos para fins de procedimento de patente.

[00144] A cepa Bacillus amyloliquefaciens DSM25840 foi depositada em DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstrasse 7B, D-38124 Braunschweig) em 3 de abril de 2012 por Chr. Hansen A/S, Dinamarca. O depósito foi feito sob

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35/78 as condições do Tratado de Budapeste sobre o reconhecimento internacional do depósito de micro-organismos para fins de procedimento de patente.

[00145] A cepa de Bacillus subtilis DSM25841 foi depositada em DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen e Zellkulturen GmbH, Inhoffenstrasse 7B, D-38124 Braunschweig) em 3 de abril de 2012 por Chr. Hansen A/S, Dinamarca. O depósito foi feito sob as condições do Tratado de Budapeste sobre o reconhecimento internacional do depósito de micro-organismos para fins de procedimento de patente.

[00146] A cepa de Bacillus amyloiiquefaciens DSM27032 foi depositada em DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstrasse 7B, D-38124 Braunschweig) em 21 de março de 2013 por Chr. Hansen A/S, Dinamarca. O depósito foi feito sob as condições do Tratado de Budapeste sobre o reconhecimento internacional do depósito de micro-organismos para fins de procedimento de patente.

[00147] A cepa de Bacillus subtilis DSM32324 foi depositada em DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen e Zellkulturen GmbH, Inhoffenstrasse 7B, D-38124 Braunschweig) em 8 de junho de 2016 por Chr. Hansen A/S, Dinamarca. O depósito foi feito sob as condições do Tratado de Budapeste sobre o reconhecimento internacional do depósito de micro-organismos para fins de procedimento de patente.

[00148] A cepa de Bacillus subtilis DSM32325 foi depositada em DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen e Zellkulturen GmbH, Inhoffenstrasse 7B, D-38124 Braunschweig) em 8 de junho de 2016 por Chr. Hansen A/S, Dinamarca. O depósito foi feito sob as condições do Tratado de Budapeste sobre o reconhecimento internacional do depósito de micro-organismos para fins de procedimento de

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36/78 patente.

[00149] Para todos os micro-organismos depositados identificados acima, as seguintes indicações adicionais se aplicam:

[00150] No que diz respeito aos respectivos escritórios de patentes dos respectivos estados designados, os requerentes solicitam que uma amostra dos micro-organismos depositados mencionados acima seja disponibilizada apenas a um versado na técnica nomeado pelo solicitante até a data em que a patente é concedida ou a data em que o pedido foi recusado ou retirado ou é considerado retirado.

EXEMPLOS IN VITRO

EXEMPLO 1 [00151] Triagem para inibição de patógeno e sensibilidade a antibióticos [00152] Materiais:

[00153] Caldo de infusão de vitela (VIB) (Difco, 234420) [00154] Ágar de Caldo de Infusão de Vitela (VIB) (VIB + 1,5% de Agar bacteriológico (Agar no. 1), Oxoid LP0011) [00155] Caldo Muller Hinton 2, cátion-ajustado (Fluka) [00156] Placas de ágar T3 (por litro: 3 g de triptona, 2 g de triptose,

1,5 g de extrato de levedura, 0,05 M de di-hidrogênio fosfato de sódio e 0,005 g de MnCI2 [pH 6,8], e 15 g de ágar) [00157] Caldo Laura-Bertani (LB) (g/L: Bacto triptona 10 (Difco 0123), Extrato de levedura 5 (Oxoid L21), NaCI 10 (Merck no. 106404)) [00158] Ágar de Infusão Cérebro-Coração (BHI) (Oxoid CM375) [00159] Sais biliares (extrato biliar, suíno; Sigma B8631) [00160] Placas de bioensaio (Nunc 240845) [00161] Placas de Petri (Procudan 140096, placas de petri com ranhuras) [00162] Solução salina fisiológica com peptona (cloreto de sódio a 0,9%, peptona a 1%) FKP

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37/78 [00163] Caldo ISO-SENSITEST (Oxoid CM0473) [00164] Placas de microtitulação (MTP) NUNC, Dinamarca [00165] Bandeja omni/placas de poço único N 242811 Thermo Seientific/NUNC Dinamarca [00166] Bandejas de 96 poços de microtitulação de poços profundos (DW) sem Rnase/DNase (Thermo Fisher Science) [00167] Ampicilina (Sigma, A9518-5G) [00168] Vancomicina (Sigma, V1764-250MG) [00169] Gentamicina (Sigma, G1264-50MG) [00170] Canamicina (Sigma, K1377-1G) [00171] Estreptomicina (Sigma, S6501-5G) [00172] Eritromicina (Sigma E-5389) [00173] Clindamicina (Sigma, C2569-10MG) [00174] Tetraciclina (Sigma T-7660) [00175] Cloranfenicoi (Sigma, C0378-5G) [00176] [00177] Escherichia coii 0101 Η-, K99 F5 (State Serum Institute, Copenhague, Dinamarca) [00178] Escherichia coii 0147: K89 F4 H19 (State Serum Institute, Copenhague, Dinamarca) [00179] Escherichia coii 0149: k91, k88a, c, h10 NCTC10650 (National Collection of Type Cultures, Inglaterra) [00180] E. co//ATCC11775 (American type culture collection) [00181] E. coii Cp6salp3 (Universidade Veterinária de Copenhague) [00182] Clostridium perfringens tipo A, DSM756, Leibniz-lnstitut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen [00183] Clostridium perfringens tipo C, NCTC3180, National Collection of Type Cultures (Inglaterra) [00184] Clostridium perfringens CCUG2036 (Culture Collection, Universidade de Gotemburgo, Suécia)

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38/78 [00185] Clostridium perfringens CCUG2037 (Culture Collection, Universidade de Gotemburgo, Suécia) [00186] Clostridium perfringens CCUG44727 (Culture Collection, Universidade de Gotemburgo, Suécia) [00187] Todas as cepas de patógenos mencionadas acima foram mantidas em LB com glicerol a 20% em BHI a -80° C.

[00188] Culturas de Bacillus:

[00189] As cepas de Bacillus isoladas a partir de fezes, solo, fontes de alimento e coletadas a partir de coleções de bancos de cepas foram mantidas em VIB com glicerol a 20% em placas master MTP a 80° C.

[00190] Os isolados aeróbios formadores de esporos de bactérias foram submetidos à identificação por sequência ribossômica 16S e gyrB (Wang e outros., 2007), triagem quanto à suscetibilidade a antibióticos de acordo com Guidance on the assessment of bacterial susceptibility to inhibitors of human and veterinary importance”. EFSA Journal 2012; 10 (6): 2740, como descrito abaixo, e resistência à bile e sensibilidade a pH baixo, atividade enzimática, crescimento em diferentes meios, resistência ao calor e esporulação, conforme descrito no documento WO2013/153159.

Susceptibilidade a antibióticos medida por MIC [00191] As cepas de Bacillus foram analisadas quanto à susceptibilidade a antibióticos, medindo a concentração inibidora mínima (MIC) para vários antibióticos. O método utilizado foi um método de microdiluição em caldo, conforme descrito pelo padrão de CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute M07-A8 e M45-A2).

[00192] Uma suspensão de uma cultura noturna da cepa a ser testada foi inoculada em Caldo ISO-SENSITEST (Oxoid CM0473) em placas de microtltulação a uma concentração aproximada de 10⁵CFU/ml (unidades formadoras de colônias/ml) em diluições em série

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39/78 duplas do antibiótico a ser testado (volume total de 100 μΙ/poço) e incubada aerobicamente por 20-24 horas a 37° C. Os resultados foram registrados após 20 horas de incubação como a menor concentração do antibiótico para inibir o crescimento visível. O teste foi realizado duas vezes como duas réplicas biológicas independentes.

[00193] Apenas as cepas de Bacillus susceptíveis a inibidores de acordo com o Guia da EFSA foram incluídas na triagem para inibição de patógenos E. coli e Clostridium perfringens.

Triagem de cepas de Bacillus para inibição de E. coli patogênico [00194] As cepas de Bacillus foram adicionadas em um volume de 50 μΙ das placas master MTP a 700 μΙ de VIB em placas DW e incubadas a 37° C e 175 rpm durante a noite. As cepas de E. coli foram cultivadas em LB a 30° C durante a noite. 2 ml de cultura de E. coli durante a noite foram misturados com 200 ml de ágar VIB líquido a 50° C, e vertidos em cada placa de bioensaio. As placas foram secas em uma bancada estéril. Durante a noite, as culturas de Bacillus, 2 μΙ de cada uma, foram observadas na superfície do ágar VIB misturado com E. coli nas placas de bioensaio e incubadas a 37° C por 1 dia.

[00195] Os raios das zonas de inibição clarificadas ao redor do Bacillus foram medidos e registrados como 3 ··· alto” - maior do que 2 mm, 2 · médio” - entre 0,5 - 2 mm e 1 baixo” - menor do que 0,5 mm e0 = sem inibição.

Inibição de Clostridium perfringens pelo teste de ponto de ágar [00196] O ágar VIB foi vertido em placas de bioensaio (200 ml por placa) e seco cuidadosamente em uma bancada estéril. Durante a noite, as culturas de Bacillus, 2 μΙ de cada uma, foram observadas na superfície das placas de ágar VIB e incubadas a 37° C durante a noite. As cepas de Clostridium perfringens foram cultivadas anaerobiamente em agar BHI a 37° C durante a noite. A cultura durante a noite de Clostridium perfringens foi adicionada em um volume de 2 ml a 200 ml

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40/78 de ágar BHI líquido, misturada e sobreposta suavemente nas placas de bioensaio com pontos de Bacillus. As placas foram incubadas anaerobiamente a 37° C por 1 dia.

[00197] Os raios das zonas de inibição clarificadas ao redor do Bacillus foram medidos e registrados como 3 = alto” - maior do que 2 mm, 2 ···· médio” - entre 0,5 - 2 mm e 1 ™ baixo” - menor do que 0,5 mm e0 = sem inibição.

[00198] Todos os dados foram replicados em dias separados.

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RESULTADOS

Tabela 1

Resultados da Inibição selecionada de E. co//das cepas de Bacillus

Inibição		Inibição de E.coli
Número DSM se disponível		E. coli O101 F5	E. coli 0147: K89 F4	E. coli 0149: k91,k88a	E. coliNVCC 11775	E. coli Cp6salp3
Bacillus licheniformis		0	0	0	0	0
Bacillus licheniformis	17236	0	0	0	0	0
Bacillus subtilis	19489	0	0	0	0	0
Bacilius subtiiis		0	0	1	1	1
Bacillus subtilis	32324	3	3	3	3	3
Bacillus subtilis		0	0	0	0	0
Bacilius subtiiis		0	0	0	0	0
Bacilius subtiiis	32325	2	2	3	2	2
Bacillus subtilis	25841	2	2	2	2	2
Bacillus amyloliquefaciens	25840	1	1	2	1	1
Bacilius amyloliquefaciens	27032	2	3	3	2	2

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Tabela 2

Resultados da inibição de Clostridium das cepas de Bacillus selecionadas

Inhibição	Inibição
Número DSM se disponível	DSM756	NCTC3180	CCUG2036	CCUG2037	CCUG44727
Bacillus licheniformis		1	2	1	0	1
Bacillus licheniformis	17236	1	1	0	0	0
Bacillus subtilis	19489	0	0	0	1	0
Bacillus subtilis		0	2	0	0	1
Bacillus subtilis	32324	3	3	3	3	3
Bacillus subtilis		1	0	1	2	1
Bacillus subtilis		1	0	0	1	0
Bacillus subtilis	32325	3	3	3	2	3
Bacillus subtilis	25841	2	3	2	2	3
Bacillus amyloliquefaciens	25840	2	3	3	2	3
Bacillus amyloliquefaciens	27032	3	3	3	2	3

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43/78 [00199] Os resultados nas Tabelas 1 e 2 da inibição de E. coll e Clostridium mostram que as cepas de Bacillus licheniformis e muitas das cepas de Bacillus subtilis testadas não demonstraram nenhuma inibição de E. coli e fraca inibição de Clostridium. No entanto, as duas cepas de B. subtilis DSM32324 e DSM32325 demonstraram resultados impressionantes em relação à inibição de E. cell e à inibição de Clostridium.

EXEMPLO 2

Medição da quantidade de açúcares redutores em ração incubada com uma composição de Bacillus [00200] O objetivo deste experimento foi examinar a capacidade de diferentes cepas de Bacillus degradarem o NSP em rações comerciais para aves domésticas e aumentar a quantidade de açúcar disponível.

Tabela 3

Composição da ração composta utilizada no ensaio

Ingrediente	% de ração na alimentação
Milho moído	30,0
Trigo	27,0
Farelo de soja	22,5
Canola	6,0
Girassol	5,0
Aveia	4,0
Farelo de peixe	2,0
Calcário	1,24
Monofosfato de cálcio	0,78
Óleo vegetal	0,54
Bicarbonato de sódio	0,28
Pré-mistura de vitaminas, minerais, aminoácidos	0,25
Cloreto de sódio (0,17%);	0,17

[00201] A ração composta à base de trigo-milho-soja (Tabela 3) foi autodavada a 121° C por 15 min para esterilização. Em seguida, a

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44/78 amostra de ração foi diluída 20 vezes com tampão de fosfato de sódio para garantir um pH em cerca de 6 a 6,5 durante todo o experimento. Os produtos Bacillus foram obtidos por inoculação com 2% de cultura durante a noite das cepas de Bacillus, cultivadas em Caldo de Infusão de Vitela (VIB) (Difco, 234420). Uma amostra foi coletada para análise de açúcar redutor (DNS) (T - 0). Após incubação a 37° C por 24 horas, uma amostra foi coletada para determinação de CFU. Outra amostra foi centrifugada e o sobrenadante usado para determinar o DNS.

[00202] O açúcar redutor foi analisado pelo ensaio de ácido 3,5dinitrosalicílico (DNS) da seguinte forma:

[00203] O tampão de Na-acetato (100 mM, pH 6) foi misturado com o sobrenadante estéril da amostra de Bacillus filtrado e incubado a 40° C por 10 min. O reagente DNS foi adicionado ao tubo de ensaio, misturado e incubado em banho-maria em ebulição por 5 minutos. Após o resfriamento, a absorbância foi medida a 540 nm em um espectrofotômetro.

[00204] Uma curva padrão foi estabelecida com uma solução estoque de glicose para apresentar resultados no açúcar redutor ou unidades de enzima (quantidade de enzima necessária para liberar 1 pmol de glicose redutora equivalente em 1 ml por unidade de tempo).

[00205] Os resultados são mostrados na Tabela 4.

Resultados

Tabela 4

	Amostra	kJ/kg de ração
	Número DSM se disponível
Controle		214
Bacillus aryabhattai		237
Bacillus licheniformis	17236	340
Bacillus licheniformis	15326	541
Bacillus subtilis	19489	403
Bacillus subtilis	25841	458
Bacillus subtilis	32325	642

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	Amostra	kJ/kg de ração
	Número DSM se disponível
Bacillus subtiiis	32324	723
Bacillus amyloliquefaciens	16734	515
Bacillus amyloliquefaciens	27032	515
Bacillus amyloliquefaciens	14623	517
Bacillus amyloliquefaciens	15509	853
Bacillus amyloliquefaciens	25840	1142
Bacillus mojavensis	25839	939

[00206] A Tabela 4 mostra os resultados de várias cepas diferentes de Bacillus e mostra que todas as cepas de Bacillus testadas forneceram mais nutrientes ao animal, fornecendo mais açúcares redutores em comparação com o controle, mas também que há uma variação considerável entre as cepas individuais.

[00207] Com base nos resultados da inibição de E. coli e Clostridium perfringens combinados com os resultados da capacidade de fornecer uma quantidade aumentada de açúcares redutores, as duas cepas de melhor desempenho, as cepas de B. subtiiis DSM32324 e DSM32325, foram selecionadas para estudos in vivo.

EXEMPLOS IN VIVO

EXEMPLO 3 [00208] Eficiência da cepa de Bacillus subtiiis DSM32324 na provocação de Clostridium perfringens em ensaios In vivo

Tabela 5

Dietas

Nome do Ingrediente % (em p/p)	inicial	Crescimento	Terminação
Milho, grão	58,509	64,054	69,218
Farelo de soja, sem casca, solvente	35,550	29,771	24,511
Gordura, vegetal	2,100	2,585	2,748
Fosfato de dicálcio	1,734	1,780	1,693
Carbonato de cálcio	1,150	0,910	0,873
Sal, (NaCI)	0,386	0,390	0,393

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Metionina MHA, L - Lisina, Minerais traço, pré-mistura de vitaminas e L-Treonina foram incluídos consequentemente às recomendações para reprodutores.

[00209] Foi utilizada uma dieta à base de farelo de milho/soja não medicada (Tabela 5). 1,2 x 10® CFU/g de Bacillus subtilis DSM32324 foram adicionados à ração de um dos grupos. Ração e água estavam disponíveis à vontade em todos os ensaios. Toda a ração era por unidade experimental. A ração inicial foi fornecida do dia 0 ao 21. No dia 21, a dieta inicial não consumida foi pesada e descartada. A ração de crescimento foi fornecida até o dia 35 e a ração de crescimento não consumida foi pesada e descartada. Da mesma forma, a ração de terminação foi fornecida até o dia 42, onde a dieta de terminação não consumida foi pesada e descartada.

Tabela 6

Tratamento	inocuiação de Clostridium perfríngens CP-6	Unidades experimentais/Trt	aves/T rt
Não medicado	Não infectado	8	320
Não medicado	Dias 19, 20 e 21	8	320
DSM32324	Dias 19, 20 e 21	8	320

[00210] O experimento começou com 40 frangos de corte Ross 308 machos por unidade experimental. Os tratamentos foram replicados em oito blocos, randomizados em blocos de seis unidades experimentais cada.

[00211] Nos dias 19, 20 e 21, todas as unidades experimentais, exceto o grupo de tratamento 1 não infectado não medicado, foram provocadas com uma cultura de caldo de C. perfríngens CP-6 (Knap I, e outros., 2010). Esta cepa é um isolado em campo de C. perfríngens conhecido por causar NE originário de uma operação comercial de frangos de corte e utilizado no presente estudo como organismo de provocação. Inóculo fresco foi usado todos os dias. Cada unidade ex

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47/78 perimental recebeu a mesma quantidade de inóculo correspondente a aproximadamente 1 x 10⁸ a 1 x 10⁹ CFU de C. perfringens CP-6. O inóculo foi administrado por misturação na ração com base em alimentadores de tubos.

[00212] No dia 21, três aves de cada unidade experimental foram selecionadas, sacrificadas, pesadas em grupo e examinadas quanto ao grau de presença de lesões por enterite necrótica. A classificação foi baseada em um escore de 0 a 3, sendo 0 normal e 3 grave. A classificação foi a seguinte: 0 para intestinos normais, 1 para leve cobertura mucosa e perda de tônus, 2 para enterite necrosante grave e 3 para enterite necrosante extrema com presença de sangue no lúmen.

[00213] Todas as aves foram pesadas nos dias 31,35 e 42 para ver o impacto da enterite necrótica nos parâmetros de desempenho: meios para peso vivo, ganho de peso médio (AWG), consumo de ração, taxa de conversão alimentar (FOR), escores de lesão por enterite necrótica, e mortalidade (total e NE) foram calculadas para todas as unidades experimentais.

[00214] A análise estatística dos dados foi realizada no SAS Stat Versão 9.2, utilizando a análise ANOVA com design randomizado completo para estabelecer diferenças entre os grupos de tratamento. A unidade experimental foi considerada a unidade experimental estatística com dietas como efeito fixo. Os resultados foram relatados como médias dos mínimos quadrados e foram assumidos diferentes em P < 0,05.

Resultados

Tabela 7

Dia 21

T ratamento	FCR	AWG (kg)
Não medicados, não infectados	1,447c	0,562a
Não medicados, infectados	1,652a	0,501b
DSM32324, infectados	1,575b	0,567a

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Dia 35

T ratamento	FCR	AWG (kg)
Não medicados, não infectados	1,569b	1,735ab
Não medicados, infectados	1,634a	1,679b
DSM32324, infectados	1,593b	1,756a
Dia 42
T ratamento	FCR	AWG (kg)
Não medicados, não infectados	1,627b	2,272a
Não medicados, infectados	1,731a	2,155b
DSM32324, infectados	1,645b	2,303a
[00215] As tetras aderentes aos resultados representam grupos de
tratamento estatisticamente significativamente diferentes do controle
não medicado (P < 0,05) ou um do outro.
Tabela 8
Tratamento Escore de lesões NE % de Mortalidade NE
Não medicado, não infectado 0,05b	0,0b
Não medicado, infectado 0,58a	4,3a
DSM32324, infectado 0,18b	0,7b

[00216] As tetras aderentes aos resultados representam grupos de tratamento estatisticamente significativamente diferentes do controle não medicado (P < 0,05) ou um do outro.

[00217] Conclusão:

[00218] Para os parâmetros de desempenho, taxa de conversão alimentar (FCR) e ganho de peso médio (AWG) medidos no dia 21, dia 35 e dia 42, foi observada uma melhora significativa em todos os pontos de dados quando considerando o Bacillus subtilis DSM3234 como um aditivo para ração em comparação com o grupo de controle infectado não tratado. Surpreendentemente, o grupo tratado com Bacillus não mostrou diferenças significativas em relação ao grupo de controle não infectado não medicado, mesmo que o último grupo não tenha re~

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49/78 cebido a provocação e tenha sido considerado saudável (Tabela 7).

[00219] No que diz respeito à entente subclínica induzida no ensaio in vivo, os resultados mostram que o Bacillus subtilis DSM3234 diminuiu a escore de lesão por entente necrótica em galinhas e reduziu significativamente a mortalidade por entente necrótica (Tabela 8). EXEMPLO 4

Eficácia da cepa de Bacillus subtilis DSM32325 em uma provocação de Clostridium nerírínoens em ensaios in vivo [00220] O estudo foi realizado com o objetivo de avaliar o efeito da cepa de Bacillus subtilis DSM32325 na frequência de entente necrótica e nos escores de lesão por enterite necrótica em galinhas.

[00221] Frangos de corte Ross 308 machos foram distribuídos em três grupos com 48 aves por grupo: controle infectado não tratado; grupo infectado tratado com antibiótico 20 mg de amoxicilina/kg de peso corporal; e grupo infectado tratado com Bacillus subtilis DSM32325

1,2 x 10⁶ CFU/g de ração.

[00222] Todos os animais foram alimentados à vontade em todas as fases e foram vacinados por aspersão na chegada à instalação do estudo (D1) contra Bronquite Infecciosa e contra a Doença de Newcastle. Até o D9, as aves foram alimentadas com uma ração inicial Kip 1-3” adquirida em uma fábrica de ração comercial (Cibus, Kaaistraat 49; 8800 Roeselare, Bélgica). A composição quantitativa da ração inicial foi a mesma para todos os animais, exceto a inclusão do produto correspondente em cada grupo. De D9 a D26, as aves receberam ração de crescimento com alto teor de proteínas e farelo de peixe incluído em 40%. A ração de crescimento Teler2” foi adquirida a partir de uma fábrica de ração comercial (Cibus, Kaaistraat 49; 8800 Roeselare, Bélgica). A composição da ração de crescimento para os diferentes grupos de tratamento foi exatamente a mesma, exceto pela inclusão do produto correspondente em cada grupo. As rações receberam um

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50/78 código de grupo e a pré-mistura de tratamento foi posteriormente misturada com a quantidade de ração destinada a cada lote de ração.

[00223] Nos dias 19, 20, 21 e 22, aproximadamente 10⁹ CFU de cepa 56 de Clostridium perfringens (Timbermont e outros. 2009) foram administrados por via oral três vezes ao dia a todas as aves, conforme descrito por Timbermont e outros, 2009. As lesões por enterite necrótica foram determinadas nos dias 25 e 26 (escore 0-6) (Johnson & Reid 1970). A frequência de NE e os escores de NE foram analisados usando modelos de regressão logística e linear, respectivamente. A significância estatística foi avaliada em P < 0,05.

Resultados [00224] A porcentagem de aves positivas para lesões por enterite necrótica macroscópica (escore de lesão > 2) em cada dia de amostragem é apresentada na tabela abaixo. Para cada dia, um modelo de regressão linear foi adequado para analisar as diferenças entre os grupos de tratamento e o IUC. Um modelo adicional foi ajustado com os dados do Dia 25 e do Dia 26 combinados. Nesse modelo, os grupos dos Dias 25 e 26 foram adicionados como efeito fixo.

Tabela 9

	Dia 25	Dia 26	Dias 25 e 26
Grupo	%NE	%NE	%NE	P < 0,05
Controle infectado não tratado	50	23	36,5	ref.
Amoxicilina	44	14	29
Bacillus subtilis DSM32325	25	7	16	**

** os números marcados representam grupos de tratamento estatisticamente significativamente diferentes de IUC de controle não tratado (P < 0,05).

[00225] Os escores médios de NE por grupo e dia foram calculados de maneira similar.

Tabela 10

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	Dia 25	Dia 26	Dias 25 e 26
Grupo	Escore médio	Escore médio	Escore médio	P < 0,05
Controle infectado não tratado	1,75	1,15	1,450	Ref
Amoxicilina	1,56	1,07	1,315
Bacillus subtilis DSM32325	1,25	1,00	1,125	kk

[00226] Os resultados mostram que Bacillus subtilis DSM32325 diminuiu a frequência de entente necrótica em galinhas em comparação com o controle infectado não tratado de uma maneira estatisticamente significativa quando os dados dos dias 25 e 26 foram combinados. Surpreendentemente, a frequência de entente necrótica foi ainda mais baixa no grupo tratado com Bacillus do que no grupo tratado com Amoxicilina (Tabela 9).

[00227] Além disso, Bacillus subtilis DSM32325 reduziu a gravidade da entente necrótica (escore médio) em comparação com o controle infectado não tratado de uma maneira estatisticamente significativa quando os dados dos dias 25 e 26 foram combinados. Surpreendentemente, o escore médio foi ainda menor no grupo tratado com Bacillus do que no grupo tratado com Amoxicilina (Tabela 10).

EXEMPLO 5

Ensaio de ração de desempenho [00228] Animais:

[00229] Frangos de corte Ross 308 machos de um dia de idade foram alocados aleatoriamente em 72 unidades experimentais, cada uma contendo 25 galinhas em cada unidade experimental, de modo que cada tratamento fosse replicado 12 vezes. Os grupos experimentais foram controle negativo (NC), Bacillus subtilis DSM19489, Bacillus subtilis DSM32324 e Bacillus subtilis DSM32325.

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52/78 [00230] Dietas:

[00231] Rações fareladas de três fases (de 1 a 14 dias, 15 a 28 dias e 29 a 42 dias) livres de quaisquer compostos antibióticos, inibidores, meihoradores de desempenho, outros probióticos, enzimas ou acidificantes foram fornecidos à vontade. As dietas foram baseadas em farelo de milho, trigo, cevada, centeio e soja.

Tabela 11

Teor de composição das dietas basais

INGREDIENTES, %	Inicial 0-14 d	Crescimento 1528 d	Terminação 2942 d
Milho	19,647	19,574	20,207
Farelo de soja 44%CP	30,147	24,190	20,210
Trigo	15,000	15,000	15,000
Soja integral	12,000	15,000	15,000
Cevada	10,000	10,000	10,000
Centeio	5,000	7,5000	10,000
Óleo de soja	4,141	4,833	—
Gordura animal (banha)	—	—	5,905
Carbonato de cálcio	1,139	1,067	1,045
Fosfato de monocálcio	1,546	0,462	1,286
Sal	0,327	0,302	0,303
Bicarbonate de sódio	0,100	0,100	0,100
DL-Metionina	0,295	0,326	0,289
L-Lisina HCI	0,186	0,168	0,176
L-Treonina	0,071	0,077	0,078
Pré-mistura de Vit&Min	0,400	0,400	0,400

[00232] Artigos de teste:

[00233] Os artigos de teste Bacillus subtilis DSM19489, Bacillus subtilis DSM32324 e Bacillus subtilis DSM32325 foram alimentados durante toda a duração do teste de 42 dias em uma dosagem de 1,210⁶ CFU/g de ração.

[00234] Observações:

[00235] Ganho diário médio (ADG), peso corporal (PC), consumo de ração como consumo médio diário de ração (ADFI) e eficiência alimentar; a taxa de conversão alimentar (FCR) aos 1,14, 28, 35 e 42 dias de idade

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53/78 foram medidos. A saúde geral, o tratamento médico e a mortalidade foram avaliados diariamente. O fator de eficiência de produção europeu (EPEF) foi calculado: [(capacidade de sobrevivência,% x ganho de peso corporal, kg)/(duraçâo do estudo em dias x FCR)] x 100.

[00236] Análise estatística e interpretação:

[00237] A análise de variância foi a técnica estatística básica aplicada. Os dados foram analisados como um design completamente randomizado por GLM de SPSS v. 19.0 seguido pelo teste de média de Tukey. P < 0,05 foi considerado uma diferença estatisticamente significtiva, enquanto 0,05 < P < 0,10 foi considerado uma tendência quase significativa.

Resultados [00238] A saúde dos animais foi considerada normal ao longo do estudo, e nenhum evento adverso foi observado. Houve 23 óbitos/abates (1,27%) entre 0 e 14 dias, 19 óbitos/abates (1,07%) entre 14 e 28 dias e 16 óbitos/abates (0,91%) entre 28 e 42 dias, e não estavam relacionados ao tratamento. A relação de mortalidade total/abate de 58/1800 aves (3,22%) aos 42 dias foi considerada normal. Tabela 12

T ratamento	Fase de engorda total, 0-42 d
ADG, g/d	ADFI, g/d	FCR	EPEF
1 Controle negativo	68,6“	116,2	1,69^b	386^b
2 DSM19489 (S. subtilis)	70,4^ab	116,1	1,65^a	420^a
3 DSM32324 (B. subtilis)	71,9^a	116,6	1,62^a	424^a
5 DSM32325 (β. subtilis)	70,9^a	115,9	1,64^a	416^a
SEM (n=12)	0.53	0,79	0,006	5,3
P (Probabilidade)	0,0002	0,7429	< 0,0001	< 0,0001

[00239] O desempenho dos animais estava de acordo com as condições experimentais (frangos de corte alimentados com ração farelada e criados em unidades experimentais). Aos 28 dias de idade, os frangos de corte que receberam DMS32324 eram 3,77% mais pesa

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54/78 dos do que as aves controle (P < 0,05). Aos 35 e 42 dias de idade, os frangos de corte suplementados com as cepas de Bacilli DSM32324 ou DSM32325 estavam significativamente mais pesados do que os animais de controle, mostrando o grupo DSM19489 como tendo pesos intermediários. Durante o período inicial (de 0 a 14 dias de idade), não foram observadas diferenças significativas entre os tratamentos no crescimento, consumo de ração ou conversão alimentar. Durante o período de crescimento (de 15 a 28 dias de idade), as galinhas que receberam DSM32324 cresceram significativamente mais do que os frangos de controle. A conversão alimentar de todos os frangos de corte suplementados com probióticos foi significativamente melhorada quando comparada aos animais de controle. Não foram observadas diferenças significativas entre os tratamentos no crescimento, consumo de ração ou conversão alimentar durante a última semana de teste (de 35 a 42 dias de idade).

[00240] Para o período de engorda global (0-42 dias de idade), frangos de corte suplementados com as cepas de Bacilli DSM32324 ou DSM32325 cresceram significativamente mais do que os animais de controle. A conversão alimentar (FCR) e o EPEF de todos os frangos de corte suplementados com probióticos foram significativamente melhorados quando comparados aos dos animais de controle. EXEMPLO 6

Ensaio de ração de desempenho [00241] O objetivo deste estudo foi avaliar a adição do Bacillus subtiiis DSM32324 e do produto comercial Bacillus subtilis DSM19489 em dietas para frangos de corte. O objetivo foi avaliar o efeito dos produtos nos parâmetros de produção em uma dieta à base de trigo, incluindo coccidiostatos e enzimas alimentares.

[00242] Havia pintos de 1300 dias (machos) de ROSS 308 em cada tratamento - divididos em 10 currais de 130 pintos. As galinhas foram

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55/78 alimentadas à vontade com ração em três fases na forma peletizada em todas as fases e a água potável foi fornecida à vontade pelos bebedores de bicos. A composição das dietas é mostrada na tabela abaixo. A ração foi fornecida por Mezinárodní testování drúbeze, s.p., feed mill Lysá nad Labem.

[00243] Os aditivos probióticos para ração foram distribuídos da seguinte forma:

[00244] T1: grupo de controle não suplementado;

[00245] T2: Bacillus subtilis DSM19489 1,2 x 10⁶ CFU/g de ração; [00246] T3: Bacillus subtilis DSM32324 1,2 x 10⁶ CFU/g de ração. Tabela 13

Fórmulas dietárias

Componentes	Dieta inicial	Dieta de crescimento	Dieta de terminação
	Dia 1 - 13	Dia 14-28	Dia 29 - 42
Trigo	40,000	51,880	56,450
Milho	19,460	10,000	10,000
Extr. farelo de soja	32,800	29,500	24,600
Óleo de soja	4,000	5,000	5,800
HCI de L-lisina	0,170	0,220	0,200
DL-metionina	0,060	0,100	0,120
L-treonina	0,060	0,080	0,060
Calcário	1,500	1,500	1,400
Sal	0,250	0,250	0,240
Fosfato de monocálcio	1,000	0,770	0,500
Bicarbonato de sódio	0,200	0,200	0,130
AMV BR1 Plus	0,500	-	-
AMV BR2 Plus	-	0,500	-
AMV BR3 Plus	-	-	0,500

[00247] O peso vivo foi medido nos dias 1 (todas as aves em cada unidade experimental foram pesadas juntas), 13 e 28 (todas as aves

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56/78 foram pesadas individualmente, sem jejum) e 42 (todas as aves foram pesadas Individualmente após 12 horas de jejum).

[00248] O consumo de ração por 1 kg de peso vivo foi registrado por unidade experimental nos dias 13, 28 e 42 e a taxa de conversão alimentar foi calculada.

[00249] Análise estatística:

[00250] Os resultados de desempenho de peso vivo nos dias 13, 28 e 42 e a mortalidade foram avaliados estatisticamente usando o efeito principal do modelo ANOVA fatorial do teste de tratamento de Dunnett (todas as dietas suplementadas contra o controle não suplementado (T1)).

Resultados [00251] O coeficiente de variação (CV) para conversão alimentar e taxa de conversão alimentar foi em média 2,7%. O CV para o peso corporal final e o ganho de peso corporal foi de 3,7%, e a média do tratamento dentro da variação de unidade experimental de BW final (como uma medida da homogeneidade do rebanho) variou de 10,3 a 15,3%.

[00252] A mortalidade nos rebanhos foi baixa (3,4% no geral em aves não suplementadas) e surpreendentemente baixa nos primeiros 13 dias.

Tabela 14

Tratamento	Mortalidade no período
Dia 1-13	Dia 14-28
No. de aves	G	No. de aves	g
Não suplementado	2	514	18	14421
DSM19489	4	1459	10	7074
DSM32324	3	1048	14	11295

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Tabela 14 -continuação-

Tratamento	Mortalidade no período
Dia 29-42	Dia 1-42
No. de aves	g	No. de aves	g	%
Não suplementado	24	45212	44	60147	3,38
DSM19489	14	25049	28	33582	2,15
DSM32324	7	11473	24	23816	1,85

[00253] Conclusão:

[00254] DSM19489 teve uma tendência de mortalidade reduzida (p = 0,096) e o Bacillus subtilis DSM32324 teve uma mortalidade acentuada e significativamente reduzida, especialmente no período de terminação, que também serviu para significância estatística da mortalidade para o estudo geral.

EXEMPLO 7 [00255] Efeito de diferentes cepas de bacllus no desempenho do crescimento, digestibilidade e saúde do intestino em frangos de corte [00256] As aves foram alojadas por 15 animais em unidades experimentais medindo 1,2 m x 0,8 m de D1 até o final do experimento (D42). O piso em cada unidade experimental era coberto com aparas de madeira com uma espessura de cerca de 5 cm. Um alimentador de panela comercial com um reservatório de ração foi suspenso no interior da unidade experimental e quatro bicos foram montados na lateral da unidade experimental.

[00257] As aves foram alimentadas com uma dieta subótima, com centeio incluído como fonte de proteínas não amiláceas e sem enzimas alimentares. Até D22, as aves foram alimentadas com uma ração inicial. De D22 a D42, as aves foram alimentadas com ração de crescimento. A composição quantitativa da ração foi a mesma para todos os animais, exceto pela inclusão da cepa correspondente em cada grupo. Os detalhes sobre a composição da ração são mostrados na

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Tabela 15. As cepas a serem testadas (DSM32324, DSM25840 e DSM32325) foram misturadas a uma razão de 1,2 x 10⁶ CFU/grama de ração na ração.

Tabela 15

Teor de composição das dietas basais

INGREDIENTES, %	Início 0-21 d	Terminação 22-42 d
Milho	41,6	31,6
Farelo de soja 47,3%CP	26,0	24,0
Farelo de canola 32,5CP	4,0	5,0
Farelo de peixe 70,0CP	2,0
Trigo	15,0	20,0
Centeio	5,0	10,0
Óleo de soja	1,0	1,0
Gordura animal (banha)	1,5	5,0
Carbonato de cálcio	1,359	1,10
Fosfato monocálcio	1,2	0,85
Sal	0,18	0,21
Bicarbonate de sódio	0,27	0,23
DL-Metionina	0,195	0,195
HCI de L-Lisina	0,15	0,21
L-Treonina	0,045	0,065
L-valina	0,015	0,035
Pré-mistura de Vit&Min	0,500	0,500

[00258] No início (D1), 960 animais foram colocados em 64 unidades experimentais (isto é, 15 animais por unidade experimental). Como mencionado acima, uma ração inicial foi administrada a todas as aves de D1 até D22. De D22 a D42, uma ração de crescimento foi administrada a todas as aves.

[00259] Em D12, D22 e D42, amostras de tecido foram colhidas a partir do duodeno, jejuno e íleo de 1 ave por unidade experimental.

[00260] Nos dias D1, D12, D22, D33 e D42, as aves e as rações foram pesadas para analisar os efeitos dos probióticos no desempenho de crescimento (ganho de peso, consumo de ração e conversão

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59/78 alimentar) durante os diferentes períodos.

[00261] Em D22 e D42, 6 aves por unidade experimental foram eutanizadas. O teor ileal e o teor cecal foram agrupados por unidade experimental. Amostras adicionais do teor ileal e do teor cecal foram congeladas e armazenadas a -80° C.

[00262] Em D19-D22 e D40-42, 3 as fezes por unidade experimental foram coletadas diariamente. As fezes foram agrupadas por unidade experimental.

[00263] A saúde foi registrada diariamente. Desde D1 até o final do estudo em D42, observações gerais de saúde foram feitas e registradas por pessoal experiente em estoque diariamente. Se os animais apresentavam sinais de doença, observações gerais de saúde eram feitas ao menos duas vezes ao dia. As mortalidades foram registradas diariamente.

[00264] O peso corporal (BW) foi medido por unidade experimental em D1. O peso BW do animal foi medido individualmente em D12, D22, D33 e D42. O ganho de peso diário (DWG) foi calculado por unidade experimental para os períodos D1 a D12, D1 a D22 e D1 a D42. O ganho de peso diário (DWG) foi calculado por animal para os períodos D12 a D22, D22 a D33, D33 a D42 e D22 a D42.

[00265] A diferença em BW entre o início e o final de cada período de estudo foi o ganho de peso (WG) para esse período. O ganho de peso diário (WGD) foi calculado como o WG dividido pelo número de dias no período correspondente. O DWG dos animais mortos foi incluído no cálculo do DWG médio de cada grupo, considerando a data da morte da ave como o final do período de estudo para essa ave.

[00266] O consumo de ração diário (FC) e a taxa de conversão alimentar (FCR) foram calculados no nível da unidade experimental para os períodos D1 a D12, D12 a D22, D1 a D22, D22 a D33, D33 a D42, D22 a D42 e D1 a D42.

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60/78 [00267] A ração fornecida aos animais (Feed IN”) foi pesada em D1, D12, D22 e D33. Quando em qualquer outro dia uma unidade experimentai estava ficando sem ração e era necessário fornecer mais, a ração adicionada também foi pesada e registrada como Feed IN”. A ração restante em cada unidade experimental (Feed OUT”) foi pesada em D12, D22, D33 e D42. A diferença no peso da ração no início e no final de cada período de estudo foi calculada para definir o consumo de ração (FC) por unidade experimental. A diferença no peso de ração entre o início e o final de cada período de estudo (Feed IN” - Feed OUT”) foi o FC da unidade experimental correspondente para esse período. O FC médio diário por ave foi calculado como o FC dividido pelo número de dias no período correspondente multiplicado pelo número de animais que teriam comido durante esse período na unidade experimental correspondente.

[00268] O teor de matéria seca, proteína bruta, gordura bruta, Ca, P, energia e teor de dióxido de titânio foram determinados no teor ileal e no teor cecal reunido coletado em D22 e D42 e na ração. Óxido de titânio foi adicionado à ração (0,3%) como marcador inerte. A digestibilidade ileal aparente foi calculada como descrito por Waititu e outros., 2014.

[00269] As amostras foram analisadas no Department of Animal Sciences, Subdivision Animal Nutrition da Universidade de Wageningen, sob a supervisão de Leon de Jonge. Os seguintes métodos foram utilizados:

[00270] Matéria seca: 3h de secagem a 103° C com base em ISO 6496 (1999) [00271] Cinzas: 3h de aquecimento a 550° C com base em ISO 5984 (2002) [00272] Proteína: método de Kjeldahl baseado em ISO 5983 (2005) [00273] Gordura: Extração com éter de petróleo após tratamento com ácido com base em ISO 6492 (1999)

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61/78 [00274] Cálcio: espectroscopia de absorção com base em ISO 6869 (2000) [00275] Fósforo: Determinação espectrométrica baseada em ISO 6869 (2000) [00276] Energia: método calórico de bomba baseado em ISO 9831 (1998) [00277] Titânio: determinação espectrométrica baseada na destruição de Kjeldahl seguida por coloração com peróxido e medição de absorção a 408 nm [00278] Os teores de matéria seca, proteína bruta, gordura bruta, Ca, energia e dióxido de titânio foram determinados nas fezes reunidas em D19-D22 e D40-D42 e na ração. Óxido de titânio foi adicionado à ração (0,3%) como um marcador inerte. A retenção aparente total do trato foi calculada como descrito por Waititu e outros., 2014.

[00279] Os dados foram analisados com o RStudio (versão 0.99.467, RStudio, Inc.). Todos os dados, exceto o peso corporal e o ganho de peso diário no nível das aves, foram analisados usando modelos de regressão linear com o grupo de tratamento como efeito fixo (procedimento Im do pacote principal). O peso corporal e o ganho de peso diário ao nível das aves foram analisados usando modelos de regressão linear mista com grupo de tratamento como efeito fixo e unidade experimental como efeito aleatório para corrigir o agrupamento de aves dentro de unidades experimentais (procedimento Ime do pacote nlme) (desvio de protocolo no. 1). A significância estatística foi avaliada em P < 0,05.

Resultados [00280] Oito aves morreram durante o estudo (0,8%).

[00281] A tabela abaixo mostra o peso corporal médio por dia de estudo e tratamento. As diferenças foram analisadas com modelos de regressão linear misto com tratamento como efeito fixo categórico e

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62/78 unidade experimental como efeito aleatório, para explicar o agrupamento de aves em unidades experimentais.

Tabela 16

Peso corporal médio

Nome do grupo	D12	D22
Média	Valor P	Média	Valor P
NC	266	Ref.	687	Ref.
DSM32324	272	0,220	730	0,010
DSM25840	286	< 0,001	759	< 0,001
DSM32325	283	0,001	744	0,001

Tabela 16 -continuação-

Nome do grupo	D33	D42
Média	Valor P	Média	Valor P
NC	1569	Ref.	2390	Ref.
DSM32324	1613	0,208	2459	0,176
DSM25840	1672	0,003	2525	0,009
DSM32325	1632	0,070	2476	0,087

[00282] A Tabela 17 mostra a digestibilidade ileal aparente média (AID) por nutriente e tratamento. As diferenças foram analisadas com modelos de regressão linear com tratamento como efeito fixo categórico (procedimento Im do pacote principal).

Tabela 17

Digestibilidade ileal aparente média (AID)

Nome do Grupo	Matéria Seca	Cinzas	Proteína	Gordura
Média	Valor P	Média	Valor P	Média	Valor P	Média	Valor P
NC	57,6	Ref.	38,2	Ref.	74,1	Ref.	61,6	Ref.
DSM32324	58,8	0,233	38,7	0,697	76,3	0,050	59,5	0,515
DSM25840	59,5	0,075	40,8	0,039	76,3	0,050	64,0	0,458
DSM32325	57,4	0,862	37,5	0,568	74,6	0,639	63,1	0,640

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Tabela 17 -continuação-

Nome do Grupo	Ca	Fósforo	Energia
Média	Valor P	Média	Valor P	Média	Valor P
NC	36,6	Ref.	53,8	Ref.	65,0	Ref.
DSM32324	36,3	0,900	53,6	0,879	66,5	0,160
DSM25840	33,4	0,190	54,0	0,842	67,2	0,043
DSM32325	31,3	0,031	51,0	0,039	65,4	0,677

[00283] Conclusão:

[00284] O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito de diferentes cepas de Bacillus no desempenho de crescimento e digestibilidade em frangos de corte.

[00285] As cepas testadas apresentaram efeitos significativos no desempenho e na digestibilidade ileal aparente:

[00286] Aves suplementadas com DSM32324 apresentaram maior ganho diário de peso (Tabela 16), consumo diário de ração e taxa de conversão alimentar no período inicial (dados não mostrados) e maior digestibilidade de proteína em D42 (Tabela 17) em comparação com as aves não suplementadas.

[00287] As aves suplementadas com DSM25840 apresentaram maior ganho de peso diário (Tabela 16) e consumo diário de ração no período inicial (dados não mostrados), maior peso corporal em D42 (Tabela 16) e maior digestibilidade de cinzas, proteínas e energia em D42 (Tabela 17) em comparação com as aves não suplementadas.

[00288] As aves suplementadas com DSM32325 apresentaram maior ganho de peso diário (Tabela 16) e consumo diário de ração no período inicial (dados não mostrados), e menor digestibilidade de Ca e de fósforo em D42 (Tabela 17) em comparação com as aves não suplementadas.

[00289] Em conclusão, todas as três cepas apresentaram resultados surpreendentemente bons e significativamente melhorados.

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EXEMPLO 8

Eficácia comparativa de 4 diferentes probióticos administrados na ração para o controle de entente necrótica causada por Clostridium perfrinqens em frangos de corte [00290] O objetivo do estudo foi avaliar o efeito de DSM32324, DSM25840 e DSM32325, bem como uma composição de todos eles na relação de 8:3:5, EPB5, no desempenho de frangos de corte Cobb 500 provocados com NE e para comparar o efeito de cada cepa com o efeito da composição.

[00291] Pintos machos Cobb 500 no dia da eclosão foram obtidos a partir da incubadora Cobb Vantress, Cleveland, GA. 2250 pintos foram alocados para o estudo. Todas as aves foram vacinadas por aspersão com vacina contra coccidiose com a dose recomendada no rótulo no dia da eclosão.

[00292] Práticas padrão de manejo de unidade experimental foram usadas durante todo o experimento. As unidades experimentais eram verificadas diariamente quanto à mortalidade. Os pesos das aves (kg) por unidade experimental foram registrados no início do estudo e nos DOTs 21,35 e 42.

[00293] As dietas para frangos de corte foram fornecidas como farelo (alimentação inicial) ou como péletes (crescimento e terminação). A composição quantitativa da ração foi a mesma para todos os animais, exceto para a inclusão das cepas de Bacillus ou composição para os grupos de tratamento. Formulações de dieta:

Tabela 18

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Metionina MHA, L - Lisina, Minerais traço, pré-mistura de Vitamina e L-Treonina foram incluídos consequentemente às recomendações do produtor.

[00294] Toda a ração foi por unidade experimental. A ração inicial foi enviada e fornecida do DOT 0 ao 21. No DOT 21, a ração inicial não consumida foi pesada e descartada. A ração de crescimento foi enviada e fornecida até o DOT 35. No DOT 35, a ração de crescimento não consumida foi pesada e descartada. A ração de terminação foi enviada e fornecida até o DOT 42. No DOT 42, a ração de terminação não consumida foi pesada e descartada.

[00295] O experimento consistiu em 45 unidades experimentais, começando com 50 frangos de corte machos por unidade experimental. Os tratamentos foram replicados em nove blocos, randomizados dentro de blocos de cinco unidades experimentais cada.

Tabela 19

Tratamento	Descrição	Ração alvo (cfu/g ração)	Clostridium perfringens	Unidades experimento is/Trt
T1	Controle sem probiótico	0	DOT 19,20,e21	9
T2	Bacillus subtiiis DSM32324	8XW⁵	DOT 19,20,e21	9
T3	Bacillus subtiiis DSM32325	5X 1Q⁵	DOT 19,20,e 21	9
T4	Bacillus amyloliquefaci- ens DSM25840	3X10⁵	DOT 19,20,e21	9
T5	EBP5	1,6 X 10®	DOT 19,20,e 21	9

Ό0296] Nos dias 19, 20 e 21, todas as unidades experimentais foram provocadas com uma cultura de caldo de C. perfringens. Um isolado em campo de C. perfringens conhecido por causar NE foi utilizado como organismo de provocação. Inóculo fresco foi usado todos os dias. Os níveis de titulação foram de aproximadamente 10^{8 9} CFU/unidade experimental. Cada unidade experimental recebeu a mesma quantidade de inóculo. O inóculo foi administrado por misturação na

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66/78 ração na base dos alimentadoras de tubos.

[00297] No dia 21, cinco aves de cada unidade experimental foram selecionadas, sacrificadas, pesadas em grupo e examinadas quanto ao grau de presença de lesões por enterite necrótica. O escore foi baseado em um escore de 0 a 3, sendo 0 normal e 3 grave. O escore foi o seguinte: 0 para intestinos normais, 1 para leve cobertura mucosa e perda de tônus, 2 para enterite necrosante grave, e 3 para enterite necrosante extrema com presença de sangue no lúmen.

[00298] Nenhuma terapia de fármaco concomitante foi usada durante o estudo. A unidade experimental foi usada como unidade estatística. Foram calculadas as médias de peso vivo, ganho de peso, consumo de ração, taxa de conversão alimentar (FCR), escore de lesão por NE, e mortalidade (total e NE). Os dados brutos foram analisados estatisticamente (ANOVA), utilizando um Design de Bloco Completo Aleatório. O teste HSD de Tukey (p < 0,05) foi utilizado para separar as médias quando os valores de ANOVA F são significativos (p < 0,05). Diferentes sobrescritos dentro das linhas indicam níveis de significância em P < 0,05.

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Resultados

Tabela 20

Dia 21	Consumo
T ratamento	de Ração
1. Não medicado	44,70a
2. Bacillus subtilis DSM32324	43,48a
3. Bacillus subtilis DSM32325	44,92a
4. Bacillus amyloliquefaciens DSM25840	42,32a
5. EBP5	43,14a

FCR	AWG (kg)
1,903a	0,430b
1,694c	0,476a
1,649c	0,509a
1,786b	0,436b
1,646c	0,488a

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Tabela 21

Dia 35	Consumo
T ratamento	de Ração
1. Não medicado	143,17a
2. Bacillus subtiiis DSM3234	141,29a
3. Bacillus subtilis DSM3235	145,73a
4. Bacillus amyloliquefaciens DSM25840	140,13a
5. EBP5	142,33a

FCR	AWG (kg)
1,909a	1,606b
1,802b	1,667a
1,816b	1,695a
1,801b	1,641ab
1,774b	1,689a

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Tabela 22

Dia 42	Consumo
T ratamento	de Ração
1. Não medicado	199,77a
2. Bacillus subtilis DSM32234	197,67a
3. Bacillus subtilis DSM32235	203,61a
4. Bacillus amyloiiquefaciens DSM25840	196,86a
5. EBP5	199,87a

FCR	AWG Percentual de (kg) Mortalidade
1,957a	2,237b 4,2a
1,873bc	2,291ab 3,1a
1,896b	2,322a 2,7a
1,898b	2,244b 3,3a
1,841c	2,342a 2,7a

Tabela 23	Lesões
T ratamento	por NE
1. Não medicado	1,0a
2. Bacillus subtilis DSM32234	0,5c
3. Bacillus subtilis DSM32235	0,5c
4. Bacillus amyloiiquefaciens DSM25840	0,7b
5. EBP5	0,5c

% de Mortalidade por NE

4?2ã

0,4b

0,9b

1,6b

0,4b

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Discussão e Conclusão [00299] Para os parâmetros de desempenho, taxa de conversão alimentar (FCR) e ganho de peso médio (AWG) medidos no dia 21, dia 35 e dia 42, foi observada uma melhora significativa em todos os pontos de dados quando considerando os aditivos probióticos de ração de uma única cepa e ο EBP5 em particular em comparação com o grupo de controle infectado não tratado.

[00300] Surpreendentemente, os grupos tratados com EBP5 mostraram melhora significativa para alguns dos parâmetros de desempenho em comparação com os grupos com o tratamento com Bacillus de cepa única, que novamente mostrou diferenças significativas nos parâmetros de desempenho para o grupo de controle infectado não medicado.

[00301] Com relação à entente subclínica induzida na provocação in vivo, os resultados mostram que tanto as cepas simples de Bacillus subtilis DSM32234, Bacillus subtilis DSM32235 e Bacillus amyloliquefaciens DSM25840 quanto a combinação EBP5 diminuíram o escore de lesão por enterite necrótica em galinhas e a mortalidade por entente necrótica reduzida significativamente.

EXEMPLO 9 [00302] Composição de bacilus com três cepas de Bacillus em perus machos [00303] O estudo consistiu em 300 perus machos saudáveis com um dia de idade (Kartzfehn Premium), que foram distribuídos aleatoriamente em 60 unidades experimentais com 5 aves por unidade experimental (10 repetições por qualquer grupo de tratamento).

[00304] As dietas consistiam em dieta de peru de tipo comercial não medicado tendo uma composição de ingredientes, conforme descrito na Tabela 24 para perus de d 01 a d 63 de idade e na Tabela 25 para perus de d 64 a d 147 de idade. A composição quantitativa da ração foi

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70/78 a mesma para todos os animais, exceto pela inclusão da composição de Bacillus para o grupo de tratamento.

[00305] A composição de Bacillus EBP5 compreendendo 1,6 x 10⁹CFU/g de DSM32324, 0,6 x 10⁹ CFU/g de DSM25840 e 1,0 x 10⁹CFU/g de DSM32325, isto é, em uma relação de 8:3:5, foi misturada na ração.

Tabela 24. Composição dos ingredientes nas dietas P1, P2 e P3 para perus

Fase de alimentação		P1 (d 01 a 14 de idade)	P2 (d 15 a 35 de idade)	P3 (d 36 a 63 de idade)
		ingredientes
Farelo de soja (Proteína crua: 49%)	g/kg	470,00	442,80	369,00
Milho	g/kg	352,40	389,40	455,70
Trigo	g/kg	79,30	79,30	79,30
Óleo de soja	g/kg	35,00	35,00	41,00
Fosfato monocálcio	g/kg	25,00	17,90	17,90
Calcário	g/kg	20,20	17,80	18,80
Pré-mistura	g/kg	12,00	12,00	12,00
Metionina	g/kg	2,50	2,20	2,20
Usina	g/kg	1,60	1,60	2,10
Calcário	g/kg	2,00; 1,90; 1,75; 1 ,50;1,00;0	2,00; 1,90; 1,7 5; 1,50; 1,00;0	2,00; 1,90; 1,7 5; 1,50; 1,00;0
EPB5	g/kg	0;0,1;0,25;0,50; 1,00;2,00	0;0,1;0,25;0, 50;1,00;2,00	0;0,1;0,25;0, 50;1,00;2,00

* Teor por kg de Pré-mistura: 600000 LU. de Vit. A (acetato); 120000 LU. Vit. D3; 6000 mg de Vit. E (acetato de a-tocoferol); 200 mg de Vit. K3 (MSB); 250 mg de Vit. B1 (mononitrato); 420 mg de Vit. B2 (riboflavina cristalina); 300 mg de Vit. B6 (piridoxina-HCi); 1500 pg de Vit. B12; 3000 mg de niacina (niacinamida); 12500 pg de biotina (comercial, grau alimentício); 100 mg de ácido fólíco (cristal, comercial, grau alimentício); 1000 mg de ácido pantotênico (Ca d-pantotenato); 60000

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71/78 mg de colina (cloreto): 5000 mg de ferro (carbonato de ferro): 5000 mg de zinco (sulfato de zinco); 6000 mg de manganês (óxido manganoso); 1000 mg de cobre (óxido de cobre); 45 mg de iodo (iodato de cálcio); 20 mg de selênio (seienito de sódio); 140 g de sódio (NaCI); 55 g de magnésio (sulfato de magnésio); carreador: carbonato de cálcio (cálcio mínimo 38%); Monteban G100: 5’833 mg

Tabela 25. Composição de ingredientes nas dietas P4, P5 e P6 para perus

Fase de alimentação		P4 (d 64 a 91 de idade)	P5 (d 92 a 119 de idade)	P6 (d 120 a 147 de idade)
		Ingredientes
Milho	g/kg	524,60	606,80	658,00
Farelo de soja (Proteína	g/kg	303,00	225,00	173,00
crua: 49%)
Trigo	g/kg	79,30	79,30	79,30
Óleo de soja	g/kg	37,80	35,00	38,00
Fosfato monocálcio	g/kg	19,00	16,00	14,90
Calcário	g/kg	18,70	17,00	15,30
Pré-mistura *	g/kg	12,00	12,00	12,00
L-Lisina	g/kg	2,00	2,80	3,50
DL-Metionina	g/kg	1,60	1,50	1,50
L-Treonina	g/kg		0,50	0,30
L-Triptofano	g/kg		0,10	0,20
Calcário	g/kg	2,00;1,90;1,75;1	2,00;1,90;1,75;1	2,00;1,90;1,75;1
		,50;1,00;0	,50;1,00;0	,50;1,00;0
Probiótico	g/kg	0;0,1;0,25;0,50;	0;0,1;0,25;0,50;	0;0,1;0,25;0,50;
		1,00:2,00	1,00;2,00	1,00;2,00

* Teor por kg de Pré-mistura: 600000 LU. de Vit. A (acetato); 120000

I.U. de Vit. D3; 6000 mg de Vit. E (acetato de a-tocoferol); 200 mg de Vit. K3 (MSB); 250 mg de Vit. B1 (mononitrato); 420 mg de Vit. B2 (riboflavina cristalina); 300 mg de Vit. B6 (piridoxina-HCI); 1500 pg de Vit. B12; 3000 mg de niacina (niacinamlda); 12500 pg de biotina (comercial, grau alimentício); 100 mg de ácido fólico (cristal, comercial, grau alimentício); 1000 mg de ácido pantotênico (Ca d-pantotenato); 60000

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72/78 mg de colina (cloreto): 5000 mg de ferro (carbonato de ferro): 5000 mg de zinco (sulfato de zinco); 6000 mg de manganês (óxido manganoso); 1000 mg de cobre (óxido de cobre); 45 mg de iodo (iodato de cálcio); 20 mg de selênio (selenito de sódio); 140 g de sódio (NaCI); 55 g de magnésio (sulfato de magnésio); carreador: carbonato de cálcio (cálcio mínimo 38%); Monteban G100: 5’833 mg

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Resultados

Tabela 26. Efeito de EBP5 no desempenho em perus machos durante o período de alimentação total (P1 a P6)

Grupos de tratamento		T1	T2	T3	T4	T5	T6	Valor P i
Aves totais	n°	50	50	50	50	50	50
Repetições	n°	10	10	10	10	10	10
EBP5	mg/kg		100	250	500	1,000	2,000
	P1 a P 6 (d 01 a d 147 de idade)
Aves	n°	48	49	48	48	49	49
Peso corporal inicial	g	61,2 ± 1,0	61,2 ±0,8	61,3 ±1,0	61,2 ±1,0	61,3 ± 0,8	61,2 ± 1,0	1,000
Peso corporal final	g	24169,3 ± 321,6^a	24522,9 ± 335,0^ab	24721,4 ± 252,2^bc	24917,7 ± 251,2^C	25333,3 ± 311,2^d	25759,3 ± 282,2®	<0,001
Ganho de peso corporal	g	24108,1 ± 320,9^a	24461,7 ± 334,6^ab	24660,2 ± 252,0^bc	24856,5 ± 251,1®	25272,0 ± 310,9^d	25698,1 ± 282,4«	<0,001 i
Ganho de peso corporal/d	g/d	164,0 ±2,2^a	166,4 ±2,3^ab	167,8 + 1,7^DC	169,1 ±1,7=	171,9 ± 2,1^d	174,8 ±1,9®	<0,001 I
Consumo de ração	g	51538,2 ± 735,3^ab	51309,4 ± 408,7^ab	51294,0 ± 377,0^8b	50941,6 ± 598,1^aB	51049,7 ± 404,7^a	51737,8 ± 581,9^b	0,016 1
Consumo de ração/d	g/d	350,6 ± 5,0^ab	349,0 ±2,8^ab	348,9 ± 2,6^ab	346,5 ± 4,1^ab	347,3 ± 2,8^a	352,0 ±4,0^b	0,016
Conversão alimentar		2,138 ± 0,024^d	2,098 ± 0,035®	2,080 ± 0,026^bc	2,050 ± 0,025^ab	2,020 ± 0,032^a	2,013 ± 0,025^a	< 0,001 i

73/78 ^ab Sobrescritos diferentes dentro das linhas indicam níveis de significância em P < 0,05.

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Ganho de peso corporal [00306] O peso corporal inicial de perus foi de cerca de 61,2 g e quase semelhante em todos os grupos de tratamento. O ganho de peso corporal total em perus alimentados com dietas sem conter EBP5 (grupo de controle) foi de 24,11 kg; no período de alimentação de 147 dias, o ganho de peso corporal diário atingiu em média 164 g. O ganho de peso corporal geral mostrou uma melhora significativa por adição de EBP5 em níveis de dose de 250 ou mais (250 mg/kg: + 2,3%; 500 mg/kg: + 3,1%; 1.000 mg/kg: + 4,8%; 2.000 mg/kg: + 6,6%) em comparação com o controle, enquanto em perus alimentados com dietas contendo EBP5 na dose de 100 mg/kg, não foram encontradas alterações significativas (+1,0%) quando comparadas com o controle.

Taxa de conversão alimentar [00307] A taxa de conversão alimentar geral (ração:ganho) de perus alimentados com dietas sem o uso de EBP5 atingiu 2,138, o que indicou um nível de desempenho notável e superou até as metas estabelecidas pelo produtor (2.540). Devido aos benefícios no ganho de peso corporal em perus alimentados com dietas contendo EBP5, os níveis de dose aumentados foram associados a taxas de conversão alimentar gerais significativamente reduzidas (250 mg/kg: 2,080; 500 mg/kg: 2,050; 1.000 mg/kg: 2,020; 2.000 mg)/kg: 2,013) em comparação com o controle.

Conclusão [00308] A mortalidade geral (incluindo o abate) foi de 2,7%, indicando um excelente estado de saúde do rebanho.

[00309] O presente estudo mostrou uma melhora significativa nos parâmetros de produção em aves alimentadas com dietas contendo 250 mg/kg a 2000 mg/kg do probiótico Bacillus multi-cepa EBP5. O ganho de peso corporal até d 147 de idade foi significativamente aumentado por EBP5 até 6,6% (2.000 mg/kg) quando comparado com o controle.

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75/78 [00310] Em perus alimentados com dietas contendo o probiótico Bacillus multicepa EBP5, os níveis de dose aumentados foram associados a taxas de conversão alimentar significativamente melhoradas de até 5,8% (2.000 mg/kg), em comparação com o controle.

[00311] É notável que em níveis de dose de 250 mg/kg a 2000 mg/kg, o teor médio geral de matéria seca dos excrementos aumentou significativamente quando comparado com o controle.

EXEMPLO 10

Combinação de uma composição de Bacillus com três cepas de Bacillus e de uma vacina de salmonella atenuada viva em galinhas [00312] Cento e vinte (120) pintos de corte não sexados Ross x Ross no dia da eclosão foram alocados em três salas de isolamento diferentes, cada uma contendo quarenta (40) pintos de corte no início do estudo. Cada unidade experimental continha aproximadamente quatro (4) polegadas de aparas de pinus frescas, um alimentador de tubo e um bebedor de sino para alimentação e bebida à vontade.

[00313] Todas as aves foram vacinadas contra coccidiose no primeiro dia e nenhuma terapia de fármaco concomitante foi usada. As unidades experimentais eram verificadas diariamente quanto à mortalidade.

[00314] A dieta inicial (farelos) e a dieta de crescimento (péletes) do dia 22 até as formulações finais consistiram de frangos de corte comerciais não medicados. A composição quantitativa da ração foi a mesma para todos os animais, exceto pela inclusão da composição de Bacillus para o grupo de tratamento. A composição de Bacillus compreendendo DSM32324, DSM25840 e DSM32325 na relação de 8:3:5 foi misturada na relação de 1,6 x 10⁶ CFU/grama de ração na ração.

[00315] O AvIPro® Megan® Vac 1, uma vacina viva contra Salmonella Typhimurium produzida por Lohmann Animal Health, Maine, ELJA, a seguir denominada Megan Vac”, foi pulverizada de maneira

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76/78 grosseira no 1 dia de idade para os grupos de tratamento T2 e T3 em uma dose por ave em um volume de 0,25 ml por pinto.

Tabela 27

Grupos de tratamento (40 aves em cada grupo)

Grupo	Megan Vac	Composição de Bacillus na dieta
T1	Não	Não
T2	Sim	Não
T3	Sim	1,6 x 10⁶ CFU/grama de ração

[00316] No dia 3, quatro cecos e quatro baços de cada tratamento foram pesados e coletados para confirmar a colonização de vacina. Todas as aves restantes foram administradas por via oral (gavagem) com 3 x 10⁷ CFU de Salmonella Heidelberg (Alali e outros., 2013) no Dia 4.

[00317] No dia 40, pouco antes do abate, dez aves por tratamento foram retiradas de cada unidade experimental individual, sacrificadas e os cecos removidos assepticamente. As amostras de ceco foram testadas quanto a Salmonella.

Resultados [00318] Os resultados da prevalência de Salmonella em amostras de ceco e fígado/baço coletados a partir de quatro aves no Dia 3 (ver Tabela 28) confirmam a colonização de vacina.

Tabela 28

Prevalências de Salmonella em amostras de ceco e fígado/baço

Tipo de amostra	T ratamento	No	No positivo (%)
Ceco	T1	4	0
	T2	4	0
	T3	4	0
Fígado/Baço	T1	4	0
	T2	4	3
	T3	4	4

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77/78 [00319] Os isolados suspeitos de Salmonella foram confirmados por Anti-Soro Específico Poly-0 Salmonella (MiraVista, Indianapolis, IN).

[00320] Megan Vac isoladamente ou com a composição de Bacillus teve numericamente o menor número de Salmonella em ceco no Dia 40 em comparação com as aves não tratadas (dados não mostrados).

[00321] Como é evidente na Tabela 29 abaixo, a FCR de aves alimentadas com a composição Megan Vac + Bacillus (T3) foi menor do que em aves não tratadas (T1) e em aves tratadas isoladamente com Megan Vac (T2).

Tabela 29

Desempenho no dia 40

T ratamento	Consumo de ração (kg/unidade experimental)	Ganho de peso (kg/ave viva)	FCR
T1	95,86	1,86	1,47
T2	110,32	2,16	1,50
T3	106,70	2,15	1,38

Conclusão [00322] O objetivo era avaliar o efeito de um probiótico baseado em Bacillus na colonização de uma vacina viva de Salmonella Typhimurium e a capacidade subsequente da composição de Bacillus de proteger contra uma provocação de Salmonella Heidelberg em frangos de corte.

[00323] As amostras do Dia 3 indicaram que a composição de Bacillus não afetou a colonização inicial por Salmonella da vacina.

[00324] Além disso, o estudo indica que pode haver um efeito aditivo em ter a composição da vacina e de Bacillus.

Referências [00325] WO2013/153159 [00326] WO2016/060934 [00327] WO2016/118840 [00328] Alali, W. Q, C.L. Hofacre, G. F. Mathis e G. Faltys, 2013.

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Effect of essential oil compound on shedding and colonization of Salmonella enteric serovar heidelberg in broilers, Poultry Science 92: 836 a 841.

[00329] Johnson J, Reid WM. Anticoccidial drugs: lesion scoring techniques in battery and floor-pen experiments with chicken, Exp Parasitol., 1970, Aug;28(1 ):30-6.

[00330] Knap I, Lund B, Kehlet AB, Hofacre C, Mathis G.: Bacillus licheniformis prevents necrotic enteritis in broiler chicken. Avian Dis. 2010 Jun;54(2):931-5.

[00331] Timbermont L, e outros. Lanckriet A, Gholamiandehkordi AR, Pasmans F, Martel A, Haesebrouck F, Ducatelle R, Van Immerseel F., Origin of Clostridium perfringens isolates determines the ability to induce necrotic enteritis in broilers., Comp Immunol Microbiol Infect Dis., 2009, Nov;32(6):503-12.

[00332] Waititu e outros. Effect of Supplementing Direct-Fed Microbials on Broiler Performance, Nutrient Digestibilities, and Immune Responses. Poult Sci, 2014, 93 (3), 625 a 635.

[00333] Wang e outros., Comparison of gyrB gene sequences, 16S rRNA gene sequences and DNA-DNA hybridization in the Bacillus subtilis group, Int J Syst Evol Microbiol. 2007 Aug;57(Pt 8):1846-50.

[00334] Guidance on the assessment of bacterial susceptibility to inhibitorys of human and veterinary importance”, EFSA Journal 2012;10(6):2740.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Cepa de Bacillus subtilis caracterizada pelo fato de que é selecionada a partir do grupo que consiste em:

a) a cepa depositada como DSM32324,

b) a cepa depositada como DSM32325, e

c) uma cepa mutante de (a) ou (b) que (i) tem sensibilidade à ampicilina, vancomicina, gentamicina, canamicina, estreptomicina, eritromicina, clindamicina, tetraciclina e cloranfenicol; e (ii) tem atividade inibidora contra E. coli e Clostridium perfringens.
2. Composição de Bacillus, caracterizada pelo fato de que compreende ao menos uma cepa de Bacillus subtitle, como definida na reivindicação 1.
3. Composição, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que compreende a cepa de Bacillus subtilis DSM32324.
4. Composição, de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizada pelo fato de que compreende a cepa de Bacillus subtilis DSM32325.
5. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4, caracterizada pelo fato de que compreende Bacillus subtilis DSM32324 e Bacillus subtilis DSM32325.
6. Composição de Bacillus, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 5, caracterizada pelo fato de que a cepa ou cepas de Bacillus são esporos,
7. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 6, caracterizada pelo fato de que é um Microbianos de Alimentação Direta (DFM), uma pré-mistura, um aditivo para ração animal, ou uma ração animal.

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8. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 7, caracterizada pelo fato de ser para uso na prevenção ou controle de colonização ou infecção bacteriana.
9. Composição, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de ser para uso na prevenção ou controle de colonização ou infecção bacteriana por E. coli e/ou Clostridium.
10. Método para prevenção ou controle de colonização ou infecção bacteriana, caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma quantidade eficaz de uma cepa como definida na reivindicação 1, ou de uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 2 a 7, a um animal em necessidade do mesmo.
11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a colonização ou infecção por E. coll e/ou Clostridium é prevenida ou controlada.
12. Método para aumentar a digestibilidade de uma ração animal, caracterizado pelo fato de que compreende alimentar uma cepa como definida na reivindicação 1, ou uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 2 a 7, a um animal.
13. Método para melhorar um ou mais parâmetros de desempenho animal selecionados a partir do grupo que consiste em:

i) aumento do ganho de peso (WG), ií) menor taxa de conversão alimentar (FCR), iii) menor escore de lesão por enterite necrótica, iv) menor frequência de enterite necrótica,

v) menor mortalidade por enterite necrótica, vi) aumento do fator de eficácia da produção europeu (EPEF) e vii) menor mortalidade, caracterizado pelo fato de que compreende alimentar uma cepa como definida na reivindicação 1, ou uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 2

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3/3 a 7, a urn animal·
14. Método para alimentar um animal, caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma cepa como definida na reivindicação 1, ou uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 2 a 7, a um animal.
15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o animal é um animal selecionado a partir do grupo que consiste em aves tais como frangos de corte, galinhas reprodutoras, matrizes, perus, avestruzes, codornas, patos e gansos, herbívoros tais como cavalos e ruminantes, por exemplo, camelos, lhamas, bovinos e ovinos, bezerros, suínos, tais como leitões, desmamados, em crescimento, em terminação, jarretes, polis”, marras, porcas, porcas gestantes, roedores tais como coelhos, animais de estimação tais como cães e gatos, peixes; e crustáceos.