JP6991162B2 - プロバイオティック活性を示すバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株 - Google Patents

Description

DSMZ DSM 32314 DSMZ DSM 32315

本発明は、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）を強力に阻害する新規なバチルス・サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株およびプロバイオティクスとしてのその使用に関する。

飼料産業におけるプロバイオティック成分としてのバチルス・サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株の使用は、従来技術において周知である。プロバイオティクス（「直接給与生菌剤」または「ＤＦＭ」とも呼ばれる）の機能は、有益な細菌の増殖の補助および／または病原性細菌の増殖の抑制によって腸内細菌叢に好影響を与えることにある。理想的には、プロバイオティクスを用いることによって、成長促進抗生物質（ＡＧＰ）を使用しなくても済むようになる。しかしそれに加えて、プロバイオティクスが、特定の飼料成分の消化を助けるなどのさらなる機能を果たすことが望ましい。

したがって、技術水準に鑑み、腸内細菌叢に好影響を及ぼすだけでなく、望ましくは少なくとも１つのさらなる機能を果たすプロバイオティクスが求められている。

驚くべきことに、本発明による細菌は、有利な特性を数多く示すことが見出された。本発明による細菌は、商業的に重大な影響を及ぼす主要な家禽類の病原菌であるクロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）の増殖を阻害するその能力に加えて、特に胆汁の存在下で非常に高い増殖速度を示すとともに、セルロースの消化を非常に効果的に支援する。

バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＤＳＭ ３２３１５は、天然に存在する単離物のスクリーニングによって同定されている。これは、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の規定に基づき、Ｅｖｏｎｉｋ Ｄｅｇｕｓｓａ ＧｍｂＨの名義にて前述の受託番号で２０１６年５月１２日付でドイツ微生物細胞培養コレクション（ＤＳＭＺ）に寄託されている。

したがって、本発明の第１の対象は、以下の群から選択されるバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株および／または前記バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株の調製物である：
ａ） ＤＳＭＺにＤＳＭ ３２３１５で寄託されたバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株；
ｂ） ＤＳＭ ３２３１５で寄託されたバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株の変異体であって、ＤＳＭ ３２３１５菌株のすべての同定特性を示し、好ましくは、前記菌株ＤＳＭ ３２３１５に対して少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、少なくとも９７％または少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％または少なくとも９９．５％のＤＮＡ配列同一性を有する変異体；
ｃ） （ａ）または（ｂ）の調製物；
ｄ） （ａ）、（ｂ）または（ｃ）に含まれる代謝産物の有効な混合物を含有する調製物。

ＤＳＭＺにＤＳＭ ３２３１５で寄託されたバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株は、以下の特徴的配列を示す：
ａ） 配列番号１のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９９．５％、特に１００％の配列同一性を有する１６Ｓ ｒＤＮＡ配列；
ｂ） 配列番号２のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９９．５％、特に１００％の配列同一性を有するｙｑｆＤ配列；
ｃ） 配列番号３のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９９．５％、特に１００％の配列同一性を有するｇｙｒＢ配列；
ｄ） 配列番号４のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９９．５％、特に１００％の配列同一性を有するｒｐｏＢ配列；
ｅ） 配列番号５のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９９．５％、特に１００％の配列同一性を有するｇｒｏＥＬ配列。

したがって、本発明のさらなる対象は、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株またはその調製物、特に前述の特性を示すバチルス・サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株であって、以下の特性のうちの少なくとも１つを示し、好ましくは以下の特性のすべてを示すものである：
ａ） 配列番号１のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９９．５％、より好ましくは少なくとも９９．８％または少なくとも９９．９％、特に１００％の配列同一性を有する１６Ｓ ｒＤＮＡ配列；
ｂ） 配列番号２のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９９．５％、より好ましくは少なくとも９９．８％または少なくとも９９．９％、特に１００％の配列同一性を有するｙｑｆＤ配列；
ｃ） 配列番号３のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９９．５％、より好ましくは少なくとも９９．８％または少なくとも９９．９％、特に１００％の配列同一性を有するｇｙｒＢ配列。

好ましくは、このバチルス・サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株は、以下のさらなる特性のうちの少なくとも１つを示し、より好ましくは以下のさらなる特性のすべてを示す：
ｄ） 配列番号４のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９９．５％、より好ましくは少なくとも９９．８％または少なくとも９９．９％、特に１００％の配列同一性を有するｒｐｏＢ配列；
ｅ） 配列番号５のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９９．５％、より好ましくは少なくとも９９．８％または少なくとも９９．９％、特に１００％の配列同一性を有するｇｒｏＥＬ配列。

したがって、本発明の特定の対象はまた、以下の特性を示すバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株である：
ａ） 配列番号１の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列；
ｂ） 配列番号２のｙｑｆＤ配列；
ｃ） 配列番号３のｇｙｒＢ配列。

好ましくは、このバチルス・サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株は、以下のさらなる特性を示す：
ｄ） 配列番号４のｒｐｏＢ配列；
ｅ） 配列番号５のｇｒｏＥＬ配列。

本発明の菌株は、好ましくは、以下のさらなる特性のうちの少なくとも１つを特徴とし、より好ましくは以下のさらなる特性のすべてを特徴とする：
本発明の菌株は、好ましくは、嫌気性条件下で増殖することができる。さらに、本発明の菌株は、好ましくは、このような嫌気性条件下で非水溶性セルロースおよびタンパク質を分解することができる。

本発明の菌株は、好ましくは、感染性細菌、特にクロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）を非常に効果的に阻害する。特に本発明の菌株は、好ましくは、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）のＡＴＣＣ １３１２４型菌株に関してＬＢＫｅｌｌｙ寒天プレート上でのウェル拡散拮抗アッセイにおける病原菌クリアランスが少なくとも１０ｍｍであり、より好ましくは少なくとも１３ｍｍであることを特徴とする。

胞子は、好ましくは低ｐＨで生存可能であり、好ましくは、わずか４．０、特にわずか３．０、好ましくはわずか２．０のｐＨに曝された状態で少なくとも１時間生存する。

本発明による菌株は、好ましくは、０．０５重量％の酢酸、０．０５重量％のプロピオン酸および／または０．２重量％の乳酸の存在下で増殖し得ることをさらに特徴とする。

本発明による菌株は、好ましくは、セルラーゼ活性が少なくとも２００ｍＵ／ｍＬ、より好ましくは少なくとも３００ｍＵ／ｍＬ、特に少なくとも３５０ｍＵ／ｍＬ、殊に少なくとも約３６９ｍＵ／ｍＬであり、キシラナーゼ活性が少なくとも１５ｍＵ／ｍＬ、より好ましくは少なくとも２０ｍＵ／ｍＬ、特に少なくとも２５ｍＵ／ｍＬ、殊に少なくとも約３３ｍＵ／ｍＬであることをさらに特徴とする。

本発明によるバチルス・サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株は、好ましくは、２ｍＭの胆汁の存在下で、より好ましくは４ｍＭの胆汁の存在下で増殖し得ることをさらに特徴とする。特に本発明によるバチルス・サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株は、好ましくは、それぞれ２ｍＭの胆汁の存在下で、ＡＵＣ５性能値が少なくとも０．５、好ましくは少なくとも０．６５、特に少なくとも０．８、殊に約０．８８であり、かつＡＵＣ１０性能値が少なくとも１．２、好ましくは少なくとも１．４、特に少なくとも１．６、殊に約１．７であることを特徴とする。

さらに、本発明によるバチルス・サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株は、好ましくは、高濃度塩の条件下で、特に５重量％のＮａＣｌの存在下で、少なくとも１日間増殖することができる。

さらに、本発明の菌株は、好ましくは、動物飼料のペレット化に必要な高温で生存し、特に好ましくは、８０℃の温度で少なくとも２０分間生存する。

いかなる理論にも束縛されることを望むものではないが、本発明によるバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株は、選択的有効性を示す抗菌性代謝産物の産生や、利用可能な栄養素をより良好に消費することによる病原性細菌との競合を含む多面的な作用様式によって動物の健康を増進し、これによって腸内の病原性細菌の効果的な抑制が確立されるものと考えられる。

抗生物質に対するプロバイオティクスの大きな利点の１つに、プロバイオティクスは、無秩序に細菌を破壊することも、病原性細菌の抗生物質耐性菌株を生じさせることもない、という点が挙げられる。通常、プロバイオティクスは、特定の有効性を示す抗菌性物質の産生によって病原性細菌と選択的に競合することができるとともに、理想的には、これと同時に、有益な腸内細菌叢の増殖および生存を増強することができる。さらに、プロバイオティクスは、好ましくは、処置動物における全身免疫応答を刺激することができる。

本発明のＤＳＭ ３２３１５の変異菌株は、好ましくは偶発的変異体である。「偶発的変異体」なる用語は、変異誘発物質を意図的に使用することなくＤＳＭ ３２３１５から生じる変異体を指す。こうした偶発的変異体は、ＵＶ光の存在下または親が感受性を示す特定の抗生物質の存在下でバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株を増殖させて、耐性変異体を生物学的活性の向上や動物の健康の１つまたは複数の徴候を増強させる能力の向上について試験するなどの古典的な方法によって得ることができる。偶発的変異体を同定するための他の方法は、当業者に知られている。しかし、本発明には、これらの好ましい偶発的変異体の他に、遺伝子工学によって得られる変異体などの、ＤＳＭ ３２３１５の他のあらゆる種類の変異体が包含される。

本発明の特定の一実施形態は、前述の特性を特徴とするＤＳＭ ３２３１５菌株の、天然に存在しない変異体である。

本発明の好ましい一実施形態において、本発明の菌株および調製物は、好ましくは、動物またはヒトに経口投与される。

したがって、本発明のさらなる対象は、本発明のバチルス・サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株および／または調製物を含有する、組成物、例えば飼料原料、食料品、飲用水および飼育用水ならびに治療用組成物である。

本発明のさらなる対象はまた、飼料または食品中のプロバイオティック成分（ＤＦＭ）としての、本発明のバチルス・サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株および／または調製物の使用である。

本発明による好ましい食料品は、乳製品、特にヨーグルト、チーズ、ミルク、バターおよびクワルクである。

本発明の菌株の細胞は、特に本発明の組成物中で、胞子（休眠状態である）として存在することも、栄養細胞（増殖中である）として存在することも、移行状態細胞（増殖期から胞子形成期へと移行中である）として存在することも、これらの細胞の少なくとも２種類の組合せ物として存在することも、特にこれらの細胞のすべての種類の組合せ物として存在することも可能である。好ましい一実施形態において、本発明の組成物は、主に胞子を含むか、または胞子のみを含む。

本発明のバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株およびそれを含有する組成物は、動物への投与に際し、好ましくは、当該動物の健康を増進し、かつ／または当該動物の全身状態を改善し、かつ／または当該動物の飼料要求率を改善し、かつ／または当該動物の死亡率を低下させ、かつ／または当該動物の生存率を増加させ、かつ／または当該動物の体重増加を向上させ、かつ／または当該動物の生産性を向上させ、かつ／または当該動物の疾患抵抗性を向上させ、かつ／または当該動物の免疫応答を増大させ、かつ／または当該動物において健康な腸内細菌叢を確立もしくは維持し、かつ／または当該動物の糞便を通じた病原菌の放出を減少させる。特に本発明の菌株および組成物を使用することにより、治療目的での抗生物質の投与後に腸内細菌叢の健全なバランスが再度確立されるよう支援することができる。

したがって、本発明のさらなる対象は、動物の健康を増進し、かつ／または動物の全身状態を改善し、かつ／または動物の飼料要求率を改善し、かつ／または動物の死亡率を低下させ、かつ／または動物の生存率を増加させ、かつ／または動物の体重増加を向上させ、かつ／または動物の生産性を向上させ、かつ／または動物の疾患抵抗性を向上させ、かつ／または動物の免疫応答を増大させ、かつ／または動物において健康な腸内細菌叢を確立もしくは維持し、かつ／または動物の糞便を通じた病原菌の放出を減少させる方法であって、本発明の菌株および／もしくは調製物または当該菌株を含有する本発明の組成物を動物に投与する方法である。

したがって、本発明のさらなる対象はまた、動物の健康を増進し、かつ／または動物の全身状態を改善し、かつ／または動物の飼料要求率を改善し、かつ／または動物の死亡率を低下させ、かつ／または動物の生存率を増加させ、かつ／または動物の体重増加を向上させ、かつ／または動物の生産性を向上させ、かつ／または動物の疾患抵抗性を向上させ、かつ／または動物の免疫応答を増大させ、かつ／または動物において健康な腸内細菌叢を確立もしくは維持し、かつ／または動物の糞便を通じた病原菌の放出を減少させるための、本発明の菌株および／または調製物および／または組成物の使用であって、本発明の菌株および／もしくは調製物または当該菌株を含有する本発明の組成物を動物に投与する使用である。

したがって、本発明のさらなる対象はまた、動物の健康を増進し、かつ／または動物の全身状態を改善し、かつ／または動物の飼料要求率を改善し、かつ／または動物の死亡率を低下させ、かつ／または動物の生存率を増加させ、かつ／または動物の体重増加を向上させ、かつ／または動物の生産性を向上させ、かつ／または動物の疾患抵抗性を向上させ、かつ／または動物の免疫応答を増大させ、かつ／または動物において健康な腸内細菌叢を確立もしくは維持し、かつ／または動物の糞便を通じた病原菌の放出を減少させるための、前述の本発明の菌株および調製物ならびに当該菌株を含有する本発明の組成物である。

「動物の生産性の向上」とは、特に以下のいずれかを指す：卵、乳もしくは肉をより多くまたは高品質に生産すること、または離乳した子の生産量を増加させること。

本発明の菌株、調製物および組成物の方法および使用は、治療的なものであってもよいし、治療的でないものであってもよい。本発明の特に好ましい一実施形態において、前記方法および使用は、製薬用途のものではなく、特に栄養補給用途のものである。

動物の未処置の肥料は、病原性細菌および他の成分ゆえに、特に当該動物自体および／または当該肥料と接触するヒトにとって有害な環境作用を示すことがあるが、当該動物に本発明の菌株、組成物もしくは調製物を給与するか、または当該動物の肥料もしくは敷料を本発明の菌株、組成物もしくは調製物で直接処置することのいずれによっても、前述の作用を回避することができる。したがって、本発明のさらなる対象は、肥料または汚染液体の有害な環境作用を制御および／または回避する方法であって、本発明による少なくとも１種の菌株、少なくとも１種の調製物および／または少なくとも１種の組成物を、肥料、汚染液体、敷料、ピットまたは肥料溜めに施与する工程を含む方法である。好ましくは、組成物は、液体の形態で例えば噴霧により、または粉末として例えば散布により施与される。

有害な細菌は敷料のコンシステンシーに悪影響を及ぼすことがあり、これによって特に敷料が若干ないし高度に液状となることがあり、これが家禽類の趾蹠の病変を招くことがあるが、本発明の菌株、組成物または調製物を動物に給与することで、これを回避することができる。したがって、本発明のさらなる対象は、敷料のコンシステンシーを制御および／もしくは改善する方法、特に敷料の固形のコンシステンシーを確保する方法、ならびに／または趾蹠の病変を回避する方法であって、本発明による少なくとも１種の菌株、少なくとも１種の調製物および／または少なくとも１種の組成物を、動物、特に家禽類に給与する工程を含む方法である。

本発明による菌株および調製物はまた、水質の改善にも使用することができる。したがって、本発明のさらなる対象はまた、水または水溶液、特に飲用水および／または飼育用水の品質を制御および／または向上させる方法であって、本発明の少なくとも１種の菌株および／または少なくとも１種の調製物および／または少なくとも１種の組成物を、水または水溶液に施与する工程を含む方法である。

さらに、本発明による菌株および調製物は、植物の微生物病の治療にも使用することができる。したがって、本発明のさらなる対象はまた、植物、特に栽培植物の微生物病を治療および／または予防する方法であって、本発明の少なくとも１種の菌株および／または少なくとも１種の調製物および／または少なくとも１種の組成物を、植物に施与する工程を含む方法である。この施与は、液体の形態で例えば噴霧により行うことも可能であるし、固体の形態で特に粉末として行うことも可能である。

本発明の菌株、調製物および組成物を使用することによって、好ましくは、前述の特性のうちの少なくとも１つの改善が実現され、ここで、特性の実現とは、好ましくは、適切な陰性対照と比較した場合の少なくとも１％、より好ましくは少なくとも３％または少なくとも５％の改善を意味する。陰性対照としては、畜産分野で知られている平均的なものを用いることができるが、好ましくは、陰性対照動物として、試験動物と同一の処置を施すが本発明の菌株および／または調製物を投与しないものを用いることができる。

特に本発明の菌株、調製物および組成物は、動物の腸内での病原性細菌の増殖を阻害および／または減少させるのに有効な量で動物に投与または給与することができる。こうした病原性細菌としては、クロストリジウム綱菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）、リステリア属菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、エンテロコッカス属菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ）、スタフィロコッカス属菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）、エロモナス属菌（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、ストレプトコッカス属菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、カンピロバクター属菌（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、エスケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）およびビブリオ属菌（Ｖｉｂｒｉｏ）が挙げられる。これに関連して、本発明の方法を用いることにより、動物の糞便中に放出される病原性細菌の量を減少させることができる。本発明の方法を用いることにより、動物の腸内での乳酸菌などの有益な細菌の増殖を維持または増加させることもできる。病原性細菌の減少および／または有益な細菌の増加もしくは維持により、本発明の組成物は、全体として健康な腸内細菌叢を維持することができる。

したがって、本発明のさらなる対象は、有害なもしくは病原性の細菌の増殖を阻害および／もしくは減少させ、かつ／または動物の腸内の有益な細菌の増殖を維持および／もしくは増加させる方法であって、本発明の菌株および／または調製物および／または組成物を動物に投与し、前記病原性細菌は、好ましくは、クロストリジウム綱菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）、特にクロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）およびクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、リステリア属菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、特にリステリア・モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、リステリア・ゼーリゲリ（Ｌ．ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ）およびリステリア・ウェルシメリ（Ｌ．ｗｅｌｓｈｉｍｅｒｉ）、サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、特にサルモネラ・エンテリカ（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ）、サルモネラ・ガリナルム（Ｓ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、サルモネラ・プローラム（Ｓ．ｐｕｌｌｏｒｕｍ）、サルモネラ・アリゾナエ（Ｓ．ａｒｉｚｏｎａｅ）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、サルモネラ・エンテリティディス（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）およびサルモネラ・ボンゴリ（Ｓ．ｂｏｎｇｏｒｉ）、エンテロコッカス属菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ）、特にエンテロコッカス・フェカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）およびエンテロコッカス・セコルム（Ｅ．ｃｅｃｏｒｕｍ）、スタフィロコッカス属菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）、特にスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、エロモナス属菌（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、ストレプトコッカス属菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、特にストレプトコッカス・スイス（Ｓ．ｓｕｉｓ）およびストレプトコッカス・ガリナセウス（Ｓ．ｇａｌｌｉｎａｃｅｕｓ）、カンピロバクター属菌（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、特にカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）およびカンピロバクター・コリ（Ｃ．ｃｏｌｉ）、エスケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）およびビブリオ属菌（Ｖｉｂｒｉｏ）、特にビブリオ・パラヘモリティカス（Ｖ．ｐａｒａｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）およびビブリオ・ハルベイ（Ｖ．ｈａｒｖｅｙｉ）から選択され、前記有益な細菌は、好ましくは、乳酸菌、特にラクトバチルス属菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）およびビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）から選択される方法である。

本発明の好ましい一実施形態において、少なくとも１種の病原性細菌の量、特にクロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）の量は、少なくとも０．５ ｌｏｇだけ減少し、より好ましくは少なくとも１ ｌｏｇ、少なくとも２ ｌｏｇまたは少なくとも３ ｌｏｇだけ減少する。

したがって、本発明のさらなる対象はまた、病原性細菌の増殖を阻害および／もしくは減少させ、かつ／または動物の腸内の有益な細菌の増殖を維持および／もしくは増加させるための本発明の菌株、調製物および組成物であって、前記病原性細菌は、好ましくは、クロストリジウム綱菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）、特にクロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）およびクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、リステリア属菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、特にリステリア・モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、リステリア・ゼーリゲリ（Ｌ．ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ）およびリステリア・ウェルシメリ（Ｌ．ｗｅｌｓｈｉｍｅｒｉ）、サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、特にサルモネラ・エンテリカ（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ）、サルモネラ・ガリナルム（Ｓ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、サルモネラ・プローラム（Ｓ．ｐｕｌｌｏｒｕｍ）、サルモネラ・アリゾナエ（Ｓ．ａｒｉｚｏｎａｅ）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、サルモネラ・エンテリティディス（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）およびサルモネラ・ボンゴリ（Ｓ．ｂｏｎｇｏｒｉ）、エンテロコッカス属菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ）、特にエンテロコッカス・フェカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）およびエンテロコッカス・セコルム（Ｅ．ｃｅｃｏｒｕｍ）、スタフィロコッカス属菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）、特にスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、エロモナス属菌（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、ストレプトコッカス属菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、特にストレプトコッカス・スイス（Ｓ．ｓｕｉｓ）およびストレプトコッカス・ガリナセウス（Ｓ．ｇａｌｌｉｎａｃｅｕｓ）、カンピロバクター属菌（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、特にカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）およびカンピロバクター・コリ（Ｃ．ｃｏｌｉ）、エスケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）およびビブリオ属菌（Ｖｉｂｒｉｏ）、特にビブリオ・パラヘモリティカス（Ｖ．ｐａｒａｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）およびビブリオ・ハルベイ（Ｖ．ｈａｒｖｅｙｉ）から選択され、前記有益な細菌は、好ましくは、乳酸菌、特にラクトバチルス属菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）およびビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）から選択される、菌株、調製物および組成物である。

病原性細菌の発生および／または増殖の増大によって、特定の疾患が生じるかまたは生じる可能性がある。例えば、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）の発生および／または増殖の増大は、腸疾患の発症、特に家禽類の壊死性腸炎の発症を招くことがある。クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）の発生および／または増殖の増大は、細菌性腸炎、壊疽性皮膚炎および胆管肝炎のようなさらなる疾患の発症も招く可能性がある。クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）による感染症の最も軽い形態でさえ、すでに下痢を伴うことがあり、その結果、敷料が濡れてしまい、趾蹠皮膚炎のような二次的な病気を引き起こす可能性がある。

したがって、本発明のさらなる対象はまた、前述の本発明の菌株および／または組成物を含有する治療用組成物である。

したがって、本文脈における好ましい対象は、動物、好ましくは家禽類における壊死性腸炎、特に亜臨床的壊死性腸炎を治療および／または予防するための、前述の本発明の菌株および／または組成物を含有する治療用組成物である。したがって、本文脈におけるさらなる好ましい対象は、動物、好ましくは家禽類における、細菌性腸炎、壊疽性皮膚炎、胆管肝炎、クロストリジウム症、下痢および／または趾蹠皮膚炎を治療および／または予防するための、前述の本発明の菌株および／または組成物を含有する治療用組成物である。

したがって、本発明のさらなる対象はまた、家禽類における疾患、特に腸疾患、好ましくは壊死性腸炎、特に亜臨床的壊死性腸炎の治療および／または予防であって、本発明の菌株および／または組成物および／または調製物を、それを必要とする動物に投与する治療および／または予防である。したがって、本発明のさらなる対象はまた、細菌性腸炎、壊疽性皮膚炎、胆管肝炎、クロストリジウム症、下痢および／または趾蹠皮膚炎から選択される疾患、好ましくは家禽類の疾患の治療および／または予防であって、本発明の菌株および／または組成物および／または調製物を、それを必要とする動物に投与する治療および／または予防である。

本発明の菌株および／または調製物および／または組成物は、動物の生涯にわたって、または動物の生涯の特定の段階もしくは部分の間に、複数日にわたって飼料および／または飲用水において動物に投与することができる。例えば、本発明の菌株および／または組成物を、スターター期用食餌でのみ投与することも可能であるし、家畜の仕上げ期用食餌でのみ投与することも可能である。

本発明の特定の対象はまた、ヒトの健康を増進し、かつ／またはヒトの全身状態を改善し、かつ／またはヒトの疾患抵抗性を向上させ、かつ／またはヒトの免疫応答を増大させ、かつ／またはヒトにおいて健康な腸内細菌叢を確立もしくは維持する方法であって、本発明の菌株および／もしくは調製物または当該菌株を含有する本発明の組成物をヒトに投与する方法である。

したがって、本発明のさらなる対象は、ヒトの健康を増進し、かつ／またはヒトの全身状態を改善し、かつ／またはヒトの疾患抵抗性を向上させ、かつ／またはヒトの免疫応答を増大させ、かつ／またはヒトにおいて健康な腸内細菌叢を確立もしくは維持するための、本発明の菌株および／または調製物および／または組成物の使用であって、本発明の菌株および／もしくは調製物または当該菌株を含有する本発明の組成物をヒトに投与する使用である。

本発明の組成物、特に飼料、食品および医薬組成物ならびに飲用水または飼育用水は、好ましくは、本発明の菌株を含むとともに、約１×１０^３～約２×１０^１２ ＣＦＵ／ｇ 飼料またはｍｌ 水の比率で動物に投与され、特に約１×１０^３または約１×１０^４または約１×１０^５または約１×１０^６または約１×１０^７または約１×１０^８または約１×１０^９または約１×１０^１０または約１×１０^１１または約１×１０^１２ ＣＦＵ／ｇ 飼料またはｍｌ 水の比率で動物に投与され、好ましくは約１×１０^４～約１×１０^１０ ＣＦＵ／ｇ 飼料またはｍｌ 水の量で動物に投与され、より好ましくは１×１０^４～１×１０^７ ＣＦＵ／ｇ 飼料またはｍｌ 水の量で動物に投与される。

これに相応して、本発明の飼料、食品および水性組成物中の本発明の菌株および／または調製物の好ましい量は、好ましくは０．１重量％～１０重量％、より好ましくは０．２重量％～５重量％、特に０．３重量％～３重量％である。

本発明の方法を、あらゆる種類の動物に用いることができ、特にあらゆる種類の非ヒト動物および非昆虫動物に用いることができ、より好ましくは、哺乳類や水生動物や鳥類といったあらゆる種類の脊椎動物に使用することができる。

本発明の恩恵を受け得る動物としては、これらに限定されるものではないが例えば、家畜、ペット、外来動物、動物園の動物、水生動物、スポーツ、レクリエーションまたは作業に用いられる動物が挙げられる。

ペットは、好ましくは、イヌ類、ネコ類、家庭で飼育している鳥類および家庭で飼育している外来動物から選択される。水生動物は、好ましくは魚類および甲殻類であって、好ましくはヒトの栄養を意図したものから選択される。これらには、特にコイ、ティラピア、ナマズ、マグロ、サケ、マス、バラムンディ、鯛、パーチ、タラ、小エビ、ロブスター、カニ、大型のエビおよびクレイフィッシュが挙げられる。これに関連して好ましいサケの種類は、タイセイヨウサケ、ベニザケ、サクラマス、キングサーモン、ケタサーモン、ギンザケ、ドナウイトウ、タイヘイヨウサケおよびカラフトマスである。

さらに好ましい水生動物は、養殖魚であって、続いて処理されて魚粉または魚油が得られるものである。これに関連して、これらの魚は、好ましくは、ニシン、ポラック、メンヘーデン、アンチョビ、カペリンまたはタラである。

さらに好ましい一実施形態において、動物は、消費のために飼育される、または食料生産体としての家畜であり、例えば家禽類、ブタおよび反芻動物である。家禽類は、生産的家禽類または家庭で飼育している家禽類から選択することができるが、嗜好的な家禽類または猟鳥類からも選択することができる。

本文脈における好ましい生産的家禽類は、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒルおよびガチョウである。本文脈における生産的家畜は、好ましくは、若齢畜の生産に向けて最適化された家禽類または肉を有するように最適化された家禽類である。

好ましい嗜好的な家禽類または猟鳥類は、クジャク、キジ、ヤマウズラ、イワシャコ、ホロホロチョウ、ウズラ、キバシオオライチョウ、ライチョウ、ハトおよび白鳥であり、特にウズラが好ましい。

さらに好ましい家禽類は、平胸類の鳥類、特にダチョウおよびエミューならびにオウムである。

本発明による反芻動物は、好ましくはウシ、ヤギおよびヒツジから選択される。一実施形態において、本発明の組成物を離乳前の動物に給与することにより、当該動物の健康を増進させ、特に当該動物における下痢の発症率を減少させることができる。離乳前の動物とは、子牛を含む、出生時から約１２週齢までの範囲の反芻動物である。

本発明の組成物は、少なくとも１種の担体もしくは典型的な飼料成分またはそれらの組合せ物を含むことができる。

適切な担体は、回収性、効率もしくは物理的特性を改善するために、および／または包装および投与を補助するために添加される不活性配合成分である。このような担体を、個々に添加してもよいし組み合わせて添加してもよい。これらの担体は、固結防止剤、抗酸化剤、増量剤および／または保護剤から選択することができる。有用な担体の例には、多糖類（特にデンプン、マルトデキストリン、メチルセルロース、ガム、キトサンおよび／またはイヌリン）、タンパク質源（特に脱脂粉乳および／またはスイートホエー粉末）、ペプチド類、糖類（特にラクトース、トレハロース、スクロースおよび／またはデキストロース）、脂質類（特にレシチン、植物油および／または鉱油）、塩類（特に塩化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、チョーク、石灰石、炭酸マグネシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸マグネシウムおよび／またはクエン酸ナトリウム）およびシリケート（特にクレー、特にベオライトクレー、非晶質シリカ、ヒュームド／沈降シリカ、ゼオライト、フラー土、ベイリス、クリントポライト、モンモリロナイト、珪藻土、タルク、ベントナイトおよび／またはケイ酸塩、例えばケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウムおよび／またはケイ酸カルシウム）が挙げられる。動物用飼料の添加物に適した担体は、毎年発行されるＡｍｅｒｉｃａｎ Ｆｅｅｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｏｆｆｉｃｉａｌｓ， Ｉｎｃ．’ｓ Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎに記載されている。例えば、Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｆｅｅｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｏｆｆｉｃｉａｌｓ， Ｓｈａｒｏｎ Ｋｒｅｂｓ編集， ２００６年版， ＩＳＢＮ １－８７８３４１－１８－９参照。担体は、発酵ブロスを濃縮した後および／または乾燥中および／または乾燥後に添加することができる。本発明による好ましい担体は、炭酸カルシウム、珪藻土および植物油から選択される。

本発明の好ましい一実施形態は、濃縮組成物、特に飼料添加組成物、すなわち、本発明の少なくとも１種の菌株と前述の少なくとも１種の担体とを含有する飼料組成物の調製に適した組成物であり、ここで、少なくとも１種の菌株は、好ましくは０．１～１０重量％の量で含まれ、より好ましくは０．２～５重量％の量で含まれ、特に０．３～３重量％の量で含まれ、とりわけ０．４～２．２重量％の量で含まれ、少なくとも１種の担体は、好ましくは少なくとも９０重量％の量で含まれ、好ましくは９０～９９．９重量％の量で含まれ、より好ましくは９５～９９．８重量％の量で含まれ、特に９７～９９．７重量％の量で含まれ、とりわけ９７．８～９９．６重量％の量で含まれ、担体は、好ましくは、実質的に石灰石からなり、特に少量の珪藻土および／または植物油を含有する石灰石からなる。

安定化された菌株を含有する本発明のこれらの好ましい組成物を用いることにより、好ましくは本発明による菌株を本明細書で上述した量で含有する飼料および医薬組成物ならびに飲用水および飼育用水を調製することができる。好ましい一実施形態において、飼料、飲用水または飼育用水１トンあたり、こうした濃縮組成物を２００～１０００ｇ、特にこうした濃縮組成物を２５０ｇ、５００ｇまたは１０００ｇ使用することによって、動物への給与に使用することができる組成物が提供される。これらの濃縮組成物は、好ましくは、該濃縮組成物１ｇあたり、本発明の少なくとも１種の菌株を１×１０^９～２×１０^１１ ＣＦＵ、特に２×１０^９～１×１０^１１ ＣＦＵの量で含有する。

これらの濃縮組成物から出発して、濃縮組成物を典型的な飼料成分または食品成分と混合することによってそれぞれ飼料組成物および食品組成物を調製することができる。

本発明による組成物に含有させることができ、かつ／または本発明による濃縮組成物から出発する飼料組成物の調製に使用することができる適切かつ典型的な動物飼料成分には、以下のもののうち１つまたは複数が挙げられる：タンパク質類、炭水化物類、脂肪類、さらなるプロバイオティクス、プレバイオティクス、酵素類、ビタミン類、免疫調節剤、乳代替物、ミネラル類、アミノ酸類、抗コクシジウム剤、酸ベースの生成物および／または抗生物質などの医薬品。

本発明により使用することができる成分を含有する炭水化物類は、例えば、飼草、粗飼料、小麦全粒粉、ヒマワリ全粒粉または大豆粕およびそれらの混合物である。

本発明により使用することができる成分を含有するタンパク質類は、例えば、大豆タンパク質、エンドウタンパク、小麦グルテンまたはコーングルテンおよびそれらの混合物である。

本発明により使用することができる成分を含有する脂肪類は、特に動物性および植物性の双方の油であり、例えば、大豆油、菜種油、ヒマワリ油、アマニ油またはヤシ油といった植物油、魚油およびそれらの混合物である。

本発明により使用することができる、タンパク質類を含有しつつさらに脂肪類をも含有する成分は、例えば、魚粉、オキアミ粉末、二枚貝類粉末、イカ類粉末またはエビ殻およびそれらの組合せ物である。

本発明の菌株および調製物と組み合わせて本発明により使用することができるさらなるプロバイオティクス（ＤＦＭ）は、好ましくは、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ラテロスポーラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、バチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・アレヴィ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｅｖｉ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・バディウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｄｉｕｓ）、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｇｉｅｎｓｉｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）およびペジオコッカス・アシジラクティシー（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）の種から選択される細菌である。好ましい例は、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＤＳＭ ３２３１４（特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の規定に基づき２０１６年５月１２日付でＤＳＭＺに寄託）およびその誘導体、Ｋｅｍｉｎより商標ＣＬＯＳＴＡＴ（登録商標）として市販されているバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＰＢ６（米国特許第７，２４７，２９９号明細書（ＵＳ ７，２４７，２９９）に記載、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－６７３７にて寄託）、ＣａｌｐｉｓよりＣＡＬＳＰＯＲＩＮ（登録商標）として市販されているバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｃ－３１０２（米国特許第４，９１９，９３６号明細書（ＵＳ ４，９１９，９３６）に記載、発酵研究所（Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、産業技術総合研究所（Ａｇｅｎｃｙ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（日本）にＦＥＲＭ ＢＰ－１０９６として寄託）、Ｃｈｒ．Ｈａｎｓｅｎより商標ＧａｌｌｉＰｒｏ（登録商標）として市販されているバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＤＳＭ １７２９９、Ｃｈｒ．Ｈａｎｓｅｎより商標ＧａｌｌｉＰｒｏＴｅｃｔ（登録商標）として市販されている、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＤＳＭ １７２９９とバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＤＳＭ １７２３６との混合物、Ｃｈｒ．Ｈａｎｓｅｎより商標ＢＩＯＰＬＵＳ２Ｂ（登録商標）として市販されている、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）とバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）胞子との混合物、または米国特許第６，８４９，２５６号明細書（ＵＳ ６，８４９，２５６）に記載のバチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）菌株である。サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）またはハンセヌラ属菌（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）などの、バチルス属菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）以外のプロバイオティクスも、本発明の組成物に使用することができる。特に食品組成物においては、ヒトの健康に有用であることが知られているさらなるプロバイオティクス、例えば乳酸生成細菌、特に乳酸菌またはビフィズス菌を使用することができる。こうしたさらなるプロバイオティクスを本発明の組成物の一部として配合しない場合には、こうしたプロバイオティクスを、本発明の組成物と一緒に（同時にまたは異なる時点のいずれでも）投与することができる。

本発明により使用することができるプレバイオティクスは、好ましくはオリゴ糖類であり、特にガラクトオリゴ糖類、シリアルオリゴ糖類、ラクツロース、ラクトスクロース、フラクトオリゴ糖類、パラチノースまたはイソマルトースオリゴ糖、グリコシルスクロース、マルトオリゴ糖類、イソマルトオリゴ糖類、シクロデキストリン類、ゲンチオオリゴ糖類、大豆オリゴ糖類、キシロオリゴ糖類、デキストラン類、ペクチン類、ポリガラクツロナン、ラムノガラクツロナン、マンナン、ヘミセルロース、アラビノガラクタン、アラビナン、アラビノキシラン、難消化性デンプン、メビオース、キトサン、アガロース、イヌリン、タガトース、ポリデキストロースおよびアルギン酸塩から選択されるものである。

本発明による飼料組成物中で使用することができ、飼料の消化を助けることができる酵素は、好ましくは、フィターゼ（ＥＣ ３．１．３．８またはＥＣ ３．１．３．２６）、キシラナーゼ（ＥＣ ３．２．１．８）、ガラクタナーゼ（ＥＣ ３．２．１．８９）、ガラクトシダーゼ、特にα－ガラクトシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．２２）、プロテアーゼ（ＥＣ ３．４）、ホスホリパーゼ、特にホスホリパーゼＡ１（ＥＣ ３．１．１．３２）、ホスホリパーゼＡ２（ＥＣ ３．１．１．４）、ホスホリパーゼＣ（ＥＣ ３．１．４．３）およびホスホリパーゼＤ（ＥＣ ３．１．４．４）、リゾホスホリパーゼ（ＥＣ ３．１．１．５）、アミラーゼ、特にα－アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．１）；リゾチーム（ＥＣ ３．２．１．１７）、グルカナーゼ、特にβ－グルカナーゼ（ＥＣ ３．２．１．４またはＥＣ ３．２．１．６）、グルコアミラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼまたはそれらの任意の混合物から選択される。

市販のフィターゼの例には、Ｂｉｏ－Ｆｅｅｄ（登録商標）Ｐｈｙｔａｓｅ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、Ｒｏｎｏｚｙｍｅ（登録商標）ＰおよびＨｉＰｈｏｓ（登録商標）（ＤＳＭ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、Ｎａｔｕｐｈｏｓ（登録商標）（ＢＡＳＦ）、Ｆｉｎａｓｅ（登録商標）およびＱｕａｎｔｕｍ（登録商標）Ｂｌｕｅ（ＡＢ Ｅｎｚｙｍｅｓ）、Ｐｈｙｚｙｍｅ（登録商標）ＸＰ（Ｖｅｒｅｎｉｕｍ／ＤｕＰｏｎｔ）およびＡｘｔｒａ（登録商標）ＰＨＹ（ＤｕＰｏｎｔ）が挙げられる。他の好ましいフィターゼには、例えば国際公開第９８／２８４０８号（ＷＯ ９８／２８４０８）、国際公開第００／４３５０３号（ＷＯ ００／４３５０３）および国際公開第０３／０６６８４７号（ＷＯ ０３／０６６８４７）に記載されているものが挙げられる。

市販のキシラナーゼの例には、Ｒｏｎｏｚｙｍｅ（登録商標）ＷＸおよびＧ２（ＤＳＭ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、Ｅｃｏｎａｓｅ（登録商標）ＸＴおよびＢａｒｌｅｙ（ＡＢ Ｖｉｓｔａ）、Ｘｙｌａｔｈｉｎ（登録商標）（Ｖｅｒｅｎｉｕｍ）およびＡｘｔｒａ（登録商標）ＸＢ（キシラナーゼ／β－グルカナーゼ、ＤｕＰｏｎｔ）が挙げられる。市販のプロテアーゼの例には、Ｒｏｎｏｚｙｍｅ（登録商標）ＰｒｏＡｃｔ（ＤＳＭ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）が挙げられる。

本発明により使用することができるビタミン類は、例えば、ビタミンＡ、ビタミンＤ３、ビタミンＥ、ビタミンＫ、例えばビタミンＫ３、ビタミンＢ１２、ビオチン、コリン、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ナイアシン、葉酸およびパントテン酸塩、例えばＤ－パントテン酸カルシウムまたはそれらの組合せ物である。

使用することができる免疫調節剤は、例えば、抗体、サイトカイン、噴霧乾燥血漿、インターロイキンもしくはインターフェロンまたはそれらの組合せ物である。

本発明により使用することができるミネラル類は、例えば、ホウ素、コバルト、塩化物、クロム、銅、フッ化物、ヨウ素、鉄、マンガン、モリブデン、セレン、亜鉛、カルシウム、マグネシウム、カリウムもしくはナトリウムまたはそれらの組合せ物である。

本発明により使用することができるアミノ酸類は、例えば、リジン、アラニン、スレオニン、メチオニンもしくはトリプトファンまたはそれらの組合せ物である。

したがって、本発明のさらなる一実施形態は、動物飼料組成物の製造方法であって、本発明の少なくとも１種の菌株および／または少なくとも１種の調製物および／または少なくとも１種の濃縮組成物を、特に動物の健康増進に有効な量で、飼料成分、例えばタンパク質類、脂質類および／または炭水化物類、ならびに必要に応じてさらなる有益な物質、好ましくは前述の有益な物質と混合して飼料組成物を生成することを含む方法である。この方法は、例えばペレット化工程も含むことができる。

当業者に知られている標準的なペレット化法を用いることができ、これには例えば、乾燥飼料または半湿性飼料の押出加工が挙げられる。好ましいペレット化温度は、約６５℃～約１２０℃である。

本発明の菌株および組成物は、当技術分野で周知の方法にしたがって本発明の菌株を培養することによって得ることができ、これには、例えば米国特許第６，０６０，０５１号明細書（ＵＳ ６，０６０，０５１）、欧州特許出願公開第０２８７６９９号明細書（ＥＰ ０２８７６９９）または米国特許出願公開第２０１４／００１０７９２号明細書（ＵＳ ２０１４／００１０７９２）に記載の培地や他の方法を用いることが含まれる。従来の大規模な微生物培養プロセスには、液中発酵、固体発酵または液面培養が挙げられる。発酵の終了に向かって栄養素が枯渇するにつれて、菌株の細胞は増殖期から胞子形成期への移行を開始し、それによって、発酵の最終生成物の大部分が、胞子、代謝産物および残留発酵培地となる。胞子形成はこれらの菌株の自然の生活環の一部であり、一般には栄養素の制限に応じて細胞によって開始される。発酵は、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞の高レベルのコロニー形成単位が獲得できかつ胞子形成が促進されるように構成される。発酵により生じる培養培地内の細菌の細胞、胞子および代謝産物は、直接使用することも可能であるし、遠心分離法、接線流ろ過法、深層ろ過法および蒸発法などの従来の工業的方法によって濃縮させることも可能である。濃縮発酵ブロスを例えばダイアフィルトレーション法により洗浄することにより、残留発酵ブロスおよび代謝産物を除去することができる。

発酵ブロスまたはブロス濃縮物は、担体の添加の有無にかかわらず、噴霧乾燥法、凍結乾燥法、トレイ乾燥法、流動層乾燥法、ドラム乾燥法または蒸発法などの従来の乾燥プロセスまたは方法を用いて乾燥することができる。得られた乾燥生成物を、粉砕法や造粒法などによりさらに加工して、特定の粒子サイズまたは物理的形態を得ることができる。上記の担体は、乾燥後に添加することもできる。

本発明の菌株の調製物は、無細胞調製物であってもよいし、細胞破片を含有する調製物であってもよいし、無傷細胞と細胞破片との混合物を含有する調製物であってもよい。本発明の菌株の無細胞調製物は、例えば発酵ブロスの遠心分離および／またはろ過によって得ることができる。用いる技術に応じて、これらの無細胞調製物は、細胞を全く有していないわけではなく、少量の細胞を含んでいてもよい。細胞は、代謝産物、酵素および／またはペプチドのような化合物を周囲の培地に分泌するため、細胞の上清は、該細胞によって分泌された化合物、特に代謝産物、酵素および／またはペプチドの混合物を含有する。したがって、本発明の好ましい一実施形態において、菌株の調製物は、発酵ブロスの上清である。

菌株の細胞破片を含有する組成物は、当業者に知られている技術、例えば機械的手段または高圧の印加による細胞の破砕によって得ることができる。印加する力の程度に応じて、破砕された細胞のみを含有する組成物か、または細胞破片と無傷細胞との混合物を含有する組成物が得られる。細胞の均質化は、例えば、細胞フレンチプレス、ソニケーター、ホモジナイザー、マイクロフルイダイザー、ボールミル、ロッドミル、ペブルミル、ビーズミル、高圧粉砕ロール、垂直軸インパクター、工業用ブレンダー、高せん断ミキサー、パドルミキサーおよび／またはポリトロンホモジナイザーの利用によって実現可能である。好適な代替物は、細胞の酵素的および／または化学的処理である。

本発明の無細胞調製物には、まず前述の技術を適用して細胞を破砕し、続いて細胞破片および残りの無傷細胞を除去することによって得られる調製物も含まれる。細胞破片および残りの無傷細胞の除去は、特に遠心分離および／またはろ過によって行うことができる。

本発明の菌株の調製物は、活性化合物として、以下にさらに記載される少なくとも１種の代謝産物、好ましくは代謝産物の混合物、および／もしくは少なくとも１種の酵素であって、プロテアーゼ、特にサブチリシン、キシラナーゼおよび／もしくはセルラーゼから選択される酵素、および／もしくは少なくとも１種のペプチド、ならびに／またはそれらの組合せ物を含有することができる。

本発明の菌株に含まれかつ／または前述の細胞調製物に含まれる代謝産物の有効な混合物を含有する調製物は、例えば米国特許第６，０６０，０５１号明細書（ＵＳ ６，０６０，０５１）に記載の方法にしたがって得ることができる。特に、こうした調製物は、酢酸エチルのような有機溶媒を使用して前述の調製物に含まれる代謝産物を沈殿させ、次いでこの沈殿した代謝産物を適切な溶媒に再度溶解させることによって得ることができる。続いて、この代謝産物を、サイズ排除ろ過にて分子量カットオフに基づいて代謝産物を異なる画分に分類することによって精製することができる。

本発明の代謝産物の有効な混合物を含有する調製物は、好ましくは、本発明の菌株の代謝産物を少なくとも５種、より好ましくは少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種または少なくとも１２種含み、特に本発明の菌株の代謝産物をすべて含む。ＤＳＭ ３２３１５菌株の代謝産物の含量を、表５．１に示す。これらの代謝産物は、好ましくは４００～４０００ダルトン、より好ましくは５００～３５００ダルトンの分子量を有する。

好ましくは、本発明によれば、本発明の各実施形態において常に、本発明の菌株および／または調製物および／または組成物を有効量で使用する。「有効量」なる用語は、本発明の菌株および／または調製物および／または組成物を投与せずに同一の食餌（飼料および他の化合物を含む）を投与した動物と比較した場合に、特にすでに前述した特性に関して、動物および／または環境に対して有益な効果を少なくとも１つ奏する量を指す。

治療用途の場合には、好ましくは治療量の本発明の菌株および／または調製物および／または組成物が使用される。「治療量」なる用語は、動物の疾患状態を改善させ、一変させ、または予防するのに十分な量を指す。特に、組成物が（ｉ）様々な用量で腸内の病原性細菌を阻害または減少させ、（ｉｉ）有益な細菌のレベルを増加または維持し、かつ／または（ｉｉｉ）様々な用量で動物の健康を増進する能力を評価することにより、当業者は様々な動物について最適な投与量レベルを容易に決定することができる。

実施例
例１．胃腸管における生存に関連する菌株特性
動物の直接給与生菌剤／プロバイオティクスとして優れた菌株を得るために、様々な環境サンプルからバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株をスクリーニングした。この菌株は、標的動物の腸においてその完全な能力を発揮することを目的としているため、様々な環境や腸に関連する条件に耐えるものとなるように、この菌株について予めスクリーニングを行った。菌株の胞子を生成させ（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ ａｎｄ Ｓｅｔｌｏｗ １９９０）、これを洗浄し、８０℃で２０分間インキュベートし（低温殺菌処理）、次いでビールインフュージョンブロス寒天（ＶＩ、Ｄｉｆｃｏ（登録商標）、Ｎｏ．２３４４２０、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＧｍｂＨ、独国ハイデルベルク）を用いて滴定により対数で１ずつ減少させて１０個の希釈物を得た。増殖前に濃度が２番目に高い希釈物を－８０℃で保存し、これを、胞子状態以降のすべての評価の標準化出発点として用いた。胃の通過をシミュレートするために（Ａｒｇｅｎｚｉｏ ２００４ａ； Ｔｒａｍｐｅｌ ａｎｄ Ｄｕｋｅ ２００４）、Ｌａｒｓｅｎら（２０１４）に基づいて酸曝露の生存について評価した。栄養細胞の増殖について、さらに、低ｐＨで（これは、胃／前胃および砂嚢の条件下での増殖を示す）評価し、また、胃または砂嚢の通過直後での小腸の近位部での菌株の増殖を確認する（Ａｒｇｅｎｚｉｏ ２００４ｂ； Ｔｒａｍｐｅｌ ａｎｄ Ｄｕｋｅ ２００４）目的で、ｐＨ７で４ｍＭまでの胆汁（Ｂ８６３１、ＣＡＳ ８００８－６３－８、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）の存在下で評価した。２．５ｍＭのＫＮＯ_３（Ｇｌａｓｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９５）を補充したＶＩ培地内で嫌気性条件（ＡｎａｅｒｏＰａｋ（登録商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）下で標準化した胞子溶液を接種することにより、嫌気性腸内（Ａｒｇｅｎｚｉｏ ２００４ｂ； Ｔｒａｍｐｅｌ ａｎｄ Ｄｕｋｅ ２００４）での菌株の適性を評価した。さらに、１％スキムミルク粉末（７０１６６、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）または０．１％非水溶性ＡＺＣＬ－ＨＥセルロース（Ｉ－ＡＺＣＥＬ、Ｍｅｇａｚｙｍｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、アイルランド国ブレイ）を補充したＶＩ寒天プレートで、菌株の嫌気的なタンパク質分解性および細胞溶解活性を評価した。５％ＮａＣｌを添加したＶＩ寒天上での増殖を測定することにより、腸内でも見られる浸透圧ストレス（Ａｒｇｅｎｚｉｏ ２００４ｂ； Ｔｒａｍｐｅｌ ａｎｄ Ｄｕｋｅ ２００４）を評価した（ｄｅｎ Ｂｅｓｔｅｎ ｅｔ ａｌ．２００９）。最後に、胞子を９９℃に２０分間曝露し（Ｐａｌｏｐ ｅｔ ａｌ．１９９６）、続いてＶＩ寒天上に接種して胞子の熱安定性を評価することにより、ペレット化の安定性を測定した。

バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株ＤＳＭ ３２３１５は、模擬的な胃を通過して生存した。ＤＳＭ ３２３１５菌株の増殖は、ｐＨ６から出発して観察された。ＤＳＭ ３２３１５菌株は嫌気的に増殖し、嫌気性条件下で非水溶性セルロースおよびタンパク質を分解することができた。ＤＳＭ ３２３１５菌株は、２ｍＭおよび４ｍＭの胆汁の存在下でも、５％ＮａＣｌの存在下でも増殖することができた。ＤＳＭ ３２３１５菌株は、８．４２×１０^８ ＣＦＵ／ｍＬの平均胞子数に達し、ＤＳＭ ３２３１５菌株の胞子は、９９℃に２０分間曝露した後も生存可能であった。

参考文献：

例２．動物の栄養摂取のための従来の直接給与生菌剤（ＤＦＭ）／プロバイオティクスに対する菌株性能の比較 － 胆汁耐性の定量的評価
例１から選択されたバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株ＤＳＭ ３２３１５の競合性を評価するため、市販のバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株ＤＳＭ １７２９９およびＤＳＭ ５７５０を使用してベンチマーク解析を行った。実施した各試験によりどちらの菌株も同一であったため、本例および以下のすべての例におけるデータでは、ＤＳＭ １７２９９菌株を対照として用いた。胃を通過した直後の近位小腸において中性ｐＨでの胆汁の存在下で菌株が機能しうるか否かを（Ａｒｇｅｎｚｉｏ ２００４ｂ； Ｔｒａｍｐｅｌ ａｎｄ Ｄｕｋｅ ２００４）、２ｍＭの胆汁を添加したＶＩＢ培地での菌株増殖によって調べた。１００ｍＬの三角フラスコ内の５０ｕＬの候補菌株細胞懸濁液および１０ｍＬのＶＩＢを含む一晩培養物を３７℃および２００ｒｐｍでインキュベートし、次いで、一晩培養物約５０ｕＬを、２ｍＬの胆汁を含むｐＨ７の１ｍＬのＶＩＢを入れた１００ウェルハニカムプレート（Ｏｙ Ｇｒｏｗｔｈ Ｃｕｒｖｅｓ Ａｂ Ｌｔｄ、旧Ｔｈｅｒｍｏ Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ、フィンランド国ヘルシンキ）に移して、１ｍＬにつきＯＤ ０．２を得た。ＢｉｏＬｉｎｋソフトウェアパッケージを搭載したＢｉｏｓｃｒｅｅｅｎ Ｃ ＭＢＲ（Ｏｙ Ｇｒｏｗｔｈ Ｃｕｒｖｅｓ Ａｂ Ｌｔｄ）を用いて１５分ごとにＯＤを測定しながら、３７℃および２００ｒｐｍでの菌株の特定の増殖を４８時間観察した。曲線下面積（ＡＵＣ）を計算する前の各時点で、各培養物につき、胆汁のみを有するブロス（ブランク）の３つのブランクＯＤ読取値の平均値分を減じた。各菌株の定量的評価を、０～５時間の曲線下面積（ＡＵＣ５：ＯＤ×時間（ｈ））、０～１０時間の曲線下面積（ＡＵＣ１０：ＯＤ×時間（ｈ））および菌株がその最大光学濃度に達するまでの時間（Ｔ_ｍａｘ（ｈ））として比較して行った。ＭｉｎｉＴａｂ（登録商標）１６ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅの一方向ＡＮＯＶＡ手法（Ｍｉｎｉｔａｂ Ｉｎｃ．，米国ペンシルベニア州ステートカレッジ）を用いて統計的解析を行った。結果を、表２．１．に示す。

表２．１．バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株ＤＳＭ ３２３１５およびベンチマーク菌株ＤＳＭ １７２９９の、２ｍＭの胆汁の存在下での増殖

ＡＵＣ５とは、０時間の時点～５時間の時点の曲線下面積（光学濃度×ｈ）であり；ＡＵＣ１０とは、０時間の時点～１０時間の時点の曲線下面積（光学濃度×ｈ）であり；Ｔ_ｍａｘとは、最大光学濃度に達するまでの時間（ｈ）であり；ＳＥＭとは、プールした平均値の標準誤差であり；^Ａ、Ｂは、文字が一緒でないものは著しく相違することを意味する。

直接比較したところ、２ｍＭの胆汁の存在下で、ＤＳＭ ３２３１５菌株は、ベンチマークのバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株ＤＳＭ １７２９９よりも１０時間早くその最大ＯＤに達した。さらに、ＤＳＭ ３２３１５菌株は、ベンチマーク菌株ＤＳＭ １７２９９の増殖と比較して、この試験の最初の５時間で２．４倍、そしてこの試験の最初の１０時間で１．３倍、それぞれ速く増殖した。

参考文献：

例３．動物の栄養摂取のための従来の直接給与生菌剤（ＤＦＭ）／プロバイオティクスに対する菌株性能の比較 － 短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）の存在下での増殖
ＤＳＭ ３２３１５菌株の増殖とＤＳＭ １７２９９菌株の増殖との比較を、短鎖脂肪酸の存在下で評価した。短鎖脂肪酸は腸内で観察され、大腸に向かって重大性を増す（Ａｒｇｅｎｚｉｏ ２００４ｂ； Ｔｒａｍｐｅｌ ａｎｄ Ｄｕｋｅ ２００４）。例１に記載の標準化した胞子溶液を用いて試験を開始し、３７℃およびｐＨ６でＶＩ培地内での好気菌の増殖を試験し、読取パラメーターは、増殖対増殖なしであった。この試験のために、ＭｃＩｌｖａｉｎｅバッファー（Ｐａｌｏｐ ｅｔ ａｌ．１９９６）を用いてＶＩ培地をｐＨ６に調整し、次いで０．０５％酢酸（ＨＡ、５３７０２０、ＣＡＳ ６４－１９－７、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．０５％プロピオン酸（ＨＰ、Ｐ１３８６、ＣＡＳ ７９－０９－４、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）または０．２％乳酸（ＨＬ、Ｗ２６１１０６、ＣＡＳ ５０－２１－５、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充した。結果を、表３．１．に示す。

表３．１．短鎖脂肪酸の存在下でｐＨ６でのバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株ＤＳＭ ３２３１５およびベンチマーク菌株ＤＳＭ １７２９９の増殖の評価

バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株ＤＳＭ ３２３１５は、酢酸、プロピオン酸および乳酸の存在下でｐＨ６で増殖することができたが、ＤＳＭ １７２９９菌株は、これらの条件下で胞子期から増殖することができなかった。

参考文献：

例４．動物の栄養摂取のための従来の直接給与生菌剤（ＤＦＭ）／プロバイオティクスに対する菌株性能の比較 － 酵素活性の定量的評価
例２で行った試験と同様に、菌株ＤＳＭ ３２３１５およびＤＳＭ １７２９９を比較して、それぞれの炭水化物分解活性を評価した。セルラーゼ活性およびキシラナーゼ活性を、Ｌａｒｓｅｎら（２０１４）に記載のとおりに測定した。分析を、３回の独立した実験で行い、次いで溶液１マイクロリットルあたりのｍＵ数として平均をとり、ＭｉｎｉＴａｂ（登録商標）１６ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅの一方向ＡＮＯＶＡ手法（Ｍｉｎｉｔａｂ Ｉｎｃ．，米国ペンシルベニア州ステートカレッジ）を用いて統計的解析を行った。結果を、表４．１．に示す。

表４．１．ＤＳＭ ３２３１５菌株およびＤＳＭ １７２９９菌株のセルラーゼ活性およびキシラナーゼ活性

ＳＥＭとは、プールした平均値の標準誤差であり；Ａ、Ｂは、文字が一緒でないものは著しく相違することを意味する。

直接比較したところ、ＤＳＭ ３２３１５菌株は、ベンチマーク菌株ＤＳＭ １７２９９と比較して７．５倍の著しいセルラーゼ活性の増加を示すとともに、２．１倍の著しいキシラナーゼ活性の増加を示した。

参考文献：

例５．動物の栄養摂取のための従来の直接給与生菌剤（ＤＦＭ）／プロバイオティクスに対する菌株性能の比較 － 代謝産物の発現および病原菌の阻害
例２で行った試験と同様に、ＤＳＭ ３２３１５菌株とベンチマーク菌株ＤＳＭ １７２９９とを比較して、各培地における発現された代謝産物および阻害された病原菌のそれぞれの数を評価した。代謝産物発現分析のために、スターター培養物を増殖させ、Ｓｃｈｏｌｚら（２０１１）により記載されたとおりに試験を行った。１００ｍＬフラスコ内で３７℃、１６０ｒｐｍで２４時間増殖させた１０ｍＬのＬｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｍｉブロス（ＬＢ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）培養物から、１００ｕＬを主培養物に移した。主培養物を、０．２ｍＬ／Ｌ ＫｅｌｌｙＴ微量金属溶液（ＬＢＫｅｌｌｙ， Ｓｃｈｏｌｚ ｅｔ ａｌ．２０１１）を含有する１０ｍＬのＬＢ内で、または１０ｍＬのトリプチカーゼ大豆ブロス（Ｏｘｏｉｄ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に０．６％酵母抽出物を加えたもの（Ｙ１６２５、ＣＡＳ ８０１３－１－２、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；得られたブロスをＴＳＢＹＥと略記する）の中で、いずれも１００ｍＬフラスコ内で３７℃で１６０ｒｐｍで２４時間増殖させた。この主培養物のうち４ｍＬを、１５ｍＬの試験管内で２ｍＬのｎ－ブタノールと合し、３分間ボルテックス処理し、次いで１５分間超音波処理した。５０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行った後、有機相を移し、真空乾燥させ、これを、高速液体クロマトグラフィー － エレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＨＰＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．２００６）を用いて分析した。各サンプルを負モードと正モードの２つの異なるモードで測定し、質量スペクトルを得た。ＴｅｏおよびＴａｎ（２００５）に同様に報告されたとおりに得られたピークを、分子量（Ｄａ）に換算した。比較の結果を、表５．１．に示す。

さらに、表５．１．の代謝産物の一部ではあるが詳細には調査されていないバチルス・サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）によるバクテリオシンの産生によるクロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）の阻害について、ウェル拡散拮抗試験（Ｐａｒｅｎｔｅ ｅｔ ａｌ．１９９５）により評価した。病原性クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）の４種の候補について試験した。これらの候補は、ＴｅｏおよびＴａｎ（２００５）によるクロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）のＡＴＣＣ １３１２４型菌株、ならびに家禽類およびブタ由来の３種の病原性クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）野生分離株（ライプチヒ大学獣医学部バクテリオロジー・ミクロロジー学科教授Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈ Ｂａｕｍｓ博士、独国ポツダムにより取得）であった。ライプチヒより取得したクロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）のＡ型菌株には、次のように記載されている：菌株２３００－１－１７および２３００－１－１８は、壊死性腸炎陽性ニワトリの消化管から単離したものである。どちらの菌株もα毒素を産生し、菌株２３００－１－１７はさらにＮｅｔＢ毒素も発現する（Ｓａｖｖａ ｅｔ ａｌ．２０１３；Ｕｚａｌ ｅｔ ａｌ．２０１４）のに対して、試験した２３００－１－１８菌株はβ２毒素について陽性であった（Ａｌｌａａｒｔ ｅｔ ａｌ．２０１２）。２３００－１－１９菌株を、クロストリジウムＡ型腸炎の症状を示す下痢をした子ブタの消化管から単離した（Ｓｏｎｇｅｒ ａｎｄ Ｕｚａｌ ２００５）。増殖条件および培地は、ＴｅｏおよびＴａｎ（２００５）によって記載されている。簡潔に述べると、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌株を、５％ＣＯ_２雰囲気中で１００ｍＬフラスコ内で３７℃および１６０ｒｐｍで、１０ｍＬのＴＳＢＹＥおよびＬＢＫｅｌｌｙスターター培養物中でそれぞれ２４時間増殖させた。クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）スターター培養物を、１００ｍＬフラスコ内で３７℃および１６０ｒｐｍで、液状のチオグリコレートブロス（ＦＴＢ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）内で嫌気的に（ＡｎａｅｒｏＰａｋ（登録商標）， Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）２４時間培養し、次いで滅菌綿棒を用いて寒天プレート（１％寒天を含有するＴＳＢＹＥ、略してＴＳＡＹＥ）上に広げた。接種したＴＳＡＹＥプレートを、次いで３７℃で嫌気的に一晩インキュベートして、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）の菌叢を得た。一晩増殖させた後、直径９ｍｍの３つのウェルを菌叢入りの寒天に切断し、ここで、１番目のウェルを、培養物を含まない非接種対照として使用し、２番目のウェルに、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）を阻害しないバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌株（バチルス・セレウス変種トヨイ（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ ｖａｒ．ｔｏｙｏｉ、ＮＣＩＭＢ ４０１１２））１００ｕＬを接種し、３番目のウェルに、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＤＳＭ ３２３１５またはＤＳＭ １７２９９スターター培養物１００ｕＬを接種した。３７℃で２４時間インキュベーションした後、切断したウェルの縁部からクリアランスされた菌叢の境界部までを測定してクリアランスゾーンをｍｍで求め、各コロニーを２回（水平方向、垂直方向で）測定し、次いで平均をとった。各バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の拮抗試験および培地について、２回のプレート操作で分析を行った。ＭｉｎｉＴａｂ（登録商標）１６ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅの一方向ＡＮＯＶＡ手法（Ｍｉｎｉｔａｂ Ｉｎｃ．，米国ペンシルベニア州ステートカレッジ）を用いて統計的解析を行った。病原菌阻害（ＬＢＫｅｌｌｙで増殖させた菌株）についての結果を表５．２．に示し、病原菌阻害（ＴＳＢＹＥで増殖させた菌株）についての結果を表５．３．に示す。

表５．２．バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＤＳＭ ３２３１５およびＤＳＭ １７２９９による病原性クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）の阻害能力を比較したウェル拡散拮抗アッセイ（ＬＢＫｅｌｌｙで増殖させた菌株）。値は、病原菌のクリアランス（ｍｍ）である。

ＳＥＭとは、プールした平均値の標準誤差であり；^Ａ、Ｂは、文字が一緒でないものは著しく相違することを意味する。

表５．３．バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＤＳＭ ３２３１５およびＤＳＭ １７２９９による病原性クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）の阻害能力を比較したウェル拡散拮抗アッセイ（ＴＳＢＹＥで増殖させた菌株）。値は、病原菌のクリアランス（ｍｍ）である。

ＳＥＭとは、プールした平均値の標準誤差であり；^Ａ、Ｂは、文字が一緒でないものは著しく相違することを意味する。

参考文献：

例６．インドで飼育し、新規なバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、競合的バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）生成物または成長促進抗生物質を給与したブロイラーの性能の比較
使用済みの敷料を敷いたフロアペンに入れた、孵化させた１日齢のＶｅｎｃｏｂｂ ４００（Ｖｅｎｋａｔｅｓｈｗａｒａ Ｈａｔｃｈｅｒｉｅｓ Ｐｖｔ．Ｌｔｄ，インド）の雛を用いて、ブロイラーの生育性能試験を行った。４種の食餌処置物を無作為に割り当て、ペン１つあたり２５羽を入れた状態で１つの処置物につき反復的な１２個のペンを用いた。鳥には、スターター期（１日目～１４日目）、育成期（１５日目～２８日目）および仕上げ期（２９日目～４２日目）からなる３つの時期に、これらの食餌処置物のうちの１つを給与した。基礎食餌は主に、コクシジウム症を抑制する目的でジノトルミド５００ｇ／ＭＴを含有するトウモロコシ・大豆粕（表６．１．）をベースとしていた。この基礎食餌はさらに、追加の試みとして４％の肉骨粉（ＭＢＭ）を含有していた。なぜならば、ＭＢＭは、ブロイラーのニワトリにおいてクロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）により引き起こされる壊死性腸炎の発症の素因となるためである（Ｍ’Ｓａｄｅｑａ ｅｔ ａｌ．２０１５）。これら４種の処置物は主にトウモロコシ・大豆粕をベースとしており（表６．１．）、次のものを含有していた：１．基礎対照（対照）、２．対照＋バシトラシンメチレンジサリチレート５０ｇ／ＭＴ 飼料（ＢＭＤ）、３．対照＋バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株を含有する競合的生成物５００ｇ／ＭＴ 飼料で、１．６×１０^９ ｃｆｕ／ｇを含むもの（ＤＳＭ １７２９９）、４．対照＋バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株ＤＳＭ ３２３１５ ２５０ｇ／ＭＴで、２．０×１０^９ ｃｆｕ／ｇを含むもの（ＤＳＭ ３２３１５）。実験用処置物を、１～４２日齢でマッシュ形態で自由に給与した。一方向ＡＮＯＶＡ手法およびＳＡＳ ｖｓ９．４を用いたＬＳＤ事後試験解析により統計的解析を行った（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．，米国）。体重、飼料要求率および死亡率に対するこれら各処置物の結果を、表６．２．に報告する。

表６．１．基礎食餌の成分および栄養素組成

表６．２．バチルス・サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）をベースとする飼料添加物または成長促進抗生物質を含有する食餌補助物を用いた場合および用いない場合の、０日目～４２日目の動物性能

ＢＷとは、指定された期間における鳥の平均体重であり；ＦＣＲとは、指定された期間内に体重を増加させるための飼料として算出した飼料要求率であり；対照とは、基礎食餌中に添加物を含まないものを指し；ＢＭＤとは、バシトラシンメチレンジサリチレートを基礎食餌に添加した処置物であり；ＤＳＭ １７２９９とは、基礎食餌にＤＳＭ １７２９９を添加した処置物であり；ＤＳＭ ３２３１５とは、ＤＳＭ ３２３１５菌株を基礎食餌に添加した処置物であり；差とは、ＤＳＭ ３２３１５を対照と比較した場合の数値差であり；相対％とは、ＤＳＭ ３２３１５と対照との差を、対照からの変化分として％で示したものである。

１日目～２１日目のスターター期および育成期において、ＤＳＭ ３２３１５によって、ブロイラーのＦＣＲが対照と比較して０．７％改善された。ブロイラーにＤＳＭ ３２３１５を給与した場合、対照と比較して２１日目の体重も２．１％改善した。これらの改善は、非常に強力な成長促進抗生物質であるＢＭＤを利用した場合に観察されたほどではなかったものの、ＤＳＭ ３２３１５によって、この期間中のブロイラー性能がＤＳＭ １７２９９よりも大幅に改善された。

ブロイラーの全生育期間を通じて、ＤＳＭ ３２３１５によって、体重および飼料要求率のいずれもそれぞれ１．４％および－１．７％改善することができた。これらの改善は、またも、競合的生成物であるＤＳＭ １７２９９を使用した場合に観察された改善よりも大きかった。４２日目の体重については、依然として、成長促進抗生物質群であるＢＭＤの場合の方が良好ではあったが、ＤＳＭ ３２３１５処置物によって、ＢＭＤを補充した処置物群と比較してＦＣＲをさらに０．０１（０．６％）減少させることができた。

全体として、これらの結果は、ＤＳＭ ３２３１５を補充した鳥は、対照またはＤＳＭ １７２９９を給与した鳥よりも性能が良好であるとともに、少なくともいくつかのパラメーターでは、非常に有効な成長促進抗生物質と同様に機能し得たことを示唆している。

参考文献

例７：タイで飼育し、新規なバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、競合的バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）生成物または成長促進抗生物質を給与したブロイラーの性能比較
使用済みの敷料を敷いたフロアペンに入れた１日齢の雄のＲｏｓｓ ３０８（Ａｖｉａｇｅｎ Ａｓｉａ、タイ）の雛を用いて、ブロイラーの生育性能試験を行った。食餌処置物が４種あり、ペン１つあたり１２羽で１つの処置物につき反復的な１６個のペンを用いた。鳥に、スターター期（１日目～１４日目）、育成期（１５日目～２８日目）および仕上げ期（２９日目～４２日目）からなる３つの時期に、これらの食餌処置物のうちの１つを給与した。基礎食餌は主に、コクシジウム症を抑制する目的でサリノマイシン６０ｇ／ＭＴ 飼料を含有するトウモロコシ・大豆粕（表７．１）をベースとしていた。また、ＤＤＧＳ（ｄｒｉｅｄ ｄｉｓｔｉｌｌｅｒ’ｓ ｇｒａｉｎｓ ｗｉｔｈ ｓｏｌｕｂｌｅｓ、可溶性物質添加乾燥蒸留穀物残渣）を特にスターター期用食餌に添加するとブロイラーの生育率が低下する場合があり（Ｌｕｍｐｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．２００４）、これはブロイラーのニワトリにおいてクロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）によって引き起こされる壊死性腸炎の発症の素因であることから（Ｍａｃｋｌｉｎ ｅｔ ａｌ．２０１１）、基礎食餌はまた、トウモロコシのＤＤＧＳを５％含有していた。これら４種の食餌処置物は、次のものを含有していた：１．基礎対照（対照）、２．対照＋亜鉛バシトラシン２０ｇ／ＭＴ 飼料（ＺｎＢ）、３．対照＋バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株を含有する競合的生成物５００ｇ／ＭＴ 飼料で、１．６×１０^９ ｃｆｕ／ｇを含むもの（ＤＳＭ １７２９９）、４．対照＋バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株ＤＳＭ ３２３１５ ２５０ｇ／ＭＴで、２．０×１０^９ ｃｆｕ／ｇを含むもの（ＤＳＭ ３２３１５）。基礎食餌。一方向ＡＮＯＶＡ手法およびＳＡＳ ｖｓ９．４を用いたＬＳＤ事後試験解析により統計的解析を行った（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．，米国）。０日目～４２日目の動物生育性能を、表７．２．に示す。

表７．１．基礎食餌の成分および栄養素組成

表７．２．バチルス・サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）をベースとする飼料添加物もしくは成長促進抗生物質を含有する食餌補助物を用いた場合および用いない場合の、０日目～４２日目の動物性能

ＢＷとは、指定された期間における鳥の平均体重であり；ＦＣＲとは、指定された期間内に体重を増加させるための飼料として算出した飼料要求率であって、死亡率に関して調整したものであり；対照とは、基礎食餌中に添加物を含まないものを指し；ＺｎＢとは、亜鉛バシトラシンを添加した処置物であり；ＤＳＭ １７２９９とは、基礎飼料にＤＳＭ １７２９９を添加した処置物であり；ＤＳＭ ３２３１５とは、基礎飼料にＤＳＭ ３２３１５菌株を添加した処置物であり；差とは、ＤＳＭ ３２３１５を対照と比較した際に認められる数値差であり；相対％とは、ＤＳＭ ３２３１５と対照との差を、対照からの変化分として％で示したものである。

１日目～４２日目の全生育期間を通じて、ＤＳＭ ３２３１５での処置によって、ＦＣＲを２．７％低下させることができた。この効果は、他の処置群であるＢＭＤおよびＤＳＭ １７２９９、ＤＳＭ ３２３１５処置物でも観察されたが、これに加えてさらに、ＤＳＭ ３２３１５での処置によって、対照から６．９％増加した非常に重い最終体重が得られた。さらに、ＤＳＭ ３２３１５によって、鳥の死亡率を、未処置対照と比較して２．２５％、そしてＤＳＭ １７２９９と比較して０．６４％減少させることができた。

これらの結果は、いずれの処置物によっても全期間にわたって飼料要求率を改善することができたが、ＤＳＭ ３２３１５を補充することにより、鳥の最終体重が非常に重くなるとともに、死亡率が顕著に減少したことを示している。

参考文献

例８．壊死性腸炎誘発の攻撃を受けた際の、新規なバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を食餌に包含させた場合および包含させない場合のブロイラーの性能比較
フロアペンに入れた１日齢の雄のＲｏｓｓ ３０８（Ａｖｉａｇｅｎ）の雛を用いて、壊死性腸炎の攻撃試験を行った。３種の食餌処置物を無作為に割り当て、ペン１つあたり１４羽を入れた状態で１つの処置物につき反復的な１１個のペンを用いた。鳥に、スターター期（１日目～１１日目）、育成期（１２日目～２５日目）および仕上げ期（２６日目～３５日目）からなる３つの時期に、これらの食餌処置物のうちの１つを給与した。基礎食餌は主に、トウモロコシ・大豆粕をベースとしていた（表８．１）。スターター期用食餌は、２ｍｍの破砕ペレットとして調製し、育成期用および仕上げ期用の食餌は、４ｍｍのペレットとして調製した。これら３種の処置物は、次のものを含有していた：１．基礎対照（対照）、２．陽性対照＋ナラシン抗コクシジウム剤（Ｍｏｎｔｅｂａｎ（登録商標）Ｇ１００， Ｅｌａｎｃｏ、米国）６５０ｇ／ＭＴ 飼料（ナラシン）、３．対照＋バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株ＤＳＭ ３２３１５ ２５０ｇ／ＭＴで、２．０×１０^９ ｃｆｕ／ｇを含むもの（ＤＳＭ ３２３１５）。実験的処置物を、１日齢～３５日齢で自由に給与させた。

壊死性腸炎とは、通常は３～４週齢のブロイラーにおいて発生する相乗的なクロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）の感染とともに素因となるアイメリア属（Ｅｉｍｅｒｉａ）の感染により引き起こされるニワトリの疾患の１つである（Ｔｉｍｂｅｒｍｏｎｔ ｅｔ ａｌ． ２０１１）。壊死性腸炎の攻撃を、２つの部分にわけて誘発させた。１２日齢で各鳥にアイメリア・マキシマ（Ｅ．ｍａｘｉｍａ）の卵母細胞５０００個を経口接種し、１６日齢で各鳥に、壊死性腸炎に罹患したブロイラーの雛の回腸内容物から初めに単離しておいたクロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）野外株の一晩培養物３００μｌを与えた。体重、飼料要求率および死亡率についての各処置物の結果を、表８．２に報告する。疾患攻撃の誘発に関連しない雛の品質による早期の鳥の損失を制御するために、１１日目～３５日目に死亡率を報告する。趾蹠の皮膚炎は敷料が濡れていることと関連があり（Ｔａｉｒａ ｅｔ ａｌ．２０１４）、また敷料の濡れは、壊死性腸炎のような腸の健康問題により生じることがあるため（Ｔｉｍｂｅｒｍｏｎｔ ｅｔ ａｌ．２０１１）、趾蹠の病変の評点も求めた。Ｗｅｌｆａｒｅ Ｑｕａｌｉｔｙ ２００９（Ｒｕｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１１）に基づき、足皮膚炎（例えば趾蹠の疾患）について、サンプリングした鳥から、０（足皮膚炎の証拠が示されない）から４（重度の足皮膚炎）までの評点で採点を行った。趾蹠の病変の評点に対する各処置物の結果を、表８．３に報告する。１１日目、１８日目および３５日目の回腸および盲腸の消化物サンプルにおいて、特定の細菌群（バチルス属種菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）およびクロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ））を計数した。消化物サンプルから抽出したＤＮＡを、目的の種の菌に特異的なプライマーを用いた定量的ＰＣＲに使用した。１１日目、１８日目および３５日目の細菌群（バチルス属種菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）およびクロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ））の分子計数に対する各処置物の結果を、それぞれ表８．４、表８．５および表８．６に報告する。

表８．１ 基礎食餌の成分および栄養素組成

ｄは、日数であり；ＣＰは、粗タンパク質であり；ＭＥは、代謝可能なエネルギーであり；ｋｃａｌは、キロカロリーであり；ｋｇは、キログラムである。

表８．２．バチルス・サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）をベースとする飼料添加物またはナラシンを含有する食餌補助物を用いた場合および用いない場合の、０日目～３５日目の動物性能

ＢＷとは、鳥の平均体重であり；ＦＣＲとは、指定された期間内に体重を増加させるための飼料として算出した飼料要求率であり；ａＦＣＲとは、指定された期間内に体重を増加させるための飼料として算出した飼料要求率であって、死亡率に関して調整したものであり；死亡率とは、ペン内の個体群の１１日目～３５日目の死亡率を％で示したものであり；対照とは、基礎食餌中に添加物を含まないものを指し；ナラシンとは、基礎食餌にナラシン抗コクシジウム剤を添加した処置物であり；ＤＳＭ ３２３１５とは、基礎飼料に新規なバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株ＤＳＭ ３２３１５を添加した処置物であり；差とは、ＤＳＭ ３２３１５を対照と比較した際に認められる数値差であり；相対％とは、ＤＳＭ ３２３１５と対照との差を、対照からの変化分として％で示したものである。

表８．３．バチルス・サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）をベースとする飼料添加物またはナラシンを含有する食餌補助物を用いた場合および用いない場合の趾蹠の病変の評点

対照とは、基礎食餌中に添加物を含まないものを指し；ナラシンとは、基礎食餌にナラシン抗コクシジウム剤を添加した処置物であり；ＤＳＭ ３２３１５とは、基礎飼料に新規なバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株ＤＳＭ ３２３１５を添加した処置物であり；差とは、ＤＳＭ ３２３１５を対照と比較した際に認められる数値差であり；相対％とは、ＤＳＭ ３２３１５と対照との差を、対照からの変化分として％で示したものである。

表８．４．バチルス・サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）をベースとする飼料添加物またはナラシンを含有する食餌補助物を用いた場合および用いない場合の、１１日齢のブロイラーの回腸および盲腸におけるバチルス種菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）およびクロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）の分子計数

対照とは、基礎食餌中に添加物を含まないものを指し；ナラシンとは、基礎食餌にナラシン抗コクシジウム剤を添加した処置物であり；ＤＳＭ ３２３１５とは、基礎飼料に新規なバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株ＤＳＭ ３２３１５を添加した処置物であり；差とは、ＤＳＭ ３２３１５を対照と比較した際に認められる数値差である。

表８．５．バチルス・サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）をベースとする飼料添加物またはナラシンを含有する食餌補助物を用いた場合および用いない場合の、１８日齢のブロイラーの回腸および盲腸におけるバチルス種菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）およびクロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）の分子計数

対照とは、基礎食餌中に添加物を含まないものを指し；ナラシンとは、基礎食餌にナラシン抗コクシジウム剤を添加した処置物であり；ＤＳＭ ３２３１５とは、基礎飼料に新規なバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株ＤＳＭ ３２３１５を添加した処置物であり；差とは、ＤＳＭ ３２３１５を対照と比較した際に認められる数値差である。

表８．６．バチルス・サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）をベースとする飼料添加物またはナラシンを含有する食餌補助物を用いた場合および用いない場合の、３５日齢のブロイラーの回腸および盲腸におけるバチルス種菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）およびクロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）の分子計数

対照とは、基礎食餌中に添加物を含まないものを指し；ナラシンとは、基礎食餌にナラシン抗コクシジウム剤を添加した処置物であり；ＤＳＭ ３２３１５とは、基礎飼料に新規なバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株ＤＳＭ ３２３１５を添加した処置物であり；差とは、ＤＳＭ ３２３１５を対照と比較した際に認められる数値差である。

本実験は、壊死性腸炎という健康上の問題を抱えるブロイラーの性能に対するプロバイオティック菌株ＤＳＭ ３２３１５の有益な効果を裏付ける証拠を提供するものである。ＤＳＭ ３２３１５を給与したブロイラーについては、体重が増加するとともに、飼料要求率および死亡率に関して補正した飼料要求率が基礎対照と比較して減少した。プロバイオティクス菌株についてのこうした結果は、このモデルにおける壊死性腸炎の発症を予防する抗コクシジウム性添加物であるナラシンの陽性対照の結果と同様であった。ＤＳＭ ３２３１５菌株を含有する食餌を給与したブロイラーでは、壊死性腸炎を伴う趾蹠の病変も、基礎食餌対照と比較して減少した。これは、敷料中の水分および病原菌の減少が要因であった可能性があるが、本実験ではこれについて試験を行わなかった。

１１日目、１８日目および３５日目に、鳥の回腸および盲腸のいずれにも細菌集団が計数された。バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＤＳＭ ３２３１５菌株を含有する食餌を給与した処置群では、すべての時点で双方の組織部位から一貫してより多くのバチルス属菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）が計数された。対照と比較してナラシン処置群ではバチルス属菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）において若干の変化が観察されたが、これらの検出事項は非常にわずかであり、またＤＳＭ ３２３１５処置群について観察されたようにすべての組織およびすべての時点にわたって一貫しているわけではなかった。

壊死性腸炎の原因物質であるクロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）をカウントしたところ、ＤＳＭ ３２３１５処置群は、対照群と比較してこれらの病原菌数の減少を一貫して示した。これは、壊死性腸炎の発症を防ぐために飼料にナラシンを添加した陽性対照群と同様であった。

本試験により得られたデータは、壊死性腸炎の発症を抑制し、性能低下、死亡または屠殺時の趾蹠の病変の宣告によるその後の損失を防ぐＤＳＭ ３２３１５の能力に関する明確な証拠を提供する。

参考文献：

例９．飼料ペレット製造および飼料貯蔵に対する菌株の耐性の評価
飼料ペレット化プロセスに対するバチルス・サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＤＳＭ ３２３１５の胞子の耐性を試験するために、ブロイラー育成期用食餌（表９．１）に胞子を加え、次いでこれを８５℃でペレット化した。ペレット化する前に、混合飼料のうち反復的な１０個の試験サンプルを取り出して、胞子をカウントした。次いで、飼料を８５℃でペレット化し、さらに反復的な５つのサンプルを得た。ペレット化前後のサンプルから生存可能な胞子を希釈系列で培養し、カウントし、各飼料濃度で算出した。胞子カウント数の結果を、表９．２に示す。

表９．１．ペレット耐性評価に使用したブロイラー用食餌の成分

表９．２ ペレット化前後の飼料における胞子カウント数

胞子回収％とは、ペレット化前にカウントした胞子に対する胞子のカウント数を算出して％で示したものである。

ペレット化後の胞子カウント数は、ペレット化前飼料から期待される３０％の範囲内にとどまっていた。これは、ペレット化プロセス中にバチルス・サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＤＳＭ ３２３１５の胞子が大幅な損失を示さないことを意味している。

バチルス・サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＤＳＭ ３２３１５の胞子の経時的安定性を試験するために、表９．１．で前記したものと同一の配合のブロイラー育成期用食餌に胞子を加えた。この飼料を８５℃でペレット化し、この食餌の反復的な３つの試験体を、４０℃、湿度８５％の空調室内で貯蔵した。ペレット化後（貯蔵０週目）、ならびに２週間、４週間、８週間および１２週間貯蔵した後に胞子をカウントした。胞子計数の結果を、表９．３に示す。

表９．３ 空調室内での貯蔵後のペレット化飼料におけるＤＳＭ ３２３１５の胞子の回収率

胞子回収％とは、ペレット化直後の貯蔵０週目にカウントした胞子に対する胞子のカウント数を算出して％で示したものである。

ペレット化飼料中の胞子カウント数は経時的に変動したが、ペレット化直後に得られた胞子カウント数から期待される３０％の範囲内にとどまっていた。したがって、１２週間の貯蔵期間中にバチルス・サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＤＳＭ ３２３１５の胞子の大幅な損失は観察されなかったと結論づけることができる。

例１０：様々な病原菌株に対するウェル拡散拮抗試験
３種の異なる病原菌であるエンテロコッカス・セコルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃｅｃｏｒｕｍ）ＤＳＭ ２０６８３、ストレプトコッカス・ガリナセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｃｅｕｓ）ＤＳＭ １５３４９およびストレプトコッカス・スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ）ＡＴＣＣ ４３７６５を用いて、ウェル拡散拮抗試験を行った。

エンテロコッカス・セコルム（Ｅ．ｃｅｃｏｒｕｍ）は、ブロイラーにおいて跛行、関節炎および骨髄炎を引き起こすことが知られており、これらは、通常、関節および／または骨組織の炎症によって引き起こされる。さらにエンテロコッカス・セコルム（Ｅ．ｃｅｃｏｒｕｍ）は、心膜の炎症を引き起こす可能性がある［Ｋｅｎｓｅ ｅｔ ａｌ．２０１１］。ＤＳＭ ２０６８３を、ニワトリの盲腸から単離した。

ストレプトコッカス・ガリナセウス（Ｓ．ｇａｌｌｉｎａｃｅｕｓ）は、家禽類において敗血症を引き起こす可能性がある。肉眼的病変には、脾腫、肝腫、腎肥大症および鬱血が含まれていた。弁膜心内膜炎を招く肝臓および脾臓の壊死および／または梗塞の複数の領域も観察された［Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．２００２］。

ストレプトコッカス・スイス（Ｓ．ｓｕｉｓ）は、ブタにおける重大な病原菌であり、離乳後の子ブタにおける細菌致死の最も重大な要因の１つであり、敗血症、髄膜炎およびその他の多くの感染症を引き起こす［Ｇｏｙｅｔｔｅ－Ｄｅｓｊａｒｄｉｎｓ ｅｔ ａｌ．２０１４］。ＡＴＣＣ ４３７６５は、血清学的群Ｒ；血清型２に属し、ブタから単離されたものである。

バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌株を、１００ｍＬの振とうフラスコ内で、３７℃、２００ｒｐｍで１６時間にわたり、ＴＳＢＹＥ（３０ｇ／ｌ ＴＳＢ＋６ｇ／ｌ 酵母抽出物）またはＬＢ－Ｋｅｌｌｙ（ＤＳＭＺ培地１０３２の微量元素溶液を補充したＬＢ培地）内で増殖させた。これらの病原性菌株を、５９５ｎｍの光学濃度が少なくとも１となるまで適切な条件下で液体培養物として増殖させ、次いで１００μｌを滅菌スパチュラで寒天プレートの表面上に広げた。ストレプトコッカス・ガリナセウス（Ｓ．ｇａｌｌｉｎａｃｅｕｓ）についてはＢＨＩ寒天プレートを使用し、エンテロコッカス・セコルム（Ｅ．ｃｅｃｏｒｕｍ）およびストレプトコッカス・スイス（Ｓ．ｓｕｉｓ）についてはＴＳＢＹＥ寒天プレートを使用する。直径９ｍｍの３つのウェルを、乾燥したプレートに切断した。１番目のウェルを、培養しない非接種培地対照として使用し、２番目のウェルに、非阻害性バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌株（バチルス・セレウス変種トヨイ（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ ｖａｒ．ｔｏｙｏｉ、ＮＣＩＭＢ ４０１１２）１００ｕＬを接種し、３番目のウェルに、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＤＳＭ ３２３１５またはＤＳＭ １７２９９の培養物１００ｕＬを接種した。適切な条件下で３７℃で２４時間インキュベーションした後、切断したウェルの縁部からクリアランスされた菌叢の境界部までを測定してクリアランスゾーンをｍｍで求めた。各コロニーを２回（水平方向、垂直方向で）測定し、次いで平均をとった。結果を表１０．１に示す。

表１０．１：ウェル拡散拮抗アッセイにおける、病原性菌株に対するバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＤＳＭ ３２３１５の阻害能力と、病原性菌株に対するバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＤＳＭ １７２９９の阻害能力との比較。値は、病原菌のクリアランス（ｍｍ）である。

このデータは、ＤＳＭ ３２３１５が、特にＤＳＭ １７２９９と比較して、エンテロコッカス・セコルム（Ｅ．ｃｅｃｏｒｕｍ）、ストレプトコッカス・ガリナセウス（Ｓ．ｇａｌｌｉｎａｃｅｕｓ）、ストレプトコッカス・スイス（Ｓ．ｓｕｉｓ）の増殖を非常に効果的に阻害できることを示す。

参考文献：

Claims (18)

1. 以下の群から選択されるバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株、その変異体またはその調製物：
   ａ） ＤＳＭＺにＤＳＭ ３２３１５で寄託されたバチルス・サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株；
   ｂ） ＤＳＭ ３２３１５で寄託されたバチルス・サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株の変異体であって、ＤＳＭ ３２３１５菌株の１６Ｓ ｒＤＮＡ、ｙｑｆＤ配列、ｇｙｒＢ配列、ｒｐｏＢ配列およびｇｒｏＥＬ配列に対してそれぞれ少なくとも９５％のＤＮＡ配列同一性を有し、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）を阻害でき、かつ、２ｍＭの胆汁の存在下で増殖し得る変異体；
   ｃ） （ａ）または（ｂ）の調製物、ここで、前記調製物は、前記（ａ）ＤＳＭＺにＤＳＭ ３２３１５で寄託されたバチルス・サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株または前記（ｂ）ＤＳＭ ３２３１５で寄託されたバチルス・サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株の変異体により分泌された代謝産物、酵素およびペプチドを含む発酵ブロスの上清である。
2. 前記バチルス・サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株は、以下の特性：
   ａ） 配列番号１のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を有する；および／または
   ｂ） 配列番号２のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するｙｑｆＤ配列を有する；および／または
   ｃ） 配列番号３のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するｇｙｒＢ配列を有する、
   を示す、請求項１記載のバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株、その変異体またはその調製物。
3. 前記バチルス・サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株は、以下の特性：
   ｄ） 配列番号４のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するｒｐｏＢ配列を有する；および／または
   ｅ） 配列番号５のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するｇｒｏＥＬ配列を有する、
   を示す、請求項１または２記載のバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株、その変異体またはその調製物。
4. 嫌気的に増殖することができることを特徴とする、請求項１から３までのいずれか１項記載のバチルス・サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株、その変異体またはその調製物。
5. クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）のＡＴＣＣ １３１２４型菌株に関してＬＢＫｅｌｌｙ寒天プレート上でのウェル拡散拮抗アッセイにおける病原菌クリアランスが少なくとも１０ｍｍであることを特徴とする、請求項１から４までのいずれか１項記載のバチルス・サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株、その変異体またはその調製物。
6. ０．０５重量％の酢酸、０．０５重量％のプロピオン酸および／または０．２重量％の乳酸の存在下で増殖し得ることを特徴とする、請求項１から５までのいずれか１項記載のバチルス・サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株、その変異体またはその調製物。
7. セルラーゼ活性が少なくとも２００ｍＵ／ｍＬであり、かつ／またはキシラナーゼ活性が少なくとも１５ｍＵ／ｍＬであることを特徴とする、請求項１から６までのいずれか１項記載のバチルス・サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株、その変異体またはその調製物。
8. ２ｍＭの胆汁の存在下で、ＡＵＣ５性能値が少なくとも０．５であり、かつＡＵＣ１０性能値が少なくとも１．２であることを特徴とする、請求項１から７までのいずれか１項記載のバチルス・サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株、その変異体またはその調製物。
9. 飼料または食品中のプロバイオティック成分（ＤＦＭ）としての、請求項１から８までのいずれか１項記載のバチルス・サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株、その変異体またはその調製物の使用。
10. 飼料原料または食料品の組成物であって、
    請求項１から８までのいずれか１項記載のバチルス・サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株、その変異体またはその調製物と、
    少なくとも１種のさらなる飼料または食品成分であって、タンパク質類、炭水化物類、脂肪類、さらなるプロバイオティクス、プレバイオティクス、酵素類、ビタミン類、免疫調節剤、乳代替物、ミネラル類、アミノ酸類、抗コクシジウム剤、酸ベースの生成物、医薬品およびそれらの組合せ物から選択される成分と
    を含有する、飼料原料または食料品の組成物。
11. 請求項１から８までのいずれか１項記載のバチルス・サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株、その変異体またはその調製物と、製薬学的に許容可能な担体とを含有する、医薬組成物。
12. 動物またはヒトの健康状態を改善するための、請求項１０または１１記載の組成物。
13. 動物への給餌方法であって、前記動物に、請求項１から８までのいずれか１項記載のバチルス・サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株、その変異体もしくはその調製物および／または請求項１０記載の飼料原料組成物および／または請求項１１記載の医薬組成物を施与することを特徴とする方法、ただし、前記動物はヒトを除くものとする。
14. 動物の健康状態を改善する方法であって、前記動物に、請求項１から８までのいずれか１項記載のバチルス・サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株、その変異体もしくはその調製物または請求項１０または１１記載の組成物を投与することを含む方法、ただし、前記動物はヒトを除くものとする。
15. 動物の健康を増進し、かつ／または動物の全身状態を改善し、かつ／または動物の飼料要求率を改善し、かつ／または動物の死亡率を低下させ、かつ／または動物の生存率を増加させ、かつ／または動物の体重増加を向上させ、かつ／または動物の疾患抵抗性を向上させ、かつ／または動物の免疫応答を増大させ、かつ／または動物において健康な腸内細菌叢を確立もしくは維持し、かつ／または動物の糞便を通じた病原菌の放出を減少させる方法であって、請求項１から８までのいずれか１項記載の少なくとも１種の菌株および／もしくは少なくとも１種のその調製物または請求項１０または１１記載の少なくとも１種の組成物を動物に投与する方法、ただし、前記動物はヒトを除くものとする。
16. 肥料または汚染液体の有害な環境作用を制御および／または回避する方法であって、請求項１から８までのいずれか１項記載の少なくとも１種の菌株、少なくとも１種のその変異体および／もしくは少なくとも１種のその調製物ならびに／または請求項１０または１１記載の少なくとも１種の組成物を、肥料、汚染液体、敷料、ピットまたは肥料溜めに施与する工程を含む方法。
17. 水または水溶液の品質を制御および／または向上させる方法であって、請求項１から８までのいずれか１項記載の少なくとも１種の菌株、少なくとも１種のその変異体および／もしくは少なくとも１種のその調製物ならびに／または請求項１０または１１記載の少なくとも１種の組成物を、水または水溶液に施与する工程を含む方法。
18. 栽培植物の微生物病を治療および／または予防する方法であって、請求項１から８までのいずれか１項記載の少なくとも１種の菌株、少なくとも１種のその変異体および／もしくは少なくとも１種のその調製物ならびに／または請求項１０または１１記載の少なくとも１種の組成物を、栽培植物に施与する工程を含む方法。