CN117016673B - 一种枯草芽孢杆菌在改善蛋鸡的肠道菌群或肠道健康或营养吸收中的应用 - Google Patents
一种枯草芽孢杆菌在改善蛋鸡的肠道菌群或肠道健康或营养吸收中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种枯草芽孢杆菌在改善蛋鸡的肠道菌群或肠道健康或营养吸收中的应用，所述枯草芽孢杆菌的保藏号为CGMCC No.28017。本发明从纳豆中筛选得到一株七烯甲萘醌(MK‑7)产量远高于常见的枯草芽孢杆菌168菌株的枯草芽孢杆菌NB205，在此基础上通过大量诱变研究获得进一步提高MK‑7产量的突变菌株NBMK308。进一步研究所述菌株可用于改善老龄蛋鸡的菌群或肠道健康或营养中吸收。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌在改善蛋鸡的肠道菌群或肠道健康或营养吸收中的应用。
背景技术
七烯甲萘醌(MK-7)在维生素K2(VK2)家族中具有更多的生物学功能，并且在动物体循环系统中的半衰期最持久为68小时。这意味着MK-7在体内更加稳定，可以更有效地发挥其生理作用。化学合成是目前合成MK-7的主流方式，然而在合成过程中存在一些棘手的问题。受制于加工工艺的限制，化学合成往往会导致结构不稳定的MK-7产物，顺式异构体无生理活性从而降低合成效率。化学合成过程中可能产生一些有毒副产物，对人体健康存在潜在风险。相较而言，人体对化学合成的MK-7吸收和利用程度较低，而自然来源的MK-7则更易被人体吸收和利用。因此，自然来源的MK-7在安全性和有效性方面优于化学合成的MK-7。另一方面，化学合成MK-7的生产成本相对较高，给生产商和消费者带来一定经济压力。相对来说，微生物合成MK-7具有明显优势，因为它能够产生生物活性更高的全反式异构体。然而，微生物生产MK-7面临的一个挑战是产量偏低。为了提高微生物合成的MK-7产量，未来的研究应关注开发多种技术，包括改进发酵工艺、基因工程以及提高生产菌株的生物活性等。从而有望实现更高产量、更安全、更具生物活性的MK-7，从而在保健品和医疗领域取得更好的应用效果。
枯草芽孢杆菌是一种常见的、广泛分布的芽孢杆菌属细菌，它可以合成多种不同亚型的MK，其中MK-7占总VK2产量的90%以上。在枯草芽孢杆菌中，MK-7作为电子传递链中的中间分子参与ATP合成的耦合，并且对于特定膜蛋白的糖基化和产孢的早期阶段必需的。因此，MK-7的生物合成对枯草芽孢杆菌的进行正常生理功能至关重要。纳豆是膳食中补充VK2的重要来源，主要原因生产所需的枯草芽孢杆菌在纳豆发酵过程中可以产生VK2。枯草芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌的一个亚种，因为它能够产生大量MK-7而受到广泛关注（Chen X,Shang C, Zhang H, Sun C, Zhang G, Liu L, Li C, Li A, Du P. Effects of AlkaliStress on the Growth and Menaquinone-7 Metabolism of Bacillussubtilis natto[J]. Frontiers in Microbiology, 2022,13:899802.）。在提高枯草芽孢杆菌合成MK-7产量方面，有着良好的应用前景。通过对枯草芽孢杆菌进行基因改造和优化发酵工艺等方法，有望进一步提高MK-7的产量，降低生产成本，从而使得这一具有重要生物学功能的VK2家族成员得到更广泛的应用和普及。
提高枯草芽孢杆菌产MK-7的方法很多种，其中常规方法有诱变育种，即通过定向筛选获得高产优质菌种的育种方法。该技术利用各种被称为诱变剂的物理或化学适当方法处理微生物，以诱导染色体畸变和基因突变，从而获得产量更高或其它优质特性的菌种。紫外线照射时间、诱变试剂的类型、剂量和诱变持续时间等几个因素都会影响微生物中产生正向基因突变的概率，需要探索相关菌株的最佳诱变条件。
随着全球对蛋的需求不断增加，确保蛋鸡的健康和生产效率已成为家禽行业的核心关注点。近年来，由于使用抗生素可能导致抗药性问题和对人类的潜在健康风险，其在家禽饲料中的应用已受到限制。因此，寻找替代方法以确保家禽的肠道健康和提高其生产效率变得尤为重要。老龄蛋鸡在其生产生命周期中可能会面临许多挑战，其中包括营养吸收不足、生产力下降、疾病风险增加等问题。肠道微生物群的平衡在这其中起到了关键的作用。一个健康的肠道菌群可以帮助老龄蛋鸡更好地吸收营养，增强免疫系统，抵御病原菌，并提高其整体健康状况。
纳豆是一种传统的日本发酵食品，由大豆通过发酵制成，其主要发酵菌为枯草芽孢杆菌。该菌在传统食品中已有数百年的使用历史，且已被证明具有多种对人类有益的生理效果。但在家禽领域，尤其是用于老龄蛋鸡的应用，目前还在研究之中。考虑到枯草芽孢杆菌的潜在益处，其或许可以用作一种天然、无害的替代品，用于改善老龄蛋鸡的肠道健康和菌群平衡，从而提高其生产效率和健康状况。
发明内容
本发明从纳豆中筛选得到一株七烯甲萘醌(MK-7)产量远高于常见的枯草芽孢杆菌 168菌株的枯草芽孢杆菌NB205，在此基础上通过大量诱变研究获得进一步提高MK-7产量的突变菌株NBMK308，并对其应用和机制进行了研究，由此完成本发明。
本发明提供一种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），其保藏号为CGMCCNo.28017。其是由枯草芽孢杆菌NB205突变得到的菌株NBMK308。具体是通过采用紫外线诱变和化学诱变相结合的方法，分别获得了高产MK-7的菌株NBMK308和NBES117。经过10代传代稳定后，枯草芽孢杆菌突变菌Notto NBMK308和NBES117菌株的MK-7产量分别较原始菌NB205提高了117.23%和65.85%。本发明针对的是前者，对枯草芽孢杆菌突变菌 NottoNBMK308进行了生物材料保藏，于2023年7月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），保藏号为：CGMCC No.28017，分类命名为：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，保藏时间为：2023年7月25日，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明提供所述的枯草芽孢杆菌在改善老龄蛋鸡肠道菌群或肠道健康中的应用。其中老龄蛋鸡可以为70周龄以上，优选为80周龄以上的蛋鸡。
具体地，是通过减少肠道炎症、保护肠道屏障并促进肠道黏膜修复而实现所述应用；或者是通过改善对肠道微生物群的平衡从而提高老龄蛋鸡的营养物质的吸收；或者是通过促进脂肪酸的吸收而提高老龄蛋鸡的营养利用效率；或者是通过调节老龄蛋鸡的肠道免疫反应而改善老龄蛋鸡的肠道健康；或者是通过调节肠道上皮细胞的凋亡而改善老龄蛋鸡的肠道健康。
本发明提供一种饲养老龄蛋鸡的方法，其是将所述的枯草芽孢杆菌作为添加剂的鸡饲料饲喂老龄蛋鸡。具体地，所述添加剂制备方法如下：通过发酵培养所述的枯草芽孢杆菌的菌液，离心丢弃上清液，在菌体中添加甘油作为保护剂制备细菌悬浮液，以玉米淀粉作为干燥载体，将载体和细菌悬浮液混合，然后在低于50℃下进行空气干燥，制备得到菌粉作为添加剂。
更具体地，所述添加剂具体制备方法如下：采和发酵培养基发酵培养所述的枯草芽孢杆菌，其中所述发酵培养基包含6%葡萄糖、5%大豆胨、1.5%酵母提取物和0.3% NaCl；
在发酵完成后，将菌液在4℃，5000 rpm离心10分钟丢弃上清液；接着加入以5%甘油为保护剂，按照1:3.5（g/ml）比例的混合菌体，制备细菌悬浮液；
以玉米淀粉作为干燥载体，将载体和细菌悬浮液按照1:5（g/ml）的比例混合，然后在50℃下进行空气干燥，制备菌粉。
优选地，每kg鸡饲料中加入所述添加剂的量按1×107-1×109CFU计。
本发明也提供一种改善老龄蛋鸡的肠道健康的方法，其在采用所述的枯草芽孢杆菌发酵培养得到的菌粉添加鸡饲料中并饲喂老龄蛋鸡。
具体应用时，将菌加入饲料具体步骤是将菌发酵以后制备成菌粉，具体步骤文中有描述，然后菌粉经四分法取样，NB205和NBMK308菌粉的活菌数分别为1.8x1010和3.1x1010CFU/Kg。添加到饲料中后，NB205组和NBMK308组中的芽孢数量分别为3.06x108和2.00x108CFU/kg。
其中，所述菌粉的制备方法为：在发酵培养完成后，将发酵菌液在4℃，5000 rpm离心10分钟丢弃上清液；接着加入以5%甘油为保护剂，按照1:3.5（g/ml）比例的混合菌体，制备细菌悬浮液；以玉米淀粉作为干燥载体，将载体和细菌悬浮液按照1:5（g/ml）的比例混合，然后在50℃下进行空气干燥，制备菌粉。经四分法取样后，NB205和NBMK308菌粉的活菌数分别为1.8x1010和3.1x1010 CFU/Kg。添加到饲料中后，NB205组和NBMK308组中的芽孢数量分别为3.06x108和2.00x108 CFU/kg。
本发明通过研究所述的枯草芽孢杆菌作为添加剂的鸡饲料饲喂老龄蛋鸡能够改善老龄蛋鸡的肠道健康，有利于老龄蛋鸡生存，减少患病率，减少抗生素的使用等诸多优势。
附图说明
图1、NB205的系统发育树。
图2、NB205的扫描电子显微镜观察图。
图3、紫外照射对NB205的致死曲线。
图4、硫酸二乙酯诱变对NB205的影响。
图5、不同1-萘酚浓度对于NB205诱变菌抑制率。
图6、空肠形态学观察；其中，A：经H&E染色后空肠形态结构；B：NB205和NBMK308组绒毛高度，隐窝深度以及VCR（绒毛高度与上隐窝深度比值）值。
图7、通过qRT-PCR测定空肠claudin-1, claudin-2, occludin, mucin-2, ZO (zonula occludens)-1, FABP (fatty acid binding protein)-2 mRNA的表达。
图8、空肠中TLR4、MyD88、PAK1、NF-κB、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-8、IL-15、IL-18、IL- 22、AvBD10和CDC42的mRNA表达水平。
图9、免疫相关蛋白IFN-γ的表达。
图10、空肠中凋亡相关基因与蛋白表达的调节；其中，A：caspase-1、Bax、Bcl-2的mRNA表达水平；B：caspase-3 和cleaved caspase-3的蛋白表达。
图11、空肠中MGP、periostin、PROS和protein C的mRNA表达水平。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
实施例一、高产MK-7 枯草芽孢杆菌的筛选鉴定
1、相关培养基和方法
培养基和试剂制备
LB培养基配方：1％蛋白胨（Tryptone）、0.5％酵母抽提物（Yeast extract）和1％氯化钠（NaCl）。发酵培养基配方：6％葡萄糖（Glucose）、5％大豆胨（Soy peptone）、1.5％酵母抽提物（Yeast extract）和0.3％氯化钠。MK-7的分析标准品购自美国药典委员会（USP,上海, 中国）。1-萘酚（1-Naphthol），硫酸二乙酯（Diethyl sulfate, DES），硫代硫酸钠（Sodium thiosulfate, Na2S2O3）购自索莱宝科技（北京，中国）。用于细菌基因组提取的试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。
种子液的制备与菌株发酵
首先，从LB琼脂平板上挑选单菌落，并将其转移到一个含有4mLLB培养基的10mL离心管中。然后在37℃、180 rpm的条件下振荡培养24小时，以实现菌落的复苏。接下来，将复苏液接种到容量为250mL的培养瓶中，其中含有25mLLB培养基，接种量为4%。再次在37℃和180rpm的条件下进行培养，直到菌液的OD 600达到0.6至0.8之间，以获得适宜的菌株种子液。为了进行菌株发酵，取400μL的种子液接种到一个含有10毫升发酵培养基的50mL锥形瓶中。然后在37℃、180rpm的条件下进行振荡发酵，持续时间为144小时。
发酵菌液中MK-7提取与超高效液相色谱分析
为了分析发酵菌液（整体发酵液，不需要离心去掉菌体）中的MK-7含量，首先对发酵液进行提取，并使用UPLC技术进行MK-7分析。具体操作为：取10 mL发酵液中的900μL，与异丙醇和正己烷以3/4/8（发酵液/异丙醇/正己烷，V/V/V）的比例混合，并振荡2分钟以获得均匀悬浮液，然后离心3000rpm 10分钟，收集有机层进行真空蒸发，重新溶解干燥的沉淀物，最终检测溶液中MK-7的含量。标准溶液是通过准确称量10.00mg MK-7标准品，加入20mL异丙醇，在50℃水浴中搅拌10分钟制备的。使用Agilent Infinity II Prime LC系统和DAD检测器（波长254 nm）分析MK-7含量，使用C18柱（Eclipse PlusC18 RRHD 1.8μm，2.1×50mm）分离代谢物，移动相包含乙腈：乙醇（50:50，v/v），在恒定的40℃柱温和0.2 mL/min的流速下进行。为确定校准曲线，使用五种标准浓度（5 mg/L至500 mg/L）的MK-7溶液。
数据分析和处理
试验为3个重复(n=3)，数据以平均值±标准误差（SEM）的形式呈现。采用SPSS20.0（美国，芝加哥）进行单因素方差分析，随后进行Duncan's多重比较检验。显著性水平由星号表示，*表示0.01 <p值< 0.05，**表示0.001 <p值< 0.01，***表示p值<0.001，或者显著性用字母标注。如果两组标注含有相同字母，表明它们之间的差异不显着，而如果两组标注不同字母，差异被认为是显着的。
2、纳豆中高产MK-7菌株的分离与鉴定
1）菌株的分离
将1g新鲜纳豆样品加入50mL的无菌生理盐水中，并在85℃的水浴中加热30分钟，使纳豆混合物悬浊液混合均匀。随后冷却至室温（25±1℃），将上清液均匀涂布于LB平板上，并在37℃下培养12小时。从中挑选单菌落进行接种发酵，并分析MK-7含量，筛选出产量最高的MK-7菌株。
2）高产MK-7菌株鉴定
本试验通过提取菌株基因组，采用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3'）和1492R（5'-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3'）进行PCR扩增16S rDNA。随后，对PCR产物进行测序，并利用NCBI Blast网站（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行比对。最后，使用MEGA11软件通过邻接法（neighbor-joining, NJ）构建系统发育树，以进一步分析菌株的系统发育分类。按常规PCR反应体系50µL下进行，PCR反应条件为：98℃ 1分钟，（98℃ 10秒，55℃ 15秒，72℃ 30秒）30次循环，最后72℃延伸5分钟，以保证高质量准确的测序结果。
使用Promega的Wizard genomic DNA purification kit从高MK-7产量的菌株中提取基因组DNA，并对其进行全基因组测序，使用Illumina MiSeq和PacBio测序平台。
3）扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscope, SEM）观察
将发酵液离心（转速为5000rpm），去除上清液后，在适当pH（7.2-7.4）的PBS中温和地悬浮菌体，进行3次洗涤，以清洁样品。接着使用2.5%戊二醛进行固定处理，持续3小时，之后使用PBS再次洗涤3次，并将样品固定在样品台上。随后，采用30%、50%、70%、80%、90%乙醇水溶液，按照浓度梯度对样品进行脱水，每步约进行15分钟，每次脱水结束后进行离心并去除上清液。最后在100%乙醇中进行15分钟的脱水处理，之后进行临界点干燥。将干燥的样品盖玻片粘附到导电胶带的样品台上，然后进行喷金处理。最终使用扫描电子显微镜观察样品。
3、实验结果
1）高产MK-7菌株的分离与鉴定
根据枯草芽孢杆菌的耐热特点，对纳豆样品进行了高温处理。经分离和培养发酵，获得了数十株菌株。通过测定MK-7含量，如表1。
表1、初筛菌株MK-7含量
选取菌株NB205在培养基配方为6％葡萄糖（Glucose）、5％大豆胨（Soy peptone）、1.5％酵母抽提物（Yeast extract）和0.3％氯化钠培养下，最终NB205的MK-7含量为16.31±2.234 mg/L，相同条件下，比常见的枯草芽孢杆菌 168中MK-7产量含量4.31±0.500 mg/L高出278.42%。通过比较NB205和其它相关物种的16S rRNA序列构建了系统发育树，结果表明NB205属于枯草芽孢杆菌属（如图1）。
2）NB205基因组全测序
为了确定NB205菌株的分类位置，本研究对其全基因组进行了测序。NB205基因组的特征中，包括4,114,223个碱基对、GC含量为43.85％、4,364个蛋白编码序列、9个rRNA操纵子和88个tRNA基因，占编码序列的87.30％。基于比对的分类显示，与枯草芽孢杆菌168（NCBI参考序列：NC_000964.3）相比，NB205的平均核苷酸同源性（ANI）为98.51％，表明这两株菌株存在密切关系。
3）NB205的形态观察
根据扫描电子显微镜观察（如图2所示），NB205与Bacillussubtilis JCM 1465在形态上高度一致，并无明显区别。
据系统发育树构建、全基因组测序比对和扫描电子显微镜观察形态分析的综合结果，以及在生理生化特征方面，从NB205菌株表现出了枯草芽孢杆菌的显著特性，即高产MK-7，并且能够生成典型的纳豆粘性物质。这种粘性物质对于枯草芽孢杆菌的识别具有重要意义，是枯草芽孢杆菌与其它枯草芽孢杆菌（包括其它亚种）的一个显著区别。因此，NB205菌株属于枯草芽孢杆菌。进一步证实了NB205菌株高产MK-7的特性，为后续MK-7高效表NB205菌株的MK-7产量远高于常见的枯草芽孢杆菌 168菌株，这意味着NB205可能具有特殊的生物合成途径或调控机制来提高MK-7的产量。为研究提供了坚实的基础。
实施例二、高产MK-7 枯草芽孢杆菌的诱变选育
1、相关实验方法
1）高产MK-7菌株紫外诱变处理条件
将种子液用0.9% NaCl稀释至103-104 CFU/mL，置于距离紫外灯20cm正下方的培养皿中，使用18 W 254 nm的紫外线照射14、16、18、20或22秒。同时设立空白对照组。紫外照射处理后取30 μL液体涂布于LB平板中，涂板操作在红光下进行，并全程避其余光源。37℃下培养12小时后计算细菌致死率。确定最佳诱变条件后，进行正突变菌的筛选和鉴定。
2）高产MK-7菌株化学诱变处理条件
将菌株种子液稀释至103-104 CFU/mL浓度，取5 mL稀释后的菌液加入不同浓度的DES（终浓度为0.2%、0.225%、0.25%、0.275%、0.3%），处理5分钟后将处理后的菌液置于离心管中，加入1 mL 25% Na2S2O3溶液停止反应。使用加灭菌水作为空白对照组。取30 μL菌液涂布于LB平板上，37℃下培养12小时后计算致死率。在筛选得到最佳诱变条件后，进行正向突变菌的进一步筛选。
3）高产MK-7菌株诱变致死率计算
从处理后的平板上进行菌落计数，据此计算细菌在处理过程中的致死率。
4）高产MK-7诱变菌株复筛
在成功诱变高产MK-7菌株后，将其涂布于添加MK-7结构类似物（1-萘酚，浓度为120～300mg/L）的LB平板上，以测定抑制率，并选择抑制效果最佳的80%对应的1-萘酚浓度作为复筛选条件。通过复筛，得到了一批正突变菌株，随后对其进行MK-7含量的发酵分析。最终，将选取产量最高的MK-7正突变菌株进行保藏。
5）发酵菌液中MK-7提取与超高效液相色谱（UPLC）分析
同实施例一。
2、实验结果
1）NB205最佳紫外诱变条件
在本研究中，通过图3的结果发现，紫外线照射时间与致死率呈正相关关系，且14秒和16秒致死率均在75%～85%区间，在后续试验中选择其中一个条件用于完成紫外诱变筛选，因此，将紫外线照射16秒，致死率达到81.43%的条件下，作为最佳的紫外线诱变条件。
2）NB205最佳化学诱变条件
根据图4的结果显示，硫酸二乙酯的浓度与细胞死亡率呈正相关关系且终浓度为0.15%和0.16%时致死率均在75%～85%区间，在后续试验中仅需要选择一个硫酸二乙酯处理条件用于完成紫外诱变筛选，因此，选择将NB205硫酸二乙酯终浓度为0.16%，致死率达到82.74%的条件下，作为最佳的化学处理条件。
3）诱变菌抗性筛选复筛
通过诱变手段结合结构类似物进行抗性筛选，可以有针对性地阻碍代谢物的正常生成。这种方法定向地改变了反馈抑制酶的结构（即抗反馈抑制），或者改变了生成阻遏酶的系统（即抗反馈阻遏）。因此，只有对结构类似物不敏感的突变菌才能继续生长，这样可以显著提高筛选频率。
根据图5的结果显示，当1-萘酚浓度低于120mg/L时，NB205诱变菌的生长良好，而当浓度高于260mg/L时，NB205诱变菌则无法正常生长。1-萘酚浓度220mg/L处于菌株生长良好和无法正常生长的两个浓度极点之间，足够高以阻碍大多数非突变菌株的生长，同时又足够低以允许抗性菌株生存。经过紫外和化学诱变后的菌株涂布在含有220mg/L 1-萘酚的平板上时，观察到致死率达到88.38%。该浓度提供一个有效的筛选压力，既能去除非突变菌株，又能保留能够抗呼吸链抑制并有可能高产MK-7的NB205正突变菌株。因此，选择该1-萘酚浓度作为定向筛选条件。
本试验采用最优的紫外和化学诱变条件，通过复筛定向筛选出抗呼吸链抑制的突变菌株，并经过10代传代稳定后进行发酵并测定MK-7含量。结果显示，在紫外诱变组中，NBMK308菌株的MK-7含量最高，为35.43±1.433mg/L，较原始菌NB205提高了117.23%。而在化学诱变组中，NBES117菌株的MK-7含量最高，为27.05±1.821mg/L，较原始菌提高了65.85%。
本试验结果表明，通过采用紫外线诱变和化学诱变相结合的方法，可以成功筛选出抗呼吸链抑制并高产MK-7的NB205正突变菌株。在本试验中，紫外线诱变和化学诱变分别产生了高产MK-7的菌株NBMK308和NBES117。这可能是由于高致死率下，突变的累积概率增加，从而增加了产生具有有益特性的突变菌株的概率。结构类似物筛选方法在本试验中也起到了关键作用。这种策略旨在筛选出抗反馈抑制或抗反馈阻遏的突变菌株，从而提高筛选频率。在本试验中，1-萘酚作为抗呼吸链抑制剂成功地用于筛选出能够抗呼吸链抑制并高产MK-7的突变菌株。值得注意的是，经过10代传代稳定后，NBMK308和NBES117菌株的MK-7产量分别较原始菌NB205提高了117.23%和65.85%。
为了更好地理解突变菌株NBMK308的高产MK-7的分子机制，本发明还通过基因组和转录组对其进行深入研究。由于诱变育种是一种对菌株进行突变的方法，但是这种突变是随机的。研究结果显示筛选出的高产MK-7的菌株NBMK308，可能不仅仅是因为单一通路的调节，而是多种通路协同作用的结果。
实施例三、枯草芽孢杆菌NBMK308改善老龄蛋鸡肠道菌群和肠道健康的研究
1、材料与方法
1）菌粉的制备
首先，NBMK308单菌落在含有4 mL LB的10 mL试管中培养12小时。接下来，将400 μL细胞溶液接种到含有10 L发酵培养基的50 L烧瓶中，进行36小时的发酵。发酵培养基包含6%葡萄糖、5%大豆胨、1.5%酵母提取物和0.3% NaCl。在发酵完成后，将菌液在4℃，5000 rpm离心10分钟丢弃上清液。接着加入以5%甘油为保护剂，按照1:3.5（g/ml）比例的混合菌体，制备细菌悬浮液。最后，以玉米淀粉作为干燥载体，将载体和细菌悬浮液按照1:5（g/ml）的比例混合，然后在50℃下进行空气干燥，制备菌粉。
2）日粮与饲喂方案
本试验选取180只81周龄、身体状况良好且蛋品质无差异的海兰褐蛋鸡，先饲喂基础饲料2周，然后随机分成3组（每组6个重复，每个重复10只）。试验处理包括1）对照组（用玉米淀粉处理）；2）NB205组（每kg饲料中加入1x108CFU菌粉）；3）NBMK308组（每kg饲料中加入1x108CFU菌粉）。试验期间，基础饲料的组成和营养水平如表2所示。每个重复中的蛋鸡被安置在相邻的5个笼子中（每笼2只）。整个试验期间，维持室温为25℃，每天的光照时间为16小时光照和8小时黑暗，蛋鸡可以自由饮食和饮水，共持续8周。
表2 基础饲料的组成和营养水平
a每公斤饲料中含有：VA，8,000 IU；VD3，2,400 IU；VE，40 IU；VK3，2.00 mg；VB1，2.00 mg；VB2，6.40 mg；VB6，3.00 mg；VB12，0.02mg；叶酸，1.00 mg；烟酸，30.00 mg；泛酸，10.00 mg。
b每公斤饲料中含有：铜，8.00 mg；锌，80.00 mg；铁，60.00 mg；锰，80.00 mg；硒，0.15 mg；碘，0.35 mg。
3）样品采集
采用电击麻醉方法对老龄蛋鸡进行人道处置。屠宰后，迅速取出膨大部、空肠并用无菌生理盐水冲洗干净。将膨大部样本的一部分（1cm）固定在4%多聚甲醛中，为后续的显微镜下形态学观察做准备。另一部分（2cm）被收集并置于液氮中移至负80冰箱保存，以进行后续分子检测。空肠食糜采集后放置负80℃冰箱保存。
4）测定饲料中的芽孢数量
采用四分法将0.2g添加菌粉的饲料与20 mL无菌生理盐水混合，放入95℃的水浴中处理30分钟，接着按照一定的稀释倍数进行稀释。然后取100μL的混合液涂布在LB平板上，进行37℃的培养12小时，测定平板上单菌落形态与添加的枯草芽孢杆菌一致的数量，并计算出饲料中含有的芽孢菌株数。
5）测量粪便中的芽孢数量
在试验的第3周和第6周，取0.2g粪便加入20mL无菌生理盐水中混合，放入95℃的水浴中处理30分钟，接着按照一定的稀释倍数进行稀释。然后取100μL的混合液涂布在LB平板上，进行37℃的培养12小时，测定平板上单菌落形态与添加的枯草芽孢杆菌一致的数量，并计算出粪便中芽孢菌株数的含量。
6）实时荧光定量PCR
首先，使用TRIzol试剂提取膨大部和空肠样品的总RNA，并使用NanoDrop仪器（Thermo Fisher Scientific，美国）在260nm处测量RNA的浓度。接下来，使用带有GuideDNA（gDNA）Remover的StarScript II First-strand cDNA Synthesis Mix（GenStar，中国上海）将总RNA反转录为互补DNA（cDNA）。然后，使用2X RealStar Green Fast混合物（GenStar，中国上海）进行qRT-PCR，以内部参考基因β-actin作为基础确定目标基因的相对mRNA表达量。通过计算6个重复样本的平均定量循环值（Cq）来进行实时PCR定量。
7）蛋白质印迹法
根据之前报道的方法，对膨大部和空肠中不同蛋白表达进行WB检验。首先，使用RIPA缓冲液裂解冷冻组织提取物，然后将裂解物离心以去除不溶性物质。接下来，经过电泳，将蛋白质分离于6-12% SDS-PAGE凝胶上，并将分离的蛋白质转移到PVDF膜（IPVH00010，Millipore，美国马萨诸塞州）。最后，使用以下抗体进行探测：Ovalbumin抗体（ab306591，Abcam，中国上海）、β-actin抗体（T40104F，Abcam，中国上海）、干扰素γ（IFN-γ）抗体（T56671S，Abcam，中国上海）、磷酸化STAT3（p-STAT3）（Y705）抗体（T40061，Abcam，中国上海）、STAT3抗体（9139T，Cell Signaling Technology，中国上海）、Caspase-3抗体（T40044S，Abmart，中国上海）。每组重复了四次。使用ImageJ软件进行密度扫描和计算相关蛋白的相对表达水平，并以β-actin作为内参蛋白。
8）空肠食糜MK-7含量测定
取0.1g空肠食糜，按比例3/4/8（发酵液/异丙醇/己烷，V/V/V）混合。混合物在涡旋混合2分钟，然后在3000 rpm下离心10分钟，收集有机层进行真空蒸发。接下来，将干燥的沉淀重新溶解于100 µL的异丙醇中，并测定溶液中MK-7的含量。
9）空肠的形态分析
首先，将空肠样本在清水下冲洗，然后在不同浓度的乙醇中脱水，随后浸泡在二甲苯中，再浸泡在石蜡中进行包埋，切割成5毫米厚度的切片，并使用苏木精和伊红染色（H&E）进行传统形态学评估。使用DM3000显微镜（德国莱卡）拍摄不同部位的输卵管图像。测量每个切片中2至3个相邻折叠空间中膨大部的初级褶皱和次级褶皱的长度。绒毛高度以绒毛顶端至同一绒毛隐窝顶端垂直距离测量，隐窝深度以相应腺窝内陷深度测定，每个切片8个完整绒毛隐窝结构。使用Image-Pro软件（Rockville&Media Cybernetics公司，美国）测定膨大部和空肠形态。
10）数据分析
数据以平均值±标准误差（SEM）的形式呈现。采用SPSS 20.0（美国，芝加哥）进行单因素方差分析，随后进行Duncan's多重比较检验。显著性水平由星号表示，*表示0.01<p值<0.05，**表示0.001<p值< 0.01，***表示p值<0.001，或者显著性用字母标注。如果两组标注含有相同字母，表明它们之间的差异不显着，而如果两组标注不同字母，表示两组间差异显着。
2、实验结果
1）老龄蛋鸡空肠形态学观察
经过H&E染色和显微镜观察后，如图6发现NB205和NBMK308组的空肠绒毛高度以及空肠段绒毛高度与隐窝深度的比值（villus height-to-crypt depth ratio, VCR）显著增加，这些发现可以进一步解释为老龄蛋鸡饲料中添加NB205和NBMK308能够提高老龄蛋鸡空肠营养吸收能力。
这些发现表明，老龄蛋鸡饲料中添加NB205和NBMK308能够提高营养吸收能力。绒毛高度和VCR通常被认为是评估肠道健康及其对营养物质吸收能力的重要指标。增加的绒毛高度和VCR值与改善的肠道健康和营养物质吸收能力之间的关系已被广泛报道。因此，结果与之前的研究结果一致，表明NB205和NBMK308可以显著改善老龄蛋鸡的肠道健康和营养吸收能力。这些结果可能与NB205和NBMK308对肠道黏膜的保护作用有关。近年来，研究发现，一些添加剂可以减少肠道炎症、保护肠道屏障并促进肠道黏膜修复，从而提高营养吸收能力。NB205和NBMK308可能对肠道微生物群的平衡产生了积极作用，从而进一步提高了营养物质的吸收。
2）NB205和NBMK308添加对于空肠中紧密连接蛋白基因表达的调节
结果显示，在老龄蛋鸡空肠中，NB205和NBMK30组的紧密连接相关蛋白如claudin- 2、ZO-1和FABP-2的mRNA表达水平显著高于对照组。基因occludin仅在NBMK308组中显著上调的趋势（如图7）。
老龄蛋鸡空肠中，NB205和NBMK308组的紧密连接相关蛋白（如claudin-2、ZO-1和FABP-2）的mRNA表达水平显著高于对照组。基因occludin仅在NBMK308组中呈现显著上调的趋势。这些结果表明NB205和NBMK308可能有助于改善老龄蛋鸡肠道屏障功能。肠道屏障功能对家禽的健康至关重要，因为它可以保护肠道免受有害物质和病原体的侵害。紧密连接相关蛋白质，如claudin、ZO-1和occludin，是细胞间连接的重要组成部分，它们的表达水平与肠道屏障功能的完整性密切相关。因此，结果表明，NB205和NBMK308可能通过上调这些紧密连接相关蛋白的mRNA表达，从而改善老龄蛋鸡的肠道屏障功能。FABP-2是一种脂肪酸结合蛋白，与脂肪酸的转运和吸收密切相关。试验结果发现NB205和NBMK308组的FABP-2 mRNA表达水平显著高于对照组，这可能意味着这两种添加剂可以促进脂肪酸的吸收，进一步提高老龄蛋鸡的营养利用效率。
3）NB205和NBMK308添加对于空肠中炎性因子表达的调节
在NB205和NBMK308试验组中，老龄蛋鸡的空肠IL-1β、IL-6、IL-8、NF-κB和MyD88的相对mRNA表达水平显著降低。相比于对照组，NB205组的IL-18的相对mRNA表达水平也显著降低。NBMK308试验组空肠中MyD88相对mRNA表达水平显著低于NB205组（图8）。同时，与对照组相比，NB205和NBMK308组中，免疫相关蛋白IFN-γ的表达显著增加（图9）。
在NB205和NBMK308试验组中，老龄蛋鸡的空肠IL-1β、IL-6、IL-8、NF-κB和MyD88的相对mRNA表达水平显著降低。相比于对照组，NB205组的IL-18的相对mRNA表达水平也显著降低。NBMK308试验组空肠中MyD88相对mRNA表达水平显著低于NB205组。这些结果表明NB205和NBMK308可能对老龄蛋鸡肠道的免疫调节具有积极作用。炎症细胞因子（如IL-1β、IL-6和IL-8）在肠道炎症和损伤中起着重要作用，其水平的降低可能意味着炎症反应减轻。同时，NF-κB和MyD88是关键的免疫信号转导分子，它们在炎症反应和免疫应答中发挥作用。因此，NB205和NBMK308可能通过降低这些炎症因子和信号分子的表达水平，从而调节老龄蛋鸡的肠道免疫反应。某些饲料添加剂（如益生菌和植物提取物）可以降低肠道炎症，从而维持肠道屏障功能和改善肠道健康。在衰老过程中，IFN-γ水平的增加可能对免疫系统产生积极影响，包括促进T细胞激活和增强巨噬细胞功能。因此，NB205和NBMK308可能通过调节肠道炎症反应，进一步改善老龄蛋鸡的肠道健康。
4）NB205和NBMK308添加对于空肠凋亡相关基因与蛋白表达的调节
与对照组相比，在mRNA表达水平上，相对于NB205，NBMK308组均显示出Bax表达上调。NBMK308组显示出caspase-1表达下调的趋势（图10中A）。在蛋白表达水平上，NB205和NBMK308组中，caspase-3和cleaved caspase-3显著上调（图10中B）。
对照组相比，在mRNA表达水平上，NB205和NBMK308组均显示出Bax表达上调。NBMK308组显示出caspase-1表达下调的趋势。在蛋白表达水平上，NB205和NBMK308组中，caspase-3和cleaved caspase-3的蛋白表达显著上调。这些结果表明NB205和NBMK308可能通过调节细胞凋亡相关因子的表达来影响老龄蛋鸡肠道上皮细胞的凋亡。Bax是一种促凋亡蛋白，其表达上调与细胞凋亡的激活有关。Caspase-1和caspase-3是细胞凋亡的关键执行酶，它们在细胞凋亡过程中起着重要作用。因此，NBMK308通过上调基因Bax和caspase-3的表达以及降低caspase-1的表达，可能调节肠道上皮细胞的凋亡过程。细胞凋亡对肠道健康至关重要，因为它可以保持肠道上皮细胞的更新和平衡。因此，NB205和NBMK308通过调节肠道上皮细胞的凋亡可能对老龄蛋鸡的肠道健康产生积极影响。
5）老龄蛋鸡空肠VKDPs相关基因的调节
与VKDPs相关的基因，如MGP、periostin、PROS和protein C，在NBMK308组中转录水平显著上调，而在NB205组中MGP呈上调趋势，PROS表达显著上调（图11）。
在老龄蛋鸡空肠中，与VKDPs相关的基因，如MGP、periostin、PROS和protein C，在NBMK308组中转录水平显著上调，而在NB205组中MGP呈上调趋势，PROS表达显著上调。VKDPs在钙磷代谢、骨骼生长和维持肠道健康方面发挥重要作用，例如，MGP和periostin对骨骼生长和矿化具有调节作用；Protein C作为抗凝蛋白，具有抗炎和抗凝血功能。
Claims (5)
1.一种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）在制备改善老龄蛋鸡的营养吸收的产品中的应用，所述的枯草芽孢杆菌的保藏号为CGMCC No.28017，且其中，通过改善对肠道微生物群的平衡和通过促进脂肪酸的吸收而提高老龄蛋鸡的营养吸收利用效率。
2.一种将保藏号为CGMCC NO:28017 的枯草芽孢杆菌作为添加剂的老龄蛋鸡饲料，所述老龄蛋鸡饲料用于改善老龄蛋鸡的营养吸收。
3.如权利要求2所述的老龄蛋鸡饲料，其特征在于，所述添加剂制备方法如下：
通过发酵培养所述的枯草芽孢杆菌的菌液，离心丢弃上清液，在菌体中添加甘油作为保护剂制备细菌悬浮液，以玉米淀粉作为干燥载体，将载体和细菌悬浮液混合，然后在低于50℃下进行空气干燥，制备得到菌粉作为添加剂。
4.如权利要求3所述的老龄蛋鸡饲料，其特征在于，所述添加剂具体制备方法如下：采用发酵培养基发酵培养所述的枯草芽孢杆菌，其中所述发酵培养基包含6%葡萄糖、5%大豆胨、1.5%酵母提取物和0.3% NaCl；在发酵完成后，将菌液在4℃，5000 rpm离心10分钟，丢弃上清液；接着加入以5%甘油为保护剂，按照1:3.5 g/ml 的比例混合菌体，制备细菌悬浮液；以玉米淀粉作为干燥载体，将载体和细菌悬浮液按照1:5 g/ml的比例混合，然后在50℃下进行空气干燥，制备菌粉。
5.如权利要求4所述的老龄蛋鸡饲料，其特征在于，每kg鸡饲料中添加剂的加入量按1x107-1x109CFU计。
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