CN110607251A - 一种降解呕吐毒素的耐盐海杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种降解呕吐毒素的耐盐海杆菌Pelagibacterium halotolerans ANSP101 CGMCC No.17304和培养方法及其应用。通过所述方法，该耐盐海杆菌发酵液对呕吐毒素的降解率可达79％；耐盐海杆菌所产活性蛋白对呕吐毒素的降解率可达80.21％。所述菌株或菌株所产活性蛋白及制备的添加剂，可用于猪、鸡、牛、羊、宠物、水产动物、皮毛动物用全价饲料、浓缩饲料、预混合饲料，谷物、玉米、花生粕、小麦、燕麦等饲料原料，青贮饲料，粮食、粮油、粮食加工及农副产品、陈化粮，工业乙醇加工副产物DDGS，食品、茶叶及中草药中呕吐毒素的生物脱毒。

Description

一种降解呕吐毒素的耐盐海杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种能够降解呕吐毒素的耐盐海 杆菌(Pelagibacterium halotolerans)及其活性蛋白的制备方法和应用。
背景技术
呕吐毒素(DON)最早于1970年在日本香川县感染赤霉病的病麦中发现， 因其结构为雪腐镰刀菌烯醇的4-脱氧衍生物，故命名为脱氧雪腐镰刀菌烯醇 (Deoxynivalenol，DON)。呕吐毒素主要由禾谷镰孢菌、黄色镰刀菌等产生， 属于B类单端孢霉烯族毒素，其对禾谷类作物的污染居于镰刀菌毒素之首，严 重威胁人和家畜的健康。全世界范围内粮食和饲料样品受呕吐毒素污染较普 遍。世界卫生组织2001年度的报告显示，燕麦中呕吐毒素的检出率高达68％， 其他谷物中也达到27％～59％。欧盟2003年的报告显示，食品中呕吐毒素的检 出率达到57％。
人和动物在误食被呕吐毒素污染的谷物和粮食后可产生广泛的毒性效 应。低剂量的呕吐毒素会引起食欲减退、生长缓慢甚至拒食并刺激免疫反应， 高剂量的呕吐毒素会引起伴随呕吐效应的急性肠胃炎，且会引起免疫抑制。 霉变的饲料经动物采食后，毒素及其代谢产物残留在畜产品及其加工制品中， 通过食物链进入人体，严重威胁人类的健康。因此，有效控制和消除霉菌毒 素对粮食和饲料的污染，对改善动物生产性能和保障人类食品安全有非常重 要的意义。
霉菌毒素传统的物理和化学消除方法存在效果不稳定、营养成分损失大、 影响饲料适口性，且难以规模化生产等缺点而不能广泛应用到实际生产中。 微生物及生物酶降解具有解毒效率高、特异性强、对饲料和环境没有污染等 特点和优势，从而备受研究者的关注。近年来陆续有研究者从自然界中筛选 出能够降解DON的微生物，但早期报道的能降解DON的微生物大多在厌氧条 件下进行，其中梭菌目(Clostridiales)，毛螺旋菌科(Anaerofilum)，真杆 菌属(Eubacterium)，芽孢杆菌属(Bacillus)和柯林斯氏菌(Collinsella)中 均含有在厌氧条件下使DON上C12/C13环氧基团脱环氧化能力的菌株。随着科技的进步，近年来一些能降解DON的单一菌株被分离鉴定，2016年，He 等报道了一株德沃斯氏菌，可通过在C3上羟基的差向异构化，将DON转化为 毒性较低的3-差向异构-脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-epi-DON)；2017年He等从麦 田土壤中筛选出一株鞘氨醇单胞菌，它可在72h将100μg/mL DON完全降解。
由于呕吐毒素分子结构比较稳定，目前发现的降解呕吐毒素的微生物种 类和数量非常有限，关于降解酶的研究报道非常稀缺。在报道的微生物中， 其中一些菌株不在饲料和食品添加剂目录中，虽然具有较高的降解呕吐毒素 活性，却不能直接应用于食品或饲料中呕吐毒素的生物降解。为了解决呕吐 毒素在饲料原料及饲料中的污染问题，分离能够高效降解呕吐毒素的微生物 对其在饲料生产和食品加工上的应用具有十分重要的作用。有关耐盐海杆菌 降解呕吐毒素的相关内容还尚未见报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是从大量的自然界样品中筛选出新的具有降解 呕吐毒素的菌株，从而解决饲料和食品中呕吐毒素污染对动物和人类健康造 成危害的问题。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种新的降解呕吐毒素的耐盐海杆 菌(Pelagibacterium halotolerans)ANSP101。
本发明的海洋杆菌Pelagibacterium halotolerans ANSP101，已于2019年03 月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为 北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为 CGMCC No.17304。
所述降解呕吐毒素的耐盐海杆菌Pelagibacterium halotolerans ANSP101是 发明人经过复杂筛选工作从大量自然界样品中分离得到的。
本发明的另一目的是提供上述耐盐海杆菌的培养方法，具体为：取活菌 浓度为109CFU/mL的所述耐盐海杆菌ANSP101 0.5-2.5mL，接种于50-100mL培 养基中进行摇瓶发酵培养。
优选地，取活菌浓度为109CFU/mL的所述耐盐海杆菌2.0mL，接种于 100mL培养基中进行摇瓶发酵培养。
所述发酵培养基由如下组分组成：蛋白胨4.0-6.0g，酵母浸粉0.5-3.0g， 氯化钠18.0-21.0g，氯化镁4.0-7.0g，硫酸钠2.0-4.0g，氯化钙1.0-3.0g，氯 化钾0.5-1.0g，碳酸钠0.1-0.3g，加蒸馏水至800-1200mL，pH值为7.4-7.8。
优选地，所述发酵培养基由如下组分组成：蛋白胨5.0g，酵母浸粉1.0g， 氯化钠20.0g，氯化镁6.0g，硫酸钠3.5g，氯化钙2.0g，氯化钾0.55g，碳 酸钠0.16g，蒸馏水1000mL，pH为7.6。
所述摇瓶发酵的条件为：发酵温度26-32℃，pH值7.4-7.8，转速180-220 r/min，发酵时间20-30h。
优选地，所述发酵条件为：发酵温度为28℃，pH值7.6，转速200r/min， 发酵时间24h。
本发明还提供一种降解呕吐毒素的方法，该方法包括如下步骤：取按照 上述发酵条件得到的耐盐海杆菌ANSP101的发酵液600-800μL，加入500μg/mL 的呕吐毒素150-200μL，将反应体系的pH值调节为7.0-8.0，在25-30℃反应 2-72h。
本发明还提供一种降解呕吐毒素的活性蛋白及其制备方法，其特征在于， 该活性蛋白来源于所述的耐盐海杆菌菌体细胞。其制备方法为：将发酵液离 心后得菌体，用pH7.4的PBS缓冲液连续洗3次并冷冻离心，最后取菌细胞沉淀 加PBS缓冲液溶解，于冰浴中进行细胞超声波破碎，再将破碎的细胞液冷冻离 心10min，将离心获得的上清液用0.22μm孔径的滤膜过滤，即得活性蛋白溶液。
本发明还提供一种食品或饲料添加剂，其特征在于，
包含耐盐海杆菌ANSP101菌细胞或活性蛋白以及生理上可接受的载体， 所述菌细胞或活性蛋白的含量为1-10％。
所述生理上可接受的载体选自麦芽糖糊精、奶粉、环糊精、蔗糖、淀粉、 小麦、麦麸、稻米、米糠、石灰石、滑石粉或蒙脱石中的一种或多种。
上述添加剂中，耐盐海杆菌ANSP101菌细胞由以下步骤制得：
取活菌浓度为109CFU/mL的所述耐盐海杆菌ANSP101 20mL，接种于1L 培养基中进行摇瓶发酵培养，制得一级种子液；然后再将一级种子液转接到 50L发酵罐中进行发酵培养。
所述发酵条件为：发酵温度为28℃，pH值7.6，转速150r/min，发酵时间 24h。
将发酵液经0.22μm PVDF(聚偏二氟乙烯)膜过滤、冷冻干燥后得菌体。 取菌细胞沉淀加PBS缓冲液溶解，于冰浴中进行细胞超声波破碎，再将破碎的 细胞液冷冻离心10min，将离心获得的上清液用0.22μm孔径的PVDF膜过滤， 即得活性蛋白溶液。
上述添加剂中，还包括微生态制剂，所述微生态制剂为枯草芽孢杆菌、 地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、两歧双歧杆菌、粪肠球菌、 屎肠球菌、乳酸肠球菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、德式乳杆菌乳酸亚种、 植物乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、产朊假丝酵母、婴儿双歧杆菌、长 双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌、嗜热链球菌、罗伊氏乳杆菌、动物 双歧杆菌、米曲霉、纤维二糖乳杆菌、发酵乳杆菌或德氏乳杆菌保加利亚亚 种中的一种或多种，优选的，所述饲料添加剂在用于青贮饲料或牛饲料时， 还含有产丙酸杆菌、布氏乳杆菌和副干酪乳杆菌中的至少一种；或者所述饲 料添加剂在用于禽类、猪和水产养殖动物的饲料时，还含有凝结芽孢杆菌和/ 或侧孢短芽孢杆菌。
上述添加剂中，所述微生态制剂的含量为0-20％。
上述添加剂的制备方法，包括以下步骤：将耐盐海杆菌ANSP101菌细胞 或活性蛋白以及生理上可接受的载体，配制成含有耐盐海杆菌菌菌细胞或活 性蛋白的添加剂，进一步的，或者再与微生态制剂按一定比例混合，得到添 加剂；该添加剂中耐盐海杆菌菌细胞或活性蛋白含量为1-10％。
上述添加剂中，耐盐海杆菌菌细胞或活性蛋白：生理上可接受的载体： 微生态制剂的质量比例可以为：1：79：20或2：78：20或3：77：20或4： 76：20或5：75：20或6：74：20或7：73：20或8：72：20或9：71：20或 10：70：20。
一种降解呕吐毒素的方法，包括将上述耐盐海杆菌菌细胞或活性蛋白或 上述添加剂处理含有呕吐毒素的材料。
上述方法中，所述处理为将上述耐盐海杆菌菌细胞或活性蛋白或上述添 加剂和含有呕吐毒素的材料混合。
上述方法中，所述含有呕吐毒素的材料为猪、鸡、牛、羊、宠物、水产 动物、皮毛动物用全价饲料、浓缩饲料、预混合饲料，谷物、玉米、花生粕、 小麦、燕麦等饲料原料，青贮饲料，粮食、粮油、粮食加工及农副产品、陈 化粮，工业乙醇加工副产物DDGS，食品、茶叶及中草药等。
本发明具有以下有益效果：
1)本发明的耐盐海杆菌发酵液或活性蛋白或添加剂对呕吐毒素的降解率 非常高，在反应24h，其对DON的降解率超过80％，且本解毒反应为不可逆的 生物降解过程。
2)本发明的耐盐海杆菌对呕吐毒素的催化为酶的生物降解作用，其特征 为解毒活性高，作用专一，作用效果温和，不破坏饲料中的营养成分，对饲 料的感官品质没有影响。
3)本发明的耐盐海杆菌降解呕吐毒素的方法操作简单，对饲料、食品和 环境没有污染，克服了传统去毒方法存在的问题。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实 施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1本发明的菌株ANSP101的系统发育树；
图2本发明的菌株ANSP101的扫描电镜图；
图3本发明的菌株ANSP101的耐盐生长曲线；
图4验证本发明的菌株ANSP101胞内酶对DON的降解是否为酶促反应；
图5本发明的菌株ANSP101胞内酶在不同反应时间下对DON的降解率；
图6本发明的菌株ANSP101胞内酶在不同反应温度下对DON的降解率；
图7本发明的菌株ANSP101胞内酶在不同反应pH下对DON的降解率。
具体实施方式
本发明公开了一种能够降解呕吐毒素的耐盐海杆菌(Pelagibacteriumhalotolerans)及其活性蛋白的制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本 文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改 动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发 明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离 本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与 组合，来实现和应用本发明技术。
本发明中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1菌株的筛选与鉴定
菌株的筛选具体步骤如下：
1)菌株筛选：本研究从海洋土壤样品中进行菌种的筛选。
种子液制备：称取1g海洋土壤于无菌试管中，加入9mL无菌生理盐水，于 28℃、140r/min摇床振荡过夜；静置1h后吸取上清液100μL，与900μL的2216E 液体培养基混合，于28℃恒温箱震荡培养12h，得种子液。
其中，2216E液体培养基的配方为：蛋白胨5.0g/L、酵母浸粉1.0g/L、 柠檬酸铁0.1g/L、氯化钠19.45g/L、氯化镁5.98g/L、硫酸钠3.24g/L、氯 化钙1.8g/L、氯化钾0.55g/L、碳酸钠0.16g/L、溴化钾0.08g/L、氯化锶 0.034g/L、硼酸0.022g/L、硅酸钠0.004g/L、氟化钙0.0024g/L、硝酸钠 0.0016g/L、磷酸氢二钠0.008g/L，pH 7.6±0.2；121℃高压蒸汽灭菌20min。
菌株初筛：分别将50μL呕吐毒素(500μg/mL)加入450μL种子液，以不 接菌的2216E液体培养基加呕吐毒素作为空白对照，涡旋震荡混匀，置于28℃ 培养箱静置培养48h，使用高效液相色谱法对其进行呕吐毒素降解率的分析。
菌株复筛：选择具有毒素降解效率的种子液，吸取种子液0.1mL，用发酵 培养基梯度稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，分别取200μL各稀释 样品溶液，涂布于2216E固体培养基的平板，28℃恒温箱培养3d。观察菌落的 形态和特征，将有代表性的菌落逐一挑出，在新鲜的2216E固体培养基平板上 划线纯化，分别编号并转接至2216E固体培养基斜面保存。
将上述分离纯化的菌株按2％接种量接种到2216E液体培养基中，28℃发 酵24h，分别取900μL发酵液，与100μL毒素(500μg/ml)置于18mm×180mm 试管中，以不接菌的培养基加毒素作为空白对照，置于28℃培养箱静置培养 24h，测定毒素的剩余量，计算毒素降解率。
2)菌种鉴定：对降解效率高的菌株进行16S rDNA基因序列测定，将测序 结果在NCBI上进行Blast比对，采用邻近法构建其系统发育树，对菌种进行 鉴定。
鉴定结果：菌ANSP101的16S rDNA基因核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示， 经过序列对比，该菌株ANSP101属于耐盐海杆菌，其系统发育树见图1。
形态观察：扫描电镜图2所示，耐盐海杆菌ANSP101为短杆状，长度1-2μm 不等，未见鞭毛。
实施例2本发明耐盐海杆菌的培养方法
取耐盐海杆菌Pelagibacterium halotolerans ANSP101CGMCC No.17304 2.0mL(活菌浓度为109CFU/mL)，接种于100mL培养基中进行摇瓶发酵培养， 发酵温度为28℃，pH值7.6，转速200r/min，发酵时间24h。
其中，摇瓶发酵培养基由下述组分组成：蛋白胨5.0g，酵母浸粉1.0g， 氯化钠19.45g，氯化镁5.98g，硫酸钠3.24g，氯化钙1.8g，氯化钾0.55g， 碳酸钠0.16g，蒸馏水1000mL，pH为7.6。
发酵结束后，将发酵液保存在4℃冰箱内备用。
实施例3本发明耐盐海杆菌的耐盐特性研究
取耐盐海杆菌Pelagibacterium halotolerans ANSP101CGMCC No.17304 2.0mL(活菌浓度为109CFU/mL)，分别接种于含有0％，0.5％，1％，4％，8％ 以及12％NaCl的100mL发酵培养基中进行培养，发酵温度为28℃，pH值7.6， 转速200r/min，发酵时间24h，分别于接种后每隔3h测定其OD600，绘制不同氯 化钠浓度下ANSP101的生长曲线。
测定结果：耐盐海杆菌ANSP101在NaCl浓度小于4％的培养基中可正常生 长；8％NaCl对其有一定的抑制作用，生长较缓慢；12％NaCl完全抑制菌体的 生长(图3)。
实施例4本发明耐盐海杆菌菌细胞的制备方法
取活菌浓度为109CFU/mL的实施例2所述耐盐海杆菌ANSP101 20mL，接 种于1L培养基中进行摇瓶发酵培养，制得一级种子液；然后再将一级种子液 转接到50L发酵罐中进行发酵培养。
所述发酵条件为：发酵温度为28℃，pH值7.6，转速150r/min，发酵时间 24h。
将发酵液经0.22μm PVDF(聚偏二氟乙烯)膜过滤、冷冻干燥后得菌细胞。
实施例5本发明耐盐海杆菌产生的降解呕吐毒素的活性蛋白的制备方法
取实施例4得到的耐盐海杆菌菌细胞，用pH7.4的PBS缓冲液连续洗3次并 冷冻离心，取菌细胞沉淀加PBS缓冲液，在冰浴中进行细胞超声波破碎，再将 破碎的细胞液在4℃，12000r/min条件下冷冻离心10min，将离心获得的上清 液用0.22μm孔径的PVDF膜过滤，即得活性蛋白溶液。
PBS(0.01mol/L)的制备：称取8g NaCl、0.2g KCl、3.58g Na2HPO4·12H2O 和0.24gKH2PO4，溶于800mL蒸馏水中，用NaOH调节溶液的pH值至7.5，最后 加蒸馏水定容至1000mL。
实施例6验证本发明耐盐海杆菌产生的活性蛋白对DON的降解是否为酶促反 应
取450μL实施例5得到的活性蛋白溶液进行热处理(煮沸加热10min)后与 50μL呕吐毒素(500μg/mL)反应；分别取450μL活性蛋白溶液加入25mg SDS、 1mg蛋白酶K、25mg SDS+1mg蛋白酶K反应24h后，向混合液中加入50μL呕 吐毒素(500μg/mL)；对照组为450μL PBS(0.01mol/L)缓冲液中加入50μL 呕吐毒素(500μg/mL)；分别在28℃反应24h，用HPLC检测呕吐毒素含量。
检测结果表明，活性蛋白溶液对DON的降解率为79％，经过热处理、SDS 处理、蛋白酶K处理及SDS和蛋白酶K联合处理后，活性蛋白溶液对DON的降 解率显著降低，说明耐盐海杆菌产生的活性蛋白对DON的降解为酶促反应(图 4)。
实施例7本发明耐盐海杆菌产生的活性蛋白在不同反应时间下对DON的降解 率
取900μL实施例5得到的耐盐海杆菌活性蛋白溶液于2mL离心管中，加入 100μLDON(500μg/mL)，在40℃避光反应，每隔1h取100μL反应样品，取 至7h，以900μL PBS加100μLDON(500μg/mL)为空白对照，加入等体积甲 醇终止反应，用HPLC检测呕吐毒素的浓度，计算降解率。
检测结果：由图5可知，在40℃条件下，ANSP101产生的活性蛋白在3h时 对DON的降解率已达到最大，此时降解率为80.26％，此后随着时间的增长降 解率维持在80％左右。
实施例8本发明耐盐海杆菌产生的活性蛋白在不同反应温度下对DON的降解 率
取450μL实施例5得到的耐盐海杆菌活性蛋白溶液与50μL呕吐毒素 (500μg/mL)分别在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃反应4h；对照组 为450μL PBS与50μL呕吐毒素(500μg/mL)分别在20℃、30℃、40℃、50℃、 60℃、70℃反应4h，反应结束后加入同等体积甲醇终止反应。
将反应后得到的各样品在4℃，12000r/min冷冻离心5min，将上清液用 0.22μm滤膜过滤，用HPLC检测呕吐毒素的浓度，计算降解率。
检测结果：由图6可知，ANSP101产生的活性蛋白在40℃时对DON的降解 活性最高，此时降解率为80.21％。在20℃、30℃、50℃、60℃、70℃的降解 率分别为38.07％，64.39％，13.86％，10.05％，4.39％。当温度大于40℃时， ANSP101所产活性蛋白对DON的降解活性降低。
实施例9本发明耐盐海杆菌产生的活性蛋白在不同反应pH下对DON的降解 率
取1mL实施例5得到的耐盐海杆菌活性蛋白溶液分别与pH为3.0、4.0、5.0、 6.0、7.0、8.0、9.0、10.0及11.0的缓冲液进行混合，混合均匀后分别取450μL 与50μL呕吐毒素(500μg/mL)在28℃反应24h；对照组为相应的450μL pH缓 冲液与50μL呕吐毒素(500μg/mL)；其中，pH＝3.0-6.0由0.1M柠檬酸和0.1M 柠檬酸三钠配制，pH为7.0-8.0由0.1M磷酸二氢钠进而0.1M磷酸氢二钠配制， pH为9.0-11.0由0.1M甘氨酸和0.1M氢氧化钠配制。
反应结束后加入同等体积甲醇终止反应，将反应后得到的各样品在4℃， 12000r/min冷冻离心5min，将上清液用0.22μm滤膜过滤，用HPLC检测呕吐毒 素的浓度，计算降解率。
检测结果：在pH8.0-10.0范围内，耐盐海杆菌ANSP101所产活性蛋白均保 持较高的降解活性，pH8.0、9.0、10.0的降解率分别84.95％，83.84％和78.69％。 当反应pH为8.0时，降解率最高；当pH<7.0时，ANSP101所产活性蛋白对DON 的降解活性被明显抑制；当pH等于7.0时，其降解率为30.63％；当pH等于11.0 时，其降解率为14.52％(图7)。
实施例10一种添加剂及其制备方法
称取添加剂总质量的90％的载体(麦麸与米糠按质量比4:1比例混合)， 然后再按添加剂总质量的10％的比例混入耐盐海杆菌ANSP101菌细胞或活性 蛋白以，得到添加剂。
实施例11一种添加剂及其制备方法
称取添加剂总质量的45％的载体(米糠与滑石粉按质量比10:1比例混合)， 然后再按添加剂总质量的5％的比例混入耐盐海杆菌ANSP101菌细胞或活性蛋 白，最后按添加剂总量的50％混入凝结芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌混合制剂粉 (凝结芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌质量比为1：1)，得到添加剂。
实施例12一种添加剂及其制备方法
先将占添加剂总质量的70％的淀粉与占添加剂总质量的20％的短小芽孢 杆菌混合，然后再按添加剂总质量的10％的比例混入耐盐海杆菌ANSP101菌细 胞或活性蛋白，得到添加剂。
以上对本发明所提供的耐盐海杆菌ANSP101菌细胞或活性蛋白或添加剂 在呕吐毒素脱毒中的应用进行了详细介绍。本文应用了具体个例对本发明的 原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的 方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域技术人员来说，在不脱离本 发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰 也落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 一种降解呕吐毒素的耐盐海杆菌及其应用
<130> MP1917972Z
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1381
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccagggcggc agcttacaca tgcaagtcga acgaagtctt cggacttagt ggcagacggg 60
tgagtaacgc gtgggaatct acccagttct ctggaataac tgatggaaac gtcagctaat 120
accggatacg cccttttggg gaaagattta tcgggattgg atgagcccgc gtaagattag 180
ctagttggtg gggtaatggc ctaccaaggc gacgatcttt agctggtctg agaggatgat 240
cagccacact gggactgaga cacggcccag actcctacgg gaggcagcag tggggaatat 300
tggacaatgg gggcaaccct gatccagcca tgccgcgtga gtgatgaagg ccttagggtt 360
gtaaagctct ttcaccggtg aagataatga cggtaaccgg agaagaagcc ccggctaact 420
tcgtgccagc agccgcggta atacgaaggg ggctagcgtt gttcggaatt actgggcgta 480
aagcgcacgt aggcggatat ttaagtcagg ggtgaaatcc cggagctcaa ctccggaact 540
gcctttgata ctggatatct agagaccgag agaggtaagt ggaactccta gtgtagaggt 600
ggaattcgta gatattagga agaacaccag tggcgaaggc ggcttactgg ctcggaactg 660
acgctgaggt gcgaaagcgt ggggagcaaa caggattaga taccctggta gtccacgccg 720
taaactatga gagctagccg ttggggtgtt tacacttcag tggcgcagct aacgcattaa 780
gctctccgcc tggggagtac ggtcgcaaga ttaaaactca aaggaattga cgggggcccg 840
cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta ccagcccttg 900
acatcccggt cgcgctttcc agagatggat tgcttcagtt cggctggacc ggtgacaggt 960
gctgcatggc tgtcgtcagc tcgtgtcgtg aagatgtttg ggttaacccc gcaacgagcg 1020
caaccctcgc ctttagttgc catcatttgg ttgggcactc tagagggact gccggtgata 1080
agccggagga aggtggggat gaggtcaagt catcatggcc cttacgggct gggctacaca 1140
cgtgctacaa tggtggtgac agagggcagc taggccgcga ggtcatgcta atcccaaaaa 1200
accatctcag ttcggattgc actctgcaac tcgggtgcat gaagttggaa tcgctagtaa 1260
tcgcagatca gcatgctgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca 1320
ccatgggagt tggttctacc cgaagccggt gcgctaacct tttggaggca gccgaccatc 1380
c 1381

Claims (11)

1.一种降解呕吐毒素的耐盐海杆菌Pelagibacterium halotolerans ANSP101，其保藏编号为CGMCC No.17304。
2.一种权利要求1所述的耐盐海杆菌的培养方法，其特征在于，取活菌浓度为109CFU/mL的所述耐盐海杆菌0.5-2.5mL，接种于50-100mL培养基中进行摇瓶发酵培养，所述发酵培养基由如下组分组成：蛋白胨4.0-6.0g，酵母浸粉0.5-3.0g，氯化钠18.0-21.0g，氯化镁4.0-7.0g，硫酸钠2.0-4.0g，氯化钙1.0-3.0g，氯化钾0.5-1.0g，碳酸钠0.1-0.3g，加蒸馏水至800-1200mL，pH值为7.4-7.8；所述摇瓶发酵的条件为：发酵温度26-32℃，发酵时间20-30h，转速180-220r/min，pH值7.4-7.8。
3.一种降解呕吐毒素的方法，其特征在于，取权利要求1所述的耐盐海杆菌ANSP101CGMCC No.17304的发酵液600-800μL，加入500μg/mL的呕吐毒素150-200μL，将反应体系的pH值调节为7.0-8.0，在25-30℃反应2-72h。
4.一种降解呕吐毒素的活性蛋白的制备方法，其特征在于，将耐盐海杆菌ANSP101CGMCC No.17304发酵液离心得菌体，用pH7.4的PBS缓冲液连续洗3次并冷冻离心，取菌细胞沉淀加PBS缓冲液，在冰浴中进行细胞超声波破碎，再将破碎的细胞液冷冻离心10min，将离心获得的上清液用0.22μm孔径的滤膜过滤，即得活性蛋白。
5.权利要求4所述的制备方法制得的降解呕吐毒素的活性蛋白。
6.权利要求1所述的耐盐海杆菌及权利要求4所述的活性蛋白在呕吐毒素生物脱毒上的应用。
7.一种食品或饲料添加剂，其特征在于，包含权利要求1所述的耐盐海杆菌或权利要求4所述的活性蛋白以及生理上可接受的载体，所述耐盐海杆菌或活性蛋白的含量为1-10％。
8.根据权利要求6所述的食品或饲料添加剂，其特征在于，所述生理上可接受的载体选自麦芽糖糊精、奶粉、环糊精、蔗糖、淀粉、小麦、麦麸、稻米、米糠、石灰石、滑石粉或蒙脱石中的一种或多种。
9.根据权利要求6所述的食品或饲料添加剂，其特征在于，还含有微生态制剂，所述微生态制剂为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、两歧双歧杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、乳酸肠球菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、德式乳杆菌乳酸亚种、植物乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、产朊假丝酵母、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌、嗜热链球菌、罗伊氏乳杆菌、动物双歧杆菌、米曲霉、纤维二糖乳杆菌、发酵乳杆菌或德氏乳杆菌保加利亚亚种中的一种或多种，优选的，所述饲料添加剂在用于青贮饲料或牛饲料时，还含有产丙酸杆菌、布氏乳杆菌和副干酪乳杆菌中的至少一种；或者所述饲料添加剂在用于禽类、猪和水产养殖动物的饲料时，还含有凝结芽孢杆菌和/或侧孢短芽孢杆菌。
10.一种降解呕吐毒素的方法，其特征在于，包括步骤如下：
将权利要求1所述的耐盐海杆菌或权利要求4所述的活性蛋白或权利要求7所述的添加剂处理含有呕吐毒素的材料，该素材包括但不限于猪、鸡、牛、羊、宠物、水产动物、皮毛动物用全价饲料、浓缩饲料、预混合饲料，谷物、玉米、花生粕小麦、燕麦等饲料原料，青贮饲料，粮食、粮油、粮食加工及农副产品、陈化粮，工业乙醇加工副产物DDGS，食品、茶叶及中草药。
11.权利要求1所述的耐盐海杆菌ANSP101 CGMCC No.17304或权利要求4所述的活性蛋白或权利要求6所述的添加剂在猪、鸡、牛、羊、宠物、水产动物、皮毛动物用全价饲料、浓缩饲料、预混合饲料，谷物、玉米、花生粕小麦、燕麦等饲料原料，青贮饲料，粮食、粮油、粮食加工及农副产品、陈化粮，工业乙醇加工副产物DDGS，食品、茶叶及中草药中呕吐毒素生物脱毒中的应用。
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