CN113215018A - 一株植物乳杆菌植物亚种及其在豆粕和北艾混合发酵中的应用 - Google Patents
一株植物乳杆菌植物亚种及其在豆粕和北艾混合发酵中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及微生物领域，具体涉及一株植物乳杆菌植物亚种及其在豆粕和北艾混合发酵中的应用，本发明的植物乳杆菌植物亚种（Lactobacillus plantarum subsp.plantarum）P15，在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO：M 2020853，具有耐温、耐盐、耐酸碱等抗逆性，并能有效抑制有害杂菌的生长或产生，同时对豆粕和汤阴北艾混合发酵有良好效果，提高了乳酸和黄酮的含量，同时产生了大量益生菌，而且有效地抑制了ETEC K88；尤其是在发酵后打开饲喂的开封阶段，依然能较好地改善饲料的品质。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体涉及一株植物乳杆菌植物亚种及其在豆粕和北艾混合发酵中的应用。
背景技术
产肠毒素性大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)K88是导致断奶仔猪细菌性腹泻的主要微生物，由仔猪细菌性感染性腹泻造成的经济损失在养猪业中能达26％之多。
豆粕作为畜牧业的主要饲料之一，含有的丰富的氨基酸足以平衡动物正常生长所需蛋白质，是畜禽、鱼类等动物的重要植物性日粮蛋白来源，在现代养殖过程中可以大部分或者全部替代鱼粉等优质动物源性饲料，从而大大降低养殖成本。然而，豆粕中含有大量可诱发动物腹泻大分子蛋白和致敏蛋白，会导致饲料利用率低、适口性差等一系列问题。目前针对豆粕中大分子蛋白和致敏蛋白的处理方法，微生物发酵是主要且重要的一种，通过微生物的发酵，可以最大限度地消除豆粕中的抗营养因子、有效地降解大豆大分子蛋白为优质小肽，并能产生益生菌、寡肽、谷氨酸、乳酸、维生素、未知生长因子等一系列活性物质；经过发酵的豆粕具有独特酸香味，能够提高适口性、改善营养物质消化吸收、减少腹泻促进生长的功效。大量报道表明，益生菌可以保护动物免受病原体引起的损伤和炎症、调节肠道微生物菌群、增强消化道功能、改善动物生长性能。乳酸菌是最常见、最典型的应用益生菌之一，在自然界中广泛存在。目前对发酵豆粕的研究，所用菌种一般为市售，菌株背景不够清晰；最长的发酵周期一般是到64或72小时，至于延长发酵时间会出现什么结果，只有本课题组前期的研究-产蛋白酶乳酸菌的筛选及其应用于豆粕发酵初探(于豪杰，2020)，初步报道了发酵30天过程中所筛选乳酸菌菌株对豆粕发酵过程中微生物多样性、发酵品质和化学成分及大分子蛋白降解情况的影响。专利一种嗜热链球菌固态发酵制备发酵豆粕的方法(CN111264684A)只在于利用菌种处理豆粕，没有关于菌种的来源及优良机能筛选；一种低水分且高度抑菌的替抗乳酸菌发酵饲料及其制备方法和应用(CN 110839773A)公开了抑菌的替抗乳酸菌发酵饲料及其制备方法和应用，主要是通过复合乳酸菌特定菌种之间的协同作用，促进乳酸菌发酵分泌抑菌物质以达到抑菌效果，也没有关于菌种的筛选，菌种来源不清晰；粪肠球菌及其应用与其饲料添加剂和发酵剂(CN 102517227B)，涉及一株粪肠球菌的筛选及其应用于其饲料添加剂和发酵剂，所用的指示菌只是大肠杆菌K88、K99和金黄色葡萄球菌，对豆粕发酵品质情况不清楚；一种粪肠球菌ANSE228及其应用(CN 102031235A)提供了一株粪肠球菌在抑制鸡白痢沙门氏菌和或大肠杆菌和或金黄色葡萄球菌中的应用，但没有在发酵饲料中的应用。
汤阴北艾(Artemisia vulgaris L.)是河南省安阳市汤阴县特产、中国国家地理标志产品，居中国四大名艾之首，可全草入药，有温气血、逐寒湿、止血、温经、安胎等功效；汤阴北艾产量高，2017年，汤阴北艾规模种植达到1.5万亩，年产量达15000吨。营养成分丰富，粗蛋白、粗脂肪、无氮浸出物含量较高；艾叶中富含多糖、精油、黄酮、矿物质、微量元素、鞣酸以及维生素A、B1、B2、C等多种功效成分，是一种极具开发价值的天然植物资源。研究发现，艾灸可治疗因感染大肠杆菌致腹泻的猪，说明艾灸对控制猪早期诱发大肠杆菌性腹泻有较好的作用；在饲料中添加1.5～4％艾叶粉，日增重可提高5～10％，节省饲料8～12％。但艾草纤维含量高且有特殊气味，影响其适口性和单胃动物对其消化和利用。目前关于艾草的发酵，主要有专利(CN 202010838482.3)提供发酵艾草在制备提高肉鸡生产性能和抗氧化能力的产品中的应用，直接在粉碎的全株艾草中加入1％复合益生菌(v/w)和1.5％的纤维素酶(w/w)，在37℃恒温箱培养4天后，添加到动物饲料中以期提高肉鸡生产性能和抗氧化能力；用纤维素酶与复合益生菌发酵提高艾草发酵产物品质的方法(CN201910414970.9)发明实施例提供一种用纤维素酶与复合益生菌发酵提高艾草发酵产物品质的方法，目的是获得较高含量、抗氧化能力较好的艾草活性成分。
畜牧业是世界范围内的重要产业，养殖业对益生菌的需求量较大，而饲用益生菌市场尚处于初级阶段，目前商品化的益生菌产品数量较少；目前发酵豆粕所用菌种背景不够清晰，且发酵周期较短，开封后发酵豆粕如何保存、是否会出现二次污染滋生杂菌等问题都没有报道。因此，本发明旨在通过分离猪源乳酸菌菌株，筛选出生长性能良好的抗ETECK88乳酸菌菌株，和同样具有抑菌能力的汤阴北艾一起添加到豆粕中进行发酵，考查连续发酵30天过程中及发酵后再次打开暴露在空气中豆粕的发酵特性，以期为微生态制剂的开发提供益生菌资源，为发酵豆粕及汤阴北艾的充分利用和新型发酵饲料开发提供参考。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足而提供一株植物乳杆菌植物亚种及其在豆粕和北艾混合发酵中的应用。
本发明的第一个目的是提供一株乳酸菌：植物乳杆菌植物亚种。
本发明所提供的乳酸菌具体为植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarumsubsp.plantarum)P15，该菌株已于2020年12月4日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内武汉大学保藏中心)，其保藏编号为CCTCC NO：M 2020853。
所述植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)P15CCTCC NO：M 2020853从中国河南省新乡市某猪场断奶健康仔猪粪便中分离得到的，该菌株在固体培养基上的单菌落外观形态为白色光滑凸起圆形，革兰氏染色阳性，革兰氏染色后显微镜下观察菌体呈短杆状、不产芽孢，不具有过氧化氢酶，兼性厌氧，发酵葡萄糖不产气，发酵类型为同型发酵；在5和45℃可以生长，在10℃生长良好，50℃时长势微弱，表明该菌株有良好的耐低温和耐高温性；在3.0％NaCl中生长良好，6.5％的NaCl中也可以生长，有较好的耐盐性；在pH为3.0、3.5、4.0、9.0和10.0时表现为生长，当pH值为4.5～8.0时生长性能良好，表明该菌株具有优良的耐酸碱性能，对羧苄青霉素、头孢美辛、克林霉素和氯霉素均有敏感性，而对阿米卡星和诺氟沙星有抗性，对庆大霉素和青霉素的耐药性处于中等水平，不具有溶血性能；表明该菌株具有良好的生理生化特性和安全性。其16S DNA序列如序列表中序列1所示。
本发明的第二个目的是提供一种菌剂。
本发明所提供的菌剂的活性成分为所述植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillusplantarum subsp.plantarum)P15 CCTCC NO：M 2020853。
本发明的第三个目的是提供一种豆粕和北艾混合发酵的接种剂。
本发明所提供的豆粕和北艾混合发酵的接种剂的活性成分为所述的植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)P15 CCTCC NO：M 2020853或其发酵产物或其菌悬液或其培养液。
所述的豆粕和北艾的混合，是北艾在豆粕中的添加量为1～20％。
所述的北艾，是汤阴北艾地上部分全草干燥至水分含量为5～10％后，粉碎过10～40目筛的颗粒，或者是切成2～20mm的小段。
所述的植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)P15在所述的豆粕和汤阴北艾的混合料中的接种量为1～20％。P15的添加方式为P15发酵12～48小时的菌液与豆粕及汤阴北艾搅拌混匀，或者是P15发酵12～48小时后的固态菌粉与豆粕及汤阴北艾搅拌混匀。
所述植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)P15CCTCC NO：M 2020853或所述的菌剂在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：
(a1)抑制ETEC K88；
(a2)抑制细菌；
(a3)制备细菌生长抑制剂；
(a4)制备权利要求3所述的豆粕和北艾混合发酵的接种剂。
在所述(a2)和(a3)中，所述细菌具体为大肠杆菌(Escherichia coli)和/或肠炎沙门氏菌(Salmonella enterica)，和/或金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，和/或铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，和/或单核细胞李斯特菌(Listeriamonocytogenes)，和/或藤黄微球菌(Micrococcus luteus)，和/或枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。
所述的植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)P15CCTCC NO：M 2020853或所述菌剂对所述细菌的抑制为30～37℃条件下的抑制。
本发明所提供的植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarumsubsp.plantarum)P15 CCTCC NO：M 2020853具有耐温、耐盐、耐酸碱等抗逆性，并能有效抑制有害杂菌的生长或产生，同时对豆粕和汤阴北艾混合发酵有良好效果。本发明通过豆粕和汤阴北艾混合发酵，分析比较了微生物、发酵品质(pH、有机酸和氨态氮)、黄酮含量。
与现有技术相比，本发明的改进在于：通过单因素试验和响应面试验，确定了植物乳杆菌植物亚种P15发酵豆粕和汤阴北艾混合物的发酵工艺，提高了乳酸和黄酮的含量，同时产生了大量益生菌，而且有效地抑制了ETEC K88；尤其是在发酵后打开饲喂的开封阶段，依然能较好地改善饲料的品质。本发明通过对发酵工艺的优化，使所筛选植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)P15最大程度发酵生产适口性好、营养丰富且含有大量益生菌的生物活性饲料。既为抑制ETEC K88提供微生物菌剂、为发酵制备替代抗生素的饲料益生菌剂提供基础数据，又对我国豆粕和艾草的综合利用和资源开发具有重要意义。
保藏说明
菌种名称：植物乳杆菌植物亚种
拉丁名：Lactobacillus plantarum subsp.plantarum
菌株编号：P15
保藏机构：中国典型培养物保藏中心
保藏机构简称：CCTCC
地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内武汉大学保藏中心
保藏日期：2020年12月4日
保藏中心登记入册编号：CCTCC NO：M 2020853。
附图说明
图1是本发明的菌株P15的系统发育树。
图2是细菌基因组的recA扩增图。
其中，图2中M指marker，含有2000bp的PLUS DNA梯度，其中条带1、2、3、4和5的PCR扩增产物分别来自模式菌株干酪乳杆菌(Lactobacillus casei JCM 16167T，阴性对照)、类植物乳杆菌(Lactobacillus paraplantarum JCM12533T)、戊糖乳杆菌(Lactobacilluspentosus JCM 1558T)、植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarumsubsp.plantarum JCM 1149T)和植物乳杆菌斯特拉斯堡亚种(Lactobacillus plantarumsubsp.argentoratensis JCM 16169T)，条带6的PCR扩增产物来自植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)P15。
图3是实施例4中豆粕和汤阴北艾混合发酵的单因素试验结果对比图。
图4是实施例4中发酵时间和接种量对豆粕发酵液pH影响的等高线和响应曲面结果图。
图5是实施例4中发酵时间和料液比对豆粕发酵液pH影响的等高线和响应曲面结果图。
图6是实施例4中接种量和料液比对豆粕和汤阴北艾发酵液pH影响的等高线和响应曲面结果图。
图7是实施例5中豆粕和汤阴北艾混合发酵3天后开封暴露7天状态对比图(图中左图为空白对照组，右图为P15组)。
图8是实施例5中豆粕和汤阴北艾混合发酵30天后开封暴露7天状态对比图(图中左图为空白对照组，右图为P15组)。
图9是实施例5中芦丁标准曲线。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂、培养基等如无特殊说明，均可从商业途径和/或公开资料中得到。
实施例1、植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)P15 CCTCC NO：M 2020853的分离与鉴定
一、植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)P15的分离
准确称取20g取自中国河南省濮阳市某猪场断奶健康仔猪粪便样品，放入装有180mL无菌水的三角瓶中，用封口膜封口，放入180r/min的摇床中震荡30分钟，使微生物充分分散，静置20秒，即成10-1的稀释液；吸取100μL 10-1的稀释液，加入装有900μL无菌水的离心管中，充分混匀后，即成10-2稀释液；再吸取100μL 10-2稀释液，加入装有900μL无菌水的离心管中，混匀即成10-3稀释液；用同样方法连续稀释，制成10-4、10-5等一系列稀释菌液。取装有121℃、15分钟灭菌的MRS培养基，用记号笔在每个培养皿的3个120℃的扇形标出10-1、10-3、10-5等3种稀释度；然后再分别从10-1、10-3、10-5稀释液管中吸取20μL，滴在对应的培养基表面的扇形区域内，再用涂布棒在培养基上均匀涂抹菌液。涂抹好的培养基静置25分钟后装入厌氧盒中，37℃恒温培养箱培养48小时取出计数，挑取单菌落进行编号，其中一株菌编为P15，并进一步在灭菌的MRS培养基上纯化培养两次后，保存于-80℃超低温冰箱中待用。
二、植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)P15的鉴定
1、形态学鉴定
步骤一中分离得到的菌株P15，该菌株在固体培养基上的单菌落外观形态为圆形、乳白色、表面凸起有光泽、边缘整齐；革兰氏染色后显微镜下观察菌体呈短杆状、不产芽孢。
2、生理生化特征鉴定
步骤一中分离并筛选得到的植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarumsubsp.plantarum)P15为革兰氏染色阳性，不具有过氧化氢酶，发酵葡萄糖不产气，发酵类型为同型发酵。
检测植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)P15对常见的34种不同碳源的发酵利用情况。结果如表1所示。可见，菌株P15不能发酵利用甘油、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、阿东糖醇、D-木糖、β-甲基木糖苷、杜冷丁醇、肌醇、水杨素、纤维二糖、松三糖、棉子糖、淀粉、糖原、木糖醇、D-呋喃糖、D-羟乙基糖、D-塔加糖和D-褐藻糖做碳源；可以发酵利用半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、L-山梨糖、鼠李糖、甘露醇、山梨醇、麦芽糖、乳糖、蜜二糖、蔗糖和海藻糖做碳源；可以微弱利用核糖和β-龙胆二糖做碳源进行发酵。
表1、菌株P15对不同碳源的利用情况
| 甘油 | 核糖 | D-阿拉伯糖 | L-阿拉伯糖 | 阿东糖醇 | D-木糖 | β-甲基木糖苷 |
| - | w | - | - | - | - | - |
| 半乳糖 | D-葡萄糖 | D-果糖 | D-甘露糖 | L-山梨糖 | 鼠李糖 | 杜冷丁醇 |
| + | + | + | + | + | + | - |
| 肌醇 | 甘露醇 | 山梨醇 | 水杨素 | 纤维二糖 | 麦芽糖 | 乳糖 |
| - | + | + | - | - | + | + |
| 蜜二糖 | 蔗糖 | 海藻糖 | 松三糖 | 棉子糖 | 淀粉 | 糖原 |
| + | + | + | - | - | - | - |
| 木糖醇 | β-龙胆二糖 | D-呋喃糖 | D-羟乙基糖 | D-塔加糖 | D-褐藻糖 | |
| - | w | - | - | - | - |
注：“+”表示阳性，能够利用；“-”表示阴性，不能利用。
3、16S DNA序列同源性分析及recA扩增
步骤一所得的菌株P15在MRS固体平板上活化培养48h备用。
选用细菌的16S DNA基因扩增的通用引物27F和1492R进行PCR扩增，经过30个循环后，在1％琼脂糖凝胶中电泳，所用Marker含有1.5Kb条带。电泳结束后，用EB溶液染色，在紫外凝胶成像系统下观察。对菌落PCR产物进行测序，将测序所得长度约1500bp左右的16SrDNA序列在GeneBank中使用Blast程序寻找与其最大同源性的序列，确定菌到种的水平。如图1所示，16S DNA序列同源性分析结果将步骤一所得的菌株P15鉴定到植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)簇，但是无法将其鉴定到种。
将P15和标准菌株植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarumsubsp.plantarum)，植物乳杆菌斯特拉斯堡亚种(Lactobacillus plantarumsubsp.argentoratensis)，戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)和类植物乳杆菌(Lactobacillus paraplantarum)进行recA基因扩增产物的比对。
结果如图2所示，条带6来自待鉴定菌株P15的PCR扩增产物，和条带4来自植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum JCM 1149T)的PCR扩增产物一样，都是318bp，因此，将菌株P15鉴定为植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarumsubsp.plantarum)，并于2020年12月4日，将植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillusplantarum subsp.plantarum)P15保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学，武汉大学保藏中心，邮编430072)，保藏号为CCTCC NO：M2020853，其分类命名为植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarumsubsp.plantarum)P15CCTCC NO：M 2020853。
实施例2、植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)P15抑制ETEC K88的特性及生理生化特性
一、植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)P15抑制ETEC K88能力测定
采用琼脂块扩散法测定植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarumsubsp.plantarum)P15对ETEC K88的拮抗作用。将目标菌ETEC K88在Luria-Bertani(LB)液体培养基中37℃、180rpm培养12h，随后取100uL过夜培养物在LB琼脂培养基中加入K88，冷却至50℃，摇动，搅拌均匀后倒入已经凝固的LB琼脂板的表面。凝固后，用直径10.00mm的打孔器在琼脂板中心打孔，加入200uL培养16h的P15菌液。分别以未接种的空白MRS肉汤和青霉素为阴性和阳性对照。在4℃下扩散2h后测定抑菌圈直径，发现P15的直径为28mm。
二、植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)P15在不同温度、pH及盐浓度下的生长
1、不同pH下植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)P15的生长
分别在pH为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、8.0、9.0和10.0的液体MRS培养基(pH6.5)中接种P15，同时设置不加菌液的MRS液体培养基作对比，37℃下放置于恒温培养箱培养7天后，用分光光度计测定600nm处光吸收值。实验设置3个重复，结果取平均值。
结果如表2所示，在pH为3.0、3.5、4.0、9.0和10.0时，植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)P15表现为生长，当pH值为4.0～8.0时表现出良好生长性能，表明该菌株具有优良的耐酸碱性能。
表2、菌株P15的耐pH情况
注：“++”表示生长良好，“+”表示能够生长(OD600大于等于0.4为生长良好，大于等于0.3小于0.4为能够生长)。
2、不同温度下植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarumsubsp.plantarum)P15的生长
将活化的植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)P15接种于MRS液体培养基，分别在4、10和50℃温度下恒温培养，不加菌液的MRS液体培养基做空白对照；其中4和10℃条件分别培养14天，50℃下培养7天，用分光光度计测定600nm处光吸收值。实验设置3个重复，结果取平均值。
结果如表3所示，可见植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarumsubsp.plantarum)P15在5和45℃可以生长，在10℃生长良好，50℃时长势微弱，说明该菌株有较好的耐低温和良好的耐高温性能。
表3、菌株P15的耐温情况
注：“++”表示生长良好，“+”表示能够生长，“w”表示能够微弱生长(OD600大于等于0.4为生长良好，大于等于0.3小于0.4为能够生长，小于0.3大于0.2为微弱生长)。
3、不同盐浓度下植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarumsubsp.plantarum)P15的生长
将活化的植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)P15分别接种在3.0和6.5％(w/v)NaCl的液体MRS培养基(pH 6.5)中，设置不加菌液的MRS液体培养基作对比，37℃下放置于恒温培养箱培养48小时，用分光光度计测定OD600的光吸收值。实验设置3个重复，结果取平均值。
结果如表4所示，植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarumsubsp.plantarum)P15在3.0％盐度生长良好，在6.5％的浓度下都可以生长，表明该菌株具有较好的耐盐性。
表4、菌株P15的耐盐情况
注：“+”表示能够生长(OD600大于等于0.3小于0.4为能够生长)。
4、不同酸度下植物乳杆菌植物亚种植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillusplantarum subsp.plantarum)P15的生长
用pH 2.5的MRS液体培养基评估植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarumsubsp.plantarum)P15的低pH耐受性，设置pH 6.2作为对照。将LAB P15分别pH 2.5和pH6.2条件下30℃培养2、4、6小时，然后在30℃孵育20小时后，用分光光度计测定600nm处光吸收值。实验设置3个重复，结果取平均值。
结果如表5所示，植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarumsubsp.plantarum)P15在pH 2.5的酸性条件下培养2小时和4小时后，OD依然达到1.325和1.220，生长良好，表明该菌株具有较好的耐酸性。
表5、菌株P15在不同酸度下生长情况
实施例3、植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)P15的耐胆盐、模拟胃肠道及细菌生长抑制剂的制备及应用
一、植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)P15的耐胆盐测定
将活化的植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)P15的种子液按2％的比例与0.5％的胆盐溶液混合均匀，在室温条件下分别在0、2、4和6小时培养取样，然后在30℃孵育48小时后，用分光光度计测定600nm处光吸收值。实验重复3次，结果取平均值。
结果如表6所示，在6小时的胆盐耐受实验中，植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)P15的OD600都达到1.0以上，与对照组0％胆盐相比，其生长性能稍弱，但与0小时起始菌株的0.148相比均有显著增加，表明其具有较好的胆盐耐受性。
表6、菌株P15的耐胆盐情况
二、植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)P15的模拟胃肠道测定
将活化两代的植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarumsubsp.plantarum)P15发酵液2mL，12000r/min离心2分钟，加入2mL无菌生理盐水重悬，按2％接种量接种到人工胃液(pH 3.0)、肠液和无菌生理盐水中，30℃培养3小时。每个实验组各取20μL样液，均匀涂布在MRS固体培养基上，30℃培养48小时，计算各个实验组的菌落数。实验重复3次，结果取平均值。
结果如表7所示，植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarumsubsp.plantarum)P15菌株活菌数在人工胃液中3个小时仍能够维持7.32×107cfu/mL，与0小时的活菌数7.13×107cfu/mL相差不大，表明其具有一定的胃液耐受性；P15菌株活菌数在3小时肠液中处理后，存活数仍有2.65×106cfu/mL，表明其具有一定的肠液耐受性。
表7、菌株P15在模拟胃肠道存活情况
三、植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)P15制备细菌生长抑制剂
将活化两代的植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarumsubsp.plantarum)P15传代液体MRS培养基制成发酵液，6000r/min离心除去MRS液体培养基后，把沉积于离心管底部的菌体用无菌水调OD值至0.8制成细菌生长抑制剂。
按照2％的接种量采用琼脂扩散法，将引起肠胃问题的常见菌株：大肠杆菌(Escherichia coli)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enterica)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、单核细胞李斯特菌(Listeria monocytogenes)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)和/或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)作为指示菌接种于营养肉汤培养基，在37℃下培养24小时，取20μL细菌生长抑制剂接到20mL冷却到45℃的MRS液体培养基中，充分混合均匀，待其完全凝固之后，用直径1cm的打孔器打孔，然后将培养好的产蛋白酶菌液加入到各孔中，每个孔中加200μL菌液，在37℃条件下培养48小时，观察抑菌圈的直径，以MRS液体培养基取代发酵液作为对照。实验重复3次，结果取平均值。
结果如表8所示，可见在37℃培养条件下，植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillusplantarum subsp.plantarum)P15对铜绿假单胞菌、单核细胞李斯特菌、藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和肠炎沙门氏菌6种指示菌均有不同程度的抑制作用，其中对单核细胞李斯特菌和大肠杆菌有明显的抑制作用。
表8、菌株P15细菌生长抑制剂的抑菌活性
| 菌株 | 铜绿假单胞菌 | 单核细胞李斯特菌 | 藤黄微球菌 | 枯草芽孢杆菌 | 大肠杆菌 | 肠炎沙门氏菌 |
| P15 | +++ | ++++ | +++ | +++ | ++++ | +++ |
注：“+++”表示抑菌圈直径在18.00～22.00mm，“++++”表示抑菌圈直径大于22.00mm。
实施例4、添加植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarumsubsp.plantarum)P15混合发酵豆粕和汤阴北艾条件的优化
一、单因素实验
在200g豆粕和汤阴北艾里面按照10％接种量加入P15，分别加入1:0.8、1:0.9、1:1.0、1:1.1、1:1.2料液比(Kg/L)的无菌水，室温下发酵72小时。
在200g豆粕和汤阴北艾里面加入1:1.0的料液比(L/Kg)的无菌水，分别加入5.0％、7.5％、10％、12.5％、15％接种量的P15，室温下发酵72小时。
在200g豆粕和汤阴北艾里面按照10％接种量加入P15，1:1.0料液比(L/Kg)的无菌水，分别在室温下发酵24、36、48、60、72小时。
如图3所示，随着料水比的增加，发酵液pH值呈现先升高后降低再升高的趋势，在料水比1:1.1处有最低pH值，确定1:1.1的比例为最佳发酵料水比。随着菌液接种量的增加，发酵液pH值呈现先降低后升高的趋势，在10％的接种量处有最低pH值，确定10％的接种量为最佳发酵菌株接种量。随着发酵时间的增加，发酵液pH值呈现降低趋势，在发酵72小时处有最低pH值，确定72小时为最佳发酵时间。
二、响应面实验
根据单因素试验结果，设定每个因素的最佳水平为0水平，每个因素选择三个水平，进行响应面优化。因素水平表和响应面试验设计表分别见表9和10。
表9、响应面水平因子设计和编码
表10、响应面优化实验设计方案及实验结果
对响应面试验进行方差分析，见表11，分析模型的回归性和稳定性，以及各因素对响应值影响力的大小。
表11、响应面回归方程方差分析结果
| 模型项 | 平方和 | 自由度 | 均方 | F值 | 概率p>F | 显著性 |
| 模型 | 0.043 | 9 | 4.766E-003 | 5.46 | 0.0179 | * |
| X<sub>1</sub> | 0.018 | 1 | 0.018 | 20.80 | 0.0026 | ** |
| X<sub>2</sub> | 9.888E-004 | 1 | 9.888E-004 | 1.13 | 0.3223 | |
| X<sub>3</sub> | 2.092E-004 | 1 | 2.092E-004 | 0.24 | 0.6393 | |
| X<sub>1</sub>X<sub>2</sub> | 4.941E-004 | 1 | 4.941E-004 | 0.57 | 0.4762 | |
| X<sub>1</sub>X<sub>3</sub> | 1.133E-004 | 1 | 1.133E-004 | 0.13 | 0.7292 | |
| X<sub>2</sub>X<sub>3</sub> | 1.229E-003 | 1 | 1.229E-003 | 1.41 | 0.2739 | |
| X<sub>1</sub><sup>2</sup> | 6.361E-003 | 1 | 6.361E-003 | 7.29 | 0.0306 | * |
| X<sub>2</sub><sup>2</sup> | 2.010E-004 | 1 | 2.010E-004 | 0.23 | 0.6458 | |
| X<sub>3</sub><sup>2</sup> | 2.560E-003 | 1 | 2.560E-003 | 2.94 | 0.1304 | |
| 残差 | 6.105E-003 | 7 | 8.722E-004 | |||
| 失拟度 | 5.209E-003 | 6 | 8.682E-004 | 0.97 | 0.6511 | |
| 纯误差 | 8.961E-004 | 1 | 8.961E-004 | |||
| 总和 | 0.049 | 16 |
注：*表示差异显著(p≤0.05)，**表示极显著(p≤0.01)。
三元二次多项回归方程如下:
pH＝4.44-0.056*X1-0.011*X2-4.781E-003*X3+0.014*X1*X2+5.040E-003*X1*X3-0.017*X2*X3+0.044*X12+7.834E-003*X22-0.026*X32
用软件预测最优值，得知料水比1:1.0，菌接种量12.37％，发酵时间63.41h，为最优发酵条件，此时发酵液pH值为4.382，但是考虑到实际操作问题，将条件调整为料水比1:1.0，菌接种量12.0％，发酵时间64h，在该条件下进行3次平行试验来验证模型的准确性，3次实际测得发酵液pH平均值为4.383，与预测值无显著差异，说明模型准确性好，即此模型可以用于豆粕的发酵的条件。
实施例5、添加植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarumsubsp.plantarum)P15混合发酵豆粕和汤阴北艾
综合单因素和响应面结果，豆粕和汤阴北艾混合发酵的最佳条件为：料水比1:1.0，菌接种量12.0％，发酵时间为64小时。考虑到目前研究及生产中，所用豆粕发酵时间通常都是到72小时，至于延长发酵会有何影响，却鲜有报道。所以本发明选取了30天作为一个发酵周期，来考量添加植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarumsubsp.plantarum)P15对豆粕和汤阴北艾混合发酵的影响。
发酵原料：市售豆粕(水分含量5.5％)，汤阴北艾全株(地上部分)干草粉碎过40目筛备用。
一、制备发酵豆粕饲料
以植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)P15 NO：M2020853作为饲料添加剂制备发酵饲料
将P15在固体MRS平板上活化两代后，挑取单菌落于1mL MRS液体培养基中制成种子液，调OD使菌液浓度相同，然后再按2％的接种量转到50mL液体MRS培养基中，37℃过夜培养，培养至对数期时备用。
试验设置：空白组(豆粕+汤阴北艾，艾草占比为12％)和P15组(豆粕+汤阴北艾+P15，艾草占比为12％)，每个组3个重复。接种时把发酵好的乳酸菌P156000r/min离心以便除去MRS液体培养基，然后把沉积于离心管底部的菌体用无菌水调OD值至0.8，按照2％的接种量，用喷壶均匀的喷洒于豆粕和汤阴北艾上，戴上手套抓拌混合均匀，称取100g装入发酵专用袋，然后利用真空包装机抽真空后密封，每个组制备33袋，室温避光储存(温度变化范围为21～29℃，平均温度约为25℃)，分别于发酵的第0、12、24、36、48、60及72小时，7、12、18和30天进行开封取样；同时，发酵72小时和30天开封后，分别进行开袋暴露于空气中3天和7天的二次发酵处理。每次开封3袋，作为3个平行，检测其中微生物分布、发酵品质(pH、有机酸)和化学成分(粗蛋白、粗脂肪)。
二、豆粕和汤阴北艾混合发酵前后的状态和感官变化
豆粕发酵前呈浅黄色、松散状粉末，有淡淡的豆腥味；发酵后豆粕颜色加深呈深黄色，质地松软，散发出豆香味；P15处理组发酵之后的酸香味比对照组更加浓烈、外观更加松散，没有发生黏结成块的现象；至于发酵72小时后和30天后的开封暴露于空气中二次发酵样品，对照组出现发霉、结块、变臭现象，而处理组基本保持和刚开封时候一样的外观及气味。
三、豆粕和汤阴北艾混合发酵中的微生物分析
每次开封时，在无菌超净工作台打开发酵豆粕真空袋，每袋取20g样品与180mL无菌水混合震荡，以10倍梯度稀释依次至10-1、10-2、10-3、10-4和10-5，从中选取10-1、10-3和10-5的稀释液涂布在相应均分成三份的半选择性固体平板上，其中乳酸菌用MRS培养基，一般好氧细菌用NA培养基，霉菌和酵母菌用PDA培养基(二者可根据菌落形态进行区分)，梭菌用CLO培养基，大肠杆菌用EMB培养基。每个处理组做三组平行。因为芽孢杆菌和梭菌具有耐热的性质，因此在筛选这两种菌的时候要经过75℃15分钟加热处理，以便杀死其他杂菌。涂布结束之后，把MRS和CLO平板放在恒温厌氧箱、其余各平板置于恒温培养箱中，37℃培养48小时，结束之后计数分析。
结果如表12所示，在发酵12小时加入植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillusplantarum subsp.plantarum)P15 NO：M 2020853组的乳酸菌数量达到10.68cfu/g，且10以上的水平一直维持到发酵7天，而空白对照组在整个发酵过程中都没有达到10以上的水平；发酵3天后开封暴露3天时，P15组仍然是10.29cfu/g，到第7天下降到了8.97cfu/g，而空白对照组在暴露3天时是9.77cfu/g，但到了第7天则是6.95cfu/g，与P15组差别显著。
表12、豆粕和汤阴北艾发酵过程中乳酸菌的变化
注：3d-3d，发酵3天后开封暴露3天；3d-7d，发酵3天后开封暴露7天；30d-3d，发酵30天后开封暴露3天；30d-7d，发酵30天后开封暴露7天。
加入植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)P15NO：M 2020853组的好氧性细菌，在12小时降到了6.42log cfu/g，而空白对照组则在发酵30天时才降到了5.95cfu/g以下，而在这之前均高于7.95cfu/g；至于发酵3天后开封暴露3天和7天，空白组中好氧细菌的水平分别比对照高了51.22％和34.19％，发酵30天开封3天和7天的样品中，P15组比空白组分别低了36.72％和51.87％。表明植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)P15 NO：M 2020853对于豆粕和汤阴北艾混合发酵中的好氧细菌，具有较好地抑制作用，如表13所示：
表13、豆粕和汤阴北艾发酵过程中好氧细菌的变化
注：3d-3d，发酵3天后开封暴露3天；3d-7d，发酵3天后开封暴露7天；30d-3d，发酵30天后开封暴露3天；30d-7d，发酵30天后开封暴露7天。
至于消耗发酵饲料能量的酵母菌，植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillusplantarum subsp.plantarum)P15 NO：M 2020853组的酵母菌，只有在发酵3天后开封暴露3天和7天及发酵30天开封暴露3天的样品中检测到了，而空白对照组除了在这三个时间点被检测到、且含量都比P15组高之外，在发酵12和72小时也有发现。表明植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)P15 NO：M 2020853对于酵母菌有良好抑制效果，如表14所示：
表14、豆粕和汤阴北艾发酵过程中酵母菌的变化
注：3d-3d，发酵3天后开封暴露3天；3d-7d，发酵3天后开封暴露7天；30d-3d，发酵30天后开封暴露3天；30d-7d，发酵30天后开封暴露7天。
发酵产生的霉菌会影响发酵饲料的品质，霉菌产生的霉菌毒素，是在生长代谢过程中产生的有毒次级代谢产物，不仅会导致饲料质量降低、营养物质流失，还会严重侵害动物的消化和免疫系统。因此，对发酵饲料必须加强霉菌毒素的防御、检验和管理工作。在本发明中，霉菌只有在发酵3天后开封暴露3天时候被检测到，且植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)P15 NO：M 2020853组比空白组低36.1％。表明植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)P15 NO：M2020853对于霉菌有较好抑制，如表15所示：
表15、豆粕和汤阴北艾发酵过程中霉菌的变化
注：3d-3d，发酵3天后开封暴露3天；3d-7d，发酵3天后开封暴露7天；30d-3d，发酵30天后开封暴露3天；30d-7d，发酵30天后开封暴露7天。
至于条件致病菌大肠杆菌，植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarumsubsp.plantarum)P15 NO：M 2020853组在发酵12小时即降到了3.65log cfu/g，在发酵12天时达到了最高水平8.82log cfu/g，发酵30天后开封暴露3天和7天时都没有检测到；而在空白对照组中，发酵12小时达到了8.87log cfu/g，且在发酵前12天，这个是最低水平，尤其是在两次暴露过程中，发酵3天后开封暴露3天和7天时，数量都是P15组的2倍，发酵30天后开封暴露3天和7天，都仍然高达5.92和5.13log cfu/g。以上数据表明，P15对于大肠杆菌具有良好的抑制作用。如表16所示：
表16、豆粕和汤阴北艾发酵过程中大肠杆菌的变化
注：3d-3d，发酵3天后开封暴露3天；3d-7d，发酵3天后开封暴露7天；30d-3d，发酵30天后开封暴露3天；30d-7d，
发酵30天后开封暴露7天。
芽孢杆菌属是革兰氏阳性好氧或兼性厌氧菌，其内生孢子能耐受极高和极地的环境温度，难易消除，而被芽孢杆菌污染的饲料，对人和动物是有致病性的。植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)P15 NO：M 2020853组在发酵48小时降低到了4.0以下，达到了3.79log cfu/g，且直到发酵结束一直维持在这个水平左右，而空白对照组整个发酵过程中除了第18天时，其余一律没有低于4.3以下；尤其是在两个二次发酵阶段，发酵3天后开封暴露7天时，对照组芽孢杆菌含量是P15组的近2倍，发酵30天后开封暴露3天和7天时，含量分别是P15组的2.7倍和1.6倍。说明植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)P15 NO：M 2020853对芽孢杆菌也有非常好的抑制效果。如表17所示：
表17、豆粕和汤阴北艾发酵过程中芽孢杆菌的变化
注：3d-3d，发酵3天后开封暴露3天；3d-7d，发酵3天后开封暴露7天；30d-3d，发酵30天后开封暴露3天；30d-7d，发酵30天后开封暴露7天。
腐败梭菌能引起饲料变臭腐败，在本发明中，整个发酵过程里植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)P15 NO：M 2020853组均没有检测到梭菌的存在，而空白对照组则在发酵30天、发酵3天后开封暴露7天及发酵30天开封暴露3天和7天时都有，且含量高于5.0log cfu/g。表明植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillusplantarum subsp.plantarum)P15 NO：M 2020853对于腐败梭菌有非常好地抑制作用。如表18所示：
表18、豆粕和汤阴北艾发酵过程中腐败梭菌的变化
注：3d-3d，发酵3天后开封暴露3天；3d-7d，发酵3天后开封暴露7天；30d-3d，发酵30天后开封暴露3天；30d-7d，发酵30天后开封暴露7天。
综上，可见植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)P15 NO：M 2020853在豆粕和汤阴北艾混合发酵体系中具有较好抑制杂菌的作用。
四、豆粕和汤阴北艾混合发酵体系中pH和有机酸的测定
每个处理取豆粕和汤阴北艾混合发酵饲料10g加入90mL的无菌蒸馏水中在旋涡振荡器上震荡均匀，然后用四层纱布过滤，用玻璃电极pH计测量pH值；滤液经0.22μm滤膜过滤后，采用高效液相色谱仪进行有机酸分析，以甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、苹果酸、琥珀酸和柠檬酸作为标准品，配制一系列浓度梯度溶液，确定其保留时间并绘制标准曲线，条件为：柱温55℃，流动相流速0.6mL/min，进样量10μL，紫外吸收检测器进行检测。根据样品的出峰时间和峰面积与标准品的比对，对各样品中各种有机酸进行定性和定量分析。
由表19结果可知，植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarumsubsp.plantarum)P15 NO：M 2020853组在发酵12小时即把pH降低到5.0以下，达到了4.69，并一直维持到发酵结束；而空白对照组则在发酵7天时pH才降低到了4.60，发酵3天后开封暴露7天时，空白对照组的pH更是由3天时候的4.75急剧上升到6.93。以上结果表明，植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)P15 NO：M 2020853可以迅速有效的将豆粕和汤阴北艾混合发酵体系的pH降低到利于发酵的水平。
表19、豆粕和汤阴北艾混合发酵过程中pH的变化
注：3d-3d，发酵3天后开封暴露3天；3d-7d，发酵3天后开封暴露7天；30d-3d，发酵30天后开封暴露3天；30d-7d，发酵30天后开封暴露7天。
乳酸测定结果如表20所示，在发酵12小时，植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillusplantarum subsp.plantarum)P15 NO：M 2020853组的能维持动物肠道菌群平衡、减少腹泻、促进钙吸收的乳酸含量迅速升到48.25g/Kg，而对照组只有9.39g/Kg，且直到发酵7天时对照组的含量才达到40以上水平(45.49g/Kg)；而对照组直到发酵48小时达到最高1.675mg/ml，之后就迅速下降。
表20、豆粕和汤阴北艾混合发酵过程中乳酸含量的变化
注：3d-3d，发酵3天后开封暴露3天；3d-7d，发酵3天后开封暴露7天；30d-3d，发酵30天后开封暴露3天；30d-7d，发酵30天后开封暴露7天。
含量过高吸入会对呼吸道、食道等有强烈刺激性的丙酸，在植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)P15 NO：M 2020853组没有检测到(表21)，而在空白对照组在发酵30天时达到了28.04g/Kg，尤其是发酵3天后开封暴露7天及发酵30天开封暴露3天和7天，含量都在20g/Kg以上。
表21、豆粕和汤阴北艾混合发酵过程中丁酸含量的变化
注：3d-3d，发酵3天后开封暴露3天；3d-7d，发酵3天后开封暴露7天；30d-3d，发酵30天后开封暴露3天；30d-7d，发酵30天后开封暴露7天。
氨态氮与总氮的比值是反映饲料中蛋白质及氨基酸分解的程度，比值越大，说明蛋白质分解越多，质量不佳。在本发明中，植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarumsubsp.plantarum)P15 NO：M 2020853组的氨态氮含量除了在发酵18天时和空白组的一样，其余时间内都低于空白对照组，尤其是发酵3天后开封暴露7天，对照祖是0.82g/Kg，而P15组是0.18g/Kg(表22)。表明植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarumsubsp.plantarum)P15 NO：M 2020853在发酵贮存期间能够减少饲料中蛋白质损失(分解为氨)。
表22、豆粕和汤阴北艾混合发酵过程中氨态氮含量的变化
注：3d-3d，发酵3天后开封暴露3天；3d-7d，发酵3天后开封暴露7天；30d-3d，发酵30天后开封暴露3天；30d-7d，发酵30天后开封暴露7天。
五、豆粕和汤阴北艾混合发酵体系中黄酮类化合物的测定
在畜牧业动物生产上，黄酮类化合物的应用能显著提高动物生产性能，提高动物机体抗病力，改善动物机体免疫机能。本发明利用的是紫外可见分光光度计的方法测定发酵饲料样品中黄酮类化合物的含量。因为黄酮类化合物可以与氧化剂硝酸铝反应生成一种黄色的络合物(黄酮铝)，黄酮铝在碱性环境下呈红色，并且在可见光内出现非常稳定的吸收峰。
1、芦丁标准曲线的制定
将芦丁标准品于120℃下干燥至恒重，准确称取芦丁0.0146g，用60％(体积分数，下同)乙醇溶解，定容至50mL，得浓度为0.292g/L芦丁标准液。精密量取芦丁标准溶液0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5mL于25mL量瓶中，加入5％的NaNO2溶液0.75mL，摇匀，放置6min后加入10％的Al(NO3)3溶液0.75mL，摇匀，放置6min后加入4％NaOH溶液5.00mL，用30％乙醇定容，摇匀，放置15min，以不含芦丁的空白液为对照，于波长510nm处测定吸光度，以吸光度(x)对浓度(y)绘制标准曲线，得线性回归方程。
根据图9可知：溶液的吸光度随着芦丁浓度的增加呈正相关的线性变化，因此可以把芦丁浓度定为横坐标，吸光度定为纵坐标，作线性回归曲线如上图，可以看出线性回归方程为y＝11.986x+0.0228，并且线性相关系数R2＝0.9999，因此相关性特别好。
2、检测发酵72小时和发酵30天样品的吸光度
首先配置5％的NaNO2溶液，4％NaOH溶液，10％的Al(NO3)3溶液。称取一定量的发酵饲料样品用60％的乙醇溶解后，用60％乙醇定容至25mL。取上述溶液10mL于25mL容量瓶中，加入5％的NaNO2溶液0.75mL，摇匀，放置6min后加入10％的Al(NO3)3溶液0.75mL，摇匀，放置6min后加入4％NaOH溶液5.00mL，用30％乙醇定容，摇匀，放置15min，以不含芦丁的空白液为对照，按照测定芦丁标准液吸光度的测定条件测定吸光度，重复测定3次取平均值。
由表23发酵72小时和发酵30天各组之间黄酮含量的变化，可知，无论是哪一个时间段，植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)P15 NO：M2020853组中总黄酮的含量都显著高于对照组。
表23、豆粕和汤阴北艾混合发酵过程中黄酮类物质含量的变化
发酵豆粕作为动物性蛋白原料的替代品列入配方已经成为很多饲料厂的选择，但目前市场上发酵豆粕产品质量良莠不齐、鱼目混杂，这很大一部分原因是发酵菌种和工艺的问题。本发明通过将豆粕和汤阴北艾混合发酵饲料添加植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)P15 NO：M2020853，证实添加乳酸菌有效提高了豆粕和艾草的发酵水平，增强了艾草的中草药作用效果。
SEQUENCE LISTING
<110> 郑州大学
<120>一株植物乳杆菌植物亚种及其在豆粕和北艾混合发酵中的应用
<160> 1
<210> 1
<211> 1375
<212> DNA
<213>植物乳杆菌植物亚种（Lactobacillus plantarum subsp. plantarum）
<400> 1
tgacgggcgg tgtgtacaag gcccgggaac gtattcaccg cggcatgctg atccgcgatt 60
actagcgatt ccgacttcat gtaggcgagt tgcagcctac aatccgaact gagaatggct 120
ttaagagatt agcttactct cgcgagttcg caactcgttg taccatccat tgtagcacgt 180
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gtcaccggca gtctcaccag agtgcccaac ttaatgctgg caactgataa taagggttgc 300
gctcgttgcg ggacttaacc caacatctca cgacacgagc tgacgacaac catgcaccac 360
ctgtatccat gtccccgaag ggaacgtcta atctcttaga tttgcatagt atgtcaagac 420
ctggtaaggt tcttcgcgta gcttcgaatt aaaccacatg ctccaccgct tgtgcgggcc 480
cccgtcaatt cctttgagtt tcagccttgc ggccgtactc cccaggcgga atgcttaatg 540
cgttagctgc agcactgaag ggcggaaacc ctccaacact tagcattcat cgtttacggt 600
atggactacc agggtatcta atcctgtttg ctacccatac tttcgagcct cagcgtcagt 660
tacagaccag acagccgcct tcgccactgg tgttcttcca tatatctacg catttcaccg 720
ctacacatgg agttccactg tcctcttctg cactcaagtt tcccagtttc cgatgcactt 780
cttcggttga gccgaaggct ttcacatcag acttaaaaaa ccgcctgcgc tcgctttacg 840
cccaataaat ccggacaacg cttgccacct acgtattacc gcggctgctg gcacgtagtt 900
agccgtggct ttctggttaa ataccgtcaa tacctgaaca gttactctca gatatgttct 960
tctttaacaa cagagtttta cgagccgaaa cccttcttca ctcacgcggc gttgctccat 1020
cagactttcg tccattgtgg aagattccct actgctgcct cccgtaggag tttgggccgt 1080
gtctcagtcc caatgtggcc gattgccctc tcaggtcggc tacgtatcat tgccatggtg 1140
agccgttacc ccaccatcta gctaatacgc cgcgggacca tccaaaagtg atagccgaag 1200
ccatctttca agctcggacc atgcggtcca agttgttatg cggtattagc atctgtttcc 1260
aggtgttatc ccccgcttct gggcaggttt cccacgtgtt actcaccagt tcgccactca 1320
ctcaaatgta aatcatgatg caagcaccaa tcaataccag agttcgttcg actgc 1375
Claims (9)
1.植物乳杆菌植物亚种（Lactobacillus plantarum subsp. plantarum）P15，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO：M 2020853。
2.一种菌剂，其特征在于：所述菌剂的活性成分为权利要求1所述的植物乳杆菌植物亚种（Lactobacillus plantarum subsp. plantarum）P15。
3.一种豆粕和北艾混合发酵的接种剂，其特征在于：所述豆粕和北艾混合发酵的接种剂的活性成分为权利要求1所述的植物乳杆菌植物亚种（Lactobacillus plantarum subsp. plantarum）P15或其发酵产物或其菌悬液或其培养液。
4.根据权利要求3所述的豆粕和北艾混合发酵的接种剂，其特征在于：所述的豆粕和北艾的混合，是北艾在豆粕中的添加量为1～20%。
5.根据权利要求3或4所述的豆粕和北艾混合发酵的接种剂，其特征在于：所述的北艾，是汤阴北艾地上部分全草干燥至水分含量为5～10%后，粉碎过10～40目筛的颗粒，或者是切成2～20 mm的小段。
6.根据权利要求5所述的豆粕和北艾混合发酵的接种剂，其特征在于：所述的植物乳杆菌植物亚种（Lactobacillus plantarum subsp. plantarum）P15在所述的豆粕和汤阴北艾的混合料中的接种量为1～20%。
7.根据权利要求6所述的豆粕和北艾混合发酵的接种剂，其特征在于：所述的植物乳杆菌植物亚种（Lactobacillus plantarum subsp. plantarum）P15的添加方式为P15发酵12～48小时的菌液与豆粕及汤阴北艾搅拌混匀，或者是P15发酵12～48小时后的固态菌粉与豆粕及汤阴北艾搅拌混匀。
8.权利要求1所述的植物乳杆菌植物亚种（Lactobacillus plantarum subsp. plantarum）P15或权利要求2所述的菌剂在如下任一中的应用：
（a1）抑制ETEC K88；
（a2）抑制细菌；
（a3）制备细菌生长抑制剂；
（a4）制备权利要求3所述的豆粕和北艾混合发酵的接种剂；
在所述（a2）和（a3）中，所述细菌具体为大肠杆菌（Escherichia coli）和/或肠炎沙门氏菌（Salmonella enterica），和/或金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），和/或铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），和/或单核细胞李斯特菌（Listeria monocytogenes），和/或藤黄微球菌（Micrococcus luteus），和/或枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述的植物乳杆菌植物亚种（Lactobacillus plantarum subsp. plantarum）P15或所述菌剂对所述细菌的抑制为30～37℃条件下的抑制。
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