CN113186139B - 一株植物乳杆菌lr002及其应用 - Google Patents

一株植物乳杆菌lr002及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一株植物乳杆菌LR002及其应用。本发明所述的植物乳杆菌LR002，拉丁文名称为：LactobacillusplantarumLR002，保藏单位名称为：中国典型培养物保藏中心，地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为：2021年5月13日，保藏编号为：CCTCCNO：M2021527。本发明分离得到的植物乳杆菌具有很强的耐胆盐、耐胃液、耐肠液的能力；可抑制有害菌生长；对抗生素敏感、无耐药性，保证其安全；有望作为益生菌用于动物饲料中。

Description

一株植物乳杆菌LR002及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一株植物乳杆菌LR002及其应用。
背景技术
益生菌也称益生素，是能够对动物产生有益作用的微生物制剂。益生菌作为动物饲料的添加剂使用，具有促生长、抗病治病、提高饲料消化率等功能。理想的益生菌应当具有如下功效：(1)对酸、胆盐有抵抗力，经过胃、小肠时能保持自身的活性，即能够耐酸、耐胆盐、耐肠液、耐胃液的能力。(2)能够附植于肠道的黏膜上皮细胞，产生的黏液有利于其在胃肠道的定植。即具有一定的粘附能力。(3)对抗生素敏感，无耐药性，不可能将其携带的耐药基因水平传达给肠道中的致病类菌，导致肠道中的致病类菌获得耐药性，保证其安全性。但是现有技术并未发现这样一株同时具有2种及以上功效的植物乳杆菌。
发明内容
本发明的目的在于提供一种同时具备耐酸、耐胆盐、耐肠液、耐胃液，抑制有害菌，具有很好抗生素耐药性的植物乳杆菌。具体涉及一株植物乳杆菌LR002及其应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一株植物乳杆菌LR002，拉丁文名称为：Lactobacillus plantarumLR002，保藏单位名称为：中国典型培养物保藏中心，地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为：2021年5月13日，保藏编号为：CCTCC NO：M2021527。
作为优选，所述植物乳杆菌LR002的16S rDNA的序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了所述的植物乳杆菌LR002在制备耐酸产品方面的应用。
本发明还提供了所述的植物乳杆菌LR002在制备耐胆碱产品方面的应用。
本发明还提供了所述的植物乳杆菌LR002在制备耐胃液产品方面的应用。
本发明还提供了所述的植物乳杆菌LR002在制备耐肠液产品方面的应用。
本发明还提供了所述的植物乳杆菌LR002在制备抑菌产品方面的应用。
本发明还提供了所述的植物乳杆菌LR002在制备无耐药性产品方面的应用。
本发明提供了一株植物乳杆菌LR002及其应用，本申请的植物乳杆菌LR002具有如下优点：
(1)本申请的植物乳杆菌LR002具有很好的耐酸、耐胆碱、耐胃液、耐肠液的作用；
(2)本申请的植物乳杆菌LR002还具有对抗生素敏感的特性，无耐药性，不可能将其携带的耐药基因水平传达给肠道中的致病类菌，导致肠道中的致病类菌获得耐药性，保证其安全性；
(3)本申请的植物乳杆菌LR002还具有很好的抑菌功能；
(4)本发明的植物乳杆菌LR002有望作为益生菌用于动物饲料中。
附图说明
图1为植物乳杆菌LR002菌落形态图。
图2为植物乳杆菌LR002革兰氏染色结果图。
图3为植物乳杆菌LR00216S rDNA琼脂糖凝胶电泳图。
图4为植物乳杆菌LR00216S rDNA系统发育树。
图5为植物乳杆菌LR002耐酸能力图。
图6为植物乳杆菌LR002耐胆盐能力图。
图7为植物乳杆菌LR002耐人工胃液能力图。
图8为植物乳杆菌LR002耐人工肠液能力图。
图9为植物乳杆菌LR002抑菌图(从左到右依次为枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌)。
图10为植物乳杆菌LR002对抗生素的敏感实验结果图。
保藏说明
植物乳杆菌LR002，拉丁文名称为：Lactobacillusplantarum LR002，保藏单位名称为：中国典型培养物保藏中心，地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为：2021年5月13日，保藏编号为：CCTCC NO：M2021527。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1菌株的分离、鉴定
称取甘南藏族自治州临潭县藜麦茎叶置于MRS固体培养基上覆盖上一层水琼脂进行分离，37℃恒温培养48h。得到菌落，菌落结果见图1。
挑取菌落，连续划线分离纯化，最后选择单菌落，经镜检确认为纯种后，接种到斜面培养基培养24h后，置4℃冰箱保存备用。将鉴定为纯种的菌株进行革兰氏染色以及生理生化鉴定，革兰氏染色结果见图2，生理生化结果如表1所示。
表1 LR002生理生化鉴定结果
Figure BDA0003125051110000031
提取菌株DNA，并进行16S rDNA扩增，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图3。将扩增得到的16S rDNA送至大连美仑生物技术有限公司进行测序，测序结果如SEQ IDNO.1所示。
然后对测序结果进行比对，构建系统发育树，鉴定菌株的种属关系。系统发育树结果见图4。
所述MRS固体培养基包括如下浓度的组分：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母粉5g/L、葡萄糖20g/L、无水乙酸钠5g/L、吐温-801mL/L、柠檬酸二胺2g/L、磷酸氢二钾2g/L、硫酸镁0.58g/L、硫酸锰0.25g/L、溴甲酚紫溶液2mL/L、琼脂18g/L。
所述MRS固体培养基的pH为6.3。
经过上述分离纯化，本发明纯化得到的单菌落为乳白色，直径2mm，表面光滑、边缘整齐、中央隆起，菌落周围呈黄色。
镜检结果为菌株短杆状，(1～1.2)μm×(1～1.5)μm，单个、成对、短链排列，将分纯菌株命名为LR002。
图2显示的革兰氏染色结果为：阳性，兼性厌氧。
图4系统发育树构建结果表明：LR002菌株与植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)的同源性为100％。
最终将本申请分离到的菌株鉴定为植物乳杆菌LR002。
实施例2菌株耐酸实验
将菌株活化后制成菌体浓度为107cfu/ml的菌悬液，按4％的接种量接入pH值分别为1、2、3的MRS液体培养基内，37℃静置培养，分别于0、1、2和3h从中吸取菌悬液，进行梯度稀释，涂布至对应的固体培养基上，于37℃恒温培养箱倒置培养48h，选取菌落数30～300之间的平板进行计数，3个平行求平均值。得到菌株对酸的耐受力，结果见图5。
图5表明，菌株具有较好的耐酸性，在pH3.0的条件下菌体出现生长现象，pH2.0、pH1.0时，随着培养时间的延长，菌株的存活率有所下降。
实施例3菌株耐胆盐实验
将菌株活化后制成菌体浓度为108cfu/ml的菌悬液，按4％的接种量分别接入胆盐浓度分别为0.3、1.5、3g/L的MRS液体培养基中，37℃静置培养，分别于0、3h从中吸取菌悬液，进行梯度稀释，涂布至对应的固体培养基上，于37℃恒温培养箱倒置培养48h，选取菌落数30～300之间的平板进行计数，3个平行求平均值。计算菌株对胆盐的耐受能力，耐受结果见图6。
所述菌株对胆盐的耐受力的计算公式为：胆盐耐受力(％)＝Nt/N0×100％。
式中:Nt：3h含胆盐培养基活菌数(cfu/ml)；
N0：0h含胆盐培养基的活菌数(cfu/ml)。
图6显示：菌株LR002在胆盐浓度为3g/L时，菌株耐受能力为94.12％，具有较好的耐胆盐能力。
实施例4菌株耐人工胃液实验
菌株活化后制成菌体浓度为107cfu/ml的菌悬液，按4％的接种量接入人工胃液中，分别于0、2、4h从中吸取菌悬液，进行10倍梯度稀释，涂布至MRS固体培养基上，37℃倒置培养，选取菌落数30～300之间的平板进行计数，3个平行求平均值。计算菌株对人工胃液的耐受力。耐受结果见图7。
菌株对人工胃液的耐受力的计算公式为：人工胃液耐受力(％)＝Nt/N0×100％。
式中:Nt：各时间段培养基活菌数(cfu/ml)；
N0：0h培养基的活菌数(cfu/ml)。
人工胃液的配置方法为：取20％盐酸16.4mL，pH值调至3.0。然后加入胃蛋白酶(颗粒)，使其浓度为0.01g/mL，待其充分溶解后，用0.22μm规格的微孔膜过滤除菌，即得。
图7显示：菌株在人工胃液中出现了菌体生长现象，随着培养时间的延长，存活率出现了先降后升的情况，但存活率一直保持90％以上，在4h时，存活率可达106.6％，表明菌株具有优秀的耐胃液能力。
实施例5菌株耐人工肠液实验
菌株活化后制成菌体浓度为107cfu/ml的菌悬液，按4％的接种量接入人工肠液中，分别于0、4、8h从中吸取菌悬液，进行10倍梯度稀释，涂布至MRS固体培养基上，37℃倒置培养，选取菌落数30～300之间的平板进行计数，3个平行求平均值，计算菌株对人工肠液的耐受力。耐受结果见图8。
菌株对人工肠液的耐受力的计算公式为：人工肠液耐受力(％)＝Nt/N0×100％。
式中:Nt：各时间段培养基活菌数(cfu/ml)；
N0：0h培养基的活菌数(cfu/ml)。
所述人工肠液的配置方法为：加入胰蛋白酶(颗粒)，使其的浓度为0.01g/mL，待胰蛋白酶充分溶解后，用0.22μm规格的微孔膜过滤除菌，即得。
图8显示：菌株在人工肠液中出现了菌体生长现象，随着培养时间的延长，存活率出现了先降后升的情况，但存活率一直保持90％以上，在8h时，存活率可达101.98％，表明菌株具有优秀的耐肠液能力。
实施例6菌株抑菌实验
将50mL营养琼脂固体培养基灭菌后冷却到45℃，分别加入菌体浓度为108cfu/ml的指示菌1000μL，混匀后倒平板。待平板凝固后放入灭菌的牛津杯。
在牛津杯中加入菌体浓度为108cfu/ml的植物乳杆菌LR002的菌悬液100μL，对照的牛津杯中加入无菌水100μL。盖上皿盖，放入4℃冰箱扩散，然后放置37℃恒温培养24h，观察小孔周围抑菌圈直径。每个指示菌做两个平行，测抑菌圈直径，求平均值。结果见图9和表2。
所述指示菌为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis JCM1465、铜绿假单胞菌Pseudomona aeruginosa CMCC(B)10104，大肠杆菌Escherichia coli 882364和金黄色葡萄球菌Staphylococcus areusAS1.2465。
所述铜绿假单胞菌指示菌购买于中国医学细菌保藏管理中心(CMCC)，其余菌株为厌氧微生物实验室自行分离保藏菌株。
表2植物乳杆菌LR002的抑菌结果
Figure BDA0003125051110000061
表2显示，植物乳杆菌LR002对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌以及铜绿假单胞菌均有抑制作用，菌株具有广谱抑菌效果。
实施例7菌株对抗生素的敏感实验
采用K-B(药敏纸片琼脂扩散法)进行药敏试验来评价菌株的抗生素耐药性。取菌体浓度为108cfu/ml的植物乳杆菌LR002的种子液100μL，接种于40℃MRS固体培养基中，混匀倒平皿。待培养基冷却凝固后，将药敏纸片分别均匀平贴于MRS固体培养基表面。将贴好药敏纸片的平板放置于37℃培养箱中培养48h，用游标卡尺测量各药敏纸片的抑菌圈直径(D)大小。抗药结果见图10和表3。
所用的药敏纸片中各抗生素的含量为：阿米卡星(30μg)、CTR(30μg)、TE四环素(30μg)、CFP头孢哌酮(75μg)、DX多西环素(30μg)、N新霉素(30μg)、P青霉素(10μg)、GM庆大霉素(10μg)、CZ头孢噻肟(30μg)、美满霉素(30μg)、氧氟沙星(5μg)、E红霉素(15μg)。
表3植物乳杆菌LR002抗药性结果
Figure BDA0003125051110000071
表中所述的S表示敏感，I表示中介，R表示耐药。
结果表明：植物乳杆菌LR002对常用抗生素青霉素、新霉素、四环素等表现为耐药，对头孢噻肟、美满霉素、氧氟沙星3种抗生素表现出敏感，抗药率、敏感率和中介率分别为50％、25％、25％。益生菌进入在肠道中其自身的耐药性对其存活具有积极意义，但也有负面影响，当菌株在肠道中定殖后，如果其基因中携带耐药基因片段，就可能把耐药基因片段通过水平传达给肠道中的致病类菌，导致此类菌也获得耐药性。所以该菌株对以长期使用的素青霉素、新霉素、四环素具有耐药性，提高了在肠道中的生存能力，对头孢噻肟、美满霉素、氧氟沙星3种抗生素表现出敏感，不会把耐药基因片段通过水平传达给肠道中的致病类菌，具有安全性。
由以上实施例可知，本发明提供了一株植物乳杆菌LR002及其应用，本申请的植物乳杆菌LR002具有如下优点：
(1)本申请的植物乳杆菌LR002具有很好的耐酸、耐胆碱、耐胃液、耐肠液的作用；
(2)本申请的植物乳杆菌LR002还具有对抗生素敏感的特性，无耐药性，保证其安全性；
(3)本申请的植物乳杆菌LR002还具有很好的抑菌功能；
(4)本发明的植物乳杆菌LR002有望作为益生菌用于动物饲料中。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 西北民族大学
<120> 一株植物乳杆菌LR002及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1442
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttaggcggct ggttcctaaa aggttacccc accgactttg ggtgttacaa actctcatgg 60
tgtgacgggc ggtgtgtaca aggcccggga acgtattcac cgcggcatgc tgatccgcga 120
ttactagcga ttccgacttc atgtaggcga gttgcagcct acaatccgaa ctgagaatgg 180
ctttaagaga ttagcttact ctcgcgagtt cgcaactcgt tgtaccatcc attgtagcac 240
gtgtgtagcc caggtcataa ggggcatgat gatttgacgt catccccacc ttcctccggt 300
ttgtcaccgg cagtctcacc agagtgccca acttaatgct ggcaactgat aataagggtt 360
gcgctcgttg cgggacttaa cccaacatct cacgacacga gctgacgaca accatgcacc 420
acctgtatcc atgtccccga agggaacgtc taatctctta gatttgcata gtatgtcaag 480
acctggtaag gttcttcgcg tagcttcgaa ttaaaccaca tgctccaccg cttgtgcggg 540
cccccgtcaa ttcctttgag tttcagcctt gcggccgtac tccccaggcg gaatgcttaa 600
tgcgttagct gcagcactga agggcggaaa ccctccaaca cttagcattc atcgtttacg 660
gtatggacta ccagggtatc taatcctgtt tgctacccat actttcgagc ctcagcgtca 720
gttacagacc agacagccgc cttcgccact ggtgttcttc catatatcta cgcatttcac 780
cgctacacat ggagttccac tgtcctcttc tgcactcaag tttcccagtt tccgatgcac 840
ttcttcggtt gagccgaagg ctttcacatc agacttaaaa aaccgcctgc gctcgcttta 900
cgcccaataa atccggacaa cgcttgccac ctacgtatta ccgcggctgc tggcacgtag 960
ttagccgtgg ctttctggtt aaataccgtc aatacctgaa cagttactct cagatatgtt 1020
cttctttaac aacagagttt tacgagccga aacccttctt cactcacgcg gcgttgctcc 1080
atcagacttt cgtccattgt ggaagattcc ctactgctgc ctcccgtagg agtttgggcc 1140
gtgtctcagt cccaatgtgg ccgattaccc tctcaggtcg gctacgtatc attgccatgg 1200
tgagccgtta ccccaccatc tagctaatac gccgcgggac catccaaaag tgatagccga 1260
agccatcttt caagctcgga ccatgcggtc caagttgtta tgcggtatta gcatctgttt 1320
ccaggtgtta tcccccgctt ctgggcaggt ttcccacgtg ttactcacca gttcgccact 1380
cactcaaatg taaatcatga tgcaagcacc aatcaatacc agagttcgtt cgactgcatg 1440
ta 1442

Claims (6)

1.一株植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）LR002，其特征在于，保藏单位名称为：中国典型培养物保藏中心，地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为：2021年5月13日，保藏编号为：CCTCC NO：M2021527。
2.权利要求1所述的植物乳杆菌LR002在制备耐酸产品方面的应用。
3.权利要求1所述的植物乳杆菌LR002在制备耐胆盐产品方面的应用。
4.权利要求1所述的植物乳杆菌LR002在制备耐胃液产品方面的应用。
5.权利要求1所述的植物乳杆菌LR002在制备耐肠液产品方面的应用。
6.权利要求1所述的植物乳杆菌LR002在制备抑菌产品方面的应用，其特征在于，所述菌为枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌或金黄色葡萄球菌。
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