CN109055268B

CN109055268B - 一种复合微生态制剂及其在蜜蜂养殖过程中的应用

Info

Publication number: CN109055268B
Application number: CN201810954663.5A
Authority: CN
Inventors: 曹振辉; 林秋叶; 潘洪彬; 黄丝艳; 汪思凡; 雷清芝; 郭文清; 叶朋飞; 钱颖艳; 余行; 罗程
Original assignee: Yunnan Agricultural University
Current assignee: Yunnan Agricultural University
Priority date: 2018-08-21
Filing date: 2018-08-21
Publication date: 2021-08-31
Anticipated expiration: 2038-08-21
Also published as: CN109055268A

Abstract

本发明提供了一种复合微生态制剂及其在蜜蜂养殖过程中的应用，该复合微生态制剂由两种乳酸菌组成，其一为罗伊氏乳杆菌，其二为瑞士乳杆菌。此两株菌使用MRS琼脂培养基培养后，菌落形态均呈圆形、乳白色、边缘整齐、表面光滑且隆起、不透明；均具有较好的抑菌活性，对多种抗生素敏感，将罗伊氏乳杆菌LP4和瑞士乳杆菌KM7等比例混合制成微生态制剂，添加到饲喂蜜蜂的糖水中，能够改善蜜蜂肠道内的菌群微生态结构，增强蜜蜂肠道免疫力，提高蜜蜂存活率。

Description

一种复合微生态制剂及其在蜜蜂养殖过程中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种复合微生态制剂及其在蜜蜂养殖过程中的应用，具体涉及2种乳酸菌：罗伊氏乳杆菌LP4和瑞士乳杆菌KM7在蜜蜂养殖过程中的应用。

背景技术

蜜蜂是一种常见的有益昆虫，其不仅可为植物传花授粉，提高植物果实和种子的产量及质量，同时其产生的蜂蜜、采集的花粉、分泌的蜂毒和蜂胶等在医学、农业、工业中都有重要的应用。我国是传统养蜂大国，已有3000多年的历史，但随着养蜂业规模化发展，蜜蜂群发性疾病的发生概率也有所增加，且呈现爆发性和多种病原混合发生，给我国养蜂业造成很大损失。为控制蜜蜂传染性疾病，目前仍多采用抗生素防治为主，且存在盲目用药，过量使用等现象，不仅导致肠道菌群微生态失衡，增强肠道微生物的耐药性，使一般药物无效，而且抗生素会在蜂产品中残留，降低蜂产品质量，影响消费者健康，减少养蜂场经济效益。因此，在蜜蜂养殖过程中，研发能够减少或替代抗生素使用、促进机体健康、提高成活率的产品，在蜜蜂产业中将具有广阔的应用前景。

微生态制剂是指通过改善动物肠道菌群生态平衡、促进营养物质消化吸收、增强免疫功能，以提高动物健康水平的微生物制剂产品。与抗生素相比，微生态制剂具有安全、无毒、无残留、无耐药性以及环境友好等优点，是饲用抗生素最具发展潜力的替代品。复合微生态制剂主要由乳酸菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌等菌种组成，目前复合微生态制剂技术在畜禽养殖过程中得到了广泛应用，并取得显著效果。近年来复合微生态制剂在我国部分养蜂场得到了应用，在促进蜜蜂机体健康，预防爬蜂病、大肚病、幼虫病和痢疾等疾病方面均取得了一定效果。

罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)属厚壁菌门、乳杆菌科、乳杆菌属。国内外研究证实，罗伊氏乳杆菌具有众多的益生功能和极高的安全性。2001年我国卫生部批准罗伊氏乳杆菌为可用于保健食品的益生菌菌种，2014年国家卫生计生委同意罗伊氏乳杆菌(菌株号DSM17938)用于婴幼儿食品。瑞士乳杆菌 (Lactobacillus helveticus)亦属厚壁菌门、乳杆菌科、乳杆菌属，具有调节宿主菌群、抑制致病菌，适应高温、低pH、低氧、低渗透压多种环境等优良特性，目前已广泛应用于干酪、酸乳等发酵乳制品生产，属于安全的食品级微生物。因此，筛选具有抑制致病菌增殖、对抗生素敏感、促进肠道微生态平衡、提高机体免疫力等益生功能的罗伊氏乳杆菌和瑞士乳杆菌，将其混合制成复合微生态制剂饲喂蜜蜂，对于提高蜜蜂成活率，减少抗生素在蜜蜂养殖过程中的应用，保障蜂产品安全具有重要意义。

发明内容

本发明提供了一种复合微生态制剂添加到饲喂蜜蜂的糖水中，可达到改善蜜蜂肠道菌群平衡，增强蜜蜂机体免疫力，提高蜜蜂成活率和养殖企业经济效益的技术方法。

本发明的技术方案：

一种复合微生态制剂，该复合微生态制剂由2种乳酸菌组成，其一为罗伊氏乳杆菌，该菌种于2018年7月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.16043，分类命名为罗伊氏乳杆菌LP4，该罗伊氏乳杆菌LP4从云南省罗平县蜂农饲养、春季自由采食油菜花蜜的东方蜜蜂工蜂肠道内自主分离得到；其二为瑞士乳杆菌，该菌种于2018年7月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.16042，分类命名为瑞士乳杆菌KM7，该瑞士乳杆菌KM7从云南省昆明市云南农业大学动物科学技术学院蜂学系养蜂场、春季自由采食花蜜的东方蜜蜂工蜂肠道内自主分离得到。此2株菌使用MRS琼脂培养基培养后，菌落形态均呈圆形、乳白色、边缘整齐、表面光滑且隆起、不透明；均具有较好的抑菌活性，对多种抗生素敏感，将罗伊氏乳杆菌LP4和瑞士乳杆菌KM7等比例混合制成微生态制剂，按1×10⁸CFU/mL的量添加到饲喂蜜蜂的糖水中，能够改善蜜蜂肠道内的菌群微生态结构，增强蜜蜂肠道免疫力，提高蜜蜂存活率。

本发明分离得到了具有良好益生特性的罗伊氏乳杆菌LP4和瑞士乳杆菌KM7；将罗伊氏乳杆菌LP4和瑞士乳杆菌KM7等比例混合制成微生态制剂，按 1×10⁸CFU/mL的量添加到饲喂蜜蜂的糖水中，可用于改善蜜蜂肠道内的菌群微生态结构，增强蜜蜂肠道免疫力，提高蜜蜂存活率。减少抗生素在蜜蜂养殖过程中的应用，提高蜂产品的安全性。

附图说明

图1是饲喂复合微生态制剂对东方蜜蜂成年工蜂死亡率的影响。

图2是饲喂复合微生态制剂对东方蜜蜂成年工蜂肠道真菌数量的影响。

图3是饲喂复合微生态制剂对东方蜜蜂成年工蜂肠道乳酸菌数量的影响。

图4是饲喂复合微生态制剂对东方蜜蜂成年工蜂肠道细菌数量的影响。

图5是饲喂复合微生态制剂对东方蜜蜂成年工蜂肠道肠球菌数量的影响。

图6是饲喂复合微生态制剂对东方蜜蜂成年工蜂肠道Abeacin类抗菌肽基因

表达量的影响。

图7是饲喂复合微生态制剂对东方蜜蜂成年工蜂肠道Defensin类抗菌肽基因表达量的影响。

图8是饲喂复合微生态制剂对东方蜜蜂成年工蜂肠道PPO类抗菌肽基因表达量的影响。

图中：不同的大写字母表示在同一实验天数，检测指标差异极显著(P<0.01)。

具体实施方式

以下结合技术方案和附图，进一步说明本发明的具体实施方式。

实施例1：

复合微生态制剂组成菌株的筛选和鉴定

(一)复合微生态制剂组成菌株的筛选

(1)样品的采集

将从云南省罗平县随机捉取的东方蜜蜂健康成年工蜂放入50mL灭菌离心管中，接入二氧化碳至蜜蜂昏迷后，在超净工作台内固定好蜜蜂，使用镊子取出蜜蜂的肠道并转移入1.5mL灭菌离心管中，放入4℃冰箱保存备用，实验所用器材均用紫外灯与75％乙醇消毒。

(2)菌株的筛选

在无菌条件下，取东方蜜蜂健康成年工蜂的肠道样品，加入到10mL的PBS 中，匀浆5min后，按1％的比例接种到含0.1％维生素C的MRS肉汤培养基中， 37℃厌氧培养18h。将富集后的培养液用无菌生理盐水进行梯度稀释，在碳酸钙-MRS固体培养基铺板，37℃厌氧培养24h，从平板中挑取了2株溶钙圈大的疑似乳酸菌单菌落。

(二)复合微生态制剂组成菌株的鉴定

对从蜜蜂肠道中分离得到的2株疑似乳酸菌菌株进行分子生物学鉴定，具体方法为：(1)提取乳酸菌疑似菌株的基因组DNA；(2)使用通用引物27F： 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492R： 5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’进行16S rDNA PCR扩增。

表1 PCR扩增体系

PCR反应条件：

对16S rDNA扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳，对扩增的PCR产物测序，获得16S rDNA序列后，在NCBI上使用BLAST程序比对，结果显示，2株乳酸菌疑似菌株其中一株与罗伊氏乳杆菌(NCBI登录号：KY969258.1)同源性大于 99％；一株与瑞士乳杆菌(NCBI登录号：KX430837.1)同源性大于99％。基于凡是16S rDNA可变区序列的同源性大于97.5％便可认为是同一个种的标准，其中一株菌株鉴定为罗伊氏乳杆菌，命名为罗伊氏乳杆菌LP4；一株菌株鉴定为瑞士乳杆菌，命名为瑞士乳杆菌KM7。

实施例2：

复合微生态制剂的益生特性

(一)复合微生态制剂的抑菌特性

采用琼脂打孔扩散法，研究2株乳酸菌及其组成的复合微生态制剂对主要肠道致病菌生长繁殖的抑制作用。将罗伊氏乳杆菌LP4和瑞士乳杆菌KM7分别接种于MRS肉汤培养基中，37℃厌氧培养24h，用MRS肉汤培养基将罗伊氏乳杆菌LP4和瑞士乳杆菌KM7的菌体数调节到1×10⁸CFU/mL；4℃，5000rpm，离心10min，分别收集上清液，上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，用氢氧化钠调 pH至6.2；将20μL培养24h且浓度为1×10⁸CFU/mL的指示菌菌液(大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、福氏志贺氏菌)加入到经高温高压灭菌并冷却到45℃左右的 LB固体培养基中，剧烈混合后迅速倒入平皿中，待培养基凝固后用牛津杯在培养基上打孔(直径8mm)，吸取90μL罗伊氏乳杆菌LP4培养上清液、90μL 瑞士乳杆菌KM7培养上清液、45μL罗伊氏乳杆菌LP4培养上清液与45μL瑞士乳杆菌KM7培养上清液制成的混合液，分别注入不同小孔中，鼠李糖乳杆菌 LGG为参照，灭菌的MRS液体培养基为空白对照，室温下扩散4h后，置于37℃恒温箱中培养24h后，测量抑菌圈直径。2株乳酸菌及其混合上清液对3株肠道致病菌的抗菌活性结果如表2所示，罗伊氏乳杆菌LP4、瑞士乳杆菌KM7及其混合上清液均能显著抑制大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、福氏志贺氏菌的生长，抗菌活性均优于参考益生菌菌株鼠李糖乳杆菌LGG，且2株乳酸菌混合上清液抑菌效果最佳。

表2复合微生态制剂对3种指示菌的抑菌性试验结果

注：“-”表示无抑菌作用；“+”表示抑菌圈半径<3mm；“++”表示抑菌圈半径3-6mm；“+++”表示抑菌圈半径6-8mm；“++++”表示抑菌圈半径>8mm。

(二)复合微生态制剂的抗生素敏感性

乳酸菌如具有细菌耐药性，就可能通过水平转移的方式将携带的耐药基因传递给体内的其它肠道菌群，导致其它肠道菌群甚至是致病菌具有抗生素耐药性，因此益生菌对抗生素敏感是乳酸菌益生特性的重要指标之一。本实验采用滤纸片扩散法，鉴定复合微生态制剂的抗生素敏感性。具体方法为：在灭菌平皿中加入2％的琼脂10mL铺底；单独取罗伊氏乳杆菌LP4、瑞士乳杆菌KM7 的株菌悬液各500μL，分别加入10mL温度为50℃左右的MRS琼脂培养基中迅速混匀，倒入各自已铺底的平皿中；待培养基冷却凝固后，分别贴放标准药敏纸片，纸片间距不少于24mm，15min内放入恒温培养箱中，37℃培养48h，测量抑菌圈直径。试验乳酸菌的抗生素敏感性参照美国临床实验室标准化协会 (Clinical and LaboratoryStandards Institute，CLSI)修订的最新版本的抗菌药物敏感性试验执行标准进行判定，实验结果如表3所示，2株乳酸菌均对头孢噻肟、阿莫西林、头孢噻吩、青霉素G、氨苄青霉素、卡那霉素、万古霉素敏感，对新生霉素中度敏感，对庆大霉素耐药。而有研究证实，庆大霉素属氨基糖苷类抗生素，乳酸菌对其固有耐药。以上结果表明罗伊氏乳杆菌LP4、瑞士乳杆菌KM7均具有良好的抗生素敏感性。

下表3是东方蜜蜂成年工蜂肠道分离乳酸菌的抗生素敏感性

实施例3：

复合微生态制剂对东方蜜蜂成年工蜂生长和肠道健康的影响

(一)复合微生态制剂对东方蜜蜂成年工蜂死亡率的影响

从云南农业大学养蜂场捉取300只东方蜜蜂健康成年工蜂，随机分为2组，实验Ⅰ组为对照组，饲喂普通无菌糖水，实验Ⅱ组为实验组，饲喂添加复合微生态制剂(由罗伊氏乳杆菌LP4和瑞士乳杆菌KM7等比例混合)的糖水(1× 10⁸CFU/mL)；对照组、实验组分别饲养在2个自制培养箱中，实验过程中均保证充足的糖、水供应；在实验期的第3d、第6d、第9d，分别统计对照组、实验组的蜜蜂死亡率。实验结果如图1所示，随着饲喂日龄的增长，实验组和对照组蜜蜂的死亡率均逐渐提高；但在第3d、第6d、第9d，实验组的死亡率分别为12.3％、20.5％、28.6％，低于对照组的死亡率21.9％(P＜0.01)、39.9％(P ＜0.01)、52.4％(P＜0.01)，表明东方蜜蜂成年工蜂饲喂复合微生态制剂后可极显著提高蜜蜂的存活率。

(二)复合微生态制剂对东方蜜蜂成年工蜂肠道菌群变化的影响

从云南农业大学养蜂场捉取300只东方蜜蜂健康成年工蜂，随机分为2组，实验Ⅰ组为对照组，饲喂普通无菌糖水，实验Ⅱ组为实验组，饲喂添加复合微生态制剂(由罗伊氏乳杆菌LP4和瑞士乳杆菌KM7等比例混合)的糖水(1× 10⁸CFU/mL)；对照组、实验组分别饲养在2个自制培养箱中，实验过程中均保证充足的糖、水供应；在实验期的第3d、第6d、第9d，分别取对照组、实验组各3只蜜蜂肠道样品；称重后，每只蜜蜂的肠道样品加入10mL的PBS，匀浆5min，使用PBS做梯度稀释后，将不同的稀释比液体分别取100μL接种到PDA、MRS、LB、EB 4种琼脂培养基中，每种培养基3次重复；37℃培养48h后，对每个平板进行菌落计数，检测对照组、实验组每克肠道样品中的真菌、乳酸菌、细菌和肠球菌数量，计算lg(CFU/g)值。实验结果由图2至图5 所示，与对照组比较，饲喂东方蜜蜂成年工蜂复合微生态制剂，在第3d、第6d 时东方蜜蜂成年工蜂肠道真菌数量无显著变化(P＞0.05)，第9d时极显著减少(P ＜0.01)；而在第3d、第6d、第9d时，乳酸菌数量极显著增加(P＜0.01)，肠球菌数量极显著减少(P＜0.01)，细菌总量无显著变化(P＞0.05)，表明饲喂该复合微生态制剂可增加肠道乳酸菌数量，减少肠球菌、真菌数量，改善东方蜜蜂肠道微生态平衡。

(三)复合微生态制剂对东方蜜蜂成年工蜂肠道抗菌肽基因表达量的影响

抗菌肽能够与病原菌非特异性结合，通过破坏病原菌细胞膜的完整性来杀灭病原菌，提高动物机体免疫力。本实验从云南农业大学养蜂场捉取300只东方蜜蜂健康成年工蜂，随机分为2组，实验Ⅰ组为对照组，饲喂普通无菌糖水，实验Ⅱ组为实验组，饲喂添加复合微生态制剂(由罗伊氏乳杆菌LP4和瑞士乳杆菌KM7等比例混合)的糖水(1×10⁸CFU/mL)；对照组、实验组分别饲养在2个自制培养箱中，实验过程中均保证充足的糖、水供应；在实验期的第3d、第6d、第9d，分别取对照组、实验组各3只蜜蜂肠道样品，转移入无菌研钵中研碎，提取蜜蜂肠道总RNA，使用TaKaRa宝生物工程有限公司提供的反转录合成cDNA试剂盒将RNA反转录为cDNA后，采用RT-PCR技术，检测对照组、实验组蜜蜂肠道样品中Abeacin类、Defensin类、PPO抗菌肽目的基因和 ACTB基因的CT值。具体反转录合成体系、引物信息、RT-PCR反应体系、RT-PCR 反应程序如下：

反转录合成体系：

表4去除基因组DNA的反应体系

表5 cDNA合成的反应体系

引物信息：RT-PCR的引物序列均由TaKaRa宝生物工程有限公司合成，序列如下表6。

表6 RT-PCR引物序列

RT-PCR反应体系：

表7目的基因RT-PCR定量的反应体系

RT-PCR反应程序：

表8荧光定量PCR反应程序步骤及熔解曲线收集步骤

根据下列公式计算目的基因表达量。公式如下：

Ratio＝2^{-△CTtarget(samper-cablirator)}/2^{-△CTACTB(samper-cablirator)}

公式中，Sample为实验组样本的CT值，calibrator为对照组样本的CT值。

复合微生态制剂对东方蜜蜂成年工蜂肠道抗菌肽基因表达量的影响如图6、图7、图8所示，与对照组相比较，饲喂东方蜜蜂成年工蜂复合微生态制剂，在第3d、第6d、第9d，肠道内Abeacin类和Defensin类抗菌肽基因表达量均极显著升高(P＜0.01)；在第6d、第9d，肠道内PPO抗菌肽基因表达量极显著升高(P＜0.01)，表明复合微生态制剂能够促进东方蜜蜂成年工蜂肠道内抗菌肽的产生，提高肠道免疫力。

Claims

1.一种复合微生态制剂，其特征在于，该复合微生态制剂由2种乳酸菌组成，其一为罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）LP4，于2018年7月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.16043；其二为瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus) KM7，于2018年7月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.16042。

2.一种复合微生态制剂在制备改善蜜蜂肠道内的菌群微生态结构，增强蜜蜂肠道免疫力，提高蜜蜂存活率产品中的应用，其特征在于，将保藏号为CGMCC No.16043的罗伊氏乳杆菌LP4和保藏号为CGMCC No.16042的瑞士乳杆菌KM7等比例混合制成微生态制剂，按1×10⁸CFU/mL的量添加到饲喂蜜蜂的糖水中，用于改善蜜蜂肠道内的菌群微生态结构，增强蜜蜂肠道免疫力，提高蜜蜂存活率。