CN106497808A - 一株分离自猪肠道的可用于生产发酵饲料的唾液乳杆菌 - Google Patents

Abstract

本发明涉及猪肠道中唾液乳杆菌的分离筛选以及用其作为接种菌生产的生物发酵饲料，属优质菌种筛选以及固体饲料领域，发酵饲料是利用乳酸菌等微生物的自身特性，在厌氧条件下发酵，产生大量乳酸等有机酸，降低饲料pH值，从而增加乳酸菌数量，减少饲料中的有害菌。本发明中涉及到的唾液乳杆菌分离自健康猪肠道，具有生长速度快、产乳酸量高特点，以其接种全价饲料或饲料原料生产的发酵饲料具有绿色安全，酸香气味浓，动物喜欢采食等特点。

Description

一株分离自猪肠道的可用于生产发酵饲料的唾液乳杆菌

技术领域

本发明涉及优质乳酸菌的筛选及微生物发酵饲料技术，特别涉及一株分离自猪肠道的1可用于生产发酵饲料的唾液乳杆菌的分离筛选，以及用其接种全价饲料或饲料原料生产的发酵饲料。

技术背景

自上世纪50年代以来，饲用抗生素在养殖生产上被大规模使用，无论在抗病、防病方面，还是在促进动物生长方面都发挥了巨大的作用。但随着养殖业集约化生产的发展，添加饲用抗生素带来的微生物耐药性不断增强及农产品中药物残留的负面影响逐步凸显，世界上许多发达国家已宣布禁用饲用抗生素。随着我国对养殖业中饲用抗生素的管制不断加强，生产中可利用的饲用抗生素种类不断下降，因此，寻找饲用抗生素替代品也成为当前畜牧生产的一大热点问题。在众多饲用抗生素替代品中，益生素由于具有绿色安全的特点，成为当前饲用抗生素的主要替代品。但人们在实际生产中发现，一些微生态产品由于剂量太低以及其对环境的抗性较差，导致在实际生产中的应用效果不稳定，而且其产品的货架期也较短。实际上，微生态制剂的主要作用机制在于微生物的代谢产物以及微生物菌体对宿主的有益效应。所以，一些学者认为，如将益生菌株作为接种物，对饲料进行发酵，使益生素的代谢产物以及益生菌能够保留在发酵饲料中，可以使动物获得其代谢产物以及益生菌菌体的双重功能，这种方法可能会对动物发挥更好的效果。因此，研究开发新型益生菌及其制作的发酵饲料具有广阔的应用前景。

研究表明，发酵饲料pH一般在4.5以下，含有大量的乳酸等有机酸、乳酸菌以及其他有益微生物，而发酵饲料中的有害微生物会被酸性环境以及其他抑菌物质抑制。当前，众多学者与生产者认为，发酵饲料将在我国畜牧业生产中发挥越来越重要的作用。为获取可用于发酵饲料的生产菌株，我们从猪肠道内分离获得一株能抑制大肠杆菌K88、K99以及鸡白痢沙门氏菌且具有良好发酵性能的唾液乳杆菌，并利用该株乳酸菌发酵制作发酵饲料。当前，唾液乳杆菌主要用于人类食品以及保健品中，在动物养殖上使用的研究很少，本发明在该菌的分离筛选、性能测定以及发酵饲料制作等方面的做了大量研究工作，验证了实际生产应用效果，拟为这株唾液乳杆菌在发酵饲料中的生产应用奠定基础。

发明内容

本研究的目的在于提供一株能抑制大肠杆菌K88、K99以及鸡白痢沙门氏菌且具有良好发酵性能唾液乳杆菌，该乳酸菌株可用于生产发酵饲料，该菌株在发酵饲料时可产生大量乳酸，显著增加饲料中乳酸菌的含量，降低饲料中大肠杆菌的数量。

一株制作发酵饲料的唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)菌株和菌种名称。

本发明还提供一种制作乳酸菌类发酵饲料的方法，其特点为制作出的发酵饲料pH值低于4.5，乳酸浓度高于150mmol/g，含有大量的乳酸菌。

发酵饲中的乳酸菌数量可达到1×10⁸cfu/g。

本发明提供了制作乳酸菌发酵饲料的方法，主要包括以下步骤：取活化后的唾液乳杆菌株复壮，将复状菌液以总量8％与2％的糖蜜、20％的水和70％的饲料底物充分混匀，再将混匀物充分混合，将上述混合物放入含有单向阀的塑料袋中压实，密封，在37℃条件下发酵48h，发酵饲料中水分含量约37％。

菌株的培养活化流程：取保存良好的乳酸菌菌株5％接种至10mL标准MRS肉汤中，37℃培养24h，按1％数量接种至复壮液中，复壮液具体组分：葡萄糖1.25％；膨化玉米2.5％；糖蜜1.25％；水95％，37℃培养18h-24h，pH值达到4.5以下即为活化后的种子液。

具体实施方法

实例1、猪源乳酸杆菌菌株的获得

1.1猪源唾液乳杆菌的分离筛选以及鉴定

取大白×长白二元杂交母猪新鲜粪便，在实验室中用生理盐水梯度稀释至10^-4-10^-6，而后涂布到MRS琼脂培养基上，37℃培养24-36h后，待单菌落出现，挑取菌落进行进一步划线纯化，菌株纯化2-3次，将所获培养物在4℃冰箱保存，用于形态学观察与生化鉴定。

取干净载玻片，用接种环取一环无菌生理盐水于玻片，挑取少量细菌，在玻片上涂匀，干燥、固定，再染色，镜检(16×100)。挑取视野清晰、形态典型的细菌涂片，光镜观察茵体形态和纯度。革兰氏染色参照凌代文《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》进行，共分离乳酸杆菌104株。

乳酸菌的产酸能力测定，具体过程如下：取保存的乳酸菌菌株5％接种至10mL标准MRS肉汤中，37℃培养24h，如此活化两代。取100uL的活化后的乳酸菌，接种到10mL包含0.01g/L的溴酚蓝指示剂的改良MRS肉汤，30℃条件下厌氧培养，记录培养物的颜色(由紫色变为黄色)变化时间，在90h后测定pH值。为测定最大产乳酸量，取100uL活化后的乳酸菌接种至10mL含2％CaCO₃(w/v)的mMRS培养基中，30℃条件下培养48h后取样，测定乳酸浓度，每株菌3个重复。乳酸的浓度用乳酸试剂盒测定。

革兰氏阳性兼性厌氧无芽孢杆菌的鉴定试验包括：过氧化氢酶试验、硝酸盐还原试验、明胶液化试验、吲哚试验、硫化氢试验。如上述试验结果均为阴性，则可初步定为乳酸杆菌属。

50uL体系用于扩增菌株DNA，根据GenBank中细菌的16srDNA的序列设计通用引物：5′-AGA GTTTGATCCTGG CTC AG-3′，R：5′-GGCTACCTTGTTACG A-3′，扩增片段长度1502bp。引物由Invitrogen公司合成。PCR扩增体系为50uL，94℃预变性5min；94℃变性30s，59℃退火30s，68℃延伸90s，30个循环；68℃延伸10min。PCR产物送华大基因科技有限公司测序，将所得序列提交GenBank进行Blast分析。

初步分离出9株具有良好产酸性能的乳杆菌。

1.2猪源乳酸菌的抗逆性及益生性

乳酸菌要想在肠道发挥益生作用，要具有快速的生长速度，这有助于益生菌在肠道的生长繁殖，而良好产酸性能有助于抑制肠道的有害菌，除此之外，乳酸菌还要能耐受强酸，以保证通过胃部的强酸性环境。依据以上筛选原则，初步分离出9株具有良好产酸性能的乳杆菌进行了生长、耐酸以及体外抑制有害菌试验，针对乳酸菌菌株的安全性方面，由于细菌耐药性的潜在风险以及可能存在的有害性，乳酸菌的耐药性以及对小鼠的急性毒性进行了评价。

将活化的乳酸菌按1％的接种量接种MRS培养基，分别于接种后0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h取样，测定发酵液的吸光值(OD)，以培养时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘出生长曲线(见图1)。

将供试菌株接种于MRS液体培养基中，活化培养24h，以5％的接种量加入到两份用盐酸调pH为2.5和6.2的MRS培养基中(pH为6.2的培养基为空白对照)，第一份用灭菌生理盐水梯度稀释，取稀释液100μL接种到MRS平板涂板，置于37℃，培养48h，进行菌落计数。第二份37℃处理3h后，再用灭菌生理盐水梯度稀释，取稀释液100μL接种到MRS平板涂板，置于37℃培养48h，进行菌落计数，即3h的活菌数，并计算出乳酸菌的存活率(见表1)。存活率(％)＝(3h的活菌数/0h的活菌数)×100。

乳酸菌在MRS液体培养基中37℃培养24h活化2代，将活化好的菌液离心(10000g，4℃，10min)，上清液经0.22μm微孔滤膜过滤收集备用。将指示菌分别于LB培养基液体培养基中37℃培养24h。然后，离心(10000g，4℃，10min)，弃上清液，菌体悬浮于灭菌生理盐水中，再次离心洗涤，最后制成浓度约为3.0×10⁸CFU/mL的菌悬液，备用。将含菌数为3.0×10⁸CFU/mL的200μL指示菌菌悬液分别接种到琼脂培养基上，放置2h。 待琼脂板凝固后用直径为8mm的牛津杯在琼脂培养基上打孔，以少量灭菌营养琼脂封底。为排除有机酸的干扰，供试菌上清液应经微孔滤膜过滤后分两组，一组不调pH，一组用1mol/L的NaOH调pH为6.5。分别取处理过的上清液100μL加入到琼脂板上的孔中，室温扩散3-5h，37℃培养48h。测量抑菌圈的直径，每组3个重复，取抑菌圈直径的平均值(见表2)。

在MRS液体培养基中接种5％已活化的菌种，37℃厌氧培养2代，取活化后的菌液进行耐药性试验，耐药性试验过程参照ISO 10932/IDF 233标准(ISO.2010)。将各种抗生素稀释到测定浓度，再按比例添加到培养皿中，与温度约为60℃的MRS琼脂培养基混合均匀，待其冷却凝固，即为不同浓度抗生素的MRS琼脂培养基平皿，根据各浓度抗生素菌落的生长情况来确定最低抑菌浓度(MIC)，各抗生素测定范围：氨苄西林(0.065-64μg/mL)，青霉素(0.25-128μg/mL)，红霉素(0.12-128μg/mL)，恩诺沙星(0.065-64μg/mL)，氟苯尼考(0.5-128μg/mL)，氯霉素(0.25-128μtg/mL)，万古霉素(0.12-256μg/mL)，四环素(0.25-256μg/mL)，庆大霉素(1-256μg/mL)，链霉素(1-256μg/mL)(见表3)。

菌株活化准备：将乳酸菌在普通MRS琼脂上活化后，挑取菌落在MRS肉汤中于37℃培养24h备用。参照《现代药物试验方法》中对生物制剂的毒性检测标准，选择纯系小白鼠作为试验动物，采用经口灌胃和腹腔注射途径对菌株进行毒性试验。分别设灌胃组、腹腔注射组和空白对照组，各组随机选取健康小鼠10只，雌雄各半。灌胃组：每只灌胃0.5ml/次，调整菌液活菌数约4×10⁹CFU/ml，连续3d，观察10d，称重；腹腔注射组：每只腹腔注射菌液0.3ml，菌液活菌数约3×10⁹CFU/ml，观察10d，称重；空白对照组：灌胃或腹腔注射等量的生理盐水。动物饲养管理：各组严格隔离，采用笼养，自由采食和饮水，环境温度保持在25～28℃。期间观察小白鼠的精神和生理状态并记录。10日后，剖检小白鼠观察内脏情况(见表4)。

L71号菌株乳酸较其他菌株对pH 2.5的耐受能力更强；对胃环境的有较强的耐受性；具有良好的产酸特性、抗逆性以及益生特性，表现出不耐药性并且对小白鼠无急性毒性，具备用作发酵饲料生产接种菌的潜力。对该菌进行16srDNA测序，经比对显示，该菌为唾液乳杆菌。

图1乳酸菌生长曲线结果

表1乳酸菌对pH 2.5的耐受性结果

注：右肩标相同字母表示无差异(P＞0.05)，间隔的表示差异显著(P＜0.05)。

表2乳酸菌对大肠杆菌及鸡白痢菌的抑菌性结果

注：NE，无抑制；+，抑菌圈直径在0-3mm；++，抑菌圈直径在3-6mm.

表3 9株乳酸菌对不同抗生素的最低抑制浓度结果

注：A氨苄西林Ampicillin，P青霉素Penicillin，Er红霉素Erythromycin，En恩诺沙星Enrolloxacin，F氟苯尼考Florfenicol，C氯霉素Chloramphenicol，V万古霉素Vancomycin，T四环素Tetracycline

表4乳酸菌对饲养小鼠体增重的影响项目

注：右肩标相同字母表示无差异(P＞0.05)，间隔的表示差异显著(P＜0.05)。

1.3乳酸菌发酵饲料

将L71作为接种物，对饲料进行发酵，使其代谢产物以及益生菌能够保留在发酵饲料中，可以使动物获得其代谢产物以及益生菌菌体的双重功能，这种方法可能会有效解决益生素效果不稳定的问题，乳酸菌类发酵饲料要保证饲料内含有足够大量的乳酸菌并尽可能减少饲料中的有害菌。

筛选出的L71乳酸菌菌株，主要包括以下步骤：乳酸菌菌株经活化后，菌株的培养活化流程：取保存的乳酸菌菌株5％接种至10mL标准MRS肉汤中，37℃培养24h，1％接种至复壮液中，复壮液具体组分：葡萄糖1.25％；膨化玉米2.5％；糖蜜1.25％：水95％，37℃培养18h-24h，pH值达到4.5以下即为活化后的种子液。取复壮的种子液以总量8％与2％的糖蜜、20％的水和70％的饲料底物充分混匀，再将混匀物充分混合，将上述混合物放入含有单向阀的塑料袋中压实，密封，在37℃条件下发酵48h，发酵饲料中水分含量约37％。

发酵前后对发酵瓶称重，发酵结束后测定发酵饲料的pH值，同时取样测定发酵饲料中的乳酸含量和常规营养指标(见表5、6)。

将发酵饲料在无菌条件下取出到离心管中，加入等量的生理盐水，混匀后进行梯度稀释10^-5-10^-8，取稀释液100μL分别在MRS以及麦康凯琼脂平板上涂板，置于37℃，乳酸菌厌氧培养48h，大肠杆菌培养24h，进行菌落计数，每组做四个平行(结果见表7)。

L71菌种组的发酵饲料pH值低于4.2，在乳酸含量上，L71组的乳酸含量达到了234mmol/g。发酵饲料中的乳酸菌可达到1.6×10⁸cfu/g显著高于原饲料，大肠杆菌可减少到1×10²cfu/g以下显著低于原饲料。显示出接种L71号菌株的发酵饲料具有良好的饲用性质。

表5发酵饲料干物质消失率、pH值和乳酸含量；

注：右肩标相同字母表示无差异(P＞0.05)，间隔的表示差异显著(P＜0.05)。

表6饲料组成及营养水平

注：右肩标相同字母表示无差异(P＞0.05)，间隔的表示差异显著(P＜0.05)。

表7发酵饲料中乳酸菌和大肠杆菌计数的结果

注：右肩标相同字母表示无差异(P＞0.05)，间隔的表示差异显著(P＜0.05)。

Claims (6)

1.一株分离自猪肠道的可用于制作发酵饲料的唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)菌株。

2.一种用权利要求1中的唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)菌株接种全价饲料或饲料原料后生产的发酵饲料，其特征为：制作出的发酵饲料pH值低于4.5，乳酸浓度高于150mmol/g，含有大于1×10⁸cfu/g的乳酸菌菌落数。

3.权利要求2所述发酵饲料，其制作方法主要包括以下步骤：乳酸菌菌株经活化后，取复壮菌液以总量8％与2％的糖蜜、20％的水和70％的饲料底物充分混匀，再将混匀物充分混合，将上述混合物放入塑料袋中压实，密封，在37℃条件下发酵48h，发酵饲料中水分含量约37％。

4.权利要求3中菌株活化流程，其过程如下：

a.取保存的唾液乳杆菌菌株，按5％接种剂量接种至10mL标准MRS肉汤中，37℃培养24h；

b.取活化后的唾液乳杆菌菌液1％接种至复壮液中，37℃培养18h-24h，pH值达到4.5以下即为活化后的种子液。

5.根据权利要求4所述复壮液，其具体组成成分为：葡萄糖1.25％；淀粉2.5％；糖蜜1.25％；水95％。

6.根据权利要求的1-5任一项所述唾液乳杆菌生物发酵饲料的制备方法，其步骤如下：

a、从健康猪肠道内分离筛选到唾液乳杆菌并保存；

b、取保存的唾液乳杆菌菌株按5％体积接种至10mL标准MRS肉汤中，37℃培养24h，取1％活化菌液接种至复壮液中，复壮液具体组分：葡萄糖1.25％；淀粉2.5％；糖蜜1.25％；水95％，37℃培养18h-24h，pH值达到4.5以下即为活化后的种子液；

c、将扩增后的唾液乳杆菌菌液接种到全价配合饲料或饲料原料中，调节其水分含量，密封发酵48h，pH值达到4.5以下，发酵饲料具有明显酸香气味，即得到生物发酵饲料。