CN108531408A - 一株胶红酵母新菌株及微生态制剂 - Google Patents

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    • C02F3/34—Biological treatment of water, waste water, or sewage characterised by the microorganisms used
    • C02F3/347—Use of yeasts or fungi

Abstract

本发明属于水产微生态制剂技术领域，具体涉及一株高产类胡萝卜素胶红酵母的筛选及含有其的微生态制剂。从公园泥样筛选出产类胡萝卜素能力强的胶红酵母菌，然后经化学方法诱变，获得一株耐低温耐高盐胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)Y4‑5保藏号为CGMCC No.13012。该菌株能在繁殖过程中产生类胡萝卜素，得到的产品在虾、鱼、蟹、贝类、海参、鲍鱼等水产动物保苗、壮苗、育苗以及成体养殖中应用，提高苗种成活率、生长速率，提高皮肤肌肉色泽，提高养殖品质；消解泡沫、分解死藻，改善水质，提高养殖效益，具有推广价值。

Description

一株胶红酵母新菌株及微生态制剂
技术领域
本发明属于水产微生态制剂技术领域，具体涉及胶红酵母及含有其的微生态制剂。
背景技术
类胡萝卜素是一类呈黄色、橙色或红色的多烯类化合物，是自然界中最普遍存在且最稳定的天然色素。作为人和动物体内的一类重要生物活性物质，具有增强机体免疫力、抗辐射、抗肿瘤等重要作用，被广泛应用于食品、医药及饲料添加剂等行业中。类胡萝卜素的生产方法有化学合成法、植物提取法以及微生物发酵法。化学合成类胡萝卜素不仅技术复杂，味道不好，且存在一定的副作用；植物提取类胡萝卜素成本高和操作复杂；微生物发酵法生产类胡萝卜素，不仅成本低廉，工艺简单，且能够保证产品的优质和稳产。
因此，通过微生物发酵法生产类胡萝卜素已成为研究热点。已报道的能产生类胡萝卜素的微生物菌株主要是三孢布拉氏霉菌和海洋红酵母，特别是安全菌株海洋红酵母被广泛研究。海洋红酵母是酵母菌中的一种，属于隐形球酵母科，为单细胞真菌，能产生β-胡萝卜素、虾青素、圆酵母素和红酵母红素等多种色素。
根据市场调查，目前市售的海洋红酵母产品很少，其中不乏以次充好，无活菌及有效成分，颜色勾兑产品，也有一些生物技术公司正致力于开发此类产品，但远没有满足市场需求。现存主要问题：(1)大多数常见菌株生长速度慢，培养时间长及活菌浓度低；(2)菌株特性不明显：代谢产物如类胡萝卜素等产量低；(3)菌株易退化，发酵生产性能不稳定，不满足发酵生产应用。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一株海洋红酵母新菌株及其微生态制剂。
首先，本发明筛选得到一株海洋红酵母菌株HYH4-5，在显微镜下菌落为球状或卵圆状，球状直径为2.3-4.3μm，卵圆状直径大小为2.0-3.5μm×3.5-5.0μm，细胞大多呈现簇状、葡萄状或单个状排列，繁殖方式为芽殖，多端出芽，好氧。在平皿培养基上观察，菌落形态为圆形，菌落隆起，边缘圆整，表面湿润，光滑、粘稠、容易挑起，质地均匀，中央与中心部位颜色质地一致，在适宜琼脂培养基上为红色或橙红色，无假菌丝，直径为21.2-33.5μm。海洋红酵母菌株HYH4-5的18S ITS rRNA基因序列放入GenBank中进行比对，结果显示与Rhodotorula mucilaginosa的18S rRNA序列的相似性达99％。
本发明中的海洋红酵母菌株HYH4-5，其生理生化特性如下：不发酵葡萄糖、麦芽糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、棉子糖和蜜二糖中的任何一种。可对葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、蜜二糖、纤维二糖、海藻糖、木糖、D-阿拉伯糖和L-阿拉伯糖进行同化，对半乳糖、乳糖和可溶性淀粉不能进行同化。
综上所述，常规鉴定结果与酵母鉴定手册的标准数据(胶红酵母类酵母标准菌株的碳源发酵和同化结果)进行对比后，发现菌株与胶红酵母的特征最为接近。结合细菌形态特征、分子鉴定结果、生理生化特性、生长条件，确定海洋红酵母菌株HYH4-5为胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)。
然后，将胶红酵母菌株HYH4-5原株进行二硝基胍诱变后，筛选得到产类胡萝卜素能力最佳新菌株Y4-5。
本发明中的胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)新菌株Y4-5，已于2016年9月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.13012。
本发明还提供含有所述菌株的微生态制剂。
本发明还提供所述菌株或微生态制剂在水产动物养殖或改良养殖水质中的应用。
本发明筛选得到一株生产及应用性能良好的高产类胡萝卜素胶红酵母新菌株，并对完成诱变；同时，研制出包含其活菌及其代谢产物：类胡萝卜素等生长因子的一种新型水产微生态产品，在水产动物保苗、壮苗、育苗以及成体养殖中应用，提高苗种成活率，健胃消食，提亮体色，增加养殖收益，具有良好的市场开发前景。
本发明中的胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)新菌株Y4-5为研制兼具营养以及水体改良功能型的微生态制剂提供了优秀种源。其特点是：(1)菌株生长速度快，产类胡萝卜素能力强，50mL/150mL摇瓶水平下，类胡萝卜素含量为8.82mg/L，且菌体含有丰富的蛋白质，粗蛋白≥41％；(2)菌株适宜低温高盐条件，温度为12-28℃，盐度为0-35‰条件下均正常生长，温度越低产类胡萝卜素能力越佳；适用范围广。(3)菌株经过10次以上传代培养不退化，具有遗传稳定性，且产类胡萝卜素的能力比原菌显著提高。
附图说明
图1所示为胶红酵母Y4-5(HYH4-5-21)菌株传代类胡萝卜素含量测定结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1分离筛选高产类胡萝卜素海洋红酵母菌株
取来自于福建、江苏鱼塘和虾塘的水样、泥样及动物肠道样品、公园泥样及红树叶等，取1mL液体样品或1g固体样品于18ml试管的9mL YPD液体培养基中，加入青霉素钠(80万单位每瓶灭菌蒸馏水稀释成1mL，添加1uL/试管)，85℃水浴处理10min后。试管放入温度为28℃，转速为180rpm条件下振荡培养16h后得到富集培养液。
采用倍比稀释法将富集培养液进行梯度稀释，涂布于YPD固体培养基上，放置于28℃培养箱中48h，挑取平板上所生长的粉红色、红色或橙色单菌落进行划线，并纯化两次，获得活的单菌落，共47株菌，菌种甘油保藏。
实施例2测定生物干重及类胡萝卜素产量，筛选优秀菌株
在超净台中，将47株待测菌株单菌落接入筛选培养基中，重复数为3。培养方法为：250mL摇瓶装液50mL，培养温度28℃，转速180rpm，培养时间36h。
其中，液体培养基P3配方为：酵母膏15g，七水硫酸镁1g，蔗糖40g，海水1000mL(海盐20g)。固体培养基琼脂为20g/L。
细胞干重测定方法：取发酵液10ml，8000r/min离心5min，倒去上清液，加入蒸馏水洗涤三次，再8000r/min离心5min，倒去上清液，在50度烘干至恒重即得干菌体(单位g/L)。
类胡萝卜素的提取方法：1)破壁方法--超声波辅助酸热法：取干菌体放入带帽试管中，按照15ml/g干菌体的量加入3mol/L盐酸(需要配制)，浸泡40min。浸泡过程中将试管至于超声波条件下。破壁完成之后，向细胞碎片中加入丙酮。2)2倍于盐酸破壁液体积作为浸提液，浸泡30min，4000r/min离心15min，所得上清液即为丙酮的类胡萝卜素浸提液。将浸提液用484nm测定。
类胡萝卜素含量测定(μg/g)＝OD×D×V/(0.16×W)
(D为稀释倍数；V为有机溶剂体积；W为提取用菌体干重；0.16为有机溶剂消光系数。)测定吸光度，单位：μg/g。
9株优选菌株测定结果如表1，由表可见，菌株Y4-5细胞干重和总类胡萝卜素产量都为最高。
表1生物干重及类胡萝卜素产量前9的菌株
实施例3海洋红酵母菌株HYH4-5的ITS rRNA基因序列分析
将获得的菌株HYH4-5进行ITS rRNA基因序列分析，序列如SEQ ID No.1所示。将基因序列输GenBank，通过Blast程序对数据库中所有序列进行比较分析。结果发现，海洋红酵母菌株HYH4-5的ITS rRNA基因序列与胶红酵母属模式菌株有较高的相似性。
实施例4海洋红酵母菌株HYH4-5的生理生化特性分析
本发明中的海洋红酵母新菌株Y4-5，其生理生化特性如下：不发酵葡萄糖、麦芽糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、棉子糖和蜜二糖中的任何一种。可对葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、蜜二糖、纤维二糖、海藻糖、木糖、D-阿拉伯糖和L-阿拉伯糖进行同化，对半乳糖、乳糖和可溶性淀粉不能进行同化。
综上所述，确定海洋红酵母菌株Y4-5为胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)。
实施例5获得胶红酵母诱变菌株Y4-5
采用亚硝基胍对海洋红酵母Y4-5进行诱变，操作方法如下：
1)制备菌悬液。取摇瓶培养液10mL 4000rpm离心10min收集酵母。培养方法：250mL摇瓶装液50mL，培养温度28℃，转速180rpm，培养时间24h。用0.1mol/L pH5.5柠檬酸钠缓冲液洗涤2次，用柠檬酸缓冲溶液将细胞悬浮，制成细胞浓度为108CFU/g的菌悬液。
2)配制亚硝基胍原液。滴加2-3滴丙酮溶液至10mg亚硝基胍中，然后加入10mL0.1mol/L pH5.5柠檬酸钠缓冲液使之完全溶解。实验确定亚硝基胍溶液诱变浓度为42μg/mL时，细胞致死率为95％左右，此时突变率最高。
3)进行诱变。取上述菌悬液10mL，加入亚硝基胍溶液0.44mL，使其在菌悬液中的最终浓度达到42μg/mL，于28℃保温30min，取出后立即离心弃去上清液，用0.1mol/L pH7.0磷酸钾缓冲液洗涤2次再用10mL P3液体培养基使菌体悬浮于24℃培养过夜。
4)筛选突变株：将培养好的菌液适当稀释涂布于培养基P3固体平板上(灭菌后固体培养基P3，降温至45℃左右时加入二苯胺溶液中，终浓度为25μg/mL：抑制酵母合成类胡萝卜素的能力，该浓度可杀死90％的细胞)。24℃培养7d，待形成菌落后，挑选出红色较深的菌落，划线保存培养，测定突变株总类胡萝卜素含量。由表2可知，菌株HYH4-5-14类胡萝卜素产量最高，菌株HYH4-5-21的类胡萝卜素总量为最高，因此将HYH4-5-21选为产品候选菌株，重新编号为Y4-5。
表2胶红酵母Y4-5菌株突变菌株类胡萝卜素含量测定结果
5)突变株稳定性测试和保藏。将Y4-5菌株接种于P3固体斜面上保存菌株，连续传代10次，每次传代测定其类胡萝卜素含量。结果见图1。结果表明Y4-5具有传代稳定性，进行保藏。
实施例6胶红酵母Y4-5耐受性测定
(1)低温耐受试验:分别在12℃、15℃、18℃、21℃、24℃、28℃下，在P3固体培养基平板上，进行梯度(10-1、10-2、10-3、10-4)海洋红发酵液点种生长实验(用移液枪吸取发酵稀释液2uL，接种在培养基平板上)，培养时间均为36h，期间每4h进行观察生长状况(菌落大小和颜色)，表征其低温耐受性。
观察结果：在不同温度下，发酵液菌株均可正常生长，但在温度为12-18℃范围内比21-28℃生长速度较慢(体现为同一稀释梯度发酵液，同一时间菌落较小)，但温度越低越有利于色素的产生(菌落颜色越深)，说明该菌株在低温时，类胡萝卜素产生的量不受影响。
(2)高盐耐受试验：在盐度分别为0‰、10‰、15‰、20‰、25‰、30‰、35‰的P3固体培养基平板上，进行梯度(10-1、10-2、10-3、10-4)培养液点种生长实验(用移液枪吸取培养稀释液2uL，接种在培养基平板上)，培养时间36h，培养温度28℃。期间每4h进行观察生长状况(菌落大小和颜色)，表征其高盐耐受性。
观察结果：在不同盐度下，发酵液菌株均可正常生长，但在盐度为20-30‰范围内生长效果最佳(体现为同一稀释梯度发酵液，同一时间菌落大，菌落颜色深)。
实施例7海洋红酵母菌株Y4-5的中试发酵培养
(1)一级摇瓶种子液制备：在超净台中，将分离获得的海洋红酵母菌株单菌落接种至液体培养基P3中，250mL摇瓶装液50mL，180rpm，28℃培养30h。
(2)二级摇瓶种子液制备：将步骤(1)中制备的菌株种子液按照10％的接种量接入以二级摇瓶进行发酵，1000mL摇瓶装液300mL，发酵温度28℃，转速200rpm，发酵时间24h；
(3)发酵罐发酵：将步骤(2)中制备的菌株种子液按照5％的接种量接入100L发酵罐(装液量为60L)中进行发酵，发酵温度28℃，转速300rpm，灌压0.05Mpa，通风比是1:0.5，初始pH值为6.0左右，发酵时间24h。
在此中试条件下，测得类胡萝卜素的产量为10.45mg/L，蛋白含量为41％。
实施例8海洋红酵母产品制备
将所得发酵罐发酵液添加均质剂以及稳定剂处理，均质剂定为黄原胶，添加量为0.4-0.45％，保证液体产品的匀质性；稳定剂选为海盐或氯化钠，添加量为10-12％，以维持活菌稳定性及延长产品货架期。
实施例9本发明胶红酵母微生态制剂对培育南美白对虾幼虾生长和死亡率的影响
在福建漳浦县选择体积为20m3的10个南美白对虾幼虾培育室作为实验池，幼虾规格约为5.35±0.06mm。每个池子中饲养南美白对虾幼虾200万尾。按照质量体积比，在等量饵料(75g)中分别添加0％(对照组)、7.5％(处理一)、12.5％(处理二)、17.5％(处理三)、22.5％(处理四)浓度为5×108CFU/mL的海洋红酵母菌液，每组两个重复，投饵量按虾体重的5％投喂。各处理组投喂总量基本一致。实验周期为5d。
饲喂方式：每2h投饵+2h投喂丰年虫一次，每天投喂6次。投喂前半小时完成拌料。幼虾入池后即开始投喂饵料，试验期间保持水质良好，24h内池水约更换2/5，水温28℃，盐度为28-35‰。
测定指标包括：(1)盐度差异耐受力测定(盐度的剧烈变化可以影响虾苗的成活)。实验在玻璃烧杯内进行，每个烧杯中装进400mL淡水，并投放40尾虾苗，15min后观察虾体的活力健康状况，观察虾苗的活动及成活情况，15min后计算其成活率，每个处理2个重复。如果是健康虾苗会保持活力或短时间内恢复活力，不健康的虾苗则会死亡或恢复较慢(以15分钟内恢复到正常状态记做恢复活力)；(2)结束虾体长(mm)。(3)死亡率＝(1-收获量/放养量)×100％。实验结果见表3。
表3胶红酵母微生态制剂对南美白对虾盐度耐受性、生长和死亡率的影响
(1)盐度差异耐受力测定。与对照组相比，各处理组的虾苗在抗盐实验中死亡率显著低于于对照组。幼虾摄食不同含量的海洋红酵母后，盐度耐受后死亡率具有显著性差异(P﹤0.05)。对照组幼虾的死亡率显著高于处理组，虾苗摄食海洋红酵母后死亡率明显下降。说明海洋红酵母提高了对虾对盐度波动的耐受能力。
(2)体长。各处理组对虾的最终体长均大于对照组，各组的体长没有显著性差异(P﹥0.05)。本实验的研究结果初步证明了，在虾苗饵料中添加海洋红酵母对对虾的生长具有促进作用，但试验周期比较短，为5d，对虾苗的生长没有显著的影响。实验中提供的虾苗个体规格也比较小，不便于观察集体颜色的改善状况，待进行深入研究。
实施例10不同海洋红酵母菌粉对南美白对虾生长和免疫力的影响
首先，取本发明胶红酵母发酵液若干升(冻干保护剂配方：蔗糖5％，脱脂奶粉10％，谷氨酸钠1％，维生素VC 0.5％)进行冻干，制得活菌数为6.23×1010CFU/g菌粉。
其次，收集市售口碑好的海洋红酵母菌粉2种，并完成活菌数计数。
然后，进行实验饲料配制：在同一饲料中分别添加3种海洋红酵母菌粉，最终菌浓度都为1.25×105CFU/g，得到4个处理组：空白对照组、胶红酵母Y4-5实验组(处理1)、市售产品1实验组(处理2)、市售产品2实验组(处理3)。
南美白对虾初均重为3.4±0.048g，试验期为45d。在60L玻璃纤维水族箱中进行养殖试验，4个处理，每个处理2个重复，每个重复30尾虾。投料时间为每天9:00，17:00，22:00，投喂量为体重的4％，适时适量调节。养殖水盐度为30‰，温度28-32℃，2d换一次水。
观察试验期间对虾生长状况及肤色亮度变化；试验结束后停饲1d，称重，计算增重率、饲料系数、成活率及肝体比(肝胰腺重/虾体重)等；每个水族箱随机选取5尾对虾于-20℃保存用于体成分分析，测定指标有虾体水分和粗蛋白；每个水族箱另外随机选取5尾虾，1mL注射器心脏取血及肝胰腺，测定血清SOD及肝胰腺SOD，血清PO。实验结果见表4。
表4不同海洋红酵母菌粉对南美白对虾生长及免疫力的影响
从试验观察发现，与对照组相比，处理组对虾肠道明显粗壮，虾体亮度有所提高。数据结果表明，处理组1对虾终均重显著高于其他各组。处理组2、3饲料系数显著高于对照组、处理组1。各组间存活率没有显著性差异。处理组1的虾体粗蛋白显著高于其他处理组，与对照组有显著差异。处理1和处理2血清SOD活力显著低于对照组，处理3显著高于处理2组，处理3与对照组之间没有显著差异。与对照组相比，处理1和处理2的肝胰腺SOD活力显著低于对照组，处理1和处理2没有显著差异，对照组与处理组3无显著差异。处理1和对照组的血清酚氧化物酶(PO)活力无显著性差异，处理2和处理3的酚氧化酶活力显著高于对照组。
综上所述，与一般市售产品相比，对虾饲料中添加胶红酵母Y4-5具有促进生长的作用，增加虾体蛋白质含量，提高了产品品质；其含有的类胡萝卜素等抗氧化物质，可改善和增强对虾身体机能，使得对虾处于比较小的应激状态，从而免疫酶活力应该处于比较低的水平。处理2、处理3组处于比较高的免疫活力，有可能是类胡萝卜素等抗氧化物质的相对含量低于激活免疫活力含量所致，大量饲用可能引发过度免疫反应。
实施例11本发明胶红酵母微生态制剂对对虾养殖水体的影响
在福建省龙海市养殖区选择两口5亩×1.5米的南美白对虾和黄鳍鲷混养池塘，规格和养殖密度：黄鳍鲷为5000尾/亩，对虾土苗8万/亩。使用产品前养殖池塘水质变黑，水体倒藻，鱼虾吃料很慢。经检测，氨氮、亚硝酸盐超标。原因是前期投料过多造成水质过肥，天气突变，导致水体藻类死亡，水色偏暗，增氧机(5台)打起泡沫。将浓度为2.1×1010CFU/mL的产品1L加到40kg饲料中进行拌料使用，每天投料3次，3-4天后，死藻分解，泡沫消失，水色恢复到正常的茶绿色。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 北京大北农科技集团股份有限公司
福建大北农水产科技有限公司
淮安市淮阴大北农饲料有限公司
<120> 一株胶红酵母新菌株及微生态制剂
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 620
<212> DNA
<213> 胶红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）
<400> 1
cttccgtagg gtgaacctgc ggaaggatca ttagtgaata taggacgtcc aacttaactt 60
ggagtccgaa ctctcacttt ctaaccctgt gcatttgttt gggatagtaa ctctcgcaag 120
agggcgaact cctattcact tataaacaca aagtctatga atgtattaaa ttttataaca 180
aaataaaact ttcaacaacg gatctcttgg ctctcgcatc gatgaagaac gcagcgaaat 240
gcgataagta atgtgaattg cagaattcag tgaatcatcg aatctttgaa cgcaccttgc 300
gctccatggt attccgtgga gcatgcctgt ttgagtgtca tgaatacttc aaccctcctc 360
tttcttaatg attgaagagg tgtttggttt ctgagcgctg ctggccttta gggtctagct 420
cgttcgtaat gcattagcat ccgcaatcga acttcggatt gacttggcgt aatagactat 480
tcgctgagga attctagtct tcggactaga gccgggttgg gttaaaggaa gcttctaatc 540
agaatgtcta cattttaaga ttagatctca aatcaggtag gactacccgc tgaacttaag 600
catatcaata agcggaggaa 620

Claims (9)

1.一株胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)新菌株Y4-5，其保藏号为CGMCCNo.13012。
2.含有权利要求1所述菌株的微生态制剂。
3.如权利要求2所述的微生态制剂，其特征在于，为液体制剂，并含有稳定剂和均质剂。
4.如权利要求3所述的微生态制剂，其特征在于，所述的稳定剂为海盐或者氯化钠。
5.如权利要求3所述的微生态制剂，其特征在于，所述的均质剂为黄原胶。
6.如权利要求2所述的微生态制剂，其特征在于，为冻干粉剂，并含有冻干保护剂。
7.如权利要求6所述的微生态制剂，其特征在于，所述的冻干保护剂为蔗糖5％，脱脂奶粉10％，谷氨酸钠1％，维生素VC 0.5％。
8.权利要求1所述菌株在水产养殖中的应用，其特征在于，作为虾、蟹、鱼、贝类及海参等的开口饵料和增色剂，或作为水产幼龄动物保苗及壮苗剂，以1.0-2.0％的用量拌料使用。
9.权利要求1所述菌株在改良养殖水体中的应用，其特征在于，以0.5-1.0％的用量拌料使用或者以0.5-1L/亩的用量泼洒使用。
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