CN110295211A - 一种细菌富硒蛋白的制备方法与应用 - Google Patents

一种细菌富硒蛋白的制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种细菌富硒蛋白的制备方法与应用，本发明利用茶树内生草螺菌较强的硒酸盐还原能力的生物学特性，将茶树内生草螺菌置于含硒酸盐的培养基中生长发酵，茶树内生草螺菌通过硒酸盐还原和硒蛋白合成途径合成高富硒蛋白，蛋白中的硒含量高达1.5μg/mg以上。将制备的可溶性富硒蛋白补进鱼饲料内喂鱼，可溶性富硒蛋白既可为鱼类提供有机硒以增强鱼的抗病性又可为鱼类提供营养素蛋白质，实现养殖鱼类产量和品质的提升，该技术操作简便、成本低廉，绿色环保无公害。

Description

一种细菌富硒蛋白的制备方法与应用
技术领域
本发明涉及的是利用茶树内生草螺菌制备可溶性富硒蛋白、提高鱼产量和品质的技术以增强鱼类的生长和抗病能力，具体涉及一种应用茶树内生草螺菌与硒酸盐共培养生产可溶性富硒蛋白质的方法。
背景技术
中国经济鱼类主要有青鱼、草鱼、链、鳙、鲤、鲫、鳊、团头鲂等，它们是池塘养殖的主要鱼种。鱼病大致可分为三大类：传染性鱼病、侵袭性鱼病和非寄生物引起的鱼病，主要由病毒、细菌、真菌或藻类病原引起。尤其是病毒性鱼病，往往引起鱼类大量死亡，对淡水养鱼业影响严重，目前尚缺乏有效的控制方法。中国淡水鱼病毒病主要有草鱼出血病、青鱼出血病和鲤痘疮病等。由于鱼体皮肤能分泌粘液，鱼体内又有一定的免疫力，细菌通常难以侵入。但当水体中鱼类密度增加、水质条件恶化、饲养管理不当、鱼体有损伤、鱼类抵抗力降低时，细菌性鱼病也常发生和流行,造成鱼类大量死亡。真菌性鱼病是由水生真菌寄生于鱼的皮肤、鳃或卵上引起。只有极少数单细胞藻类可成为寄生性的病原，使草鱼、鲢、鳙、金鱼等致病，如嗜酸卵甲藻病，发生在酸性水质的鱼池中。防治方法主要采用科学放养、提高鱼体抗病力、控制病原及施用药物等措施。科学放养要求鱼场水源要充足、清洁、不受污染，水质理化特性应适合鱼类习性。多种鱼混养、密度适中，投饵定质、定量、定位、定时，定期检查鱼情，可防止病害发生和蔓延；提高抗病力则是给鱼体注射或口服疫苗、喷疫苗雾化液或将鱼体浸入疫苗液可使鱼体获得免疫力；通过人工选择或杂交方法培育抗病力强的鱼品种，也是预防鱼病的积极手段。控制病原即要求鱼池放养前要清理，除去池底表层污泥、杂草等，以消灭病原体和寄生虫产卵场所。使用生石灰、漂白粉、茶饼等撒入池中进行药物清塘，所投水草饵料和粪肥、鱼类食饵场所及养殖工具等在投饵或使用前用漂白粉等消毒。用于预防和治疗鱼病的药物主要有卤素类(漂白粉、氯化钠、碘等)、重金属盐类(硫酸铜和硫酸亚铁、氯化铜、重铬酸钾等)、磺胺类(磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺呱等)、有机磷杀虫剂(敌百虫等)、抗生素(青霉素、链霉素、氯霉素、金霉素、土霉素、红霉素等)、中草药(乌桕、大黄、五倍子、地锦草、柳树叶、蓖麻、铁苋菜、烟叶等)以及其他有杀菌作用的孔雀绿和美蓝等染料、生石灰、硫磺、硼砂、高锰酸钾等。由此可见，鱼病的防控重点在于提高鱼体抗病力。一旦鱼发病后虽可进行治疗但使用的大多数药剂污染生态环境、不利于人类健康。尤其是病毒性鱼病，目前尚缺乏有效的控制方法。注射疫苗虽然有效但疫苗功效单一、广谱性差、制备研发成本高且操作繁杂。利用基因技术培育转基因抗病鱼种不仅研发周期长而且推广应用困难，不易被社会大众接受。因此，开发新型鱼类广谱抗病制剂就显得尤为紧迫和重要。
硒是人和动物必需的微量元素之一，与机体的抗氧化能力、免疫功能、抗病、抗癌作用等有着十分密切的关系。自然界的硒主要是以SeO4 2-和SeO3 2-的形式存在，易溶于水，对动、植物有明显的毒性。它们可通过根部吸收直接进入植物体内并转化为有机硒，有机硒才能被人体或动物有效利用。鉴于硒具有高效抗氧化、抗癌、中和重金属毒性、高吸收利用率等独特的生物学效应，在家养动物生产、医药、保健品方面具有潜在的应用前景。目前尚有许多方法生产富硒食品如硒大豆、富硒茶以及硒酵母等，作为食品添加剂用于家养动物、医药、人体保健品方面。在鱼类养殖方面，目前主要是在饲料中添加亚硒酸钠或添加硒酵母喂鱼虾以提高产量和鱼肉硒含量。也有人尝试将红色元素硒(Se0)用于鱼类养殖。不过，研究发现其效果虽明显但仍不及直接喂食硒蛋白。利用动植物制备富硒蛋白作鱼食料不仅有机硒含量难达标而且成本高、无经济效益。如何提供大量价廉物美的富硒蛋白一直是个尚未解决的问题。为了促进鱼类抗病能力以提高鱼的产量和品质，我们提出了一个新的思想，利用生长繁殖快速、无毒无公害且富硒能力强的微生物制备富硒蛋白，既可以提供增强鱼类抗病能力的有机硒又可以提供鱼类生长的营养素-蛋白质。选用的微生物必须满足以下几个条件：(1)不带有任何质粒DNA和病毒；(2)不产生抗生素类物质，也不具抗抗生素的特性；(3)无公害,对鱼类、植物、动物或人类无致病性；(4)具有高效合成硒蛋白的能力。根据这些条件,我们选用实验室长期研究且独立拥有的茶树内生草螺菌,通过添加硒酸盐发酵，生产出高富硒蛋白并建立了一种应用茶树内生草螺菌生产高富硒可溶性蛋白以增强鱼类抗病性、提高产量与品质的新技术。
茶树内生草螺菌是一种与茶树共生、专一性强的内生革兰氏阴性细菌，不含质粒和噬菌体，不产生抗生素类物质，无致病性。文献“两株茶树内生草螺菌的微生物学特性”和“草螺菌Herbaspirllum sp.WT00F的生理生化性质和促生作用研究”(王婷等，微生物学报2014第4期、P424-432；刘伟林等,湖北大学学报2017第3期、P291-298)详细叙述了茶树内生草螺菌的微生物学特性与茶树促生作用，但未涉及茶树内生草螺菌的硒蛋白的合成与应用。
近期我们发现茶树内生草螺菌拥有完整的硒代谢途径，具有强的硒酸盐还原能力。在硒酸盐的刺激下，细菌能高效表达葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶(G6PD)、L-seryl-tRNA硒转移酶(L-seryl-tRNA(Ser)seleniumtransferase)和硫氧还蛋白还原酶(thioredoxinreductase)。这些酶能有效地催化硒酸盐/亚硒酸盐的还原并将硒转移至蛋白质，形成富硒蛋白。而专利“一种茶树内生草螺菌制备纳米红色元素硒的方法”CN 105838740A，该专利公开了利用茶树内生草螺菌和硒酸盐共培养来制备红色元素硒(Se0)的方法，并不涉及硒蛋白合成,因为红色元素硒的生成与硒蛋白合成的途径并不相同,仅在还原硒酸盐(6价)生成亚硒酸盐(4价)这一步是相同的，因此，草螺菌还原硒酸盐(6价)生成红色元素硒并不直接提示该细菌一定能高效合成硒蛋白。红色元素硒为无机硒,而蛋白硒为有机硒,两者是不同的。
发明内容
本发明的目的是提出一种利用茶树内生草螺菌在含有硒酸盐的培养基中发酵生产富硒蛋白的方法。茶树内生草螺菌通过硒酸盐还原，形成中间产物磷酸硒，再经过L-seryl-tRNA硒转移酶的作用将硒转移至半胱氨酰-tRNA上,后者在蛋白质合成过程将硒整合至新合成的蛋白质分子中形成硒蛋白。高浓度硒酸盐剌激茶树内生草螺菌硒蛋白合成途径中的两个关键酶L-seryl-tRNA硒转移酶(SELA)和硫氧还蛋白还原酶(TRXB)高效表达,从而有效地促进茶树内生草螺菌体内硒蛋白的合成。因此,使用茶树内生草螺菌与硒酸盐共培养，能高效合成硒蛋白。抽提茶树内生草螺菌体内可溶性硒蛋白并用于鱼类养殖，以增强鱼类生长抗病能力、提高鱼产量和质量。
发明人经过大量试验和不懈努力，最终获得了一种茶树内生草螺菌可溶性富硒蛋白的合成途径：茶树内生草螺菌基因组测序后，利用生物信息学方法分析基因功能。KEGG(京都基因与基因组百科全书)代谢途径分析后，发现茶树内生草螺菌在硫酸腺苷酰转移酶(CYSD)催化作用下将硒酸盐还原成亚硒酸盐，亚硒酸盐经硫氧还原蛋白还原酶(TRXB)催化生成硒化氢，硒化氢经硒化物-水二激酶(SELD)催化生成硒磷酸，然后在L-Seryl-tRNA硒转移酶(SELA)作用下将硒磷酸转移到L-Seryl-tRNA分子上形成L-硒半胱氨酸酰基tRNA并参与蛋白质合成，最终形成硒蛋白。另一条通路是胱硒醚经胱硫醚β-裂解酶(CBL)裂解生成硒代高胱氨酸,再经5-甲基四氢叶酸一高半胱氨酸甲基转移酶(MET)作用生成硒代蛋氨酸,硒代蛋氨酸在甲硫氨酰-tRNA合成酶(MARS)催化下形成L-硒蛋氨酸酰基tRNA，最后进入蛋白质合成过程生成硒蛋白。
茶树内生草螺菌在含有50mM硒酸钠的LB液体培养基(10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g NaCl，加水至1000mL，pH7.2)中生长12小时,半定量RT-PCR分析发现硒蛋白合成途径中的L-Seryl-tRNA硒转移酶(SELA)、硫氧还原蛋白还原酶(TRXB)和葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶(G6PD)的转录量提升1倍。这些结果为利用茶树内生草螺菌合成硒蛋白奠定了坚实的基础。
本发明一个目的为提供一种细菌富硒蛋白的制备方法，该方法包括如下步骤为(1)茶树内生草螺菌与硒酸盐共培养合成硒蛋白
取-80℃保存的茶树内生草螺菌菌种，接种5mL营养肉汤培养基(10g胰蛋白胨，3g牛肉粉，5g NaCl，加水至1000mL)，每分钟150转摇动，28℃培养过夜。将活化后的菌液以体积比1:100接入含有10mM硒酸钠的LB液体培养基(10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g NaCl，加水至1000mL，pH7.2)中，摇床转速每分钟250转，温度为37℃培养至OD600＝0.8。然后在5L发酵罐(Biotech)中加入4L LB液体培养(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％氯化钠、50-100mM硒酸钠pH7.2)，121℃灭菌30min。待培养基冷却后，按照发酵培养基体积1％的接种量接入培养的菌液，在温度为37℃、转速200rpm、pH7.0、通气量为1v/v.min条件下发酵24-48小时至OD600＝2。
(2)可溶性硒蛋白的制备
发酵完成后,在转速6000rpm、4℃离心15分钟收集菌体，并用0.1M PBS(磷酸盐平衡生理盐水,pH7.4)悬浮。再在相同条件下重复离心洗涤2次以去掉培养物中的残留成分。将离心收集的菌体悬浮在溶液I(0.1mM EDTA(乙二胺四乙酸)、50mM TrisHCl,pH8.0)中,超声波破碎菌体。转速12000rpm、4℃离心15-20分钟，去掉沉淀物并收集上清液。合并收集的上清液用溶液II(0.1mM EDTA、50mM PBS,pH7.4)4℃透析过夜,中间更换3次溶液II以除去蛋白溶液中的小分子无机物。透析后即为纯净的可溶性硒蛋白制品。依据制造商的说明指南，使用Bradford蛋白质定量试剂盒(TIANGEN BIOTECH公司)测定蛋白浓度。
(3)蛋白硒含量的检测
参照国家标准《食品中硒的测定》(GB5009.93-2010),准确取10mL样品,置于磨口锥形瓶中并在石墨电热板上180℃蒸干至2mL，静置冷却。向锥形瓶中缓慢加入10mL硝酸-高氯酸(HNO3：HClO4＝4：1)混合液，轻轻摇晃混均后放置过夜。然后置于石墨电热板上180℃消化至2mL。静置冷却至室温后，加入10mL 6M盐酸溶液并静置过夜。将锥形瓶内的消化物倒入50mL容量瓶中，并用超纯水少量多次洗净锥形瓶内部,收集洗涤液并合并至容量瓶中并用超纯水定容至50mL，静置过夜。从50mL容量瓶中取5mL澄清上层液体至干净的25mL容量瓶中，准确加入2.5mL盐酸溶液(HCl:超纯水＝1:1)和1.0mL 10％铁氰化钾溶液，用超纯水定容至25mL，混合均匀。此为待测溶液。标准曲线溶液的配制:先取1.0mL 0.1mg/L硒标准液，用超纯水定容至100mL。再按比例取不同体积的硒溶液于25mL比色管中并用超纯定容至10mL，硒的终浓度分别为0.0μg/L、4.0μg/L、8.0μg/L、12.0μg/L、16.0μg/L、20.0μg/L。再分别加2.5mL盐酸溶液(HCl:超纯水＝1:1)和1.0mL铁氰化钾溶液，混合均匀即为标准曲线待测液。所有处理后的样品均在带硒空心阴极灯的原子荧光光谱仪上测定,获得数据并汇制标准曲线。然后根据待测样品的读数减去对照的读数的差值,在标准曲线上求得待测样品的含硒值,再乘以稀释倍数即为待测样品中硒含量。每个样品测量重复三次。经步聚(1)和(2)制备的茶树内生草螺菌硒蛋白硒含量为每毫克蛋白中含1.5-2.3μg硒。
本发明另一个目的为提供一种细菌富硒蛋白的应用，按国家农业部《饲料添加剂安全使用规范》的要求，硒在饲料中的最高限量为0.5ppm,推荐的添加量为0.1-0.3ppm。依据推荐的硒含量，将内生草螺菌可溶性硒蛋白按一定比例直接喷洒到鱼饲料上，凉干后喂鱼；也可以按一定比例添加到鱼饲料内制备含硒鱼饲料。
与现有技术相比，本发明具有独特的优点：
(1)、茶树内生草螺菌是茶树专一性强的内生细菌，与茶树互惠共生无致病性。它既不含质粒也不含病毒，不产生任何抗生素类物质，也不具有抗生素抗性基因，无公害,对鱼类、动植物或人类无致病性，还具有高效合成硒蛋白的能力。本发明充分利用了茶树内生草螺菌这些生物学特性，将茶树内生草螺菌与硒酸盐共培养,生产内生草螺菌富硒蛋白。内生草螺菌富硒蛋白虽然不宜作为哺乳类动物或人类的食物但用作鱼类食物是可行的。有机硒含量高达1.5μg/mg以上的硒蛋白一方面为鱼类提供有机硒,增强鱼类免疫力即抗病源性微生物的能力；另一方面蛋白质还可为鱼类提供氨基酸来源，有利于鱼的生长发育，改善鱼的产量和品质。
(2)、制备的内生草螺菌可溶性硒蛋白内不含细菌细胞、细胞壁组分、小分子代谢产物以及有毒的无机硒，而有机硒含量高。与目前市售的富硒酵母硒相比，蛋白有机硒含量明显较高且不含其它菌体杂质。富硒酵母是完整的酵母细胞制备而成，按公司销售标注的硒含量为2000mg/kg计算，每毫克酵母粉含2μg硒。其中有机硒占95％即有机硒含量为1.9μg/mg。酵母产品中蛋白含量最高为48％,实际富硒酵母蛋白硒含量为0.91μg/mg蛋白。况且还有一部分细胞蛋白是不可溶的。由此可见，内生草螺菌可溶性硒蛋白的含硒量(>1.5μg/mg)明显高于硒酵母蛋白。内生草螺菌可溶性硒蛋白不仅有机硒含量高而且硒蛋白有利于鱼直接吸收利用，既提高鱼的抗病能力又能促进鱼的生长、提高鱼的产量。
(3)、本发明结合细菌发酵、蛋白抽提技术,通过简单的细菌发酵方法制备茶树内生草螺菌可溶性富硒蛋白,操作简便、成本低且易于放大生产规模。
附图说明
图1为本发明实施例1中使用不同浓度的红色纳米硒与鲤鱼上皮细胞共培养后干扰素IFN基因相对表达量的实验结果。与对照比较，在10、20、50μg/ml红色纳米硒的剌激下，鲤鱼上皮细胞中干扰素基因表达量呈现不同程度的提升。尤其是加有50μg/ml红色纳米硒的条件下，干扰素基因表达量提高1倍。
图2为本发明实施例2中使用不同浓度硒酸钠处理茶树内生草螺菌后硒蛋白合成途径15个基因相对表达量的实验结果。图中左上方小框内的数字表示实验中加入的硒酸钠浓度。在硒酸钠的作用下，茶树内生草螺菌细胞中的葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶(G6PD)、L-seryl-tRNA硒转移酶(SELA)和硫氧还蛋白还原酶(TRXB)基因表达明显上调。
图3为本发明实施例3中制备的茶树内生草螺菌硒蛋白的10％SDS-PAGE电泳的实验结果。M：标准分子量蛋白质；1：未加硒酸钠培养的茶树内生草螺菌的蛋白样品(对照组)；2：加50mM硒酸钠培养的茶树内生草螺菌的蛋白样品(实验组)。
图4为本发明实施例3中使用不同浓度硒酸钠培养茶树内生草螺菌后硒蛋白的硒含量测定的实验结果。用50mM硒酸钠培养茶树内生草螺菌,硒蛋白中的硒含量达到1.5μg/mg以上。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲述的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动和修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
由于硒能增强免疫力的结论是从哺乳动物实验中获得的，硒是否真正能增强鱼类免疫力一直尚未证实。为了证实硒确实能增强鱼类免疫力，我们在25ml培养瓶中加入含10％胎牛血清的199培养基(ThermoFisher Scientific公司),并接种鲤鱼上皮细胞(EPC细胞)，置于CO2培养箱28℃培养24小时。更换新鲜的培养基后加入由茶树内生草螺菌还原合成的红色纳米元素硒(Se0)(0、10、20、50μg/ml),继续培养48小时。收集细胞后使用Trizol试剂盒(Ambion公司)提取细胞RNA。再用RNA为模板,使用PrimeScriptTM II 1st StrandcDNA Synthesis试剂盒(Takara公司)合成cDNA。将cDNA稀释10倍后用SYBR Green荧光定量PCR法检测内参β-肌动蛋白(β-actin)和干扰素IFN基因的表达量。IFN基因的相对表达量用用2-△△CT表示，结果(见图1)说明硒的确可以增强鱼的干扰素基因表达，提升鱼的抗病能力。
实施例2
为了验证茶树内生草螺菌能否高效合成硒蛋白，将茶树内生草螺菌接种至含有不同硒酸钠浓度(0、20、50、100mM)的LB培养基中,37℃培养12小时。4℃、8000rpm离心收集细菌细胞，并用PBS(磷酸缓冲液pH7.2)洗涤两次。使用RNAisoTM试剂盒(Takara公司)提取总RNA，再用Prime ScriptTM RT reagent试剂盒(Takara公司)合成cDNA,然后使用常规的半定量PCR方法检测茶树内生草螺菌硒蛋白合成途径中的15个基因的相对表达量。用茶树内生草螺菌16S rRNA基因作内参,结果见图2。在硒酸盐的刺激下，茶树内生草螺菌能高效表达葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶、L-seryl-tRNA硒转移酶和硫氧还蛋白还原酶。培养过程中加入的硒酸盐能促进茶树内生草螺菌的硒蛋白合成，说明利用茶树内生草螺菌生产硒蛋白具有显著的优势。
实施例3
取-80℃保存的茶树内生草螺菌菌种，接种5mL营养肉汤培养基(10g胰蛋白胨，3g牛肉粉，5g NaCl，加水至1000mL)，每分钟150转摇动，28℃培养过夜。将活化后的菌液以1:100比例接入含有0、5、10、20、50mM硒酸钠的LB液体培养基(10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g NaCl，加水至1000mL，pH7.2)中,摇床转速每分钟250转，温度为37℃培养24小时。在转速6000rpm、4℃条件下离心15分钟收集菌体，并用0.1M PBS(磷酸盐平衡生理盐水,pH7.4)悬浮。再在相同条件下重复离心洗涤2次以去掉培养物中的残留成分。将离心收集的菌体悬浮在溶液I(0.1mM EDTA(乙二胺四乙酸)、50mM TrisHCl,pH8.0)中,超声波破碎菌体。转速12000rpm、4℃离心15-20分钟，去掉沉淀物并收集上清液。合并收集的上清液用溶液II(0.1mM EDTA、50mM PBS,pH7.4)4℃透析过夜,中间更换3次溶液II以除去蛋白溶液中的小分子无机物。使用Bradford蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度后,10％SDS-PAGE电泳检查蛋白样品，结果见图3。最后按照上述蛋白硒含量的检测方法测定硒含量，结果见图4。
实施例4
购买100条市售红鲤幼鱼(6-8cm长)，分别在两个长100cm、宽50cm、高55cm玻璃鱼缸中放养，每缸50条。电动泵通气并让水流动，室内养殖。一个鱼缸用作对照组，喂食市售鱼饲料。另一个鱼缸用作实验组。将内生草螺菌可溶性硒蛋白直接喷洒到市售鱼饲料上，使鱼饲料中的硒终浓度为0.3ppm，通风凉干后喂食实验组红鲤幼鱼。除喂食的鱼饲料不同外，两组的其它管理(如换水、喂食量和喂食时间等)相同。喂食3个月后，对照组有4条幼鱼死亡，鱼体长为9-12cm而实验组幼鱼活泼无一条死亡，体长达10-14cm。解剖未发现鱼鳃、心脏、肠道等有任何异常病变。

Claims (5)

1.一种细菌富硒蛋白的制备方法，其特征在于：茶树内生草螺菌在含硒酸盐的培养基中发酵，可将硒酸盐还原后再经过硒蛋白合成代谢途径合成硒蛋白。
2.如权利要求1所述的一种细菌富硒蛋白的制备方法，其特征在于：所述的茶树内生草螺菌在含硒酸盐培养基中的发酵制备方法包括如下步骤：
（1）茶树内生草螺菌与硒酸盐共培养合成硒蛋白：首先将茶树内生草螺菌菌种接种营养肉汤培养基，每分钟150转摇动，28 °C培养过夜；然后将活化的菌液以体积比1:100接入含有10 mM 硒酸钠的LB液体培养基中，摇床转速每分钟250转，温度为37 °C，培养至OD600=0.8；最后在发酵罐中发酵，按照发酵培养基体积1%的接种量接入已培养好的菌液，在温度为37℃、转速200 rpm、pH7.0、通气量为1 v/v.min条件下发酵24-48 小时至OD600=2；
（2）可溶性硒蛋白的制备：发酵完成后,在转速6000 rpm、4℃离心15分钟收集菌体，并用0.1 M PBS悬浮，再在相同条件下重复离心洗涤2次以去掉培养物中的残留成分；将离心收集的菌体悬浮在溶液I中,超声波破碎菌体，转速12000 rpm、4℃离心15-20分钟，去掉沉淀物并收集上清液；合并收集的上清液用溶液II 4℃透析过夜,中间更换3次溶液II以除去蛋白溶液中的小分子无机物，透析后即为硒蛋白制品。
3.如权利要求2所述的一种细菌富硒蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中的发酵培养基组成为：1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%氯化钠、50-100 mM硒酸钠、水1L，pH7.2。
4.如权利要求2所述的一种细菌富硒蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中的溶液I为0.1 mM EDTA、50 mM TrisHCl,pH8.0；溶液II为0.1 mM EDTA、50 mM PBS, pH7.4。
5.一种细菌富硒蛋白的应用，其特征在于：所述的细菌富硒蛋白可直接喷洒到鱼饲料上凉干后喂鱼；也可以添加到鱼饲料内制备含硒鱼饲料。
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