CN108641989A

CN108641989A - 一株甲基营养型芽孢杆菌及其应用

Info

Publication number: CN108641989A
Application number: CN201810684826.2A
Authority: CN
Inventors: 乔康; 程星凯; 姬小雪; 张典利; 王红艳
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2018-06-28
Filing date: 2018-06-28
Publication date: 2018-10-12
Anticipated expiration: 2038-06-28
Also published as: CN108641989B

Abstract

本发明提供了一株甲基营养型芽孢杆菌TA‑1，保藏编号为CCTCC No. M 2018362。上述甲基营养型芽孢杆菌或/和发酵产物可用于防治玉米茎基腐病菌、番茄灰霉病菌、水稻纹枯病菌、辣椒疫霉病菌、棉花枯萎病菌和烟草黑胫病菌；还可以促进植物生长；具有制备微生物制剂和肥料的应用前景。

Description

一株甲基营养型芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物应用技术及生物防治领域，具体涉及一株甲基营养型芽孢杆菌及其在防治农业病害中的应用。

背景技术

玉米是我国重要的粮食作物，玉米茎基腐病（maize stalk rot）是玉米上发生严重且传播广泛的土传病害，对玉米产量和品质造成很大威胁，在世界各地均有广泛分布。我国于20世纪20年代首次检测到玉米茎基腐病的发生，此后便迅速扩展，目前在河南、山东、新疆、广西等地均有发生，并且呈现出病害流行加剧的趋势。玉米茎基腐病发病突然，爆发性强，田间发病率正常情况下可维持在15%左右，而病害发生严重时能够达到80%以上。茎基腐病虽然发生在玉米生育后期，但这正是果穗产量积累的关键阶段，而此时病害的发生会直接影响玉米植株对水分和养料的吸收，导致植株代谢功能遭到破坏，从而引起玉米产量和品质的严重损失。研究表明，引起玉米茎基腐病的致病菌种类繁多，组成复杂，主要包括镰刀菌（Fusarium）、炭疽菌（Colletotrichum）、赤霉菌（Gibberella）、腐霉菌（Pythium）和部分细菌。受到地理差异及气候因素的影响，不同国家、不同地区甚至同一国家的不同地区之间病原菌种类也存在很大差异。因此关于玉米茎基腐病致病菌的意见和看法也存在很大分歧。多位学者研究发现，镰刀菌是我国玉米主产区玉米茎基腐病的主要致病菌，以禾谷镰刀菌（F. graminearum）致病性最强。

种植玉米抗病品种和施用化学杀菌剂是防治茎基腐病的有效手段。但由于选育抗病品种耗时耗力，而化学药剂的大量使用易造成环境污染、生态失衡等问题，因此，探寻高效安全的玉米茎基腐病防治策略就显得尤为重要。作为一种环境友好、高效无毒的防治手段，生物防治在植物病害的防治中扮演着越来越重要的角色。这其中，芽孢杆菌因具有独特的生物学特性和显著的生防潜力而备受青睐。中国专利CN201610743943.2一种枯草芽孢杆菌及其微生物菌剂和应用公开了一种防治玉米茎基腐和苗期根腐病的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）菌株YNM-3，然而其对玉米茎基腐病主要致病病原菌的抑菌率仅为57.8%，仅表现出中等室内活性；因而仅能在病指较低（18.1）的情况下表现出较好的防效，而在病指较高或在田间小区试验时导致防效较差，仅为40.8%。因此，需要寻找活性更高的生防菌。

发明内容

针对目前玉米茎基腐病抗病品种少，化学农药防治效果差、且存在污染环境的问题，本发明目的在于提供一种甲基营养型芽孢杆菌。该菌株对玉米茎基腐病有着较好的防效，而且能够防治多种土传病害和植物病原菌。

本发明的另一目的是提供一种上述甲基营养型芽孢杆菌及其发酵产物在防治玉米茎基腐病、番茄灰霉病、水稻纹枯病、辣椒疫霉病、棉花枯萎病和烟草黑胫病中的用途。

本发明的再一目的是提供一种含有上述甲基营养型芽孢杆菌及其发酵产物的微生物制剂。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种甲基营养型芽孢杆菌TA-1（Bacillus methylotrophicus），保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No. M 2018362。

所述甲基营养型芽孢杆菌的16S rRNA序列如SEQ ID No. 1所示；gyrB基因序列如SEQ ID No. 2所示。

一种上述甲基营养型芽孢杆菌的发酵产物。所述发酵产物为无细胞发酵液、发酵液的干燥物或发酵液的提取物。

一种上述甲基营养型芽孢杆菌或/和发酵产物在防治玉米茎基腐病菌、番茄灰霉病菌、水稻纹枯病菌、辣椒疫霉病菌、棉花枯萎病菌和烟草黑胫病菌中的用途；优选为玉米茎基腐病菌。

一种上述甲基营养型芽孢杆菌或/和发酵产物在促进植物生长上的用途。

一种含有上述甲基营养型芽孢杆菌或/和发酵产物的微生物药剂和肥料。

所述微生物药剂和肥料可应用于玉米、番茄、水稻、辣椒、棉花和烟草。

本发明的有益效果为：

本发明的甲基营养型芽孢杆菌或/和发酵产物对玉米茎基腐病、番茄灰霉病、水稻纹枯病、辣椒疫霉病、棉花枯萎病等多种植物病原菌有较好的室内与田间防效，尤其是对玉米茎基腐有优异的防效，而且能够促进玉米的生长，具有较好的工业化开发前景。

菌种保藏信息

甲基营养型芽孢杆菌TA-1（Bacillus methylotrophicus），于2018年6月13日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏地址为中国湖北省武汉市洪山区八一路武汉大学保藏中心，保藏编号为CCTCC No. M 2018362。

附图说明

图1是菌株TA-1在NA培养基上的菌落形态；

图2是菌株TA-1的革兰氏染色图片；

图3是基于16S rRNA序列构建的系统发育树；

图4是基于gyrB序列构建的系统发育树；

图5是菌株TA-1不同浓度发酵液对禾谷镰刀菌的抑制效果；

图6是菌株TA-1防治玉米茎基腐病的2015年大田试验结果；

图7是菌株TA-1防治玉米茎基腐病的2016年大田试验结果。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

实施例1 甲基营养型芽孢杆菌TA-1的分离

将2014年9月采集自山东省泰安市的玉米根际土壤，4 ℃保存用于分离拮抗菌。

称取10 g过筛土壤样品，放入装有90 mL无菌水和少量玻璃珠的250 mL灭菌三角瓶中，将三角瓶置于37 ℃、200 r/min摇床上振荡20 min，使之充分悬浮，随后80 ℃水浴处理10 min，用无菌水将菌悬液稀释至10^-3、10^-4、10^-5、10^-6等梯度。分别吸取各梯度溶液100 µL均匀涂布于LB培养基平板上，每个梯度重复3次，置于30 ℃恒温培养箱中培养1-2 d后挑取不同的单菌落经平板划线纯化，4 ℃保存待测。以禾谷镰刀菌（F. graminearum）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、尖胞镰刀菌（F. oxysporum）、烟草黑胫病菌（Phytophthora parasitica var.nicotianae）为筛选菌，采用平板对峙法对拮抗菌进行筛选：在无菌条件下，将病原菌进行活化，用直径5 mm的打孔器在菌落边缘打取菌饼，接种于PDA平板中央，同时在平板四周接种细菌分离物。每个处理重复3次，每重复5个培养皿。以只接种病原菌的PDA平板作为对照，28 ℃恒温培养，待对照组病原菌菌丝即将充满培养皿时测量菌落直径，计算抑菌率：

抑制率（%）=（对照菌落直径-处理菌落直径）/（对照菌落直径-菌饼直径）×100；

选择对5种病原菌抑制效果最好的拮抗菌命名为TA-1，其对5种病原菌的抑菌率见表1。

表1 TA-1对5种病原真菌的拮抗作用

实施例2 甲基营养型芽孢杆菌TA-1的鉴定

2.1 菌株TA-1菌落形态和生理生化性质

将活化后的菌株TA-1划线后接种于NA平板上，37 ℃培养24 h，观察菌落的生长情况、颜色和形态特征：菌株TA-1显微形态为杆状，能够产生芽孢，有荚膜。在NA平板上正常生长，单菌落呈不规则圆形，边缘出现隆起，表面干燥有褶皱，不透明，菌落呈乳白色（图1）；LB液体培养基静止时有菌膜形成。

生理生化性质测定指标主要包括革兰氏染色、VP（Voges-Proskauer）试验、接触酶反应、产生吲哚反应、耐盐能力、淀粉水解活性、酪素水解试验、柠檬酸盐利用试验、甲基红（MR）试验、明胶液化试验、醋酸盐反应、硝酸盐还原试验以及葡萄糖发酵试验等。具体测定方法参照《常见细菌系统鉴定手册》中的方法进行（东秀珠和蔡妙英，2001）。TA-1生理生化特征见表2。革兰氏染色呈现红色，表明菌株TA-1为革兰氏阳性细菌（图2），VP反应、硝酸盐还原试验、明胶液化、氧化酶反应、利用柠檬酸盐、葡萄糖发酵、甘露醇发酵和接触酶反应均表现为阳性，能水解淀粉和酪素，能在10% NaCl环境中生长，甲基红试验反应和醋酸盐反应表现为阴性，不能产生吲哚，不能产生硫化氢气体（表1）。将生理生化试验结果与《常见细菌系统鉴定手册》比对后将菌株TA-1归类为芽孢杆菌属Bacillus，但不能确定菌株TA-1的准确种。

表2 菌株 TA-1生理生化试验结果

注：“+”表示测定结果呈阳性，“-”表示测定结果呈阴性。

2.2 菌株TA-1的分子生物学鉴定

2.2.1 16S rRNA序列分析鉴定

采用细菌DNA试剂盒提取菌株TA-1基因组DNA，随后采用细菌16S rRNA通用引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492R：5’-ACGGCTACCTTGTTACGA CTT-3’对其进行PCR扩增。反应体系（25 µL）为：DNA模板1 μL，Easy Taq酶0.5 μL，引物各1 µL，ddH₂O补足剩余体积。PCR扩增反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35个循环；72℃ 10 min，4 ℃终止反应。扩增产物用1%（w/v）琼脂糖凝胶电泳检测后直接送由上海生工公司完成测序，序列如SEQ ID No.1所示。登录NCBI网站（www.ncbi.nlm.nih.gov），利用Blast软件将获得基因序列与GenBank中已知的序列进行同源性比对分析，选择同源性相近的序列进行系统进化分析，序列先进行多重比对，然后用MEGA 6软件采用邻接法（Kimura's2-parameter模型，bootstrap 1000）构建系统发育树（图3）。系统发育树分析显示，菌株TA-1与甲基营养型芽孢杆菌模式菌株（登录号：EU194897）处于同一分支，同源性达到97%，亲缘关系最近且遗传距离一致。

2.2.2 gyrB基因序列分析鉴定

采用gyrB基因对拮抗菌TA-1进行进一步鉴定。gyrB基因扩增正向引物序列为UP1：5’-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3’，反向引物UP2r：5’-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3’。除扩增引物不同外，反应体系同上。反应条件为：95 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10min，4 ℃终止反应。PCR产物的测序工作以及后续的系统发育进化分析同2.2.1，序列如SEQID No.2所示。系统发育树如图4所示：菌株TA-1与甲基营养型芽孢杆菌模式菌株（登录号：JN896940）处于同一分支，遗传距离最近，具有最近的亲缘关系，相似度达到99%。

根据形态学特征、生理生化测定结果以及对16S rRNA和gyrB基因进行序列分析后，最终将菌株TA-1鉴定为甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）。

实施例2 甲基营养型芽孢杆菌TA-1发酵液的室内抑菌活性

挑取TA-1单菌落转接入新鲜灭菌的LB液体培养基中，37 ℃，150 r/min振荡培养48 h，获得TA-1发酵液，用无菌水调节发酵液浓度为10⁹ CFU/mL，而后将其梯度稀释成各个浓度（10⁸-10⁵CFU/mL）后滤去菌体。采用菌丝生长速率法测定拮抗菌株TA-1发酵液对禾谷镰刀菌的毒力。将灭菌的PDA溶液冷却至55 ℃，加入1 mL不同浓度的TA-1菌液，使其在PDA中达到10⁸-10⁴ CFU/mL的终浓度。然后，将PDA培养基倒入9 cm的灭菌培养皿中。待其凝固后，将活化好的禾谷镰刀菌（直径：0.5 cm）接种到PDA平板的中心。用加入到PDA中的1 mL无菌蒸馏水制备的培养皿作为对照。PDA平板于28 ℃黑暗中培养5 d后测量菌落直径，计算抑菌率（%）。禾谷镰刀菌菌丝生长的抑制率用下式计算：

抑菌率（%）=（对照组菌丝长度-处理组菌丝长度）/对照组菌丝长度×100。

结果如图5所示，其中，A：对照；B：TA-1发酵液浓度10⁴ CFU/mL；C：TA-1发酵液浓度10⁵ CFU/mL；D：TA-1发酵液浓度10⁶ CFU/mL；E：TA-1发酵液浓度10⁷ CFU/mL；F：TA-1发酵液浓度10⁸ CFU/mL。与对照组相比，所有TA-1发酵液处理均能够有效抑制禾谷镰刀菌菌丝的生长。当TA-1发酵液浓度为10⁴ CFU/mL时，与对照平板相比，菌丝生长虽然受到抑制，但抑菌效果较差，菌丝大量生长，但随着TA-1发酵液浓度的升高，抑菌效果逐渐显著，菌丝生长变缓，特别是当发酵液浓度在10⁸ CFU/mL时，菌丝几乎停止生长，此时抑制率达到最大为86.32%。

实施例3 甲基营养型芽孢杆菌TA-1发酵液的盆栽防效

将禾谷镰刀菌接种于装有100 mL CMC培养基的250 mL灭菌三角瓶中，于25 ℃、200 r/min摇床恒温培养3-5 d，获得大型分生孢子。无菌滤纸过滤除去菌丝体，收集分生孢子悬液，采用血球计数板将其浓度调至10⁵孢子/mL。TA-1发酵液的获得如实施例2，梯度稀释成各个浓度（10⁸-10⁵ CFU/mL）。

首先挑选颗粒饱满，大小一致的玉米种子，用1% NaClO进行消毒处理。然后将玉米种子浸泡于不同浓度的TA-1发酵液（10⁴-10⁸ CFU/mL）中2 h，风干过夜后播种于盛有灭菌自然土和育苗基质的营养盆中（直径15×高12 cm），每盆播种8粒玉米种子，用清水浸泡的玉米种子作为空白对照，用25g/L咯菌腈悬浮种衣剂处理的玉米种子作为药剂对照。放置48 h后，每盆接种30 mL禾谷镰刀菌孢子悬浮液，每个处理设5次重复，室内温度控制在25-30℃、相对湿度控制为60%-90%，常规水肥管理。玉米幼苗出土2周后，开始调查玉米的发病率。每个处理选取20株玉米，用清水洗净根部，观察玉米根部发病情况。按以下标准调查玉米茎基腐病病情：

苗期病情分级标准：0级：整株正常生长，无病；

1级：生长正常，根部出现病斑，约占1/4以下，白色根群中带有少许褐色；

2级：生长受阻，侧根少而短，须根很少或没有，病斑成片出现，病斑面积约占1/4~1/2，白色根群和褐色根群相当；

3级：生长极不正常，侧根极小，病斑大片出现，病斑面积约占l/2~3/4，根群颜色以褐色为主；

4级：植株发芽，但不出苗，根部被病斑覆盖，病斑面积占3/4以上，根系出现腐烂症状；

发病率、病情指数以及防治效果分别按照以下公式进行计算：

发病率（%）=（发病植株数/总株数）×100；

病情指数=[Σ（各病级株数×病级数）/（最高病级×总株数）]×100；

防治效果（%）=（对照发病率-处理发病率）/对照发病率×100。

结果如表3所示：与对照相比，用TA-1不同浓度的发酵液对玉米种子进行处理后，玉米茎基腐病的发病率和病情指数显著降低。发酵液浓度从10⁴ CFU/mL提高到10⁸ CFU/mL，玉米茎基腐病的发病率从55.0%降到11.7%，病情指数从36.7降低为10.4，而对照组中玉米茎基腐病的发病率和病情指数分别为88.3%和75.8。随着TA-1发酵液浓度的不断提高，其对玉米茎基腐病的防效逐渐增强，尤其当发酵液浓度为10⁸ CFU/mL时，玉米茎基腐病的发病率和病情指数达到最低，表现出最佳的防治效果，防效高达86.8%，略高于25%的咯菌腈悬浮种衣剂处理。

表3 温室条件下TA-1对玉米茎基腐病的防治效果

处理	发病率(%)	病情指数	防效(%)
				10⁴ CFU/mL	55.0±2.9b	36.7±3.3b	37.7±5.7d
10⁵ CFU/mL	38.3±1.7c	29.2±3.4b	56.6±5.0c
				10⁶ CFU/mL	33.3±1.6cd	24.2±2.7cd	62.3±4.9bc
10⁷ CFU/mL	25.0±0.9de	17.5±4.7de	71.7±6.5abc
				10⁸ CFU/mL	11.7±2.3f	10.4±3.3e	86.8±4.1a
咯菌腈	16.7±1.7ef	14.6±2.2de	81.1±1.9ab
				对照	88.3±5.6a	75.8±1.1a	-

注：表中数据均为5次重复的平均值加减标准误，同列中不同字母表示在P < 0.05水平下差异显著。

实施例4 甲基营养型芽孢杆菌TA-1发酵液的田间防效

将玉米粒在清水中浸泡过夜，待玉米煮沸至开裂后分装于三角瓶，于121 ℃灭菌30min，待玉米粒培养基冷却后，将纯化的禾谷镰孢菌菌丝块接种于玉米粒培养基中，于光照培养箱培养10 d，即为带菌玉米粒培养物。TA-1发酵液的获得如实施例2，梯度稀释成各个浓度（10⁸-10⁵ CFU/mL）。

大田试验分别于2015年6月10日和2016年6月15日在泰安市黄淮海玉米区域技术创新中心进行。试验采用随机区组分布，设置4次重复，每个小区面积30 m²，行长10 m，宽3米，小区之间设有保护行，种植密度6.50万株/hm²。

玉米播种前，首先在每个试验小区里人工接种2 kg带菌玉米粒培养物。选择颗粒饱满，大小一致的玉米种子用1% NaClO进行消毒处理后浸泡于不同浓度的发酵液（10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴ CFU/mL）中2 h，风干过夜后播种于各小区，以未接种病原菌的玉米种子作为空白对照，用25 g/L咯菌腈悬浮剂处理的玉米种子作为药剂对照。田间管理按照大田标准进行，生育期内水分供应充足，病虫草害及时预防。

当玉米生长到乳熟后期，每个处理随机选取60棵玉米植株，按照以下标准调查玉米茎基腐病病情：

0级：植株叶片和茎基部生长正常；

1级：叶片出现青枯症状，面积约占1/4以下，1-2节茎基间无症状；

2级：青枯叶片增多，占1/2左右，茎基1-2节出现水渍状；

3级：叶片出现大量青枯状，约占2/3，茎基部变软，果穗下垂；

4级：整株叶片全部枯死，植株茎基部中孔松软，极易倒伏；

发病率、病情指数以及防治效果按照实施例3中防效公式进行计算。

在2015年大田试验中，与对照组相比，不同浓度的TA-1发酵液对玉米种子进行拌种处理后，均能够显著降低玉米茎基腐病的发病率，表现出良好的防治效果（图6）。随着TA-1发酵液浓度从10⁴ CFU/mL提高到10⁸ CFU/mL，玉米茎基腐的发病率逐渐降低，从22.8%降低到5.6%，而此时对照组发病率达到35.6%。相应地，TA-1对玉米茎基腐病的防效随着发酵液浓度的升高而逐渐提高，但不同浓度的发酵液对玉米茎基腐病的防效差异很大。当TA-1发酵液浓度从10⁴ CFU/mL提高到10⁷ CFU/mL时，玉米茎基腐病的发病率从22.8%降低为10.1%，而防效则从35.9%提高到70.3%；当TA-1发酵液浓度达到最高10⁸ CFU/mL时，玉米茎基腐病的发病率仅为5.6%，而防效则高达84.4%，表现出卓越的玉米茎基腐病防治效果，略高于对照药剂咯菌腈悬浮种衣剂处理后的防效。

2016年的大田试验展现出了和2015年相似的试验结果（图7）。经过TA-1发酵液处理的玉米种子同样能够有效降低玉米茎基腐病的发病率，表现出良好的防效。并且随着TA-1发酵液浓度的升高，玉米茎基腐病的发病率逐渐降低，防效相应地升高。当TA-1发酵液浓度从10⁴CFU/mL提高到10⁸ CFU/mL时，玉米茎基腐病的发病率从22.2%降低为5.0%，而防效则从34.4%提高到85.2%，甚至略高于咯菌腈悬浮种衣剂。

实施例5 甲基营养型芽孢杆菌TA-1发酵液的促生长作用

大田试验分别于2015年6月10日和2016年6月15日进行。试验采用随机区组分布，设置4次重复，每个小区面积30 m²，行长10 m，宽3米，小区之间设有保护行，种植密度6.50万株/hm²。TA-1发酵液的获得如实施例2，梯度稀释成各个浓度（10⁸-10⁵ CFU/mL）。选择颗粒饱满，大小一致的玉米，在播种前用1% NaClO进行消毒处理后浸泡于不同浓度的发酵液（10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴ CFU/mL）中2 h，风干过夜后播种于各小区，以未接种病原菌的玉米种子作为空白对照，用25 g/L咯菌腈悬浮剂处理的玉米种子作为药剂对照。田间管理按照大田标准进行，生育期内水分供应充足，病虫草害及时预防。当玉米生长到乳熟后期，每个处理随机选取60棵玉米植株，对玉米的株高和茎粗进行测量，玉米收获后对其产量进行测定，结果如表4所示：在2015和2016连续两年的大田试验中，不同浓度的TA-1发酵液处理玉米种子后，玉米的株高、茎粗以及产量均能得到显著提高。在2015年的试验中，与对照组相比，不同浓度的TA-1发酵液均能促进玉米植株的生长，当浓度为10⁸ CFU/mL时，玉米株高达到最大值221.3 cm，较对照增加了19.2%，其余浓度处理并没有显著性差异；当浓度为10⁷CFU/mL和10⁸ CFU/mL时，玉米的茎粗达到最大值，分别比对照增加了23.2%和27.8%，而用浓度为10⁴CFU/mL发酵液处理后，玉米的茎粗与对照组相比并没有显著性差异；玉米的产量随着TA-1发酵液浓度的提高而呈增加的趋势，但不同浓度处理后玉米的产量存在较大差异。当TA-1浓度为10⁸ CFU/mL时，玉米的产量达到最高10.89 t/ha，较对照提高了24.0%，较对照药剂咯菌腈悬浮种衣剂也有一定的提高，但二者之间差异并不显著；用浓度为10⁴ CFU/mL和10⁵CFU/mL的TA-1发酵液处理后，玉米产量同样有所提高，但与对照相比，提高的幅度并不是很大。2016年的大田试验结果展现了和2015年大致相同的趋势。随着TA-1发酵液浓度的升高，玉米植株的株高、茎粗以及产量也相应地增加。当TA-1发酵液浓度较低时，彼此之间的生长指标并无太大差异，而当浓度为10⁸ CFU/mL时，玉米株高、茎粗和产量均达到最大值，较对照分别增加17.3%、23.8%和26.2%。

表4 TA-1对玉米株高、茎粗及产量的影响

注：在玉米乳熟后期测量玉米株高和茎粗，在完熟期测定产量。表中数据为其平均值，各处理重复4次，并且按照Student-Newman-Keuls方法进行差异性检验（P < 0.05）。

序列表

<110> 山东农业大学

<120> 一株甲基营养型芽孢杆菌及其应用

<130> 20180619

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1401

<212> DNA

<213> Bacillus methylotrophicus

<400> 1

gcacgtcgag cggacagatg ggagcttgct ccctgatgtt agcggcggac gggtgagtaa 60

cacgtgggta acctgcctgt aagactggga taactccggg aaaccggggc taataccgga 120

tggttgtttg aaccgcatgg ttcagacata aaaggtggct tcggctacca cttacagatg 180

gacccgcggc gcattagcta gttggtgagg taacggctca ccaaggcgac gatgcgtagc 240

cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag 300

gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac ggagcaacgc cgcgtgagtg 360

atgaaggttt tcggatcgta aagctctgtt gttagggaag aacaagtgcc gttcaaatag 420

ggcggcacct tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg 480

gtaatacgta ggtggcaagc gttgtccgga attattgggc gtaaagggct cgcaggcggt 540

ttcttaagtc tgatgtgaaa gcccccggct caaccgggga gggtcattgg aaactgggga 600

acttgagtgc agaagaggag agtggaattc cacgtgtagc ggtgaaatgc gtagagatgt 660

ggaggaacac cagtggcgaa ggcgactctc tggtctgtaa ctgacgctga ggagcgaaag 720

cgtggggagc gaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgagtgctaa 780

gtgttagggg gtttccgccc cttagtgctg cagctaacgc attaagcact ccgcctgggg 840

agtacggtcg caagactgaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc 900

atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacatc ctctgacaat 960

cctagagata ggacgtcccc ttcgggggca gagtgacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag 1020

ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttga tcttagttgc 1080

cagcattcag ttgggcactc taaggtgact gccggtgaca aaccggagga aggtggggat 1140

gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa tggacagaac 1200

aaagggcagc gaaaccgcga ggttaagcca atcccacaaa tctgttctca gttcggatcg 1260

cagtctgcaa ctcgactgcg tgaagctgga atcgctagta atcgcggatc agcatgccgc 1320

ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accacgagag tttgtaacac 1380

ccgaagtcgg tgaggtaacc t 1401

<210> 2

<211> 1016

<212> DNA

<213> Bacillus methylotrophicus

<400> 2

gcgtacggtc ggggactcta gagatgagtc atcatgaccg ttctgcatgc tggtggtaaa 60

tttgacggaa gcggatataa agtgtccggc ggtcttcacg gtgtaggggc gtctgtcgta 120

aacgccttgt cgaccactct tgacgttacg gttcatcgtg acggaaaaat ccactatcag 180

gcgtacgagc gcggtgtacc tgtggccgat cttgaagtga tcggtgatac tgataagacc 240

ggaacgatta cgcacttcgt tccggatccg gaaattttca aagaaacaac cgaatacgac 300

tatgacctgc tttcaaaccg tgtccgggaa ttggccttcc tgacaaaagg tgtaaacatc 360

acgattgaag acaaacgtga aggacaagaa cggaaaaacg agtaccacta cgaaggcgga 420

atcaaaagct atgttgagta cttaaaccgt tccaaagaag tcgttcatga agagccgatt 480

tatatcgaag gcgagaaaga cggcataacg gttgaagttg cattgcaata caacgacagc 540

tatacaagca atatttattc tttcacaaat aatatcaaca catacgaagg cggcacgcac 600

gaagccggat ttaaaaccgg tctgacccgt gttataaacg actatgcaag aagaaaaggg 660

attttcaaag aaaatgatcc gaatttaagc ggggatgatg tgagggaagg gctgactgcc 720

attatttcaa ttaagcaccc tgatccgcaa ttcgaagggc agacgaaaac gaagctcggc 780

aactccgaag cgagaacgat cactgatacg ctgttttctt ctgcgctgga aacattcctt 840

cttgaaatcc ggactcagcc cgcaaaatcg ttgaaaagtt taatggccgc aagagcgcgg 900

atggcagcga aaagcgcggg atttgacccg ccgcaaagtg cggcttgaga tttccatctg 960

gccgggcaat tggctgattg ttctcttaag accgagattt tcgaagttgc agatca 1016

Claims

1.一种甲基营养型芽孢杆菌TA-1（Bacillus methylotrophicus），保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No. M 2018362。

2.根据权利要求1所述的甲基营养型芽孢杆菌，其特征在于，其16S rRNA序列如SEQ IDNo. 1所示；gyrB基因序列如SEQ ID No. 2所示。

3.一种如权利要求1所述的甲基营养型芽孢杆菌的发酵产物。

4.根据权利要求3所述的发酵产物，其特征在于，所述发酵产物为无细胞发酵液、发酵液的干燥物或发酵液的提取物。

5.一种如权利要求1或3所述的甲基营养型芽孢杆菌或/和发酵产物在防治玉米茎基腐病菌、番茄灰霉病菌、水稻纹枯病菌、辣椒疫霉病菌、棉花枯萎病菌和烟草黑胫病菌中的用途。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，在防治玉米茎基腐病菌中的用途。

7.一种如权利要求1或3所述的甲基营养型芽孢杆菌或/和发酵产物在促进植物生长上的用途。

8.一种含有如权利要求1或3所述的甲基营养型芽孢杆菌或/和发酵产物的微生物药剂和肥料。

9.根据权利要求8所述的微生物药剂和肥料，其特征在于，所述微生物药剂和肥料应用于玉米、番茄、水稻、辣椒、棉花和烟草。