CN114410481B - 一株棘孢木霉及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株内生棘孢木霉YN4及应用，于2021年10月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：62007。该菌株可以显著抑制尖孢镰刀菌大豆专化型、尖孢镰刀菌古巴专化型、腐皮镰刀菌、镰状镰刀菌、暹罗炭疽菌、胶孢炭疽菌、平头炭疽菌、齐整小核菌、球黑孢菌、立枯丝核菌、稻瘟病菌和灰葡萄孢的生长；其可以高效防治番茄灰霉病、菜心立枯病、辣椒炭疽病、大豆纹枯病；其挥发性有机物也具有生防作用；该菌也可以显著抑制土壤中菌核的萌发，有望用于防治菌核病害。该菌株来源于植物内生菌，安全性高，可以用于微生物杀菌剂的开发，其应用可以减少或替代化学杀菌剂，为农作物绿色防控提供有力的支撑。

Description

一株棘孢木霉及其应用
技术领域
本发明涉及真菌的防治技术领域，具体地，涉及一株棘孢木霉及其应用。
背景技术
植物病害的发生每年都造成大量的经济损失。目前对植物病害的主要还是依靠化学防治。但是化学农药的持续大量使用，产生严重的“3R”问题，即病原菌抗药性增强、土壤或者环境中有农药残留，还有病原物的再猖獗。这不仅威胁到人类健康，也对环境和非目标生物造成严重危害。
生物防治是农作物绿色防控的重要技术之一。生物防治筛选利用有益的微生物并制成生物制剂，用于防治植物病虫害的发生，从而达到防治病害的目的，是绿色防控病虫害的新思路、新方法。微生物产品具有安全、可持续、广谱和绿色的特点。微生物制剂发挥作用的机理包括抗生作用、竞争作用、重寄生作用及诱导植物产生系统抗性等。微生物制剂也可以促进植物生长，对农产品也有增产作用。使用微生物制备的菌肥可以减少化肥农药施用量30％～60％，增加作物产量视作物不同可达5％～40％，并增加植物对病虫害的抵抗力，从根本上减少化学农药的使用。
目前国内外已有报道多种微生物菌剂应用于生产，包括枯草芽胞杆菌、哈茨木霉、淡紫紫孢霉、巨大芽孢杆菌等等。全球生物农药的市场也呈上升的趋势，我国的微生物菌剂也同样具有庞大的市场。为了开展多功能微生物菌剂的研发，从不同环境筛选获得有益的微生物为产品研发提供重要的微生物来源。其中植物的内生微生物也可以作为生防菌剂的潜在目标，从植物中分离纯化出具有生防潜能的菌株是产品研发的重要基础。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一株棘孢木霉及其应用，本发明发现的棘孢木霉(Trichoderma asperellum)YN4。该棘孢木霉(T.asperellum)YN4菌株对多种植物病原真菌具有显著的抑制作用，还可以高效防治番茄灰霉病、菜心立枯病、辣椒炭疽病、大豆纹枯病，其挥发物也具有显著的抑菌效果，该棘孢木霉(T.asperellum) YN4菌株还可以抑制土壤中菌核的萌发，可以用于防控产菌核真菌引起的病害。该棘孢木霉(T.asperellum)YN4菌株具有开发为生防菌剂的前景。
本发明的第一个目的是提供一株棘孢木霉(Trichoderma asperellum)YN4。
本发明的第二个目的是提供所述棘孢木霉YN4产生的挥发性物质。
本发明的第三个目的是提供所述棘孢木霉YN4产生的非挥发性物质。
本发明的第四个目的是提供所述的棘孢木霉YN4和/或其发酵物、所述的挥发性物质、所述的非挥发性物质中的一种或几种在防治真菌和/或制备真菌的防治药物中的应用。
本发明的第五个目的是提供权所述的棘孢木霉YN4和/或其发酵物、所述的挥发性物质、所述的非挥发性物质中的一种或几种在防治真菌引起的植物病害或制备真菌引起的植物病害的防治药物中的应用
本发明的第六个目的是提供一种真菌抑菌剂。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
一株棘孢木霉(Trichoderma asperellum)YN4，于2021年10月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：62007。
所述棘孢木霉YN4产生的挥发性物质，也属于本发明的保护范围。
优选地，所述挥发性物质为2-辛酮、2,7-二甲基-1-辛醇、3-甲基丁醇、戊基呋喃、乙醇、6-戊基-2H-吡喃-2-酮、甲酸-2-辛酯、和苯乙醇中的一种或几种。
所述棘孢木霉YN4产生的非挥发性物质，也属于本发明的保护范围。
优选地，所述非挥发性物质为乙酸乙酯提取物。
本发明还要求保护所述的棘孢木霉YN4和/或其发酵物、所述的挥发性物质、所述的非挥发性物质中的一种或几种，在防治真菌或制备真菌的防治药物中的应用。
优选地，所述棘孢木霉YN4发酵物为固体发酵物或液体发酵物。
更优选地，所述固体发酵物为棘孢木霉YN4接种至小米，25℃～28℃培养10～14d，即得固体发酵物。
更优选地，所述液体发酵物棘孢木霉YN4接种察氏液体培养基培养5～7d，即得液体发酵物。
优选地，所述真菌为植物病原真菌。
更优选地，所述的棘孢木霉YN4为其菌体和/或孢子。
再更优选地，所述孢子为分生孢子。
优选地，所述植物病原真菌为镰刀菌(Fussarium sp.)、炭疽菌(Colletochichumsp.)、齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)、球黑孢菌(Nigrospora sphaerica)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、稻瘟病菌(Pricularia oryzae)或灰葡萄孢(Botrytis cinerea)中的一种或几种。
更优选地，镰刀菌为尖孢镰刀菌大豆专化型(F.oxysporum f.sp.glycines)、尖孢镰刀菌古巴专化型(F.oxysporum f.sp.cubense)、腐皮镰刀菌(F.solani)、或镰状镰刀菌(F. falciforme)中的一种或几种；所述炭疽菌为暹罗炭疽菌(C.siamense)、胶孢炭疽菌(C. gloeosporioides)、或平头炭疽菌(C.truncatum)中的一种或几种。
优选地，所述的挥发性物质在在防治真菌或制备真菌的防治药物中的应用，所述真菌为镰刀菌。
更优选地，所述镰刀菌为暹罗炭疽菌、镰状镰刀菌、尖孢镰刀菌古巴专化型和腐皮镰刀菌。
优选地，所述的非挥发性物质在在防治植物病原真菌或制备真菌的防治药物中的应用，所述真菌为镰刀菌、炭疽菌和/或立枯丝核菌。
更优选地，所述镰刀菌为镰状镰刀菌、尖孢镰刀菌古巴专化型和腐皮镰刀菌。
进一步优选地，所述炭疽菌为暹罗炭疽菌。
更优选地，所述非挥发性物质为乙酸乙酯提取物。
更优选地，所述应用为抑制立枯丝核菌菌核萌发。
本发明还要求保护所述的棘孢木霉YN4和/或其发酵物、所述的挥发性物质、所述的非挥发性物质中的一种或几种，在防治真菌引起的植物病害或制备真菌引起的植物病害的防治药物中的应用，所述植物病害为真菌镰刀菌(Fussarium sp.)、炭疽菌(Colletochichum sp.)、齐整小核菌(S.rolfsii)、球黑孢菌(N.sphaerica)、立枯丝核菌(R.solani)、稻瘟病菌(P.oryzae)或灰葡萄孢(B.cinerea)中的一种或几种引起的。
优选地，所述棘孢木霉YN4发酵物为固体发酵物或液体发酵物。
更优选地，所述固体发酵物为棘孢木霉YN4接种至小米，25℃～28℃培养10～14d，即得固体发酵物。
更优选地，所述液体发酵物棘孢木霉YN4接种察氏液体培养基培养5～7d，即得液体发酵物。
优选地，镰刀菌为尖孢镰刀菌大豆专化型(F.oxysporum f.sp.glycines)、尖孢镰刀菌古巴专化型(F.oxysporum f.sp.cubense)、腐皮镰刀菌(F.solani)、或镰状镰刀菌(F.falciforme)中的一种或几种；所述炭疽菌为暹罗炭疽菌(C.siamense)、胶孢炭疽菌(C.gloeosporioides)、或平头炭疽菌(C.truncatum)中的一种或几种。
更优选地，所述植物病害为番茄灰霉病、菜心立枯病、辣椒暹罗炭疽菌的、或大豆纹枯病的一种或几种。
优选地，所述真菌为植物病原真菌。
本发明还要求保护一种真菌抑菌剂，含有所述的棘孢木霉YN4和/或其发酵物、所述的挥发性物质、所述的非挥发性物质中的一种或几种。
优选地，所述真菌为镰刀菌(Fussarium sp.)、炭疽菌(Colletochichum sp.)、齐整小核菌(S.rolfsii)、球黑孢菌(N.sphaerica)、立枯丝核菌(R.solani)、稻瘟病菌(P.oryzae)或灰葡萄孢(B.cinerea)中的一种或几种。
更优选地，镰刀菌为尖孢镰刀菌大豆专化型(F.oxysporum f.sp.glycines)、尖孢镰刀菌古巴专化型(F.oxysporum f.sp.cubense)、腐皮镰刀菌(F.solani)、或镰状镰刀菌(F. falciforme)中的一种或几种；所述炭疽菌为暹罗炭疽菌(C.siamense)、胶孢炭疽菌(C. gloeosporioides)、或平头炭疽菌(C.truncatum)中的一种或几种。
优选地，所述棘孢木霉YN4发酵物为固体发酵物或液体发酵物。
更优选地，所述固体发酵物为棘孢木霉YN4接种至小米，25℃～28℃培养10～14d，即得固体发酵物。
更优选地，所述液体发酵物棘孢木霉YN4接种察氏液体培养基培养5～7d，即得液体发酵物。
优选地，所述真菌为植物病原真菌。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明得到的棘孢木霉(T.asperellum)YN4菌株可以显著抑制尖孢镰刀菌大豆专化型、尖孢镰刀菌古巴专化型、腐皮镰刀菌、镰状镰刀菌、暹罗炭疽菌、胶孢炭疽菌、平头炭疽菌、齐整小核菌、球黑孢菌、立枯丝核菌、稻瘟病菌和灰葡萄孢的生长。该棘孢木霉(T.asperellum)YN4菌株可以高效防治番茄灰霉病、菜心立枯病、辣椒炭疽病、大豆纹枯病，其防效分别达到81.25％、63.63％、94.68％和95.87。该棘孢木霉(T.asperellum) YN4菌株的挥发性有机物也具有生防作用，对大豆纹枯病的防效达到99.63％。该棘孢木霉(T.asperellum)YN4菌株也可以显著抑制土壤中菌核的萌发，抑制率达到100％，能够用于防治菌核病害。本发明提供的内生该棘孢木霉(T.asperellum)YN4菌株来源于植物内生菌，安全性高，可以用于开发成微生物杀菌剂，其应用可以减少或替代化学杀菌剂，为农作物绿色防控提供有力的支撑。
附图说明
图1为内生棘孢木霉YN4的菌落图和光学显微镜下孢子形态图；左图为YN4菌落图；右图为YN4菌株光学显微镜下孢子形态图。
图2为内生棘孢木霉YN4 ITS序列电泳图。M1为DL5000分子标记，M2为DL2000 分子标记，1、2为内生棘孢木霉YN4的DNA加样孔。
图3为内生棘孢木霉YN4 ITS序列构建的遗传进化树。
图4为内生棘孢木霉YN4对病原真菌菌丝的重寄生效果。A和B为内生棘孢木霉YN4对灰葡萄孢菌菌丝的生长的重寄生效果；C为内生棘孢木霉YN4对球黑孢菌菌丝的生长的重寄生效果图。
图5为内生棘孢木霉YN4的非挥发性粗提物对暹罗炭疽菌的抑菌效果：A为清水对照组，B为木霉菌株YN4非挥发性粗提物浓度为200mg/L，C为木霉菌株YN4非挥发性粗提物浓度为500mg/L，D为木霉菌株YN4非挥发性粗提物浓度为1000mg/L。
图6为内生棘孢木霉YN4的非挥发性粗提物对立枯丝核菌的抑菌效果；A为清水对照组，B为木霉菌株YN4非挥发性粗提物浓度为200mg/L，C为木霉菌株YN4非挥发性粗提物浓度为500mg/L，D为木霉菌株YN4非挥发性粗提物浓度为1000mg/L。
图7为内生棘孢木霉菌株YN4对番茄灰霉病的离体防治效果：A为清水对照组只喷施无菌水，B为处理组先喷施棘孢木霉菌株YN4孢子液后接种病原菌。
图8为内生棘孢木霉菌株YN4对番茄灰霉病的活体防治效果：A为清水对照组只喷施无菌水，B为处理组先喷施棘孢木霉菌株YN4孢子液后接种病原菌。
图9为内生棘孢木霉菌株YN4对菜心立枯病的防治效果：A为清水对照只喷施无菌水，B为处理组只接种病原菌，C为处理组先喷施棘孢木霉菌株YN4孢子液后接种病原菌。
图10为内生棘孢木霉菌株YN4对辣椒炭疽病的防治效果：A处理组先喷木霉孢子悬浮液后接种病原菌，B为对照组只接种病原菌。
图11为内生棘孢木霉菌株YN4对辣椒炭疽病的防治效果病斑面积统计。
图12为内生棘孢木霉菌株YN4对大豆纹枯病的防治效果：A为对照组只接种病原真菌，B为处理组先喷木霉孢子悬浮液后接种病原菌。
图13为内生棘孢木霉菌株YN4对大豆纹枯病的防治效果的相对病斑面积统计。
图14为内生棘孢木霉菌株YN4挥发性有机物防治大豆纹枯病的效果：A为对照组以灭菌小米培养基为材料，B为处理组以接种木霉菌小米为材料。
图15为内生棘孢木霉菌株YN4挥发性有机物防治大豆纹枯病相对病斑面积统计。
图16为立枯丝核菌菌核在水琼脂上的萌发情况：A处理组木霉菌处理，B为对照组清水处理。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1木霉菌株YN4的分离鉴定
1、样品采集
从云南红河州采集茶树叶片，送回实验室进行组织分离。首先清洗叶片表面，选择完整无病斑的叶片进行分离。组织分离的方法参考《植物病理学研究方法》。
2、形态鉴定
从茶树叶片组织分离获得的菌落中，用无菌牙签挑取刚长出的菌落到新的新的PDA 平板上培养，在28℃培养箱中培养2～3d。观察菌株的菌落形态、颜色。用无菌解剖针取适量菌物在光学显微镜下观察，并拍摄菌丝、分生孢子等。根据菌株的形态学特征，初步鉴定为木霉菌，编号为YN4。
YN4菌株在PDA平板上生长(图1A)较快，在28℃的培养箱中大约2d就可以长满直径为9cm的平板，菌丝中等厚度，白色毡状。后期产生分生孢子后，逐渐从白变黄再变绿。在光学显微镜下(图1B)分生孢子簇生，孢子梗对生，呈基部细中间大的瓶状。分生孢子球形，表面粗糙。该菌株初步鉴定为木霉属成员(Trichoderma sp.)。
3、分子鉴定
使用CTAB法提取YN4菌株的DNA，用真菌通用鉴定引物ITS4/ITS5进行PCR扩增。PCR产物用质量分数1％的琼脂糖凝胶进行电泳。在凝胶电泳成像仪中观察电泳条带，拍照记录。将PCR产物送擎科生物公司测序，得到YN4菌株的ITS序列。将ITS序列在 NCBI的核酸数据库中比对，并用MEGA-X软件构建YN4菌株的进化树。
菌株YN4的PCR扩增产物跑电泳并在凝胶电泳显影仪观察条带(图2)，测序结果表明木霉菌株YN4的ITS序列长度为588bp，序列在GenBank的登录号为 OK571397.1。通过Blast发现，与棘孢木霉(T.asperellum)具有100％同源性，遗传进化树表明木霉菌株YN4与棘孢木霉(T.asperellum)位于系统发育树相同分支。
YN4菌株的测序结果：
GGAAGTAAAAAATCGTAACAAGGTCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGATCATTAC CGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACGTTACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGGTCACGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGGAACCAACC AAACTCTTTCTGTAGTCCCCTCGCGGACGTATTTCTTACAGCTCTGAGCAAAAATTCAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGC AGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAA CGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGATCGGCGTTGGGGATCGGGACCCCTCACACGGGTGCC GGCCCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACAACTCGCACCGGGAGCGCGGCGCGTCCACGTCCGTAAAACACCCAACTTTCTGAAAT GTGACCTCGGATCAGGTAGA
二、实验结果
结合形态和分子鉴定，木霉菌株YN4鉴定为棘孢木霉(Trichoderma asperellum)。该菌株棘孢木霉(Trichoderma asperellum)YN4于2021年10月22日保藏于广东省微生 物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：62007，地址：广州市先烈中路100号大院 59号楼5楼广东省科学微生物研究所。
实施例2木霉菌株YN4对多种病原菌抑制作用
一、实验方法
采用对峙法，分别测定实施例1鉴定到的菌株棘孢木霉(T.asperellum)YN4对12种植物病原真菌的拮抗作用。
供试植物病原真菌：尖孢镰刀菌大豆专化型(F.oxysporum f.sp.glycines)、尖孢镰刀菌古巴专化型(F.oxysporum f.sp.cubense)、腐皮镰刀菌(F.solani)、镰状镰刀菌(F.falciforme)、暹罗炭疽菌(C.siamense)、胶孢炭疽菌(C.gloeosporioides)、平头炭疽菌(C.truncatum)、齐整小核菌(S.rolfsii)、球黑孢菌(N.sphaerica)、立枯丝核菌(R.solani)、稻瘟病菌(P.oryzae)和灰葡萄孢(B.cinerea)。以上植物病原真菌菌株，皆由本实验室保存。
具体做法：在PDA平板中生长3～5d的实施例1鉴定到的菌株棘孢木霉(T.asperellum)YN4和供试植物病原真菌分别用直径5mm的打孔器在菌落边缘打孔得到菌饼。在直径约为9cm的PDA平板中，在直径上距平板边缘2cm的两处，一边接种木霉菌，另一边接种供试植物病原真菌，作为处理组，每种供试植物病原真菌做3个重复；空白对照组则为只在直径距边缘2cm的其中一处接种供试植物病原真菌菌饼(直径5 mm)。接种后置于28℃恒温培养箱中培养。每天观察菌落生长情况，待到实施例1鉴定到的菌株棘孢木霉(T.asperellum)YN4和供试植物病原真菌两菌落刚好相接时，记录处理组和空白对照组的植物病原真菌在平板直径上，从接种点到菌落边缘的距离，得到抑菌率：
观察实施例1鉴定到的菌株棘孢木霉(T.asperellum)YN4占据平板的面积比例，根据拮抗系数的分级标准，给处理组分级并记录：Ⅰ级为实施例1鉴定到的菌株棘孢木霉(T.asperellum)YN4占平板全部面积；Ⅱ级为实施例1鉴定到的菌株棘孢木霉(T.asperellum)YN4占平板大于三分之二面积；Ⅲ级为实施例1鉴定到的菌株棘孢木霉(T.asperellum) YN4占据平板三分之一到三分之二面积；Ⅳ级为实施例1鉴定到的菌株棘孢木霉(T.asperellum)YN4占据平板小于三分之一面积；Ⅴ级为实施例1鉴定到的菌株棘孢木霉(T.asperellum)YN4不占据平板面积。
观察实施例1鉴定到的菌株棘孢木霉(T.asperellum)YN4与供试植物病原真菌相接处的抗生条带宽度与颜色，依据抗生作用级别分级标准，给处理组分级并记录：0级为两菌间无条带；1级为两菌相接有1～3mm宽浅色带；2级为两菌相接处有3～6mm宽的浅色条带；3级为两菌相接处有6～9mm宽的深色条带；4级为两菌相接处有9～12mm 宽的深色条带；5级为两菌之间有＞12mm宽的深色条带。
二、实验结果
结果表明，实施例1鉴定到的菌株棘孢木霉(T.asperellum)YN4对12种供试植物病原真菌的抑菌率在34.29％～83.44％(表1)，并根据拮抗系数与抗生作用分级，测得实施例1鉴定到的菌株棘孢木霉(T.asperellum)YN4对植物病原真菌的拮抗系数与抗生作用级别，结果见表2。结果显示实施例1鉴定到的菌株棘孢木霉(T.asperellum)YN4对镰状镰刀菌、灰葡萄孢菌、胶孢炭疽菌抑制作用最好，抑菌率都大于80％。其次是腐皮镰刀菌、尖孢镰刀菌古巴专化型和暹罗炭疽菌，都接近于77％。实施例1鉴定到的菌株棘孢木霉(T.asperellum)YN4对平头炭疽菌的抑菌作用34％。
经观察发现，实施例1鉴定到的菌株棘孢木霉(T.asperellum)YN4生长速度极快，能快速占领病原真菌的生长空间，并对能重寄生于病原真菌菌丝，如图4所示，在显微镜下能观察到实施例1鉴定到的菌株棘孢木霉(T.asperellum)YN4能以螺旋缠绕和贴附生长等方法寄生病原真菌菌丝，夺取营养，使病原真菌断裂、消解。
表1木霉菌株YN4对病原真菌的抑制作用
表2木霉菌株YN4对病原真菌的拮抗系数和抗生作用级别
实施例3木霉菌株YN4挥发性有机物的抑菌效果
一、木霉菌株的挥发性有机物的抑菌效果
1、实验方法
用已灭菌的直径为5mm的打孔器在28℃恒温培养箱培养2～3天的实施例1鉴定到的菌株棘孢木霉(T.asperellum)YN4的菌落边缘打孔，接种于直径为9cm的含有PDA 的培养基的培养皿中央，于28℃培养至菌落直径达5cm，在上方盖直径为10cm的灭菌双层玻璃纸。将4种植物病原真菌(暹罗炭疽菌、镰状镰刀菌、尖孢镰刀菌古巴专化型和腐皮镰刀菌)分别打直径为5mm的菌饼，接种到含有PDA的培养基的培养皿中。将接种了实施例1鉴定到的菌株棘孢木霉(T.asperellum)YN4(覆盖灭菌双层玻璃纸)的培养皿与分别接种4种植物病原真菌的培养皿对扣，用封口膜封紧。对照组为分别接种4种植物病原真菌的平板与未接种实施例1鉴定到的菌株棘孢木霉(Trichoderma asperellum) YN4的PDA平板对扣。置于28℃培养箱中培养。待对照组病原菌菌落生长至离平板边缘1～2cm时，用十字交叉法记录病原真菌菌落直径。计算抑菌率：
2、实验结果
结果如表3所示，实施例1鉴定到的菌株棘孢木霉(T.asperellum)YN4挥发性物质对暹罗炭疽菌的抑菌效果达到87.93％，对尖孢镰刀菌古巴专化型、腐皮镰刀菌和镰状镰刀菌的抑菌效果分别为35.26％、33.62％和42.21％。
表3木霉菌株YN4挥发性物质对病原真菌的抑菌率
二、木霉菌株YN4挥发性物质的提取和鉴定
1、实验方法
将实施例1鉴定到的菌株棘孢木霉(T.asperellum)YN4接种于200mL的PDB培养基中，于28℃、200r/min摇床中培养约1周时间。在气相色谱仪进样口中插入SPME 针头，将萃取头推出。240℃，老化20min，将萃取头缩回。将SPME针头插入棘孢木霉(T.asperellum)YN4发酵液上空进行微萃取。挥发性物质的分析鉴定采用气相色谱- 质谱联用仪(GC-MS)，结合NIST2014谱库进行定性分析，得到色谱峰图。用GC-MS 对实施例1鉴定到的菌株棘孢木霉(T.asperellum)YN4挥发性物质进行分析，
2、实验结果
结果如表4所示，从实施例1鉴定到的菌株棘孢木霉(T.asperellum)YN4的挥发物中得到以下挥发性物质组分，其中2-辛酮、7-二甲基-1-辛醇的含量最高。
表4木霉菌株YN4挥发性物质组分
实施例4木霉菌株YN4非挥发性物质的抑菌效果
一、木霉菌株YN4的非挥发性物质的抑菌效果
1、实验方法
用已灭菌的打孔器在培养2～3d的实施例1鉴定到的菌株棘孢木霉(T.asperellum) YN4的菌落边缘，取直径约为5mm的菌饼，实施例1鉴定到的菌株棘孢木霉(T. asperellum)YN4接种在在上铺双层已灭菌的玻璃纸直径为9cm的PDA平板中央，放入28℃培养箱培养。待实施例1鉴定到的菌株棘孢木霉(T.asperellum)YN4的菌落直径为 5～6cm时，揭下双层玻璃纸和玻璃纸上的木霉菌，取直径为5mm的植物病原真菌菌饼 (暹罗炭疽菌、镰状镰刀菌、尖孢镰刀菌古巴专化型和腐皮镰刀菌)，在平板中央接种。此为处理组，一个处理设置3个重复。对照组为将植物病原真菌直接接种于未经处理的空白PDA平板中央。待到对照组植物病原真菌菌落将要长满平板时，用十字交叉法测植物病原真菌菌落直径，记录并计算抑菌率。
2、实验结果
结果如表5所示，实施例1鉴定到的菌株棘孢木霉(T.asperellum)YN4非挥发性物质对暹罗炭疽菌作用最好，抑菌效果能达到60％。其次是镰状镰刀菌、尖孢镰刀菌古巴专化型和腐皮镰刀菌抑菌率一样，都能达到40％(表5)。
表5木霉菌株YN4非挥发性物质抑菌率
二、木霉菌株YN4非挥发粗提取物的抑菌效果
采用含药平板法检测非挥发粗提物的抑菌效果。将实施例1鉴定到的菌株棘孢木霉(T. asperellum)YN4在察氏培养基中发酵5～7d，之后将发酵液用滤纸进行过滤，获得培养液。加入等体积的乙酸乙酯进行萃取，有机相在旋转蒸发仪中进行蒸干，获得棘孢木霉(Trichoderma asperellum)YN4的非挥发性粗提物。将粗提物按质量浓度为200mg/L、500mg/L、1000mg/L分别配置含药PDA平板。分别接种暹罗炭疽菌和立枯丝核菌，一个浓度为一组处理，每组处理设三组重复。对照组为在不含粗提物的PDA平板上分别接种病原真菌。在28℃的恒温培养箱中培养，待对照组植物病原真菌离PDA平板边缘1～ 2cm时，取出，用十字交叉法测量植物病原真菌的菌落直径，并计算抑菌率。
2、实验结果
结果如表6所示，当浓度为1000mg/L时，实施例1鉴定到的菌株棘孢木霉(T.asperellum)YN4非挥发性粗提物对暹罗炭疽菌的抑菌率最好，浓度为200mg/L、500mg/L 时抑菌作用逐渐减弱(图5)。实施例1鉴定到的菌株棘孢木霉(T.asperellum)YN4非挥发性粗提物对立枯丝核菌菌落的生长在浓度为1000mg/L时有明显的抑制效果，达到 43％，也是三个浓度中抑菌率最好的。随着粗提物浓度的上升，对立枯丝核菌菌核的生长和成熟的抑制作用也越强，当浓度为1000mg/L时，对菌核的抑制作用最为明显，达到 87％(图6)。
表6木霉菌株YN4非挥发性粗提物的抑菌效果
实施例5木霉菌株YN4对番茄灰霉病的防治效果
一、木霉菌株YN4对番茄灰霉病的离体防治效果
1、实验方法
采摘大小一致的番茄叶片，用无菌水冲洗两遍，然后用质量分数为2％的次氯酸钠溶液处理3min进行消毒灭菌处理，然后再用无菌水冲洗干净，在阴凉处晾干表面水分。在28℃培养的PDA平板上的实施例1鉴定到的棘孢木霉(T.asperellum)YN4菌株，约3～4d后产生分生孢子，用已灭菌的毛刷小心刷取实施例1鉴定到的棘孢木霉(T. asperellum)YN4菌株的分生孢子，用无菌水配制分生孢子悬浮液。用血球计数板计算，调整分生孢子浓度至1×109个/mL。将调好浓度后的分生孢子悬浮液喷洒于番茄叶片正反面，确保覆盖整张叶片，将叶片放在阴凉处晾干表面水分，待表面水分晾干后，在叶片中央放置直径为5mm的灰葡萄孢菌菌饼，此为处理组。对照组为将灰葡萄孢菌接种于消毒后只喷洒无菌水。对照组与处理组各设置3组，每组处理设置3片叶片。将叶柄插入水琼脂培养基中培养，约一周后观察并记录番茄叶片的病斑大小，计算离体防效：
2、实验结果
结果如表7所示，实施例1鉴定到的菌株棘孢木霉(T.asperellum)YN4对番茄灰葡萄孢菌的离体防治效果为67.53％。
表7木霉菌株YN4对番茄灰霉病的离体防治效果
二、木霉菌株YN4对番茄灰霉病的活体防治效果
1、实验方法
挑选相同龄期的番茄苗，按番茄灰葡萄孢菌离体实验中的方法制备1×109个/mL的实施例1鉴定到的菌株棘孢木霉(T.asperellum)YN4的分生孢子悬浮液，均匀喷洒在番茄苗的每片叶片。待到12h后，将用PDB液体培养基在28℃、200r/min的摇床中培养 4～5d的灰葡萄孢菌，用磨浆机打成匀浆，将匀浆均匀喷洒在每片叶片。此为处理组，对照组喷洒无菌水代替实施例1鉴定到的菌株棘孢木霉(T.asperellum)YN4的分生孢子悬浮液。处理组与对照组各设置3个重复。观察发病情况，按照番茄灰霉病分级标准，记录每株番茄随机10片叶片的发病情况。
分级标准如下：0级为几乎无病斑，叶片颜色无变化；1级为病斑占叶片表面积的5％以下，叶片颜色稍微变黄；2级为病斑占叶片表面积5％至15％，叶片颜色较黄；3级为病斑占叶片表面积15％至30％，叶片颜色几乎完全变黄；4级为病斑占叶片表面积30％至50％，叶片颜色为黄褐色或浅褐色；5级病斑面积占叶片50％以上，叶片颜色变为黑褐色。并计算病情指数和防治效果：
2、实验结果
结果如表8所示，实施例1鉴定到的菌株棘孢木霉(T.asperellum)YN4对番茄灰霉病的发病有明显抑制作用(图8)，经过实施例1鉴定到的菌株棘孢木霉(T.asperellum) YN4处理的对番茄灰霉病的防治效果能达到81.25％。
表8木霉菌株YN4对番茄灰霉病的活体防治效果
实施例6木霉菌株YN4对菜心立枯病的防治效果
一、实验方法
立枯丝核菌用PDB液体培养基在28℃、200r/min的摇床中培养4d，用四层纱布过滤，得到立枯丝核菌菌丝体，将菌丝体加少量无菌水用豆浆机打成匀浆，用紫外分光光度计将立枯丝核菌菌液调至OD＝1.0。
按照实施例5的方法，准备1×109个/mL的实施例1鉴定到的菌株棘孢木霉(T.asperellum)YN4的分生孢子悬浮液。在装有无菌土的花盆中撒入100粒菜心种子，做三组处理：空白组只加40mL无菌水；对照组加20mL无菌水和20mL立枯丝核菌菌液；处理组加20mL立枯丝核菌菌液和20mL实施例1鉴定到的菌株棘孢木霉(T. asperellum)YN4的分生孢子悬浮液。每个处理各设三个重复。放进温室培养，待15d后拿出观察，记录菜心存活率。
二、实验结果
实施例1鉴定到的菌株棘孢木霉(T.asperellum)YN4对菜心立枯病有明显的防治效果(图9)，经过木霉菌株YN4处理后，菜心立枯病的发病率显著降低，发病率仅有28％，显著低于只接种病原菌的77％(表9)。
表9木霉菌株YN4对菜心立枯病的防治效果
实施例7木霉菌株YN4对辣椒暹罗炭疽菌的防治效果
一、实验方法
按照实施例5的方法，准备1×109个/mL的实施例1鉴定到的菌株棘孢木霉(T.asperellum)YN4的分生孢子悬浮液。
选用大小均匀的线椒果实，清洗干净后用75％的酒精擦拭消毒，晾干备用。将辣椒果实用无菌牙签刺伤，处理组先充分均匀喷雾实施例1鉴定到的菌株棘孢木霉(T.asperellum)YN4的分生孢子悬浮液(1×109个/mL)后晾干，在刺伤位置接种新鲜的辣椒炭疽病菌菌块(直径8mm)，覆盖灭菌棉花加无菌水保湿，置于28℃、湿度为85％的培养箱内贮藏。以不喷雾棘孢木霉孢子液的辣椒果为对照。每个处理设3次重复，每个重复5个果实。通过测量辣椒果实病斑面积，记录辣椒病斑的发布情况并计算相对抑制率。
二、实验结果
实施例1鉴定到的菌株棘孢木霉(T.asperellum)YN4对辣椒炭疽病的防治效果见图 10。结果表明，对照组的病斑面积为2.51cm2，处理组的病斑面积为0.07cm2，木霉菌对辣椒炭疽病的防效达到94.68％。
实施例8木霉菌株YN4对大豆纹枯病的离体防治效果
一、实验方法
按照实施例5的方法，准备1×109个/mL的实施例1鉴定到的菌株棘孢木霉(T.asperellum)YN4的分生孢子悬浮液。
采集大豆叶片，将大豆叶片的枝条插进无菌水里保湿。处理组在大豆叶片上充分均匀喷雾棘孢木霉的孢子悬浮液(1×109个/mL)后晾干，在每个叶片的中间接种新鲜的病原菌立枯丝核菌。对照组先喷雾无菌水后同样接种病原菌。每个处理各设置3个重复，每组处理设置3片叶片。通过用Photoshop软件根据目标叶片和病斑区域像素数计算相对病斑面积并记录大豆病斑病的分布情况并计算相对防效。
二、实验结果
经计算，木霉菌株YN4对大豆纹枯病的发病有明显抑制作用(图12)，经过实施例 1鉴定到的菌株棘孢木霉(T.asperellum)YN4处理的对大豆纹枯病的防治效果能达到95.87％(图13)。
实施例9木霉菌株YN4的挥发性有机物物对大豆纹枯病的离体防治效果
一、实验方法
按照实施例5的方法，准备实施例1鉴定到的菌株棘孢木霉(T.asperellum)YN4的分生孢子悬浮液。将实施例1鉴定到的菌株棘孢木霉(T.asperellum)YN4的分生孢子悬浮液接种于灭菌小米培养基中，在28℃下黑暗培养14～15d获得固体发酵物。称取30g 固体发酵物放在密封的塑料盒下层。采集大豆叶片，将大豆叶片的枝条插进无菌水里保湿。大豆叶片防治在密封的塑料盒上层，距离下层固体发酵物1cm。在每个叶片的中间接种新鲜的病原菌立枯丝核菌。对照组在密封的塑料盒下层放置30g灭菌的小米。接种后将密封的塑料盒置于28℃湿度为85％的培养箱内培养。
每个处理重复3次，每个重复处理3片叶片。通过用Photoshop软件根据目标叶片和病斑区域像素数计算相对病斑面积并记录大豆病斑病的分布情况并计算相对防效。记录大豆病斑的发布情况并计算相对防效。
二、实验结果
经计算，实施例1鉴定到的菌株棘孢木霉(T.asperellum)YN4的挥发物对大豆纹枯病的发病有明显抑制作用(图14和图15)，对大豆纹枯病的防治效果能达到99.63％。实施例10木霉菌株YN4抑制菌核的萌发
一、实验方法
按照实施例5的方法，准备1×109个/mL的实施例1鉴定到的菌株棘孢木霉(Trichoderma asperellum)YN4的分生孢子悬浮液。
用经过灭菌的20cm高的塑料盆，预先装2kg无菌混合土(营养土和沙土)，土高至盆的10cm处。平整土面，每个盆在土层10cm处放用无菌茶泡袋装已经表面消毒的立枯丝核菌菌核3包，每包10个菌核，每盆共计30个菌核。之后覆盖无菌混合土(营养土和沙土)至满盆。即土的总深度20cm，菌核样品放在土样的中部。每盆土浇上实施例1鉴定到的菌株棘孢木霉(Trichoderma asperellum)YN4的分生孢子悬浮液(1×109个/mL) 400mL，确保土层完全湿润。设置对照组，对照组浇上400mL无菌水。土样处理好后放在实验室工作台室温存放。之后每天每盆土样浇20mL无菌水，保持土样湿润。7天后从盆中取出菌核，用无菌水冲洗表面3次后，放在水琼脂上培养，观察菌核的萌发情况，计算萌发抑制率。萌发抑制率＝(对照组菌核萌发率-处理组菌核萌发率)/对照组菌核萌发率。
二、实验结果
结果发现，经处理的菌核表面布满绿色木霉孢子。萌发实验表明，处理组的菌核均不能萌发，而对照的组的菌核全部萌发(图16)，因此实施例1鉴定到的菌株棘孢木霉(T.asperellum)YN4对菌核萌发的抑制率达到100％。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一株棘孢木霉及其应用
<140> 2021116688401
<141> 2021-12-30
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 588
<212> DNA
<213> Trichoderma asperellum
<400> 1
ggaagtaaaa aatcgtaaca aggtctccgt tggtgaacca gcggagggat cattaccgag 60
tttacaactc ccaaacccaa tgtgaacgtt accaaactgt tgcctcggcg gggtcacgcc 120
ccgggtgcgt cgcagccccg gaaccaggcg cccgccggag gaaccaacca aactctttct 180
gtagtcccct cgcggacgta tttcttacag ctctgagcaa aaattcaaaa tgaatcaaaa 240
ctttcaacaa cggatctctt ggttctggca tcgatgaaga acgcagcgaa atgcgataag 300
taatgtgaat tgcagaattc agtgaatcat cgaatctttg aacgcacatt gcgcccgcca 360
gtattctggc gggcatgcct gtccgagcgt catttcaacc ctcgaacccc tccgggggat 420
cggcgttggg gatcgggacc cctcacacgg gtgccggccc cgaaatacag tggcggtctc 480
gccgcagcct ctcctgcgca gtagtttgca caactcgcac cgggagcgcg gcgcgtccac 540
gtccgtaaaa cacccaactt tctgaaatgt gacctcggat caggtaga 588

Claims (8)

1.一株棘孢木霉(Trichoderma asperellum)YN4，其特征在于，于2021年10月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：62007。
2.权利要求1所述棘孢木霉YN4产生的发酵物，其特征在于，所述发酵物为固体发酵物或液体发酵物。
3.权利要求1所述棘孢木霉YN4产生的挥发性物质，其特征在于，所述挥发性物质包括2-辛酮、2,7-二甲基-1-辛醇、3-甲基丁醇、戊基呋喃、乙醇、6-戊基-2H-吡喃-2-酮、甲酸-2-辛酯和苯乙醇。
4.权利要求1所述棘孢木霉YN4产生的非挥发性物质，其特征在于，所述非挥发性物质为乙酸乙酯提取物。
5.权利要求1～4任意一项或几项的产品在防治尖孢镰刀菌大豆专化型、尖孢镰刀菌古巴专化型、腐皮镰刀菌、或镰状镰刀菌、暹罗炭疽菌、胶孢炭疽菌、或平头炭疽菌、齐整小核菌、球黑孢菌、立枯丝核菌、稻瘟病菌或灰葡萄孢中的一种或几种的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，权利要求3所述的挥发性物质防治的是暹罗炭疽菌、镰状镰刀菌、尖孢镰刀菌古巴专化型和腐皮镰刀菌中的一种或几种。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，权利要求4所述的非挥发性物质防治的是暹罗炭疽菌、镰状镰刀菌、尖孢镰刀菌古巴专化型、腐皮镰刀菌和立枯丝核菌中的一种或几种。
8.权利要求1～4任意一项或几项的产品在防治番茄灰霉病、菜心立枯病、辣椒炭疽病和大豆纹枯病中的应用。
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