CN112852638A - 一种烟草镰刀菌根腐病高效生防棘孢木霉及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种烟草镰刀菌根腐病高效生防棘孢木霉及其应用，所述的棘孢木菌的保藏名称为棘孢木霉Tr‑0111（Trichoderma asperellum Tr‑0111），该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2020年8月21日，保藏编号为CCTCC NO：M 2020441；本研究通过对土壤微生物的分离、筛选，获得对烟草镰刀菌根腐病具有较好抑制作用的高效生防真菌菌株，利用传统形态学与现代分子生物学相结合的方法确定其种类，明确其对烟草的促生效果，为进一步开展高效生防菌盆栽防效、抑菌活性物质研究及生防菌剂产品化和工业化生产奠定基础，对河南省主要烟区土传病害的生物防治具有一定的科学依据和应用价值。

Description

一种烟草镰刀菌根腐病高效生防棘孢木霉及其应用
技术领域
本发明属于植物保护技术领域，具体涉及一种烟草镰刀菌根腐病高效生防棘孢木霉及其应用。
背景技术
国家科学院1987年将生物防治定义为：利用自然或经过改造的生物、基因或基因产物减少有害生物的作用，使其有利于有益生物。生防真菌的定义为：其菌体、基因或基因产物可用于减少有害生物，并有利于有益生物的自然或经改造的真菌。根据生防真菌作用的对象不同，可分为杀虫真菌、除草真菌、杀菌真菌等。
烟草镰刀菌根腐病在我国烟区的发病范围和发病程度逐步上升，在我国云南、贵州、河南的部分县(区)发生严重，在世界范围内也均有发生，如希腊、西班牙、马来西亚等。其病原菌主要是尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌，可独立侵染，又可与烟草疫霉、(根结)线虫等混合侵染，造成烟株死亡，烟叶大幅减产甚至绝收，已成为烟草危害严重的根茎类病害之一。
目前，烟草根茎类病害的防治仍以化学防治为主，如甲基硫菌灵、甲霜灵·锰锌。长期、大量地使用化学农药导致了烟叶农残增加、病原抗药性增强、农田微生态平衡破坏、环境污染和对生物健康的威胁。生物防治技术的研究与应用对烟草行业的可持续发展具有重要的意义。2006年，陈小均等报道木霉菌肥对土壤优势真菌和烟草茄病镰刀菌有较好的防病和治疗作用。2015年，田艳艳等报道哈茨木霉和棘孢木霉对烟草疫霉、瓜果腐霉和尖孢镰刀菌均有一定的抑制作用。2018年，姚晓远等报道了哈茨木霉、多粘类芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌对烟草茄病镰刀菌有较好的防治效果。但对于烟草镰刀菌根腐病的系统生物防治和生防机制的研究罕有报道。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种烟草镰刀菌根腐病高效生防棘孢木霉及其应用。
本发明采用的技术方案为：
一种烟草镰刀菌根腐病高效生防棘孢木霉，所述的棘孢木菌的保藏名称为棘孢木霉Tr-0111(Trichoderma asperellum Tr-0111)，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2020年8月21日，保藏编号为CCTCC NO：M 2020441。
一种如上所述的烟草镰刀菌根腐病高效生防棘孢木霉的制备方法，包括以下步骤：
(1)采集团棵期至旺长期的烟草及周边植物根际土壤微生物；
(2)生防真菌的分离纯化：采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)对土壤微生物进行分离纯化；
(3)生防真菌的筛选：以烟草根腐病主要致病菌尖孢镰刀菌为主要靶标，在纯化好的菌落外围打取直径5mm的菌柄，采用平板对峙培养法和菌丝生长速率法在距离PDA平板中心2.5cm的相对2点上分别接种纯化的待测真菌和尖孢镰刀菌，以不接待测真菌只接尖孢镰刀菌为对照，重复3次，倒置放入25℃恒温光照箱培养6-8d后采用十字交叉法测量菌丝半径，计算菌丝生长抑制率；以距中心2.5cm的相对2点上接种待测真菌，中心位置接种尖孢镰刀菌进行复筛，其方法同上并计算抑制率；
(4)生防真菌的鉴定：根据生防真菌的筛选结果，选取已纯化的待测菌株，制作不同生长时期的水玻片，在光学显微镜下观察其菌丝形态、产孢方式和子实体的形态、大小、颜色，再根据观察到的平板形态特征初步确定菌种的分类地位；
(5)生防真菌对烟草常见病害的抑菌谱测定：选取待测生防菌株为主要靶标，同样采取平板对峙培养法和菌丝生长速率法速率法，测定对烟草茄病镰刀菌、疫霉病菌、根黑腐病菌、根腐病菌、拟茎点霉属病菌、炭疽病菌、立枯病菌、葡萄座腔溃病菌8种常见烟草病害的抑制效果，测量菌落半径，计算抑制率。
所述的步骤(2)中的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)的制备方法：称取 200g马铃薯、20g葡萄糖、15-20g琼脂粉，用蒸馏水定容至1L，在相对湿度 70％，25℃光周期12h/12h的培养箱中培养1-5d，将纯化的菌株于4℃冰箱保存备用。
所述的步骤(3)中的抑制率的公式为
Figure RE-GDA0003009069350000031
所述的步骤(4)中的鉴定方法为：结合分子生物学的鉴定手段，使用Ezup 柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒提取待测菌株的基因组DNA，应用真菌鉴定通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)进行PCR扩增，将扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳，胶回收后进行测序，应用NCBI进行序列比对分析，并选择同源性较高的序列构建系统发育树。
所述的PCR扩增体系(25μL)：DNA模板1μL，上、下游引物(10μmol/L) 各1μL，2×PCRTaq Master Mix 12.5μL，加双蒸水至25μL，PCR反应条件：95℃ 3min；95℃45s，55℃45s，72℃1min，28个循环；72℃8min。
一种如上所述的烟草镰刀菌根腐病高效生防棘孢木霉对烟草种子萌发及促生作用的应用，采用培养皿滤纸保湿法，将中烟100裸种依次用75％的乙醇和 0.5％的次氯酸钠消毒30s后，用无菌水漂洗干净，放入制备好的生防真菌孢子悬浮液中浸种16h，再用无菌水漂洗3-4次，晾干，将种子整齐摆放在无菌脱脂棉和滤纸保湿的培养皿中，以无菌水浸泡同等时间作为对照组，每个培养皿25 粒种子，3次重复，第13天测量并统计种子根长及萌发率。
所述的生防真菌孢子悬浮液的浓度为1×107个孢子/mL，每个培养皿中种子的排布为5×5。
一种如上所述的烟草镰刀菌根腐病高效生防棘孢木霉对烟草盆栽促生作用的应用，采用室内盆栽试验法将4-5片真叶且大小均一的烟苗移栽至盆栽中，将培养7d的生防真菌发酵液按每株20mL进行灌根处理，每处理10株盆栽，重复 3次，以等体积无菌水灌根处理为对照，期间保证水肥管理统一，每天观察记录，最终根据中华人民共和国烟草行业标准YC/T142-2010中的农艺性状测量方法测定其对农艺性状的影响。
所述的生防真菌发酵液的浓度为1×107个孢子/mL。
本发明的有益效果是：本研究通过对土壤微生物的分离、筛选，获得对烟草镰刀菌根腐病具有较好抑制作用的高效生防真菌菌株，利用传统形态学与现代分子生物学相结合的方法确定其种类，明确其对烟草的促生效果，为进一步开展高效生防菌盆栽防效、抑菌活性物质研究及生防菌剂产品化和工业化生产奠定基础，对河南省主要烟区土传病害的生物防治具有一定的科学依据和应用价值。
保藏说明：
菌种名称：棘孢木霉；
拉丁名：Trichoderma asperellum；
菌株编号：Tr-0111；
保藏编号：CCTCC NO：M 2020441；
保藏机构：中国典型培养物保藏中心；
保藏机构简称：CCTCC；
地址：中国，武汉大学；
保藏日期：2020年8月21日。
附图说明
图1为木霉菌对烟草尖孢镰刀菌的平板抑制效果图：a：CK，b：初筛抑制效果图，c：复筛抑制效果图。
图2为木霉菌在PDA培养基上1-6天的菌类形体图：a-f依次为木霉菌1-6 天的菌落形态。
图3为木霉菌的显微形态观察图：a、b为菌丝，c、d、e为子实体、f为分生孢子。
图4为棘孢木霉的系统发育图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步描述，实例中的实验方法如无特殊规定均为常规方法，所涉及的试剂耗材如无特殊规定均为常规试剂材料。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不是限制本发明的保护范围。本领域技术人员在不脱离本发明原理和宗旨的情况下，针对这些实施例进行的各种变化、修改、替换和变型，均应包含在本发明的保护范围之内。
实施例一：生防真菌的分离筛选
材料：以豫中烟区为主，于2020年分别从许昌、漯河、平顶山、洛阳、三门峡、驻马店和南阳的7市14县采集团棵期至旺长期的烟草及周边植物根际土壤微生物。烟草镰刀菌根腐病主要致病菌尖孢镰刀菌、常见烟草病害的病原菌和中烟100种子均由河南省农业科学院烟草研究所种质菌源库提供。
土壤微生物分离纯化采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)。
培养基成分及用途：
PDA：马铃薯葡萄糖琼脂39g定容至1000mL蒸馏水中，121℃高温灭菌 15min。(或常规培养基配方：称取200g马铃薯，洗净去皮切成小块，加水1000ml 煮沸25分钟，至马铃薯小块能被玻璃棒轻松戳破，8层纱布过滤，再加20g葡萄糖和15-20g琼脂，搅拌均匀至完全溶解，分装至三角瓶中封口，于121℃灭菌20分钟，冷却后贮存备用)。用于分离、纯化、培养及保存。
培养温度：25-30℃，pH：自然pH，培养条件：在PDA上固体培养，在相对湿度70％、28℃光周期12h/12h的培养箱中培养2-3d即可长满整个培养基平板。需氧类型：好氧，保存方法：短期保存选择在PDA培养基试管斜面上于4℃冰箱保存备用；长期保存选择真空冷冻干燥法、-20℃等。
生防真菌分离纯化：将采回的根际土壤样品平铺置于室内阴凉处风干，并挑除残根、石块等杂物，过筛后用四分法收集土壤样品。采用梯度稀释涂布平板法，用无菌水制成10-1、10-2、10-3的土壤悬浮液，分别取100μL涂布在PDA 培养基上培养真菌菌落，挑取不同形态、颜色、大小的菌落进行纯化保存。
生防真菌的筛选：以烟草根腐病主要致病菌尖孢镰刀菌为主要靶标，在活化好的菌落外围打取直径5mm菌柄，采用平板对峙培养法和菌丝生长速率法在距离PDA平板中心2.5cm的相对2点上分别接种纯化的待测真菌和尖孢镰刀菌，以不接待测真菌只接尖孢镰刀菌为对照，重复3次。倒置放入25℃恒温光照箱培养6-8d后采用十字交叉法测量菌丝半径，计算菌丝生长抑制率。以距中心 2.5cm的相对2点上接种待测真菌，中心位置接种尖孢镰刀菌进行复筛，其它方法同上并计算抑制率。
Figure RE-GDA0003009069350000071
木霉菌拮抗系数分级标准：Ⅰ级：待测木霉菌丝平板覆盖率100％；Ⅱ级：待测木霉菌丝平板覆盖率2/3以上；Ⅲ级：待测木霉菌丝平板覆盖率1/3-2/3；Ⅳ级：待测木霉菌丝平板覆盖率1/3以下；Ⅴ级：病原菌丝平板覆盖率100％。
采用梯度稀释涂布平板法从所采集的土壤样品中分离纯化菌株371株。通过平板对峙培养法获得1株对尖孢镰刀菌具有明显抑制效果的疑似木霉菌株，编号为Tr-0111，初筛抑制率为76.12％，拮抗系数为Ⅱ级；复筛抑制率为93.13％，拮抗系数为Ⅱ级(表1)。Tr-0111对烟草尖孢镰刀菌的平板抑制效果如图1所示。
表1木霉菌对烟草尖孢镰刀菌的抑制效果测定
Table 1 Determination of the inhibitory effect of Trichoderma onF.oxysporum
Figure 100002_1
实施例二：生防真菌的鉴定
参照《真菌鉴定手册》等相关专著、文献资料，根据生防真菌的筛选结果，选取已纯化的待测菌株，制作不同生长时期的水玻片在光学显微镜下观察其菌丝形态、产孢方式和子实体的形态、大小、颜色，再根据观察到的平板形态特征初步确定菌种的分类地位。
结合分子生物学的鉴定手段，使用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒(上海生工)提取待测菌株的基因组DNA，应用真菌鉴定通用引物ITS1(5′ -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′) 进行PCR扩增。PCR扩增体系(25μL)：DNA模板1μL，上、下游引物(10μmol/L) 各1μL，2×PCR Taq Master Mix 12.5μL，加双蒸水至25μL。PCR反应条件：95℃ 3min；95℃45s，55℃45s，72℃1min，28个循环；72℃8min，将扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳，胶回收后送至上海英潍捷基贸易有限公司完成测序。应用NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行序列比对分析，并选择同源性较高的序列构建系统发育树。
形态学鉴定：
对Tr-0111菌株进行初步的形态学鉴定，如图2所示，菌落初期为白色，中心浅绿色，气生菌丝纤细、羊毛状，由中心向四周散布，菌落背面无色。菌落中期逐渐转变为浅绿色，中心呈深绿色，气生菌丝转变为棉絮状。菌落后期整体呈深绿色，棉絮状菌丝减少，菌落背面浅绿色至绿色。
如图3所示，分生孢子梗主枝呈树状，含多级分枝，各级分枝的顶端形成三个簇生的小梗。分生孢子呈球形、椭球形或卵形，浅绿色。可将其初步鉴定为木霉属真菌。
分子生物学鉴定：
ITS区域核酸序列的相似性已经成为确定木霉菌分类地位的重要分子生物学依据。通过对Tr-0111木霉菌株的ITS序列进行PCR扩增，获得大小为577bp 的特异性条带。在GenBank数据库中进行Blast比对分析，发现与数据库中多个 ITS序列的同源性均达到100％。以18S r DNA序列同源性为基础建立系统发育树，如图4所示，结合形态学鉴定结果，将Tr-0111菌株鉴定为棘孢木霉 (Trichoderma asperellum)。
实施例三：生防菌株对烟草常见病害的抑菌谱测定
选取待测生防菌株为主要靶标，同样采取平板对峙培养法和菌丝生长速率法速率法，测定对烟草茄病镰刀菌、疫霉病菌、根黑腐病菌、根腐病菌、拟茎点霉属病菌、炭疽病菌、立枯病菌、葡萄座腔溃病菌8种常见烟草病害的抑制效果，测量菌落半径，计算抑制率。
如表2所示，除烟草尖孢镰刀菌外，Tr-0111菌株对常见烟草病害的病原菌均有不同程度的抑制作用。其中对烟草根黑腐病菌的抑制效果最为显著，抑制率为90.11％，拮抗系数为Ⅰ级；对立枯病菌的抑制作用相对较弱，抑制率也达 42.67％，拮抗系数为Ⅲ级。同时也表明了Tr-0111菌株在烟草病害的生物防治方面具有非常好的广谱性和应用价值。
表2棘孢木霉菌对烟草尖孢镰刀菌的抑制效果测定
Table 2 Determination of antimicrobial spectrum of T.asperellum
Figure RE-GDA0003009069350000091
实施例四：生防菌株对烟草种子萌发及促生作用测定
采用培养皿滤纸保湿法，将中烟100裸种依次用75％的乙醇和0.5％的次氯酸钠消毒30s后，用无菌水漂洗干净，放入制备好的生防菌孢子悬浮液(浓度为 1×107个孢子/mL)中浸种16h，再用无菌水漂洗3-4次，晾干，将种子整齐摆放在无菌脱脂棉和滤纸保湿的培养皿中，以无菌水浸泡同等时间作为对照组，每皿25粒种子(5×5)，3次重复，第13天测量并统计种子根长及萌发率。
试验结果表明，如表3所示，Tr-0111菌株孢子悬浮液处理过的种子与无菌水处理过的对照组种子的萌发情况及抑制率存在显著性差异。同时，处理组的烟苗根系发育较好，长势平均且根长明显长于对照组，存在极显著差异水平。
表3烟草种子萌发和根系发育情况测定
Table 3 Determination of seed germination and root development oftobacco
Figure 2
注：表中数据为mean±SEM，不同小写字母表示5％显著差异水平，不同大写字母表示1％显著差异水平。且处理间差异有统计学意义(P≤0.05)。
实施例五：生防菌株对烟草盆栽促生作用测定
采用室内盆栽试验法将4-5片真叶且大小均一的烟苗移栽至盆栽中，将培养 7d的生防菌发酵液(浓度为1×107个孢子/mL)按每株20mL进行灌根处理，每处理10株盆栽，重复3次，以等体积无菌水灌根处理为对照，期间保证水肥管理统一，每天观察记录，最终根据中华人民共和国烟草行业标准YC/T142-2010 中的农艺性状测量方法测定其对农艺性状的影响。
盆栽试验结果表明，Tr-0111菌株发酵液灌根的烟苗与对照组烟苗在农艺性状的各项指标中均存在一定的差异，处理组的烟草较对照组长势均一，枝叶繁茂，根系发达，整体促生效果良好，尤其在叶长和地上鲜重部分存在显著性差异，如表4所示。
表4棘孢木霉菌对烟草盆栽促生效果测定
Table 4 Determination of the effect of T.asperellum on the growthpromotion of tobacco potted plants
Figure 4
注：表中数据为mean±SEM，不同小写字母表示5％显著差异水平，不同大写字母表示1％显著差异水平。
综上所述，平板对峙试验结果表明，烟草尖孢镰刀菌的平板抑制效果与 Tr-0111菌株的接种量成正相关，复筛抑菌率较初筛抑菌率提高了17.01％，最高可达93.13％，对于盆栽防效和田间试验而言，可调节生防菌剂的施用量以期达到最好的防治效果。同时对烟草茄病镰刀菌和烟草常见病原菌均有极好的抑制效果，抑菌谱广，具有较高的生防潜力和应用前景。
自1998年桑维钧等首次报道我国烟草镰刀菌根腐病的发生以来，相关研究少之又少，尤其对生防菌的促生作用更是鲜有报道。本研究采用培养皿滤纸保湿法测定了Tr-0111菌株处理过的烟草种子萌发率和根长生长均显著提高，操作方便快捷，影响因素单一，直观的筛选并反映了对镰刀菌具有极好抑制作用其兼具促生效果的高效生防菌株，对于生产上抗性品种的诱导选育、包衣剂的开发具有很好的应用价值。同时，通过盆栽试验的验证，各项农艺性状指标均有较好的提高，但整体差异不够显著，需进一步调整施用量、施用时间和施用次数，优化使用方法，以期充分发挥Tr-0111菌株的生防潜力，并为田间防效的应用提供理论参考。
烟草镰刀菌根腐病的化学防治不仅对非靶标生物有害且存在残留问题，农业防治费时费力，而生物防治可以极大程度上的降低化学药剂用量且不会损害到非靶标生物。木霉属真菌是研究最多、应用最广的一类生防真菌，具有极高的生防价值。目前，哈茨木霉(T.harzianum)、拟康宁木霉(T.koningiopsis)、长枝木霉(T.longibrachiatum)和棘孢木霉(T.asperellum)等常被用作各种作物、瓜果蔬菜的病害生物防治。本研究筛选鉴定的棘孢木霉(T.asperellum) Tr-0111对烟草镰刀菌根腐病菌有很强的抑制效果，且抑菌谱广，兼具较好的促生作用系属国内首次报道。
本研究通过大量分离、筛选，鉴定出一种对烟草镰刀菌根腐病菌具有较强抑制作用，抑菌谱很广，且能促进烟草种子萌发和植株生长的棘孢木霉Tr-0111 菌株，具有较好的研究价值和生防应用潜力。为下一步相关研究和生产应用工作的开展奠定基础：(1)抑菌代谢产物的研究和抑菌活性物质的提取；(2)抑菌相关基因的寻找、克隆、表达；(3)液体(固体)发酵条件的优化；(4)促生条件的优化和促生机制的相关研究；(5)盆栽防效及田间试验方法的探索与细化；(6)种衣剂和生防菌剂的开发，包括与高效生防真菌、细菌或放线菌的复配，与高效低毒低风险的环境友好型杀菌剂的复配等。

Claims (10)

1.一种烟草镰刀菌根腐病高效生防棘孢木霉，其特征在于：所述的棘孢木菌的保藏名称为棘孢木霉Tr-0111（Trichoderma asperellum Tr-0111），该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2020年8月21日，保藏编号为CCTCC NO：M 2020441。
2.一种如权利要求1所述的烟草镰刀菌根腐病高效生防棘孢木霉的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）采集团棵期至旺长期的烟草及周边植物根际土壤微生物；
（2）生防真菌的分离纯化：采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）对土壤微生物进行分离纯化；
（3）生防真菌的筛选：以烟草根腐病主要致病菌尖孢镰刀菌为主要靶标，在纯化好的菌落外围打取直径5mm的菌柄，采用平板对峙培养法和菌丝生长速率法在距离PDA平板中心2.5cm的相对2点上分别接种纯化的待测真菌和尖孢镰刀菌，以不接待测真菌只接尖孢镰刀菌为对照，重复3次，倒置放入25℃恒温光照箱培养6-8d后采用十字交叉法测量菌丝半径，计算菌丝生长抑制率；以距中心2.5cm的相对2点上接种待测真菌，中心位置接种尖孢镰刀菌进行复筛，其方法同上并计算抑制率；
（4）生防真菌的鉴定：根据生防真菌的筛选结果，选取已纯化的待测菌株，制作不同生长时期的水玻片，在光学显微镜下观察其菌丝形态、产孢方式和子实体的形态、大小、颜色，再根据观察到的平板形态特征初步确定菌种的分类地位；
（5）生防真菌对烟草常见病害的抑菌谱测定：选取待测生防菌株为主要靶标，同样采取平板对峙培养法和菌丝生长速率法速率法，测定对烟草茄病镰刀菌、疫霉病菌、根黑腐病菌、根腐病菌、拟茎点霉属病菌、炭疽病菌、立枯病菌、葡萄座腔溃病菌8种常见烟草病害的抑制效果，测量菌落半径，计算抑制率。
3.根据权利要求2所述的一种烟草镰刀菌根腐病高效生防棘孢木霉的制备方法，其特征在于：所述的步骤（2）中的马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）的制备方法：称取200 g马铃薯、20 g葡萄糖、15-20 g琼脂粉，用蒸馏水定容至1L，在相对湿度70%，25℃光周期12 h /12h的培养箱中培养1-5 d，将纯化的菌株于4℃冰箱保存备用。
4.根据权利要求2所述的一种烟草镰刀菌根腐病高效生防棘孢木霉的制备方法，其特征在于：所述的步骤（3）中的抑制率的公式为
Figure 1
。
5.根据权利要求2所述的一种烟草镰刀菌根腐病高效生防棘孢木霉的制备方法，其特征在于：所述的步骤（4）中的鉴定方法为：结合分子生物学的鉴定手段，使用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒提取待测菌株的基因组DNA，应用真菌鉴定通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）进行PCR扩增，将扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳，胶回收后进行测序，应用NCBI进行序列比对分析，并选择同源性较高的序列构建系统发育树。
6.根据权利要求5所述的一种烟草镰刀菌根腐病高效生防棘孢木霉的制备方法，其特征在于：所述的PCR扩增体系（25μL）：DNA模板1μL，上、下游引物（10μmol/L）各1μL，2×PCRTaq MasterMix 12.5μL，加双蒸水至25μL，PCR反应条件：95°C 3min；95°C 45s，55°C 45s，72°C 1min，28个循环；72°C 8min。
7.一种如权利要求1所述的烟草镰刀菌根腐病高效生防棘孢木霉对烟草种子萌发及促生作用的应用，其特征在于：采用培养皿滤纸保湿法，将中烟100裸种依次用75%的乙醇和0.5%的次氯酸钠消毒30s后，用无菌水漂洗干净，放入制备好的生防真菌孢子悬浮液中浸种16h，再用无菌水漂洗3-4次，晾干，将种子整齐摆放在无菌脱脂棉和滤纸保湿的培养皿中，以无菌水浸泡同等时间作为对照组，每个培养皿25粒种子，3次重复，第13天测量并统计种子根长及萌发率。
8.根据权利要求7所述的一种烟草镰刀菌根腐病高效生防棘孢木霉对烟草种子萌发及促生作用的应用，其特征在于：所述的生防真菌孢子悬浮液的浓度为 1×107个孢子/mL，每个培养皿中种子的排布为5×5。
9.一种如权利要求1所述的烟草镰刀菌根腐病高效生防棘孢木霉对烟草盆栽促生作用的应用，其特征在于：采用室内盆栽试验法将4-5片真叶且大小均一的烟苗移栽至盆栽中，将培养7d的生防真菌发酵液按每株20mL进行灌根处理，每处理10株盆栽，重复3次，以等体积无菌水灌根处理为对照，期间保证水肥管理统一，每天观察记录，最终根据中华人民共和国烟草行业标准YC/T142-2010中的农艺性状测量方法测定其对农艺性状的影响。
10.根据权利要求9所述的一种烟草镰刀菌根腐病高效生防棘孢木霉对烟草盆栽促生作用的应用，其特征在于：所述的生防真菌发酵液的浓度为 1×107个孢子/mL。
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