CN109022315B - 一株广谱抗病的生防芽胞杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于农业生物防治技术领域，尤其涉及一株广谱抗病的生防芽胞杆菌及其应用，所述生防芽孢杆菌的分类命名为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，保藏编号为CGMCC No.15766，其抑菌谱广、拮抗作用强、持效期长，能够有效抑制农作物病原真菌的生长，将其应用于农业生物防治领域，可用于防治灰霉病、枯萎病、炭疽病、茎腐病、立枯病、菌核病和赤霉病等真菌引起的作物病害。同时贝莱斯芽孢杆菌还可用于农作物种子、幼苗的促生，以及水果蔬菜的防腐保鲜。贝莱斯芽孢杆菌具有较强的耐紫外耐干旱的抗逆性，制备方法简单，成本低廉，是一株性能优良的生防菌株，具有良好的开发应用前景。

Description

一株广谱抗病的生防芽胞杆菌及其应用
技术领域
本发明属于农业生物防治技术领域，尤其涉及一株广谱抗病的生防芽胞杆菌及其应用。
背景技术
番茄灰霉病和番茄枯萎病是番茄种植栽培过程中主要发生的病害，发病率高、传播速度快，在番茄整个生长周期都可能发病；一旦染病会造成番茄大面积减产，严重的导致绝收，而且会造成番茄果实品质下降。目前，化学防治仍然是防止和控制番茄灰霉病和番茄枯萎病的主要方法。虽然化学药剂发挥了无比重要的作用，但其弊端也越来越明显。长期大量使用化学药剂会使病菌的抗药性增强，导致防治病害作用降低，且造成严重的土壤和环境污染，危及人畜健康，甚至破坏农业生态系统。对比化学农药，生物农药能够友好且有效地防治植物病害。因此，研究生物防治是解决植物病害的重要途径，为现代农业发展提供了一种十分有效的方法。但目前，针对番茄病害的生物防治技术仍不成熟，且筛选得到的生防菌抗菌谱窄，仅能针对某一种致病菌实现生防作用，无法提供针对多种致病菌的广谱的生物防治方法。
发明内容
为解决上述现有技术的不足，本发明提供了一株广谱抗病的生防芽胞杆菌及其应用。
本发明的技术方案：
一株广谱抗病的生防芽胞杆菌，分类命名为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)，于2018年5月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.15766。
进一步的，所述贝莱斯芽孢杆菌的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。
一株广谱抗病的生防芽孢杆菌在农业生物防治方面的应用。
进一步的，所述农业生物防治包括将所述生防芽孢杆菌用于防治灰霉病、枯萎病、炭疽病、茎腐病、立枯病、菌核病和赤霉病。
一株广谱抗病的生防芽孢杆菌在农作物种子及幼苗促生方面的应用。
进一步的，所述应用的具体方法是使用贝莱斯芽孢杆菌菌悬液浸泡处理农作物种子。
进一步的，所述处理农作物种子的贝莱斯芽孢杆菌菌悬液的菌体浓度为4×106cfu/mL。
一株广谱抗病的生防芽孢杆菌在水果蔬菜防腐保鲜方面的应用。
进一步的，所述应用的具体方法是使用贝莱斯芽孢杆菌菌悬液浸泡处理水果蔬菜。
进一步的，所述处理水果蔬菜的贝莱斯芽孢杆菌菌悬液的菌体浓度为1×108cfu/mL。
一种广谱抗病的生防芽孢杆菌的菌悬液。
进一步的，所述菌悬液的制备方法为：挑取所述生防芽孢杆菌的单菌落接种于无菌LB培养液中，35℃、180r/min培养24h即得到所述生防芽孢杆菌的菌悬液。
本发明的有益效果：
1、本发明提供的生防芽胞杆菌-贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)抑菌谱广、拮抗作用强、持效期长，能够有效抑制农作物病原真菌的生长，包括灰霉菌、尖镰孢菌、炭疽病菌、茎腐病菌、镰刀菌、立枯病菌、链格孢霉菌和菌核病菌。本发明提供的生防菌能够广泛应用于农业生物防治领域，可用于防治灰霉病、枯萎病、炭疽病、茎腐病、立枯病、菌核病和赤霉病等真菌引起的作物病害。
2、本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌对农作物种子及幼苗具有促生作用，可提高种子胚根生长量，提高幼苗株高和茎粗。同时，贝莱斯芽孢杆菌还具有防腐保鲜的作用，降低腐烂率和失重。
3、本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌具有较强的耐紫外耐干旱的抗逆性，制备方法简单，成本低廉，是一株性能优良的生防菌株，具有良好的开发应用前景。
附图说明
图1为本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌的显微形态照片；
图2为本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌的菌落形态照片；
图3为本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌的系统发育树；
图4为实施例2滤纸环对峙培养法-贝莱斯芽孢杆菌对番茄灰霉病菌的抑菌带照片；
图5为实施例2滤纸环对峙培养法-贝莱斯芽孢杆菌对玉米茎腐病菌的抑菌带照片；
图6为实施例4中第Ⅱ组处理贝莱斯芽孢杆菌对番茄灰霉病的温室防病效果照片；
图7为实施例4中第Ⅲ组处理贝莱斯芽孢杆菌对番茄灰霉病的温室治病效果照片。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
实施例1
采用平板稀释涂布法和平板划线法从植物的根际土中分离纯化得到多株细菌，以番茄灰霉病菌作为指示菌，采用双层纸环法进行筛选，获得一株对番茄灰霉病菌具有拮抗作用的细菌，将其编号为WZ-37。对该菌株进行形态特性、生理生化特性及分子生物学鉴定，结果如下：
(1)形态学特性
在显微镜下观察WZ-37的营养体和芽孢，该菌株属于革兰氏阳性菌，菌体呈杆状，芽胞圆柱形、中生或近端生、胞囊不膨大，其微观形态见图1；将该菌种接种于LB固体培养基上划线培养，35℃培养24h，菌落呈灰白色、圆形、表面湿润、褶皱、不透明、边缘整齐，其菌落形态见图2。
(2)生理生化特性
从葡萄糖氧化发酵试验、淀粉水解试验、接触酶试验、好氧或厌氧性试验、硝酸盐还原试验、明胶液化试验、柠檬酸盐利用试验、甲基红反应试验、V.P.试验鉴定WZ-37的生理生化特性。
结果显示WZ-37属于好氧型细菌，发酵型产酸，其中：甲基红反应、V.P.试验呈阴性，硝酸盐还原反应、淀粉水解、接触酶反应、明胶液化、柠檬酸盐利用试验呈阳性，其生长温度范围为4～37℃，其中最适生长温度为35℃。
(3)16SrDNA序列测定及系统进化分析：
取1mL WZ-37的菌悬液，离心收集菌体，用细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANGENBIOTECH)提取基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用通用引物进行16S rDNA PCR扩增，利用胶回收试剂盒将含目的DNA片段的琼脂糖凝胶进行胶回收，将PCR回收后产物交由CICC进行测序，得到如SEQ ID No：1所示的16S rDNA的核苷酸序列；对WZ-37的16S rDNA的核苷酸序列进行鉴定，将其提交到NCBI的GenBanK数据库中用Blast进行分析，并与已报道的序列进行同源性比对，构建得到由图3所示的系统发育树。
由图3所示系统发育树可看出，与WZ-37在同一个分支上的几种菌株均属于芽胞杆菌属(Bacillus sp.)，其中与Bacillus methylotrophicus KACC 13105T(JTKJ01000077)相似性为100％。
通过形态观察、生理生化特性鉴定和16S rDNA序列分析以及CICC检测，将菌株WZ-37鉴定为贝莱斯芽胞杆菌(bacillus velezebsis)，并于2018年5月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.15766。
实施例2
本实施例采用滤纸环对峙培养法，将实施例1筛选得到的贝莱斯芽胞杆菌与多种植物病原菌进行平板对峙试验，测定贝莱斯芽胞杆菌的抑菌谱。
测试植物病原菌包括：灰葡萄孢菌、番茄枯萎病菌、黄瓜枯萎病菌、黄瓜炭疽病菌、玉米茎腐病菌、木贼镰刀菌、轮枝镰刀菌、立枯病菌、西瓜枯萎病菌、甜瓜枯萎病菌、链格孢、葵花菌核病菌、禾谷镰刀菌F609和禾谷镰刀菌F1403；
具体测试方法如下：
滤纸环对峙培养法：灭菌的PDA培养基倒平板，冷却后将直径为5mm的待测试植物病原菌的圆形菌块放置于PDA平板中心位置，在距离中心3cm处放置一个无菌滤纸环，在滤纸环上滴加10μL经35℃、180r/min培养24h的贝莱斯芽孢杆菌的菌悬液，28℃恒温箱中培养7d，测量抑菌带的宽度，结果如表1所示：
表1
测试菌株 抑菌带宽度(mm) 测试菌株 抑菌带宽度(mm)
灰葡萄孢菌 8.5±0.1 立枯病菌 7.0±0.3
番茄枯萎病菌 8.0±0.2 西瓜枯萎病菌 7.0±0.1
黄瓜枯萎病菌 8.0±0.1 甜瓜枯萎病菌 6.5±0.1
黄瓜炭疽病菌 8.5±0.1 链格孢 8.0±0.1
玉米茎腐病菌 9.0±0.2 葵花菌核病菌 9.0±0.3
木贼镰刀菌 8.0±0.3 轮枝镰刀菌 6.0±0.2
禾谷镰刀菌F609 6.0±0.3 禾谷镰刀菌F1403 7.5±0.2
由表1数据可以看出，贝莱斯芽孢杆菌对测试的14种植物病原真菌均能产生抑菌带，且57％的病原菌抑菌带宽度达8mm以上，贝莱斯芽孢杆菌对上述病原真菌的生长均具有较强的拮抗作用，这充分说明贝莱斯芽孢杆菌作为生防菌的抑菌谱较广、抑菌作用较强。
实施例3
本实施例测试了实施例1筛选得到的贝莱斯芽孢杆菌对植物病原菌菌丝生长的抑制作用，作为对照本实施例同时还测试了由东北农业大学园艺园林学院实验室保存的一株生防细菌-WXCDD105，此菌株属于枯草芽胞杆菌枯草亚种(Bacillus subtilissubsp.subtilis)，具体测试方法为：
按照1％接种量分别将35℃、180r/min培养24h的贝莱斯芽孢杆菌和对照菌WXCDD105的培养液接入50mL PD培养液中，之后接入一个直径5mm的番茄灰霉病菌菌饼，空白组只接番茄灰霉病菌不接生防细菌，28℃、120r/min培养7d，用无菌干燥滤纸过滤，将收集到的番茄灰霉病菌菌丝烘干称重。采用同样的方法检测贝莱斯芽孢杆菌和对照菌WXCDD105对番茄枯萎病菌、黄瓜炭疽病菌和黄瓜枯萎病菌菌丝生长的抑制作用，检测结果如表2所示，计算公式如下：
抑制率(％)＝(对照组菌丝干重-生防菌组菌丝干重)/对照组菌丝干重×100％。(1)
表2
Figure BDA0001762564630000051
由表2数据可以看出，贝莱斯芽孢杆菌对番茄灰霉病菌、番茄枯萎病菌、黄瓜炭疽病菌和黄瓜枯萎病菌菌丝生长的抑制率均达到93％以上，且拮抗作用均优于对照菌WXCDD105，这充分说明贝莱斯芽孢杆菌作为生防菌能够有效抑制植物病原菌菌丝的生长，具有较强的拮抗作用。
实施例4
本实施例测试了实施例1筛选得到的贝莱斯芽孢杆菌对番茄灰霉病的温室防治效果，具体测试方法为：
将浸种催芽后的番茄种子播种到育苗盘中，浇足水分，培养15d后，分苗移栽到营养钵中，30d后进行温室防效试验。实验设计如下：
(1)Ⅰ组-病菌处理组：仅用番茄灰霉病病原菌孢子悬液喷洒番茄叶片；
(2)Ⅱ组-先接生防细菌后接病原菌处理组：先用浓度为1×108cfu/mL的贝莱斯芽孢杆菌菌悬液喷洒番茄叶片，1d后再喷洒番茄灰霉病病原菌孢子悬液；
(3)Ⅲ组-先接病原菌后接生防细菌处理组：先用番茄灰霉病病原菌孢子悬液喷洒番茄叶片，1d后再喷洒浓度为1×108cfu/mL的贝莱斯芽孢杆菌菌悬液；
(4)Ⅳ组-用对照菌WXCDD105作为对照，分别采用先喷洒浓度为1×108cfu/mL的对照菌WXCDD105隔天喷洒病原菌(Ⅳ-1)、先喷洒病原菌隔天喷洒浓度为1×108cfu/mL的对照菌WXCDD105(Ⅳ-2)的方法；
(5)Ⅴ组-用生物杀菌剂施倍健作为阳性对照，分别采用先接施倍健后接病原菌(Ⅴ-1)、先接病原菌后接施倍健(Ⅴ-1)的方法。
上述各组处理所喷施的番茄灰霉病病原菌孢子悬液的喷施量均相同，且所喷施的番茄灰霉病病原菌孢子悬液的浓度均为1×105cfu/mL；Ⅳ组两种处理方式所喷施的施倍健的量相同，均按照产品使用说明进行喷施。
将上述各组处理后的番茄置于25℃保湿培养，第20d观察番茄植株的发病情况。依照番茄灰霉病分级标准调查叶片受害级别，统计并计算病情指数和防治效果，计算公式如下：
Figure BDA0001762564630000061
Figure BDA0001762564630000062
番茄灰霉病分级标准见表3，
表3
Figure BDA0001762564630000063
贝莱斯芽孢杆菌对番茄灰霉病的温室防治效果见表4，
表4
Figure BDA0001762564630000064
Figure BDA0001762564630000071
由表4数据可知，Ⅱ组-先接生防细菌后接病原菌处理组的防治效果可达60.16％，Ⅲ组-先接病原菌后接生防细菌处理组的防治效果可达49.29％，由此可充分证明贝莱斯芽胞杆菌在温室环境下可以有效预防番茄灰霉病，尤其先接贝莱斯芽胞杆菌进行预防可以达到更好的防治效果，且其防治效果均优于市售生物杀菌剂，是更绿色环保的植物病害防治方法。
实施例5
本实施例测试了实施例1筛选得到的贝莱斯芽孢杆菌对番茄种子及幼苗生长的影响，具体测试方法为：
番茄种子消毒：将番茄种子消毒处理，方法如下：先用稀释过的70％乙醇处理番茄种子，时间为30s，之后用灭过菌的蒸馏水冲洗，重复3次。再用稀释过的3％次氯酸钠处理种子，时间为3min，最后用灭过菌的蒸馏水冲洗。
番茄种子促生试验：
将35℃、180r/min培养24h的贝莱斯芽孢杆菌的菌悬液分别稀释200倍、500倍、800倍，用不同稀释倍数的菌悬液和无菌水分别浸泡消毒处理后的番茄种子，每个试管放入90粒番茄种子，浸泡4h后取出，均匀放在用无菌水润湿的双层滤纸的培养皿中，每个皿中随机放入30粒。之后放置在28℃恒温箱中进行培养。每组重复3次。第4d测量并记录胚根长的平均值。
结果表明：贝莱斯芽胞杆菌菌悬液稀释200倍、500倍、800倍时均有显著的促生作用，贝莱斯芽胞杆菌处理组的胚根长最高是无菌水对照组的1.54倍，最低是无菌水对照组的1.29倍，其中贝莱斯芽胞杆菌菌悬液稀释500倍，即当贝莱斯芽胞杆菌菌悬液菌体浓度为4×106cfu/mL时促生作用最明显，胚根最长，为3.15cm。
对番茄幼苗生长的影响：
由对番茄种子的促生试验结果得出贝莱斯芽胞杆菌菌悬液菌体浓度为4×106cfu/mL时具有较好的促生作用。分别用菌体浓度为4×106cfu/mL的贝莱斯芽胞杆菌菌悬液和无菌水浸泡消毒后的番茄种子，时间为4h，之后将番茄种子播种于花盆中，每盆20粒。播种20d后分别测量番茄幼苗的株高、茎粗、鲜干和干重，计算平均值，结果见表5：
表5
Figure BDA0001762564630000081
由表5数据可知，菌体浓度为4×106cfu/mL的贝莱斯芽胞杆菌菌悬液对番茄幼苗的促生效果非常明显，其株高、茎粗、鲜重及干重对比无菌水对照组显著增加。
实施例6
本实施例测试了实施例1筛选得到的贝莱斯芽孢杆菌对番茄果实的防腐保鲜作用，具体测试方法为：
挑选新鲜的、无损伤和病害的市售小番茄用于试验。将番茄果实用无菌水清洗后自然晾干，每组取30个称重，分别放入稀释后浓度为1×108cfu/mL的贝莱斯芽胞杆菌菌悬液中浸泡4min，经过自然晾干与未作处理的番茄一起置于无菌袋中并于室温下进行贮藏。以21d为贮藏周期，每隔3d对果实的腐烂情况进行调查，并隔3d称重一次，并且计算番茄的失重率；
腐烂率按照公式3计算：
Figure BDA0001762564630000082
失重率按照公式4计算：
Figure BDA0001762564630000083
结果显示，贝莱斯芽胞杆菌菌悬液处理组的番茄腐烂率为33％，而空白对照组的腐烂率高达47％；同时经贝莱斯芽胞杆菌菌悬液处理的番茄果实的失重率为8.7％，而空白对照组的失重率为11.5％，由此可以说明贝莱斯芽胞杆菌具有防腐保鲜作用。
实施例7
本实施例测试了实施例1筛选得到的贝莱斯芽孢杆菌的抗逆性，具体测试方法为：
耐干旱：取贝莱斯芽胞杆菌单菌落转接于LB培养液中，35℃、180r/min培养24h，然后分别取50μL菌悬液至多个灭菌试管中。30℃恒温箱中培养，每隔10d取出1支试管，加50μL无菌水混匀，之后用接种环取菌液划线培养，检测菌株是否存活，直至90d。
耐紫外线照射：取贝莱斯芽胞杆菌单菌落转接于LB培养液中，35℃、180r/min培养24h，然后分别取50μL菌悬液至多个灭菌载玻片上，将载玻片上的菌悬液摊开，开始紫外线照射，每隔10min取出1个载玻片，涂布到LB平板上，直至180min。
结果表明：贝莱斯芽胞杆菌分别干旱处理90d时和紫外线照射180min时均可存活，菌数几乎不变，抑菌活性也几乎保持一致，说明该菌株具有较好的抗逆性，作为生防菌可在恶劣天气条件下长时间保持拮抗作用，持效期较长。
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gtcgagcgga cagatgggag cttgctccct gatgttagcg gcggacgggt gagtaacacg 60
tgggtaacct gcctgtaaga ctgggataac tccgggaaac cggggctaat accggatggt 120
tgtttgaacc gcatggttca gacataaaag gtggcttcgg ctaccactta cagatggacc 180
cgcggcgcat tagctagttg gtgaggtaac ggctcaccaa ggcgacgatg cgtagccgac 240
ctgagagggt gatcggccac actgggactg agacacggcc cagactccta cgggaggcag 300
ncagtaggga atcttccgca atggacgaaa gtctgacgga gcaacgccgc gtgagtgatg 360
aaggttttcg gatcgtaaag ctctgttgtt agggaagaac aagtgccgtt caaatagggc 420
ggcaccttga cggtacctaa ccagaaagcc acggctaact acgtgccagc agccgcggta 480
atacgtaggt ggcaagcgtt gtccggaatt attgggcgta aagggctcgc aggcggtttc 540
ttaagtctga tgtgaaagcc cccggctcaa ccggggaggg tcattggaaa ctggggaact 600
tagtgcagaa gaggagagtg gaattccacg tgtagcggtg aaatgcgtag agatgtggag 660
gaacaccagt ggcgaaggcg actctctggt ctgtaactga cgctgaggag cgaaagcgtg 720
gggagcgaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgag tgctaagtgt 780
tagggggttt ccgcccctta gtgctgcagc taacgcatta agcactccgc ctggggagta 840
cggtcgcaag actgaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt 900
ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt accaggtctt gacatcctct gacaatccta 960
gagataggac gtccccttcg ggggcagagt gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg 1020
tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgatctt agttgccagc 1080
attcagttgg gcactctaag gtgactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg 1140
tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg ctacaatgga cagaacaaag 1200
ggcagcgaaa ccgcgaggtt aagccaatcc cacaaatctg ttctcagttc ggatcgcagt 1260
ctgcaactcg actgcgtgaa gctggaatcg ctagtaatcg cggatcagca tgccgcggtg 1320
aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca cgagagtttg taacacccga 1380
agtcggtgag gtaacc 1396

Claims (9)

1.一株广谱抗病的生防芽孢杆菌，其特征在于所述生防芽孢杆菌的分类命名为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，于2018年5月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.15766。
2.一株如权利要求1所述的广谱抗病的生防芽孢杆菌在农业生物防治方面的应用，其特征在于，所述农业生物防治包括由致病菌灰葡萄孢菌、番茄枯萎病菌、黄瓜枯萎病菌、黄瓜炭疽病菌、玉米茎腐病菌、木贼镰刀菌、轮枝镰刀菌、立枯病菌、西瓜枯萎病菌、甜瓜枯萎病菌、链格孢、葵花菌核病菌、禾谷镰刀菌F609或禾谷镰刀菌F1403引起的植物病害。
3.根据权利要求2所述广谱抗病的生防芽孢杆菌在农业生物防治方面的应用，其特征在于所述农业生物防治包括将所述生防芽孢杆菌用于防治灰霉病、番茄枯萎病、黄瓜枯萎病、黄瓜炭疽病、玉米茎腐病、立枯病、西瓜枯萎病、甜瓜枯萎病、葵花菌核病或禾本科作物的赤霉病。
4.一株如权利要求1所述的广谱抗病的生防芽孢杆菌在番茄种子及幼苗促生方面的应用。
5.根据权利要求4所述广谱抗病的生防芽孢杆菌在番茄种子及幼苗促生方面的应用，其特征在于所述应用的具体方法是使用贝莱斯芽孢杆菌菌悬液浸泡处理番茄种子。
6.一株如权利要求1所述的广谱抗病的生防芽孢杆菌在水果蔬菜防腐保鲜方面的应用。
7.根据权利要求6所述广谱抗病的生防芽孢杆菌在水果蔬菜防腐保鲜方面的应用，其特征在于所述应用的具体方法是使用贝莱斯芽孢杆菌菌悬液浸泡处理水果蔬菜。
8.一种如权利要求1所述的广谱抗病的生防芽孢杆菌的菌悬液。
9.根据权利要求8所述一种广谱抗病的生防芽孢杆菌的菌悬液，其特征在于所述菌悬液的制备方法为：挑取所述生防芽孢杆菌的单菌落接种于无菌LB培养液中，35℃、180r/min培养24 h即得到所述生防芽孢杆菌的菌悬液。
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