CN112760268B - 一株耐紫外光芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

一株耐紫外光芽孢杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

一株耐紫外光芽孢杆菌及其应用，涉及微生物领域，尤其涉及一株耐紫外光芽孢杆菌及其应用。是要解决现有ICPB工艺中生物膜容易受到紫外光的伤害的问题。该芽孢杆菌为强光催化芽孢杆菌(Bacillus enhanphotocatalysis)T4，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2019年11月20日，保藏编号为CGMCC No.18986。强光催化芽孢杆菌T4可在紫外光UV254照射条件下生长，能够强化紫外光对腐殖酸的降解效果，在紫外光UV254照射条件下经过10h处理，腐殖酸去除率可达到50.4％。

Description

一株耐紫外光芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，尤其涉及一株耐紫外光芽孢杆菌及其应用。
背景技术
光催化和生物降解直接耦合技术(Intimated Coupling of Photocatalysis andBiodegradation，ICPB)是将光催化氧化与微生物降解相结合的一项技术。光催化氧化是利用半导体氧化物材料在光照条件下表面能受激活化的特性，从而有效地氧化分解有机物。TiO2是目前使用最广泛的半导体光催化剂，在辐射光源的波长小于387nm的紫外光照射时被激发，产生强氧化性能的羟基自由基、氧自由基等，对有机物起到降解作用。为了防止紫外光破坏微生物的细胞膜和DNA结构、影响微生物的活性，可以微生物负载在TiO2的多孔载体骨架内，形成ICPB技术，使得TiO2光催化降解产物的可生物降解部分会立即被微生物降解，降低降解时间、提高降解效率。尽管载体为微生物提供了较好的保护环境，但紫外光照射条件下，仍会对载体表面的生物膜产生损伤；且光催化过程中形成的自由基，影响载体内的生物活性。目前，ICPB工艺的生物膜主要是利用污水厂混合污泥培养固定形成的混合菌群，微生物组成相对复杂，缺少对耐紫外光或抗氧化的专性微生物。
发明内容
本发明是要解决现有ICPB工艺中生物膜容易受到紫外光的伤害的问题，提供一株耐紫外光芽孢杆菌及其应用。
本发明耐紫外光芽孢杆菌为强光催化芽孢杆菌(Bacillusenhanphotocatalysis)T4，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2019年11月20日，保藏编号为CGMCCNo.18986。
本发明强光催化芽孢杆菌(Bacillus enhanphotocatalysis)T4的形态特征：杆菌，长为1.9～2.4μm，宽为0.5～0.7μm，无鞭毛；革兰氏染色阳性，但不易脱色；有芽孢；菌落圆形，不光滑，新形成的菌落呈乳白色；老龄菌落颜色渐深，呈点黄色。
本发明强光催化芽孢杆菌(Bacillus enhanphotocatalysis)T4的生理生化特征：为专性好氧菌，可在15～45℃、pH 6～8条件下生长；最适生长温度为35℃，最适生长pH值为7.2；具有耐盐性，可在8％的盐溶液中生长；可在紫外光UV254条件下存活；接触酶阳性，氧化酶阳性，可以水解葡萄糖，可利用广泛碳源，包括糊精、低聚麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、龙胆二糖、蔗糖、松二糖、水苏糖、甘露糖、果糖、半乳糖、棉籽糖、D-甘露醇、丙氨酸，L-谷氨酸、L-乳酸、果胶、丙酸；对亚碲酸钾、利福霉素、二甲胺四环素、氨曲南、氯化锂有抗性。
本发明强光催化芽孢杆菌(Bacillus enhanphotocatalysis)T4的分子生物学鉴定结果：通过16S rDNA序列比对分析，与其相近种属阿氏芽孢杆菌(Bacillusarysbhattai)相似度仅为98％，通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定，强光催化芽孢杆菌T4为一新种细菌。
本发明强光催化芽孢杆菌(Bacillus enhanphotocatalysis)T4在废水处理中的应用。
本发明强光催化芽孢杆菌(Bacillus enhanphotocatalysis)T4在光催化氧化中的应用。
进一步的，所述强光催化芽孢杆菌(Bacillus enhanphotocatalysis)T4在ICPB体系中的应用。
进一步的，所述强光催化芽孢杆菌(Bacillus enhanphotocatalysis)T4用于形成生物膜负载在TiO2的多孔载体骨架内。
本发明的有益效果：
本发明耐紫外光芽孢杆菌，为一新种细菌，它命名为强光催化芽孢杆菌(Bacillusenhanphotocatalysis)T4，其可在紫外光UV254照射条件下生长，在35℃、紫外光条件下的世代时间为2.64min。强光催化芽孢杆菌T4能够强化紫外光对腐殖酸的降解效果，在紫外光UV254照射条件下经过10h处理，腐殖酸去除率可达到50.4％。
附图说明
图1为本发明强光催化芽孢杆菌T4的菌体形态；
图2为本发明强光催化芽孢杆菌T4的菌落形态；
图3强光催化芽孢杆菌T4在紫外光和暗培养条件下的生长曲线。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式耐紫外光芽孢杆菌为强光催化芽孢杆菌(Bacillusenhanphotocatalysis)T4，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2019年11月20日，保藏编号为CGMCCNo.18986。
具体实施方式二：本实施方式耐紫外光芽孢杆菌T4的筛选方法：从黑龙江大学校园内花坛中取300mg表层土壤，加入蒸馏水至1L，搅拌均匀后静置。静置后的上清液为土壤浸出液。取3份300mL土壤浸出液分别加入500mL筛选液，在35℃、UV254紫外灯照射磁力搅拌器下培养3天。经过梯度稀释后，在35℃、UV254紫外灯照射条件下进行划线分离，选取典型的单一菌落进行纯化培养，即为本实施方式的菌株T4。
所述筛选液成分为：1g g/L碳源，NH4Cl 0.1～0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.01～0.05g/L，K2HPO4 0.05～0.2g/L，NaCl 0.05～0.12g/L，MnSO4·4H2O 0.01g/L，FeSO4 0.01g/L，0.5～1g/L筛选用催化剂，其中碳源为腐殖酸、葡萄糖或淀粉，筛选用催化剂可以是TiO2、铁粉、硫酸亚铁等。
本实施方式参照《伯杰细菌鉴定手册》第八版和《常见细菌系统鉴定手册》对耐紫外光芽孢杆菌T4进行生理生化鉴定：
菌株的形态特征为：杆菌，如图1所示，长为1.9～2.4μm，宽为0.5～0.7μm，无鞭毛；革兰氏染色阳性，但不易脱色；有芽孢；菌落圆形，不光滑，新形成的菌落呈乳白色；老龄菌落颜色渐深，呈点黄色，如图2所示。
生理生化特征为：为专性好氧菌，可在15～45℃、pH 6～8条件下生长；最适生长温度为35℃，最适生长pH值为7.2；具有耐盐性，可在8％的盐溶液中生长；可在紫外光UV254条件下存活；接触酶阳性，氧化酶阳性，可以水解葡萄糖，可利用广泛碳源，包括糊精、低聚麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、龙胆二糖、蔗糖、松二糖、水苏糖、甘露糖、果糖、半乳糖、棉籽糖、D-甘露醇、丙氨酸，L-谷氨酸、L-乳酸、果胶、丙酸；对亚碲酸钾、利福霉素、二甲胺四环素、氨曲南、氯化锂有抗性。
对菌株T4进行分子鉴定，提取细菌基因组DNA后，进行16S rDNA序列扩增，用于扩增的PCR反应引物为通用引物：正向引物5’-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’；反向引物5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’。PCR反应体系如下：模板DNA 50～100ng，25μL Taq酶混合液，0.5μL正向引物，0.5μL反向引物，加入无菌去离子水至50μL。PCR扩增条件：94℃预变性5min，之后94℃变性1min，50～55℃扩增1min，72℃延伸1.5min，经过30次循环后，72℃延伸5min。获得1480bp序列长度，提交至GenBank注册号为MN587976，16SrDNA序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。
与其相近种属阿氏芽孢杆菌(Bacillus arysbhattai)相似度仅为98％，通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定，本实施方式的菌株T4为一新种细菌，命名为强光催化芽孢杆菌(Bacillus enhanphotocatalysis)T4。
具体实施方式三：本实施方式强光催化芽孢杆菌(Bacillusenhanphotocatalysis)T4在紫外光UV254照射条件下的生长试验：
紫外灯光254nm，在紫外灯光强27.8μw/cm2、35℃的条件下，用100mL标准LB培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L)培养菌株Bacillus enhanphotocatalysisT4，通过测定溶液在600nm下的吸光度值(OD600)来绘制菌株的生长曲线，并与在无光照、35℃条件下培养的菌株T4生长曲线做对比，结果如图3所示，图中●表示暗培养条件，■表示紫外光条件。紫外灯UV254照射条件下，菌株T4生长的适应期缩短，这与紫外光分解水中有机物，使有机物更容易被菌株利用有关。在紫外条件下培养24h后，菌株T4的生长呈衰亡趋势，与暗培养条件一致，说明长时间的紫外照射对菌株伤害很小，生长呈衰亡趋势主要是由于培养基中营养不足，限制了菌体生长，由此可见，在紫外光强27.8μw/cm2条件下照射培养有利于菌株T4的生长。
本实施方式强光催化芽孢杆菌(Bacillus enhanphotocatalysis)T4可在紫外光UV254照射条件下生长，在35℃、紫外光条件下的世代时间为2.64min。
具体实施方式四：本实施方式本实施方式强光催化芽孢杆菌(Bacillusenhanphotocatalysis)T4在紫外光UV254照射条件下去除水中腐殖酸的试验：
取0.3～0.5mg的新培养T4菌体，接种至100mL腐殖酸溶液中，在35℃、紫外灯光254nm、紫外灯光强27.8μw/cm2、160rpm的条件下，对腐殖酸处理10h之后测定水中总有机碳(TOC)浓度，以未接种菌体的腐殖酸溶液为对照，并分析菌株T4对腐殖酸的去除效果，结果如表1所示。
表1强光催化芽孢杆菌T4在紫外光催化条件下对腐殖酸的去除效果
Figure GDA0003556286740000041
结果显示，未接种菌体的处理中，TOC去除效果很低，不到10％。而经过菌株T4处理10h，可以去除水中50.4％的腐殖酸。
紫外光照射可以将腐殖酸初步分解成为可生物降解的小分子有机物，而菌T4能够耐紫外线照射，并能够利用可生物降解有机物进行生长代谢，将其彻底氧化，因而使水中的有机物达到了彻底分解的作用。因此本发明的菌株T4能够强化紫外光对腐殖酸的降解效果。
序 列 表
<110> 黑龙江大学
<120>一株耐紫外光芽孢杆菌及其应用
<160> 3
<210> 1
<211> 1481
<212> DNA
<213>强光催化芽孢杆菌（Bacillus enhanphotocatalysis）
<220>
<223>强光催化芽孢杆菌T4
<400> 1
tcaggatgaa cgctggcggc gtgcctaata catgcaagtc gagcgaactg attagaagct 60
tgcttctatg acgttagcgg cggacgggtg agtaacacgt gggcaacctg cctgtaagac 120
tgggataatt tcgggaaacc gaagttaata ccggatagga ttttatcctt catgggagat 180
gattaaaaga tggtttcggc tatcacttac agatgggccc gcggtgcatt agttagttgg 240
tgaggtaacg gctcaccaag gcaacgatgc atagccgacc tgagagggtg ttcggccaca 300
ctgggattga gacacggccc agattcttac gggaggcacc agtagggaat cttccgcaat 360
ggacgaaatt ctgacggagc aacgccgcgt gagtgatgaa ggctttcggg tcgtaaaact 420
ctgttgttag ggaagaacaa gtacgagagt aactgctcgt accttgacgg tacctaacca 480
gaaagc-cac ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtgg caagcgttat 540
ctggaattat tgggcgtaaa gcgcgcgcag gcggtttctt aagtctgatg tgaaagccca 600
cggctcaacc gtggagggtc attggaaact ggggaacttg agtgcagaag agaaaagcgg 660
aattccacgt gtagcggtga aatgcgtaga gatgtggagg aacaccagtg gcgaaggcgg 720
ctttttggtc tgtaactgac gctgaggcgc gaaagcgtgg ggagcaaaca ggattagata 780
ccctggtagt ccacgccgta aacgatgagt gctaagtgtt agagggtttc cgccccttag 840
tgctgcagct aacgcattaa gcactccgcc tggggagtac ggtcgcaaga gtgaaactca 900
aaggaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaatttg aagcaacgcg 960
aagaacctta ccaggtcttg acatcctctg acaactctag agatagagcg ttccccttcg 1020
ggggacagag tgacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt 1080
aagtcccgca acgagcgcaa cccttgatct tatttgccag catttatttg ggcactctaa 1140
ggtgactgcc ggtgacaaac cggaagaagg tggggatgac gtcaaatcat catgcccctt 1200
atgacctggg ctacacacgt gctacaatgg atggtacaaa gggctgcaag accgcgaggt 1260
caagccaatc ccataaaacc attctcagtt cggattgtag gctgcaactc gcctacatga 1320
agctggaatc gctagtaatc gcggatcagc atgccgcggt gaatactttc ccgggccttg 1380
tacacaccgc ccgtcacacc acgagagttt gtaacacccg aagtcggtgg agtaaccgta 1440
aggagctagc cgcctaaggt gggacagatg attggggtga a 1481
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 正向引物
<400> 2
gagcggataacaatttcacacagg 24
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 反向引物
<400> 3
cgccagggttttcccagtcacgac 24

Claims (5)

1.一株耐紫外光芽孢杆菌，其特征在于该芽孢杆菌为强光催化芽孢杆菌(Bacillus enhanphotocatalysis)T4，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2019年11月20日，保藏编号为CGMCCNo.18986。
2.如权利要求1所述的耐紫外光芽孢杆菌在废水处理中的应用。
3.如权利要求1所述的耐紫外光芽孢杆菌在光催化氧化中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述耐紫外光芽孢杆菌用于ICPB体系中。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述耐紫外光芽孢杆菌用于形成生物膜负载在TiO2的多孔载体骨架内。
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