CN114350575A - 一种厌氧河道底泥降解菌种及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种厌氧河道底泥降解菌种‑‑海内氏芽孢杆菌Bacillus haynesii YE6及其在河道底泥厌氧降解中的应用，涉及环境微生物技术领域。本发明的菌株海内氏芽孢杆菌Bacillus haynesii YE6，已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO:M 20211674，保藏日期为2021年12月24日。海内氏芽孢杆菌Bacillus haynesii YE6能够在厌氧环境中有效提高河道底泥中有机物的降解率，可用于河道底泥的减量化和无害化处理，具有较高的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于环境微生物技术领域，特别是涉及一种厌氧的河道底泥降解菌种及其应用。
背景技术
随着经济的快速发展和人口的急剧膨胀，大量污染物被排入河道，超过河道的自净能力，导致河道和周边环境严重恶化，对人民的生活和城市的发展造成负面影响。许多有毒有害的无机物和持久性有机物在河道底泥中长久残留并大量积聚，使其具有组分复杂、难降解等特性。在环境因素发生改变时，底泥中的氮、磷等有机污染物会渗透到地下水或释放到上覆水。此外，底泥中的生物极易摄入底泥中的污染物，进入食物链后，污染物在生物体中富集，对人类健康和生态环境构成严重风险。
目前，底泥修复技术可分为物理、化学、生物三大类。物理修复包括疏浚、截污、掩蔽、引水、曝气等技术；化学修复主要是添加化学药剂和吸附剂使污染物从底泥中分离或降解的技术；生物修复是利用植物或微生物清除污染物，实现净化环境的技术。生物修复技术包括改善底泥环境以促进土著生物降解污染物的生物促生技术，以及投放高效微生物菌剂或引种优良水生植物以减少污染的生物强化技术。其中，生物强化技术主要是将经过筛选和驯化的具有高效降解污染物能力的微生物投加到底泥中，利用微生物的代谢作用对污染物进行分解、转化与降解，达到修复水体、改善河道生态的目的。往往受污染的河道底泥中氧气匮乏，表层以下的底泥呈厌氧环境，厌氧微生物可以在这样的厌氧环境下将有机污染物降解为无毒无害物质如CO2、H2O等，适应性较强。微生物修复技术具有投资少、见效快、操作简单等特点，可广泛应用于河道底泥处理中，具有良好的发展前景。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种厌氧的河道底泥降解菌种及其应用，用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种厌氧河道底泥降解菌种，经鉴定为海内氏芽孢杆菌Bacillus haynesii，保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，菌种名称为Bacillus haynesii YE6，保藏日期为2021年12月24日，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO: M 20211674。
所述海内氏芽孢杆菌Bacillus haynesii YE6，含有如SEQ ID NO.1所示的基因序列。
所述海内氏芽孢杆菌Bacillus haynesii YE6，为革兰氏阳性菌，杆状，属于厌氧菌，菌落形态为乳白色、圆形、半透明，中间有褶皱凸起，边缘不整齐，菌落表面粗糙、无光泽。
所述海内氏芽孢杆菌Bacillus haynesii YE6，属于厌氧菌，在溶解氧（DO）为0~0.5 mg/L的河道底泥中生长良好。
所述海内氏芽孢杆菌Bacillus haynesii YE6，最高盐耐受浓度为100 g/L NaCl。
本发明第二方面提供一种液体菌剂，所述液体菌剂包含海内氏芽孢杆菌Bacillus haynesii YE6，海内氏芽孢杆菌Bacillus haynesii YE6的浓度至少为1×108 CFU/mL。
本发明第三方面提供液体菌剂的制备方法，包括如下步骤：将海内氏芽孢杆菌Bacillus haynesii YE6的纯菌种接种于液体培养基中多级厌氧扩大培养，培养结束后即得到液体菌剂。
所述液体培养基的配方为：葡萄糖5 g/L，胰蛋白胨3 g/L，牛肉粉2 g/L，NaCl 4g/L，K2HPO4 0.75 g/L，KH2PO4 0.75 g/L，FeSO4·7H2O 0.05 g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L，(NH4)2SO4 3 g/L，半胱氨酸0.25 g/L。
本发明第四方面提供海内氏芽孢杆菌Bacillus haynesii YE6在河道底泥降解中的应用。
所述海内氏芽孢杆菌Bacillus haynesii YE6在厌氧条件下对河道底泥中挥发性固体（VS）的降解率达到26.2%。
本发明第五方面提供一种河道底泥的降解方法，包括如下步骤：
（1）将海内氏芽孢杆菌Bacillus haynesii YE6的液体菌剂接种至河道底泥；
（2）在适宜的温度、pH值、DO条件下进行河道底泥的厌氧降解。
所述接种的接种量为底泥体积的0.1~5%，优选为1~3%；
所述温度为10~60 ℃，优选为20~40 ℃；
所述pH值为5~9，优选为6~8；
所述DO为0~0.5 mg/L，优选为0~0.2 mg/L。
如上所述，本发明的河道底泥降解菌种及其应用，具有以下有益效果：
（1）本发明应用海内氏芽孢杆菌Bacillus haynesii YE6对河道底泥中VS的降解率达26.2%，能在厌氧或缺氧条件下高效降解底泥中的有机物，有效提高底泥中VS的降解率，实现河道底泥的减量化和无害化，具有较高的应用价值；
（2）本发明操作方便、处理效率高、成本低、无污染。
附图说明
图1为分离纯化菌株在厌氧条件下对河道底泥中VS的降解效果。
图2为厌氧河道底泥降解菌株YE6的系统进化树图谱。
图3为厌氧河道底泥降解菌株YE6在培养基平板上的生长菌落形态。
图4为菌株YE6在厌氧条件下对河道底泥中VS降解率的变化。
具体实施方式
通过以下具体实施例对本发明的技术方案做进一步描述。目的是为了更好地解释本发明，但本发明并不局限于下述实施方式，本领域一般技术人员在本发明所揭露的技术范围内，可轻易想到的变化，均在本发明的保护范围内。
实施例1：厌氧河道底泥降解菌的分离筛选及性能测定
所用到的培养基及成分如下：
液体培养基：葡萄糖5 g/L，胰蛋白胨3 g/L，牛肉粉2 g/L，NaCl 4 g/L，K2HPO40.75 g/L，KH2PO4 0.75 g/L，FeSO4·7H2O 0.05 g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L，(NH4)2SO4 3 g/L，半胱氨酸0.25 g/L，自然pH值。
固体培养基：葡萄糖5 g/L，胰蛋白胨3 g/L，牛肉粉2 g/L，NaCl 4 g/L，K2HPO40.75 g/L，KH2PO4 0.75 g/L，FeSO4·7H2O 0.05 g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L，(NH4)2SO4 3 g/L，半胱氨酸0.25 g/L，15 g/L的琼脂粉，自然pH值。
河道底泥液体培养基：河道底泥（总固体TS含量11%，VS含量为TS的7.8%，均为质量分数）加水调节底泥TS含量为5%，pH值7.0。
河道底泥固体培养基：河道底泥（TS含量11%，VS含量为TS的7.8%，均为质量分数）加水调节底泥TS含量为5%，琼脂粉15 g/L，pH值7.0。
以上培养基配制好后，均在121 ℃下高压蒸汽灭菌20 min，备用。
富集：从不同河道中采集底泥样品，取5 mL底泥置入装有灭菌的45 mL液体培养基和玻璃珠的锥形瓶中，混合均匀后放置于37 ℃培养箱中，厌氧富集培养72 h。
分离纯化：将富集液梯度稀释后均匀涂布于固体培养基，在37 ℃培养箱中厌氧培养48 h后，挑取菌落形态各异的单克隆，划线纯化后编号保藏。经分离纯化共得到11个菌株。
初筛：将分离纯化得到的纯菌株以点接的方法接种到河道底泥固体培养基上，在37 ℃培养箱中厌氧培养48 h，挑取生长较好的菌株，划线纯化并编号保藏。经初筛共得到6个菌株。
底泥降解性能测定：实验组将初筛得到的6个菌株接种至液体培养基中，在37 ℃厌氧培养24 h，取2%（体积比）菌液离心后用无菌生理盐水洗涤、重悬，接种至河道底泥液体培养基中。对照组在河道底泥液体培养基中接入同体积的无菌生理盐水，在厌氧条件下于30 ℃培养5 d。反应结束后测定底泥中VS的降解率，与不加菌的对照组相比，评价各个菌株降解底泥的性能。由图1可以看出，菌株YE6在厌氧条件下对底泥VS的降解率最高，达到26.2%，与对照组VS降解率17.5%相比，提高了49.7%。说明菌株YE6在厌氧条件下具有显著的河道底泥降解效果。
菌株耐盐性能测定：用划线法将菌株YE6接种至不同NaCl浓度（20~120 g/L）的河道底泥固体培养基平板上，在37 ℃培养箱中厌氧培养48 h，定期观察菌株的生长情况，结果发现菌株YE6在含100 g/L NaCl的河道底泥固体培养基上生长良好，其菌落大小为2~3mm，在含120 g/L NaCl的河道底泥固体培养基上不生长，表明菌株YE6生长良好的最高盐耐受浓度为100 g/L NaCl。
实施例2：厌氧河道底泥降解菌株YE6的生物学鉴定
提取菌株YE6的基因组DNA，并以此为模板，利用一对通用引物（27F，1492R）扩增菌株16S rDNA。上游引物为27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3’），下游引物为1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）。
PCR反应体系（20 μL）如下：模板DNA 0.5 μL，PCR Taqmix 10 μL，上下游引物各0.6 μL，加ddH2O至反应体系为20 μL。
PCR程序：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min30 s，以上共循环30次，72 ℃延伸10 min，最后在4 ℃保存。
由上海杰李生物技术有限公司进行PCR产物的纯化和测序，得到菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。在NCBI提交通过测序获得的16S rDNA序列，通过软件与GenBank进行同源性序列比对分析，应用MEGA X软件构建该菌株系统发育树（图2）。
菌株YE6的基因有效序列长度为1420 bp，见基因序列表SEQ ID NO.1。经过比对，该序列与NCBI数据库的Bacillus haynesii （NCBI登录号为：MT538502.1）同源，一致性达99.93%。综合菌株的其他生物学特性，菌株YE6为革兰氏阳性菌，杆状，厌氧，菌落形态为乳白色、圆形、半透明，中间有褶皱凸起，边缘不整齐，菌落表面粗糙、无光泽。（图3）。鉴定该菌株为海内氏芽孢杆菌Bacillus haynesii，最终将其命名为海内氏芽孢杆菌Bacillus haynesii YE6。
实施例3：厌氧河道底泥降解菌株YE6的液体菌剂制备
将YE6纯菌种接种于10 mL液体培养基中，在37 ℃厌氧培养24 h，然后再以液体培养基体积的5%的接种量接入到下一级扩大培养的液体培养基中，相同条件下进行多级厌氧扩大培养，即可得到该菌株的液体菌剂。
实施例4：厌氧河道底泥降解菌株YE6对河道底泥的降解效果
河道水及底泥取自广东佛山某河流，其中底泥主要为来源于生活、工业的污染物经物理、化学和生物作用沉积于河床底部而形成的富含有机质和营养盐的灰黑色淤泥。该底泥的TS含量16.4%，VS含量为TS的11.7%，pH值为6.9。
将底泥与河道水按照体积比1:1的比例混合，置于1 m3的厌氧反应器中，实验组按照底泥体积的2%接种菌株YE6的液体菌剂，对照组接入相同体积的液体培养基，控制条件为温度30 ℃、pH值7.0、DO值0 mg/L。在反应过程中每24 h取一次样，测定河道底泥的VS降解率。图4为菌株YE6在120 h内对河道底泥的降解情况，结果显示添加了菌剂的实验组对河道底泥的VS降解率最高值达35.6%，与对照组的VS降解率19.7%相比，提高了80.7%。说明菌株YE6在厌氧条件下对河道底泥具有显著的降解效果。
序列表
<110> 佛山市玉凰生态环境科技有限公司
<120> 一种厌氧河道底泥降解菌种及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1420
<212> DNA
<213> Bacillus haynesii YE6
<400> 1
tcgagcggac agatgggagc ttgctccctg atgttagcgg cggacgggtg agtaacacgt 60
gggtaacctg cctgtaagac tgggataact ccgggaaacc ggggctaata ccggatgctt 120
gtttgaaccg catggttcaa acataaaagg tggcttttag ctaccactta cagatggacc 180
cgcggcgcat tagctagttg gtgaggtaac ggctcaccaa ggcaacgatg cgtagccgac 240
ctgagagggt gatcggccac actgggactg agacacggcc cagactccta cgggaggcag 300
cagtagggaa tcttccgcaa tggacgaaag tctgacggag caacgccgcg tgagtgatga 360
aggttttcgg atcgtaaaac tctgttgtta gggaagaaca agtaccgttc gaatagggcg 420
gtaccttgac ggtacctgac cagaaagcca cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa 480
tacgtaggtg gcaagcgttg tccggaatta ttgggcgtaa agcgcgcgca ggcggtttct 540
taagtctgat gtgaaagccc ccggctcaac cggggagggt cattggaaac tggggaactt 600
gagtgcagaa gaggagagtg gaattccacg tgtagcggtg aaatgcgtag agatgtggag 660
gaacaccagt ggcgaaggcg actctctggt ctgtaactga cgctgaggcg cgaaagcgtg 720
gggagcgaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgag tgctaagtgt 780
tagagggttt ccgcccttta gtgctgcagc aaacgcatta agcactccgc ctggggagta 840
cggtcgcaag actgaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt 900
ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt accaggtctt gacatcctct gacaacccta 960
gagatagggc ttccccttcg ggggcagagt gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg 1020
tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgatctt agttgccagc 1080
attcagttgg gcactctaag gtgactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg 1140
tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg ctacaatggg cagaacaaag 1200
ggcagcgaag ccgcgaggct aagccaatcc cacaaatctg ttctcagttc ggatcgcagt 1260
ctgcaactcg actgcgtgaa gctggaatcg ctagtaatcg cggatcagca tgccgcggtg 1320
aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca cgagagtttg taacacccga 1380
agtcggtgag gtaacctttt ggagccagcc gccgaagtga 1420
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agagtttgat cctggctca 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggttaccttg ttacgactt 19
Claims (9)
1.一种海内氏芽孢杆菌Bacillus haynesii YE6，其保藏编号为CCTCC NO: M20211674。
2.根据权利要求1所述的海内氏芽孢杆菌Bacillus haynesii YE6，其特征在于，所述的海内氏芽孢杆菌Bacillus haynesii YE6含有如SEQ ID NO.1所示的基因序列。
3.一种菌剂，其特征在于，包含如权利要求1所述的海内氏芽孢杆菌Bacillus haynesii YE6。
4.根据权利要求3所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂为液体菌剂，所述菌剂中海内氏芽孢杆菌Bacillus haynesii YE6的浓度至少为1×108 CFU/mL。
5.根据权利要求3所述的菌剂，其特征在于，所述的菌剂的制备方法为将所述海内氏芽孢杆菌Bacillus haynesii YE6的纯菌种接种于液体培养基中多级扩大厌氧培养，即得到液体菌剂。
6.一种如权利要求1所述的海内氏芽孢杆菌Bacillus haynesii YE6在河道底泥降解中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述海内氏芽孢杆菌Bacillus haynesiiYE6在厌氧条件下对河道底泥中挥发性固体的降解率达26.2%。
8.一种河道底泥降解的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将权利要求1所述的海内氏芽孢杆菌Bacillus haynesii YE6制备的液体菌剂接种至河道底泥中；
（2）在适宜的温度、pH值、DO值条件下进行河道底泥的厌氧降解。
9.根据权利要求8所述的河道底泥降解的方法，其特征在于，还包括以下条件：
（1）所述接种的接种量为河道底泥体积的0.1~5%；
（2）所述温度为10~60 ℃；
（3）所述pH值为5~9；
（4）所述DO为0~0.5 mg/L。
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