CN114292798B - 一种厌氧反硝化菌种及其在河道水体修复中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种厌氧反硝化菌种及其在河道水体修复中的应用，涉及环境微生物技术领域。所述的厌氧反硝化菌种为大豆发酵芽孢杆菌Bacillus glycinifermentans YY8，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20211700，保藏日期为2021年12月30日。本发明的大豆发酵芽孢杆菌Bacillus glycinifermentans YY8在厌氧条件下具有很强的反硝化能力，能有效降低河道水体中的总氮含量，可应用于河道修复，强化脱氮效果，在河道生物修复过程中具有较高的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于环境微生物技术领域，特别是涉及一种厌氧反硝化菌种及其在河道水体修复中的应用。
背景技术
随着城市化进程的加快，大量生活及工业废水未经适当处理排入河道中，对河道及周边土壤造成急性或慢性负影响。污水的不达标排放导致河水的各项污染指标（COD、N、P等）超标，造成河道水体变黑变臭，河水富营养化，严重影响生态环境和人类健康。
氮是水体污染过程中一类非常重要的污染物，是引起水体富营养化的重要因素之一。水体中的氮主要以有机氮、氨氮(NH4 +-N)、硝酸盐氮(NO3 --N)及亚硝酸盐氮(NO2 --N)的形式存在，其中，亚硝酸盐氮是细菌硝化过程及反硝化过程中的重要中间产物，易形成积累，具有强氧化性，对水生生物如鱼类、软体动物及甲壳动物等均有毒性。目前水体脱氮方法中，生物法效率高，成本低，无二次污染，是一种公认的较为经济有效的脱氮方法。传统的生化脱氮要经过好氧硝化和厌氧反硝化两个过程，首先通过好氧硝化菌的作用把氨氮转变为硝氮，继而在厌氧环境下通过反硝化菌的作用把硝氮转变为氮气从而达到氮素的去除。从20世纪80年代Robertson等首次发现好氧反硝化细菌，打破了传统反硝化的概念，自此越来越多具有好氧反硝化能力的菌株被筛选出来，常见的包括假单胞菌属、芽孢杆菌属、不动杆菌属等。但是由于河道水体随着深度增加，溶氧会越来越低，接近河道底部氧气匮乏，表层以下的水体呈缺氧甚至厌氧状态，因此在微生物修复实施过程中，最重要的一环是需要拥有在厌氧条件下高效降解能力的菌种，在水体中也起到强化处理效果的作用。因此，筛选分离出高效的厌氧反硝化菌种，利用高效反硝化菌强化河道黑臭水体的生物脱氮效果，有效提高脱氮效率也是亟须解决的问题之一。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种厌氧反硝化菌种及其在河道水体中的应用，用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一株厌氧反硝化菌种，经鉴定为大豆发酵芽孢杆菌Bacillus glycinifermentans，保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，菌种名称为Bacillus glycinifermentans YY8，保藏日期为2021年12月30日，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO: M 20211700。
所述大豆发酵芽孢杆菌Bacillus glycinifermentans YY8，含有如SEQ ID NO.1所示的基因序列。
所述大豆发酵芽孢杆菌Bacillus glycinifermentans YY8，其为革兰氏阳性菌，菌落呈乳白色，黏液状，半透明，隆起，培养两天后，其菌落直径为3~4 mm。
所述大豆发酵芽孢杆菌Bacillus glycinifermentans YY8，属于厌氧菌，在溶解氧（DO）为0~0.5 mg/L的河道水体中生长良好。
所述大豆发酵芽孢杆菌Bacillus glycinifermentans YY8，在反硝化培养基中，对NO3 --N和TN的去除率分别达到92.69%和90.76%。
所述反硝化培养基的配方为：KNO3 1 g/L、丁二酸钠10 g/L、MgSO4·7H2O 0.1 g/L、FeSO4·7H2O 0.05 g/L、KH2PO4 1 g/L、K2HPO4 1 g/L、半胱氨酸0.25 g/L。
所述大豆发酵芽孢杆菌Bacillus glycinifermentans YY8，最高盐耐受浓度为80g/L氯化钠。
本发明第二方面提供一种液体菌剂，所述液体菌剂包含大豆发酵芽孢杆菌Bacillus glycinifermentans YY8，且大豆发酵芽孢杆菌Bacillus glycinifermentansYY8的浓度至少为1×108 cfu/mL。
本发明第三方面提供液体菌剂的制备方法，包括如下步骤：将大豆发酵芽孢杆菌Bacillus glycinifermentans YY8的纯菌种接种于液体厌氧培养基中多级扩大培养，培养结束后即得到液体菌剂。
所述液体厌氧培养基的配方为：葡萄糖5 g/L，胰蛋白胨3 g/L，牛肉粉2 g/L，(NH4)2SO4 3 g/L，NaCl 4 g/L，K2HPO4 0.75 g/L，KH2PO4 0.75 g/L，FeSO4·7H2O 0.05 g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L，半胱氨酸0.25 g/L。
本发明第四方面提供大豆发酵芽孢杆菌Bacillus glycinifermentans YY8在河道水体中脱氮的应用。
本发明第五方面提供一种河道水体脱氮方法，至少包括如下步骤：
（1）将大豆发酵芽孢杆菌Bacillus glycinifermentans YY8制备的液体菌剂接种至河道水体；
（2）在适宜的温度、pH值、DO值条件下进行河道水体的脱氮处理。
所述接种的接种量为河道水体体积的0.1~5%，优选为1~3%；
所述温度为5~50 ℃，优选为20~40 ℃；
所述pH值为5~9，优选为6~8；
所述DO为0~0.5 mg/L，优选为0~0.2 mg/L。
如上所述，本发明的厌氧反硝化菌种及其在河道水体脱氮中的应用，具有以下有益效果：
（1）本发明的大豆发酵芽孢杆菌Bacillus glycinifermentans YY8属于厌氧菌，能够在厌氧条件下高效降低河道水体中的总氮含量，从而改善河道水质；
（2）本发明处理效率高、经济效益好、操作方便、无污染。
附图说明
图1为分离纯化菌株对NO3--N和TN的去除效果。
图2为菌株YY8的系统进化树图谱。
图3为菌株YY8在厌氧培养基固体平板上的生长菌落形态。
图4为菌株YY8对黑臭河道水体中NO3--N和TN的去除效果。
具体实施方式
实施例1：厌氧反硝化菌的分离筛选及性能测定
所用到的培养基及成分如下：
厌氧液体培养基：葡萄糖5 g/L，胰蛋白胨3 g/L，牛肉粉2 g/L，(NH4)2SO4 3 g/L，NaCl 4 g/L，K2HPO4 0.75 g/L，KH2PO4 0.75 g/L，FeSO4·7H2O 0.05 g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，半胱氨酸0.25 g/L，自然pH值。
厌氧固体培养基：葡萄糖5 g/L，胰蛋白胨3 g/L，牛肉粉2 g/L，(NH4)2SO4 3 g/L，NaCl 4 g/L，K2HPO4 0.75 g/L，KH2PO4 0.75 g/L，FeSO4·7H2O 0.05 g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，半胱氨酸0.25 g/L，15 g/L的琼脂粉，自然pH值。
反硝化液体培养基：KNO3 1 g/L、丁二酸钠10 g/L、MgSO4·7H2O 0.1 g/L、FeSO4·7H2O 0.05 g/L、KH2PO4 1 g/L、K2HPO4 1 g/L、半胱氨酸0.25 g/L，自然pH值。
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以上培养基配制好后，均在115 ℃下高压蒸汽灭菌20 min，备用。
富集：从不同河道中采集样品，取5 mL样品置入装有灭菌的45 mL厌氧液体培养基的锥形瓶中，混合均匀后放置于37 ℃培养箱中厌氧富集培养72 h。
分离纯化：将富集液梯度稀释后均匀涂布于厌氧固体培养基平板上，在37 ℃厌氧培养48 h后，挑取菌落形态各异的单克隆，划线纯化后编号保藏。经分离纯化共得到13个菌株。
初筛：将分离纯化得到的纯菌株以点接的方法接种到反硝化固体培养基上，在37℃厌氧培养48 h，挑取生长较好的菌株，划线纯化并编号保藏。经初筛共得到4个菌株。
反硝化性能测定：实验组将初筛得到的4个菌株接种至厌氧液体培养基中，在30℃下静置培养24 h制备种子液，取2%（体积比）菌液离心后用无菌生理盐水洗涤、重悬，接种至反硝化液体培养基中进行验证。在30 ℃下静置培养72 h后，4 ℃、10000 r/min条件下离心10 min，取上清液测定其NO3 --N及总氮的含量，以此来评价各个菌株反硝化的性能。由图1可以看出，菌株YY8对NO3 --N及总氮的去除率最高，分别达到了92.69%和90.76%。说明菌株YY8具有显著的反硝化作用，有良好的脱氮效果。
耐盐性能测定：用划线法将菌株YY8接种至不同NaCl浓度（20~120 g/L）的厌氧固体培养基平板上，在37 ℃培养箱中厌氧培养48 h，定期观察菌株的生长情况，结果发现菌株YY8在含80 g/L NaCl的河道水体固体培养基上生长良好，其菌落大小为2~3 mm，在含80g/L以上NaCl浓度的厌氧固体培养基上不生长，表明菌株YY8生长良好的最高盐耐受浓度为80 g/L NaCl。
温度性能测定：将菌株YY8分别接种至厌氧液体培养基中，在不同的温度（5~60℃）条件下厌氧培养，定期取样，用分光光度计法测定OD600，结果表明菌株YY8在5~50 ℃下生长良好。
实施例2：厌氧反硝化菌株YY8的生物学鉴定
提取菌株YY8的基因组DNA，并以此为模板，利用一对通用引物（27F，1492R）扩增菌株16S rDNA。上游引物为27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3’），下游引物为1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）。
PCR反应体系（20 μL）如下：模板DNA 0.5 μL，PCR Taqmix 10 μL，上下游引物各0.6 μL，加ddH2O至反应体系为20 μL。
PCR程序：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min30 s，以上共循环30次，72 ℃延伸10 min，最后在4 ℃保存。
由上海杰李生物技术有限公司进行PCR产物的纯化和测序，得到菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。在NCBI提交通过测序获得的16S rDNA序列，通过软件与GenBank进行同源性序列比对分析，应用MEGA 7软件构建该菌株系统发育树（图2）。
菌株YY8的基因有效序列长度为1476 bp，见基因序列表SEQ ID NO.1。经过比对，该序列与NCBI数据库的Bacillus glycinifermentans（NCBI登录号为：LC588564.1）同源性达99.86%。综合菌株的其他生物学特性，菌株YY8为革兰氏阳性菌，菌落呈乳白色，黏液状，半透明，隆起，培养两天后，其菌落直径为3-4 mm（图3），最终将其命名为大豆发酵芽孢杆菌Bacillus glycinifermentans YY8。
实施例3：厌氧反硝化菌株YY8的液体菌剂制备
将YY8纯菌种接种于10 mL厌氧液体培养基中，于30 ℃静置培养24 h，然后再以液体培养基体积的10%的接种量接入到下一级扩大培养的液体培养基中，相同条件下进行多级扩大培养，即可得到该菌株的液体菌剂。
实施例4：厌氧反硝化菌株YY8对河道水体的脱氮效果
河道水体取自广东佛山某黑臭河道，河道水体的COD 91.27 mg/L，TN 18.05 mg/L，NO3 --N 14.88 mg/L，pH 7.8。将此黑臭水体分别置于两个相同的1 m3反应器内，实验组按照水体体积的1%接种Bacillus glycinifermentans YY8的液体菌剂，对照组接入相同体积的液体培养基，控制条件为温度30 ℃、DO值0~0.2 mg/L，自然pH值。在反应过程中每12 h取一次样，测定水体的NO3 --N和TN含量。图4显示为菌株YY8在72 h内对黑臭河道水体的脱氮情况，可以看出，3 d后，菌株YY8对NO3 --N和TN的去除率最高值分别为96.54%和91.32%。与不接菌的对照组相比，NO3 --N和TN的去除率提高67.72%和77.87%。说明菌株YY8在厌氧条件下对河道水体具有显著的脱氮效果。
序列表
<110> 佛山市玉凰生态环境科技有限公司
<120> 一种厌氧反硝化菌种及其在河道水体修复中的应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1476
<212> DNA
<213> Bacillus glycinifermentans YY8
<400> 1
cctaatacat gtaagtcgag cggacagatg ggagcttgct ccctgatgtt agcggcggac 60
gggtgagtaa cacgtgggta acctgcctgt aagactggga taactccggg aaaccggggc 120
taataccgga tgcttgtttg aaccgcatgg ttcaaayata aaaggtggct tttagctacc 180
acttacagat ggacccgcgg cgcattagct agttggtgag gtaacggctc accaaggcaa 240
cgatgcgtag ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca cggcccagac 300
tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga cggagcaacg 360
ccgcgtgagt gatgaaggtt ttcggatcgt aaaactctgt tgttagggaa gaacaagtac 420
cgttcgaata gggcggtacc ttgacggtac ctgaccagaa agccacggct aactacgtgc 480
cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg aattattggg cgtaaagcgc 540
gcgcaggcgg tttcttaagt ctgatgtgaa agcccccggc tcaaccgggg agggtcattg 600
gaaactgggg aacttgagtg cagaagagga gagtggaatt ccacgtgtag cggtgaaatg 660
cgtagagatg tggaggaaca ccagtggcga aggcgactct ctggtctgta actgacgctg 720
aggcgcgaaa gcgtggggag cgaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg 780
atgagtgcta agtgttagag ggtttccgcc ctttagtgct gcagcaaacg cattaagcac 840
tccgcctggg gagtacggtc gcaagactga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca 900
agcggtggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat 960
cctctgacaa ccctagagat agggcttccc cttcgggggc agagtgacag gtggtgcatg 1020
gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg 1080
atcttagttg ccagcattca gttgggcact ctaaggtgac tgccggtgac aaaccggagg 1140
aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca 1200
atgggcagaa caaagggcag cgaagccgcg aggctaagcc aatcccacaa atctgttctc 1260
agttcggatc gcagtctgca actcgactgc gtgaagctgg aatcgctagt aatcgcggat 1320
cagcatgccg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccacgaga 1380
gtttgtaaca cccgaagtcg gtgaggtaac cttttggagc cagccgccga aggtgggaca 1440
gatgattggg gtgaagtcgt aacaaggtat ccgtat 1476
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agagtttgat cctggctca 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggttaccttg ttacgactt 19
Claims (8)
1.一种大豆发酵芽孢杆菌Bacillus glycinifermentans YY8，已保藏于中国典型培养物保藏中心，菌株保藏编号为CCTCC NO：M 20211700，保藏日期为2021年12月30日。
2.根据权利要求1所述的大豆发酵芽孢杆菌Bacillus glycinifermentans YY8，其特征在于，所述的大豆发酵芽孢杆菌Bacillus glycinifermentans YY8含有如SEQ ID NO.1所示的基因序列。
3.根据权利要求1所述的大豆发酵芽孢杆菌Bacillus glycinifermentans YY8，其特征在于，所述的大豆发酵芽孢杆菌Bacillus glycinifermentans YY8在反硝化培养基中，对NO3 --N和TN的去除率分别达到92.69%和90.76%。
4.一种菌剂，其特征在于，包含如权利要求1所述的大豆发酵芽孢杆菌Bacillus glycinifermentans YY8。
5.根据权利要求4所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂为液体菌剂，所述的液体菌剂中大豆发酵芽孢杆菌Bacillus glycinifermentans YY8的浓度至少为1×108 cfu/mL。
6.一种如权利要求4所述的菌剂的制备方法，其特征在于，将所述的大豆发酵芽孢杆菌Bacillus glycinifermentans YY8的纯菌种接种于液体培养基中多级扩大厌氧培养，即得到液体菌剂。
7.一种如权利要求1所述的大豆发酵芽孢杆菌Bacillus glycinifermentans YY8在河道水体脱氮中的应用。
8.一种河道水体脱氮的方法，其特征在于，至少包括如下步骤：
（1）将权利要求1-3任一所述的大豆发酵芽孢杆菌Bacillus glycinifermentans YY8制备的液体菌剂接种至河道水体，所述接种的接种量为河道水体体积的0.1~5%；
（2）在温度为5~50 ℃、pH值为5~9、DO值为0~0.5 mg/L条件下进行河道水体的脱氮处理。
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