CN113151063B - 弗氏柠檬酸杆菌as11及其在污水处理中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物技术领域，尤其涉及微生物废水处理技术领域。本发明公开了一株弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)AS11，其保藏编号为CGMCC No.21283。该菌株已于2020年12月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称为CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号是CGMCC No.21283。该菌株能够在好氧条件下，实现氨氮、总氮和COD的同步去除。

Description

弗氏柠檬酸杆菌AS11及其在污水处理中的应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，尤其涉及微生物废水处理技术领域。

背景技术

我国淡水资源(包括河流、湖泊、各大型水利工程等地表水以及地下水等)中经检测超标的主要污染指标物质包括化学需氧量(COD)、氨氮(NH₄-N)、总氮(TN)和总磷(TP)等。其中氮元素具有多种污染物存在形式且去除难度较高，并且当较高浓度的氨和亚硝酸盐等含氮污染物排放到环境中时，一方面会造成水体的富营养化，另一方面也会对多种生物产生生物毒性，因此脱氮理论与技术一直以来都是污水处理领域的研究热点。

生物脱氮是目前污水氮素去除最为经济有效的方式。传统生物脱氮工艺包括好氧自养硝化和厌氧异养反硝化两个过程，但存在以下缺点：(1)自养硝化细菌生长缓慢、环境适应性差、抗冲击负荷弱，并且容易被高浓度氨氮和亚硝态氮抑制。(2)硝化和反硝化两个反应在时间和空间上无法统一，增加了投资运行成本。

异养硝化好氧反硝化是一种新型脱氮工艺。它能够实现在一个反应器内同时实现硝化和反硝化作用，完成碳氮污染物的同步去除，缩短了反应周期，节省了空间并降低运行成本。目前，许多异养硝化好氧反硝化菌株被分离筛选，比如Bacillus subtilis、Pseudomonas stutzeri、Klebsiella pneumoniae、Alcaligenes faecalis等。但目前所分离的大多数菌株的适宜生长条件较为苛刻，对于一些特殊类型的废水(如酸碱废水、高盐废水、高氨氮废水)脱氮应用有限，而对于具有耐盐、耐酸碱、高浓度氨氮去除和同时对养猪废水COD和氨氮具有高去除率的弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一株弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)AS11，其保藏编号为CGMCC No.21283。该菌株已于2020年12月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，其地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌株保藏编号为CGMCC No.21283。

本发明的有益效果在于：

1.本发明提供的弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)AS11在生活污水、畜禽养殖污水等类型的污水微生物处理方面具有良好效果，其不仅对氨氮、总氮有很好的去除效果，同时也能去除水体中大部分的COD，从而实现污水同步脱氮除碳，极大地简化了脱氮工艺流程，节约了处理空间与成本。

2.本发明的菌株AS11具有广泛的pH适应性，在5-10.5的pH范围内都能进行高效的氨氮去除。

3.本发明的菌株AS11具有耐盐特性，在20g/L的盐浓度下其氨氮去除率仍能达到90％以上。

4.本发明所提供的菌株AS11能够在初始氨氮浓度为465mg/L养猪废水的脱氮过程中，好氧处理72h后氨氮去除率达95.7％，TN去除率达76.3％，COD去除率为64.4％，实现了高浓度氨氮污水的快速脱氮处理。

附图说明

图1为弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)AS11的生长和异养硝化特性图。

图2为弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)AS11在不同pH下的生长和脱氮特性图。

图3为弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)AS11在不同盐度下的生长和脱氮特性图。

图4为弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)AS11在未灭菌合成废水中的脱氮性能图。

图5为弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)AS11在灭菌生活污水中的脱氮性能图。

图6为弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)AS11在灭菌养猪废水中的脱氮性能图。

具体实施方式

实施例中所用培养基如下：

LB培养基：酵母浸出物5g，胰蛋白胨10g，氯化钠10g，蒸馏水1L。

异养硝化培养基：氯化钠4g，磷酸氢二钠2.66g，磷酸二氢钾1g，柠檬酸钾4.41g，氯化铵0.38g，微量元素溶液3mL，蒸馏水1L，自然pH。

合成废水：磷酸氢二钠4.78g，磷酸二氢钠1.24g，氯化钠4g，七水硫酸镁0.08g，柠檬酸三钠4.08g，氯化铵0.305g，微量元素溶液3mL，蒸馏水1L，自然pH。

微量元素溶液：七水硫酸镁3g，一水硫酸锰3g，七水硫酸锌3g，硼酸1.12g，七水硫酸亚铁0.3g，二水氯化钙0.6g，蒸馏水1L。

实施例1

菌株的分离与鉴定：

富集培养：样品为2020年4月由曹先贺采集自北京某污水处理厂的好氧段活性污泥，取充分混合的活性污泥20mL置于180mL0.2％氯化钠溶液中悬浮，取5mL悬浮液置于装有100mL异养硝化培养基的250mL锥形瓶中，在30℃、180rpm条件下进行驯化富集培养。驯化以48h为一周期。每周期结束后取10mL富集液加入新的100mL异养硝化培养基中继续进行富集培养，如此连续富集培养5个周期。期间检测培养液中氨氮的去除情况。

取富集5代后的培养液，用无菌水按照10^-3-10^-7的不同比例梯度稀释，每个梯度取100μL稀释液涂布到异养硝化固体培养基上，置于生化培养箱中30℃培养48h，观察菌落生长状况，从中挑选形态各异的单菌落，用平板划线法分别在异养硝化固体培养基上划线，并在同一条件下培养48h。然后再挑选单菌落进行多次分区划线纯化，直到获得纯菌株，将纯化后的菌株置于20％甘油中在-80℃冰箱冷冻保藏备用。

菌株筛选：用接种环分别挑取纯化后的菌株接种至灭菌后的LB液体培养基中，在30℃、180rpm条件下培养24h后，按照5％(v/v)的接种量吸取一定量的菌液在4000rpm条件下离心5min后收集菌体，用无菌水洗涤后接种于装有50mL异养硝化培养基的150mL锥形瓶中，在30℃、180rpm摇床中培养72h，并分别于12h、24h、36h、48h、60h和72h取样检测培养液中的NH₄-N、TN和COD含量。从中筛选出具有异养硝化功能的菌株。

经上述分离纯化过程得到一株异养硝化-好氧反硝化细菌AS11，该菌形态特征为短杆状，菌体大小为(0.3-0.5)μm×(0.8-1.3)μm，不产芽孢，菌落为圆形，边缘整齐光滑，在LB培养基上呈乳白色微微发黄，为革兰氏阴性好氧菌。

对所得菌株进行分子生物学鉴定，通过细菌16S rDNA序列(SEQ ID NO.1)PCR扩增后进行测序比对。

扩增引物为27F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG，1492R：TACGGYTACCTTGTTACGACTT；

反应体系为：10×Buffer 2μL，2.5mM dNTP 1.5μL，Primer1 1μL，Primer2 1μL，模板1μL，酶0.3μL，水13.2μL，总体积20μL；

反应条件为：95℃预变性5min，30cycle的95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1.5min，72℃延伸10min，4℃forever保温。

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，测序。

正反向测序并拼接后获得该菌的16S rDNA序列，将该序列于NCBI数据库进行Blast比对，比对结果显示，与弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)ATCC 8090同源性最高，达99.86％，菌株命名为弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)AS11，在本申请中以下简称菌株AS11。

弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)AS11已于2020年12月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，其地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.21283。

实施例2

菌株AS11的生长和异养硝化特性：

将菌株AS11在LB液体试管中活化培养24h后，按照2％的接种量(v/v)吸取一定量的菌液在4000rpm条件下离心5min后收集菌体，用无菌水洗涤后接种于装有50mL灭菌后的异养硝化培养基(初始氨氮浓度100mg/L，C/N＝20)的150mL锥形瓶中，在30℃、180rpm摇床中培养72h，期间每隔4h取样测量OD600值，并将样品在10000rpm离心10min去除菌体后取上清检测水样中COD、NH₄-N、NO₂-N、NO₃-N、TN的含量。

结果如下表和图1所示。在接种后的第8h菌株即开始生长，第12h后菌株快速生长，此时NH₄-N、TN和COD含量迅速下降。至20h时菌株生长基本结束，此时达到最大去除率，NH₄-N、COD和TN去除率分别为98.7％、94.2％、90.1％，并且处理全程没有亚硝态氮和硝态氮的产生。

氮平衡检测如下表所示，24h后总氮损失为40％，表明这部分氮通过反硝化作用生成气态氮化合物溢出水体。

实施例3

pH对菌株AS11生长和脱氮的影响：

调节异养硝化培养基的pH分别为3、4、5、7、8.5、9.5、10.5、11.5，将菌株AS11按照常规方法活化后，按照2％的接种量(v/v)吸取一定量的菌液在4000rpm条件下离心5min后收集菌体，用无菌水洗涤后接种于调节pH之后的异养硝化培养基中，在30℃、180rpm摇床中培养72h，检测最终各pH条件下的OD600值，并将样品在10000rpm离心10min去除菌体后取上清检测水样中COD、NH₄-N的含量。

结果如下表和图2所示。菌株AS11在5-10.5的pH范围内都能进行很好的生长及异养硝化作用，其氨氮去除率均在90％-93％之间，COD去除率在90％-100％之间。表明菌株AS11在较低或较高pH的污水处理中有广阔的应用前景。

实施例4

盐度对菌株AS11生长和脱氮的影响：

利用NaCl调节异养硝化培养基的盐度分别为5、20、40、60g/L，将菌株AS11按照常规方法活化后，按照2％的接种量(v/v)吸取一定量的菌液在4000rpm条件下离心5min后收集菌体，用无菌水洗涤后接种于调节盐度之后的异养硝化培养基中，在30℃、180rpm摇床中培养72h，检测最终各pH条件下的OD600值，并将样品在10000rpm离心10min去除菌体后取上清检测水样中NH₄-N含量。

结果如下表和图3所示。菌株AS11在5-20g/L的盐度范围内都能进行较好的生长及异养硝化作用，其氨氮去除率均在90％以上。当盐度为达到40g/L及以上时，菌株的生长及氨氮去除率均被严重抑制，因此菌株AS11在20g/L及以下盐度的污水处理中有较好的应用前景。

实施例5

菌株AS11在合成废水中的脱氮性能：

将菌株AS11进行常规活化后按照2％(v/v)的比例接种到未灭菌的合成废水中，该合成废水的初始COD为1600mg/L，初始氨氮为80mg/L。在30℃、180rpm摇床中进行好氧处理，同时设置不接菌的合成废水作为对照组，每隔12h检测污水中的氨氮、TN和COD含量，结果如下表和图4所示。

结果显示，在处理48h后，AS11处理组的氨氮、TN和COD的去除率分别为92.4％、66.4％、77.8％，而对照组氨氮、TN和COD含量并没有明显降低。表明菌株AS11在中低氨氮浓度的污水脱氮处理中具有良好的应用前景。

实施例6

菌株AS11在灭菌生活污水中的脱氮性能：

通过添加柠檬酸盐将实际生活污水(初始氨氮含量约100mg/L)的C/N比调整在20左右(初始COD含量约1980mg/L)后进行灭菌处理，将菌株AS11进行常规活化后按照2％(v/v)的比例接种到灭菌后的生活污水中，在30℃、180rpm摇床中进行好氧处理，每隔24h检测污水中的氨氮、TN和COD含量，结果如下表和图5所示。

结果显示，在接种后的24h内菌株AS11即能够去除生活污水中绝大部分的氨氮及COD，24h COD和氨氮去除率达到86.8％、88.1％，同时总氮去除率达75％以上，48h后氨氮去除率达90％，总氮去除率达82.5％，COD去除率达100％，说明菌株AS11在中低氨氮浓度的生活污水脱氮处理中具有良好的应用前景。

实施例7

菌株AS11在灭菌养猪废水中的脱氮性能：

实验室用养猪废水的预处理方法为，将采集自北京大兴某养猪场的新鲜猪尿与自来水按照1:4的比例混匀，再添加质量分数为5％的新鲜猪粪搅拌均匀，静置24h后取上层液体作为实验室养猪废水备用。

通过添加柠檬酸盐将实际养猪废水(初始氨氮含量约465mg/L)的C/N比调整在20左右(初始COD含量约11700mg/L)后进行灭菌处理，将菌株AS11进行常规活化后按照5％(v/v)的比例接种到灭菌后的养猪废水中，在30℃、180rpm摇床中进行好氧处理，每隔36h检测污水中的氨氮、TN和COD含量，结果如下表和图6所示。

结果显示，在菌株AS11接种后的36h，氨氮含量下降较缓慢，即从465mg/L下降至417mg/L，COD从11700mg/L下降至11400mg/L，说明该时间段菌株处在一个适应期；到第72h氨氮迅速降至19.8mg/L，COD降至4170mg/L，72h氨氮去除率达95.7％，COD去除率为64.4％，TN去除率达81.3％，其中出水氨氮浓度已达到我国《畜禽养殖业污染物排放标准(GB18596-2001)》的要求。说明菌株AS11在中高氨氮浓度的畜禽养殖污水脱氮处理中具有良好的应用前景。

以上所述仅为本发明示意性的具体实施方式，并非用以限定本发明的范围。任何本领域的技术人员，在不脱离本发明的构思和原则的前提下所做出的等同变化与修改，均应属于本发明的保护范畴。

序列表

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 弗氏柠檬酸杆菌AS11及其在污水处理中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1406

<212> DNA

<213> 弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)

<400> 1

cgccctcccg aaggttaagc tacctacttc ttttgcaacc cactcccatg gtgtgacggg 60

cggtgtgtac aaggcccggg aacgtattca ccgtggcatt ctgatccacg attactagcg 120

attccgactt catggagtcg agttgcagac tccaatccgg actacgacat actttatgag 180

gtccgcttgc tctcgcgagg tcgcttctct ttgtatatgc cattgtagca cgtgtgtagc 240

cctactcgta agggccatga tgacttgacg tcatccccac cttcctccag tttatcactg 300

gcagtctcct ttgagttccc ggcctaaccg ctggcaacaa aggataaggg ttgcgctcgt 360

tgcgggactt aacccaacat ttcacaacac gagctgacga cagccatgca gcacctgtct 420

cagagttccc gaaggcacca aagcatctct gctaagttct ctggatgtca agagtaggta 480

aggttcttcg cgttgcatcg aattaaacca catgctccac cgcttgtgcg ggcccccgtc 540

aattcatttg agttttaacc ttgcggccgt actccccagg cggtcgactt aacgcgttag 600

ctccggaagc cacgcctcaa gggcacaacc tccaagtcga catcgtttac ggcgtggact 660

accagggtat ctaatcctgt ttgctcccca cgctttcgca cctgagcgtc agtctttgtc 720

cagggggccg ccttcgccac cggtattcct ccagatctct acgcatttca ccgctacacc 780

tggaattcta cccccctcta caagactcta gcctgccagt ttcggatgca gttcccaggt 840

tgagcccggg gatttcacat ccgacttgac agaccgcctg cgtgcgcttt acgcccagta 900

attccgatta acgcttgcac cctccgtatt accgcggctg ctggcacgga gttagccggt 960

gcttcttctg cgagtaacgt caatcgytgc ggttattaac cacaacgcct tcctcctcgc 1020

tgaaagtact ttacaacccg aaggccttct tcatacacgc ggcatggctg catcaggctt 1080

gcgcccattg tgcaatattc cccactgctg cctcccgtag gagtctggac cgtgtctcag 1140

ttccagtgtg gctggtcatc ctctcagacc agctagggat cgtcgcctag gtgagccgtt 1200

accccaccta ctagctaatc ccatctgggc acatccgatg gcaagaggcc cgaaggtccc 1260

cctctttggt cttgcgacgt tatgcggtat tagctaccgt ttccagtagt tatccccctc 1320

catcgggcag tttcccagac attactcacc cgtccgccac tcgtcaccca aggagcaagc 1380

tcctctgtgc taccgttcga cttgca 1406

Claims (4)

1.弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)AS11，其保藏编号为CGMCC No.21283；其特征在于，所述弗氏柠檬酸杆菌AS11能去除污水中COD、氨氮或/和总氮，其中，所述污水的盐度范围为5-20g/L。

2.一种微生物制剂，其活性成分为权利要求1所述的弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)AS11。

3.依据权利要求1所述的弗氏柠檬酸杆菌AS11，其特征在于，所述污水为生活污水或养猪废水。

4.依据权利要求3所述的杆菌，其特征在于，所述污水的pH值范围为5-10.5。

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