CN104611279B - 一种红城红球菌lh‑n13及其微生物菌剂与用途 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种耐盐好氧反硝化细菌红城红球菌（Rhodococcus erythropolis）LH‑N13，其保藏编号CGMCC No.6974。本发明还公开了上述红城红球菌的微生物菌剂以及其在高盐含氮废水中的应用。本发明的菌株筛选于盐场污泥，对高盐度的耐受能力强，在盐度（以NaCl计）≤15%的条件下，可以去除污水中的硝态氮和亚硝态氮，以该菌株制备的微生物制剂，能够直接用于高盐废水的脱氮，可以有效解决高盐环境下生物脱氮总氮难以达标的难题，具有良好的应用前景。本发明的耐盐反硝化细菌红城红球菌LH‑N13或其制成的菌剂可用于食品加工、生物酿造、农药、皮革等高盐含氨氮废水的生物处理。
Description
技术领域
本发明涉及一种耐盐好氧反硝化红城红球菌（Rhodococcus erythropolis）LH-N13、其微生物菌剂以及在高盐含氮废水处理中的应用。
背景技术
在海产品加工、腌制品加工、化工、石油和养殖等行业中，外排含氮废水大多具有高盐的特点。比如金属精炼废水含有大量的硝酸盐氮、海产品加工废水普遍含有大量的蛋白质和氨氮。高盐废水一般是指总含盐质量分数至少1%的废水，海水代用等众多的工业实践过程中，含盐量有时甚至高达15~30%，目前高盐废水产出途径和产量不断增加 ，废水水量以3％的年增长速率逐年增长，高含盐废水如果不能达标排放，则会污染地表、土壤、沿海和河口等，引发诸如富营养化等各种环境问题和生态问题。
高盐度对常规生物处理系统中微生物的正常代谢会产生不利的影响，主要包括：渗透压偏高，微生物细胞质壁分离，使生长受到阻碍甚至死亡；微生物代谢酶活性受阻；水体密度增加，影响污泥沉降效果等。因此普通生化处理对高盐含氮废水难以稳定运行，一直是污水处理的瓶颈。而很多企业利用清水稀释至0.8%以下进行处理，这样不仅造成水资源的浪费，同时也增加处理设施及排污总量。因此，如何有效、经济地实现高含盐废水生物脱氮处理成为亟待解决的科学和工程难点问题，而实现有效、经济的高含盐废水生物脱氮的关键是找到高效嗜（耐）盐微生物。
嗜（耐）盐微生物的存在为高含盐废水生物脱氮处理提供新的思路，它是一类生活在高盐环境内的极端微生物，广泛存在于盐场、盐湖、土壤等高盐环境内。根据盐度生存范围（1~30%），嗜盐微生物分为耐盐菌、轻度嗜盐菌、中度嗜盐菌和极端嗜盐菌。这些嗜（耐）盐微生物在长期的进化过程中形成独特的高盐环境中生存的能力，具有极为特殊的生理结构和代谢机制。嗜盐微生物的细胞膜、细胞壁结构性成分和功能性成分的稳定性、反应动力学、酶系的性质、代谢途径及信息传递、蛋白质核酸成分及构象等方面为适应高盐环境而具有特异性。这些耐盐机制保证了嗜盐微生物在高盐环境内进行新陈代谢和生长。
另外，在对高盐废水的生物脱氮性能研究中，多数是针对于氨氮的去除，但对总氮的去除研究较少，在很多的污水处理厂及实际工程应用中，往往是氨氮达标，而硝酸盐和亚硝酸盐由于缺少外加碳源、水力停留时间不足或是内回流不够等种种原因不能够有效去除，从而反应为总氮不达标，而随着废水排放标准的不断完善，总氮指标已进入标准，并且要求越来越严，硝酸盐和亚硝酸盐的有效去除成为亟待解决的问题。
近年来，筛选出不同种属的微生物菌株，在耐盐脱氮废水治理方面取得了一定的成果。如中国公开专利文献CN 102703350 B公开一株高盐兼具异养硝化-好氧反硝化与除磷功能的高地芽孢杆菌（Bacillus alitudinis），可以利用有机碳为唯一碳源，氨氮为唯一氮源进行新陈代谢，通过异养硝化-好氧反硝化作用把氨氮直接转为气体产物，达到脱氮的目的。中国公开专利文献CN 102747014 A、中国公开专利文献CN 102703349 A分别公开了能够在高盐条件下进行生物脱氮的盐水弧菌菌株、小短杆菌菌株及其应用，两株菌均能在溶解氧为2-6mg/L 的含氮废水中即可生物脱氮。但对于高盐条件下反硝化脱氮研究较少，高盐废水环境中反硝化脱除硝态氮及亚硝氮的微生物菌株研究未有文献报道。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题是针对现有技术的不足，提供一种能够在好氧条件下有效降解高盐废水中的硝态氮和亚硝态氮的耐盐好氧反硝化细菌红城红球菌LH-N13。
本发明要解决的另一个技术问题是提供上述耐盐好氧反硝化细菌红城红球菌LH-N13的制成的微生物菌剂。
本发明要解决的再一个技术问题是提供上述耐盐好氧反硝化细菌红城红球菌LH-N13及其制成的微生物菌剂的用途。
本发明红城红球菌LH-N13，根据其形态特征和生理生化特征及其16S rRNA 基因序列在Genbank 中的检索结果，分类命名为红城红球菌（Rhodococcus erythropolis）LH-N13，该菌株已于2012年12月10日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCC No. 6974；保藏单位地址：北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，电话：010-64807355。本发明所述红城红球菌LH-N13的16S rRNA基因序列长度为1422bp，如序列表所示。
本发明所述的耐盐好氧反硝化细菌红城红球菌LH-N13从盐场污泥样品中分离获得。该菌株适宜生长的盐度为1%~15%（以NaCl计），优选≤10%，其生长以NO3 -或NO2 -为电子受体。红城红球菌LH-N13可以在高盐含氮废水中的应用。其中，耐盐好氧反硝化细菌红城红球菌LH-N13在高盐条件下，以好氧反硝化的形式进行脱氮，其能够应用的高盐废水盐浓度为1%~10%（以NaCl 计），优选盐度≤5%。
本发明还公开了一种微生物菌剂，该菌剂包含以上技术方案所述的红城红球菌（Rhodococcus erythropolis）LH-N13。菌剂的制备方法可以采用现有技术中公开的常规菌剂的制备方法。
本发明与现有技术相比，其有益效果如下：
本发明从盐场污泥中通过脱氮能力驯化、筛选获得耐盐好氧反硝化细菌红城红球菌（Rhodococcus erythropolis）LH-N13，该菌株耐受高渗透压及高盐环境，1%~15%的盐浓度不影响其脱氮效果，能够有效脱除硝态氮及亚硝氮，将其接入耐盐硝化污泥中，实现高盐含氮废水的同步硝化反硝化，能够解决高盐条件下总氮难达标的问题。本发明的耐盐反硝化细菌红城红球菌LH-N13或其制成的菌剂可用于食品加工、生物酿造、农药、皮革等高盐含氨氮废水的生物处理。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1，一种红城红球菌（Rhodococcus erythropolis）LH-N13，其保藏编号CGMCC No. 6974。
实施例2，一种红城红球菌的微生物菌剂，该微生物菌剂包含实施例1所述的红城红球菌（Rhodococcus erythropolis）LH-N13。采用常规方法制得。
实施例1所述的红城红球菌（Rhodococcus erythropolis）LH-N13或者实施例2所述的一种红城红球菌的微生物菌剂可以用于处理含氨氮废水。特别是高盐含氨氮废水。在处理含氨氮废水时，通过好氧反硝化的形式进行脱氮。所述高盐废水的盐浓度以NaCl 计为1%~10%，优选≤5%。
实施例3，红城红球菌（Rhodococcus erythropolis）LH-N13的筛选及鉴定方法：
（1）取某盐场污泥样品1g，置于装有250ml含氮培养基（(NH4)2SO4 0.5g；葡萄糖1g；Na2CO3 0.25g；FeCl2 0.05g；MgSO4 0.02g；MnSO4 0.01g ；NaCl(≤10%)；pH：7.0~8.0、蒸馏水1L）的锥形瓶中，150rpm，30℃摇床培养，2d为一个周期，每周期末转接到新鲜培养基，培养三个周期，驯化富集菌体；
（2）培养结束后，采用平板稀释法进行菌株的初筛。首先将富集的菌体进行等比例稀释，分别稀释成10-1、10-2、10-3、…. 10-7的菌悬液。然后取10-5、10-6、10-7的菌悬液各0.1mL，均匀涂布在预先制备好的高盐反硝化固体培养基（琥珀酸钠0.5g、KNO3 0.3g，NaNO20.2g，NaCl(≤10%)、琼脂：15~20g、pH：7.0~8.0、蒸馏水1L）。
（3）菌株复筛。将上述高盐反硝化固体培养基长出的单菌落反复进行平板划线，直到确保平板上的单菌落形态一致，取单菌落接种于高盐反硝化固体培养基上进行斜面上保藏。
（4）菌株鉴定：委托专业的生物测序公司，进行菌株16S rRNA基因序列测定，最后将测序结果提交到Genbank数据库进行检索，结合菌株的形态特征和生理生化特征，鉴定为红城红球菌（Rhodococcus erythropolis）LH-N13。并于2012年12月10日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.6974。
实施例4，红城红球菌（Rhodococcus erythropolis）LH-N13在不同盐度下的好氧反硝化脱氮实验：
将保藏在高盐反硝化固体斜面的纯菌株接种至实施例3中的液体培养基中进行活化，离心制备菌体，放于4℃冰箱保存待用。
以葡萄糖为碳源，硝酸钾和亚硝酸钠为氮源，磷酸盐为磷源，在1000mL锥形瓶中配制五组300mL液体培养基，其中COD在500~1000mg/L左右，硝态氮浓度在100mg/L左右，亚硝态氮浓度50mg/L左右，加入不同质量的NaCl使其盐度分别为1%、3%、5%、7%、9%。最后加入混匀的菌悬液，与对照普通活性污泥（无盐分）一起放置于30℃ 170rpm摇床培养36h后，测定上清液中的硝态氮、亚硝氮及总氮浓度，结果如表1所示：
表1 进、出水氮浓度及去除率
从表1可以看出，从盐度1%提高至9%时，本发明的红城红球菌LH-N13仍具有较高的总氮去除效率，技术效果优于现有的技术水平。
实施例5，在盐分为3%时，耐盐好氧反硝化菌株红城红球菌LH-N13在不同硝态氮浓度的脱氮实验：
将保藏在高盐反硝化固体斜面的纯菌株接种至实施例3中的液体培养基中进行活化，离心制备菌体，放于4℃冰箱保存待用。
在盐分为3%时，以葡萄糖为碳源，硝酸钾为氮源，磷酸盐为磷源，在1000mL锥形瓶中配制五组300mL液体培养基，其中COD在500~2000左右，分别配制硝态氮浓度为50mg/L左右、100mg/L左右、150mg/L左右、200mg/L左右、250mg/L左右。最后加入混匀的菌悬液，与对照普通活性污泥（无盐分）一起放置于30℃ 170rpm摇床培养36h后，测定上清液中的硝态氮浓度，结果如表2所示：
表2 进、出水硝态氮浓度及去除率
从表2可以看出，在盐度为3%时，硝态氮浓度从52.80mg/L提高至242.38mg/L时，本发明专利的红城红球菌LH-N13仍具有较高的反硝化效率，技术效果优于现有的技术水平。
实施例6，耐盐好氧反硝化菌红城红球菌LH-N13处理高盐含氮废水实验：
将保藏在高盐固体斜面的纯菌株接种至实施例3中的液体培养基中进行活化，离心制备菌体，将浓缩菌体接入扩大培养基，在30℃，150rpm 的条件下培养36h，然后按5％的比例接入富含硝态氮和亚硝态氮的实际高盐废水中，盐浓度5%左右，废水中硝态氮浓度55.4mg/L，亚硝态氮浓度35.4mg/L，总氮浓度101.4mg/L，废水总主要的总氮为硝态氮和亚硝态氮。同时设置两个对照组，一组接入耐盐活性污泥，一组接入具有反硝化作用的污泥。将摇瓶置于30℃，150rpm，培养36小时后，取上清液测定总氮，接入耐盐好氧反硝化菌红城红球菌LH-N13的出水总氮5.6mg/L，总氮去除率为94.5％，且污泥性能良好；接入耐盐活性污泥组出水总氮87.6mg/L，污泥状态良好，说明耐盐活性污泥能够适应该废水，但不能很好的脱氮；接入具有反硝化作用的污泥组出水总氮62.5mg/L，但污泥有所解体，说明虽具有一定的脱氮效果，但污泥不能很好的适应高盐环境。
由上述对比试验可以看出耐盐耐盐好氧反硝化菌红城红球菌LH-N13对高盐含氮实际废水有很好的处理效果。
SEQUENCE LISTING
<110> 中蓝连海设计研究院
<120> 一种红城红球菌LH-N13及其微生物菌剂与用途
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
〈210〉1
〈211〉1422
〈212〉DNA
〈213〉红城红球菌（Rhodococcus erythropolis）LH-N13
〈400〉1
taccatgcag tcgagcggta aggcctttcg gggtacacga gcggcgaacg ggtgagtaac 60
acgtgggtga tctgccctgc acttcgggat aagcctggga aactgggtct aataccggat 120
atgacctcct atcgcatggt gggtggtgga aagatttatc ggtgcaggat gggcccgcgg 180
cctatcagct tgttggtggg gtaatggcct accaaggcga cgacgggtag ccgacctgag 240
agggtgaccg gccacactgg gactgaaaca cggcccagac tcctacggga ggcagcagtg 300
gggaatattg cacaatgggc gaaagcctga tgcagcgacg ccgcgtgagg gatgacggcc 360
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attgacgggg gcccgcacaa gcggcggagc atgtggatta attcgatgca acgcgaagaa 900
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tatacaggtg gtgcatggct gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc 1020
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agggagccgt cgaaggtggg atcggcgatt ggacgaagtc ga 1422
Claims (7)
1.一种红城红球菌（Rhodococcus erythropolis）LH-N13，其特征在于：其保藏编号CGMCC No. 6974。
2.一种红城红球菌的微生物菌剂，其特征在于：该微生物菌剂包含权利要求1所述的红城红球菌（Rhodococcus erythropolis）LH-N13。
3.权利要求1所述的红城红球菌（Rhodococcus erythropolis）LH-N13或者权利要求2所述的一种红城红球菌的微生物菌剂在处理含氨氮废水中的用途。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述的含氨氮废水为高盐含氨氮废水。
5.根据权利要求3或4所述的用途，其特征在于：在处理含氨氮废水时，通过好氧反硝化的形式进行脱氮。
6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述高盐废水的盐浓度以NaCl 计为1%~10%。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述高盐废水的盐浓度以NaCl 计为≤5%。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |