CN102747014A

CN102747014A - 一株高盐生物脱氮的盐弧菌菌株及其在废水处理中的应用

Info

Publication number: CN102747014A
Application number: CN2012101712979A
Authority: CN
Inventors: 邓若男; 陈倩; 付东康
Original assignee: BEIJING GAIYA TECHN CENTER Co Ltd
Current assignee: BEIJING GAIA ENVIRONMENTAL TECHNOLOGY Co.,Ltd.
Priority date: 2012-05-29
Filing date: 2012-05-29
Publication date: 2012-10-24
Anticipated expiration: 2032-05-29
Also published as: CN102747014B

Abstract

本发明公开了一种能够在高盐条件下进行生物脱氮的盐水弧菌菌株及其应用。本发明提供的盐弧菌（Salinivibrio）菌株已于2012年3月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC No.5946。在盐度（以NaCl计）3%-10%下，将该菌株置于溶解氧为2-6mg/L的含氮废水中即可生物脱氮。该菌株对高盐度的耐受能力强，在高盐条件下生长良好，并且同时具备异养硝化和好氧反硝化的能力。在高盐、好氧条件下，该菌株能够进行同步硝化反硝化，高效、彻底地去除污水中的总氮，从而有效解决高盐条件下生物脱氮难以进行的重大难题，具有良好的应用前景。

Description

一株高盐生物脱氮的盐弧菌菌株及其在废水处理中的应用

技术领域

本发明涉及生物脱氮领域，特别涉及一种用于高盐生物脱氮的盐弧菌菌株（Salinivibrio）及其应用。

背景技术

随着社会的进步和经济的发展，我国各类水体富营养化污染日益严重，蓝藻赤潮问题频发，对水体安全和人体健康造成了巨大的损害。氮、磷等营养物质过剩是引发水体富营养化的根本原因，一般认为当水体中N浓度>0.2mg/l、P浓度>0.02mg/l时就可能出现富营养化现象。生活污水是氮、磷等营养物质的最大排放源；为此，我国一直致力于开发各种各样的生活污水脱氮除磷工艺以从根本上防止富营养化问题的发生。

生物脱氮技术是目前应用最广的污水脱氮技术，基本原理是在微生物的作用下将污水中的有机氮和氨态氮转化为N₂的过程。其中包括硝化和反硝化两个反应过程。硝化反应是由一群自养好氧微生物完成的，它分为两个阶段，分别由亚硝酸菌和硝酸菌两种菌完成。第一步是由亚硝酸菌将NH₄ ⁺氧化为NO₂ ^-，第二步是由硝酸菌将NO₂ ^-进一步氧化为NO₃ ^-。反硝化反应是由一群异养型兼性厌氧微生物完成的，是指在无氧或低氧条件下，反硝化细菌将NO₂ ^-和NO₃ ^-还原为氮气的过程。由上述基本原理可以看出，生物脱氮过程本身就存在着矛盾：硝化反应需要较长的污泥龄和好氧条件，大量有机物存在时会造成硝化细菌的流失；而反硝化细菌则需要较短的污泥龄和缺氧条件，高度依赖有机物为其脱氮过程提供电子供体。因硝化细菌和反硝化细菌生理机制的差异导致了基于该理论的污水脱氮技术工艺冗长，能耗大，占地面积大，且对环境变化非常敏感，尤其在高盐条件下脱氮效率不佳。

高盐度对常规生物处理系统中微生物的正常代谢会产生不利的影响，主要包括：渗透压偏高，微生物细胞质壁分离，使生长受到阻碍甚至死亡；微生物代谢酶活性受阻；水体密度增加，影响污泥沉降效果等。这些原因会导致微生物对污染物的去除率明显降低，出水难以达标。

近些年来，有研究者通过选择培养驯化出耐高盐的菌种，以及从自然界高盐环境中分离出耐盐菌和嗜盐菌，将其应用于高盐废水处理，取得了一定处理效果。但就现有研究来看，高盐废水中的生物脱氮效果并不十分理想。

本申请的发明人分离出一株盐弧菌（Salinivibrio），发现其能够耐高盐并且兼具异养硝化-好氧反硝化的能力；利用这类具有特殊性质的细菌的生理特性和代谢机理，基于硝化过程可以是异养细菌的生理行为，而反硝化过程可以在好氧条件下进行，使得可在高盐条件的同一好氧环境下完成脱氮过程，能够较好克服传统生物处理过程中存在的矛盾。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高盐生物脱氮的盐弧菌菌株及其在高盐废水处理中的应用。

本发明提供的盐弧菌（Salinivibrio sp.）菌株已于2012年3月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），保藏号为CGMCC No.5946。保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所 100101

本发明所提供的菌株，具有以下表型特征：在25-35℃下，营养琼脂培养基上培养16-32h后，菌落表面光滑，无色素；通过革兰氏染色后在显微镜下呈阴性，菌体呈杆状，直或弯曲成弧状，菌落较小，扁平，半透明。

该菌株的16S rRNA基因序列特征：其16S rRNA具有如序列表中序列1所示的核苷酸序列，序列长度为1409bp。

根据其形态特征和生理生化特征及其16S rRNA基因序列在Genbank中的检索结果，鉴定该菌株为盐弧菌（Salinivibrio）。根据该菌株耐盐性能实验结果，盐弧菌（Salinivibrio）耐盐范围（以NaCl计）为1%-13%。

本发明所提供的盐弧菌（Salinivibrio）能够在高盐条件下，以有机物为电子受体，NH₄ ⁺为电子供体，将NH⁴ ₊氧化为NO₂ ^-或NO₃ ^-；能够在好氧的条件下，以有机物为电子供体，NO₂ ^-或NO₃ ^-为电子受体，将其还原为氮气，实现在高盐条件下脱氮的目的。

其所述废水的盐度（以NaCl计）范围为1%-13%，优选为3%-10%

所述废水的接种量可为5-15%，优选为10%。

所述废水的碳氮比可为3.7-9，优选为9。

所述废水的温度可为20-40℃，优选为20-30℃，更优选为30℃。

所述废水的pH可为6.5-8.0，优选为6.5-7.5，更优选为6.5-7.0。

本发明的盐弧菌（Salinivibrio）及其应用与现有技术相比较有如下有益效果：

（1）本发明的盐弧菌（Salinivibrio）菌株对高盐的耐受力强，能够在高盐、好氧条件下以氨氮为唯一氮源生长，并进行异养硝化-好氧反硝化作用，利用该菌株的这种特性，可以将其直接接种于高盐含氮废水，只需要通过好氧阶段即可实现总氮的快速去除。该菌株的应用可以解决高盐条件下微生物代谢受阻，硝化反应难以进行的问题；另外，不需设置缺氧反硝化段即可实现总氮的有效去除，简化了工艺流程，节约了基建和运行费用，具有巨大的经济效益和环境效益。

（2）本发明的盐弧菌（Salinivibrio）菌株适用于高盐度废水的脱氮处理，应用前景广阔，具有很好的社会效益。

（3）本发明的盐弧菌（Salinivibrio）菌株在30℃下接种到初始氨氮浓度为40mg/L、盐度（以NaCl计）为3%的废水中，可以利用葡萄糖为唯一碳源，氨氮为唯一氮源进行新陈代谢。经过24h，氨氮的去除率达到93.6%，且无硝氮与亚硝氮的明显积累。

（4）本发明的盐弧菌（Salinivibrio）菌株生长盐度（（以NaCl计）范围为1-13%，在盐度为3-10%的范围内均能够生长良好并高效脱氮。

（5）本发明的盐弧菌（Salinivibrio）菌株在接种量较大约为10%时，脱氮性能较好。但即使在接种量较小约为5%时，仍能高效去除废水中的氮素，处理效果并不随接种量的降低而明显下降，这种特性也使得菌种在实际应用中经济可行。

下面结合具体实施方式对本发明进行详细描述。本领域的普通技术人员可以理解，实施例仅仅是举例说明的目的，本发明的范围并不以具体实施方法为限，而是由权利要求的范围加以限定。

附图说明：

图1为盐弧菌（Salinivibrio）菌株的显微镜照片

图2为盐弧菌（Salinivibrio）菌株在盐度（以NaCl计）为3%下对氨氮的降解曲线

图3为盐弧菌（Salinivibrio）菌株在盐度（以NaCl计）为3%下对磷酸盐的降解曲线

图4为盐弧菌（Salinivibrio）菌株在不同盐度下对氨氮的降解曲线

图5为盐弧菌（Salinivibrio）菌株在不同接种量时对氨氮的降解曲线

图6为盐弧菌（Salinivibrio）菌株在不同温度条件下的氨氮降解曲线

图7为盐弧菌（Salinivibrio）菌株在不同pH条件下的氨氮降解曲线

图8为盐弧菌（Salinivibrio）菌株在不同C/N条件下的氨氮降解曲线

具体实施方式：

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于一下实施例。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中，所述百分含量如无特殊说明，均为质量百分含量。

实施例中各种污染物的监测分析方法参考《水和废水监测分析方法》（第四版，中国环境科学出版社，2002）。温度和溶解氧通过便携式溶氧测定仪（YSI550A，USA）进行测定。污泥浓度（MLSS）和挥发性悬浮固体浓度（MLVSS）根据重量法测定。

实施例中使用的各种单位，统一采用国家标准。

实施例1.具有高盐异养硝化-好氧反硝化性能的盐弧菌（Salinivibrio）菌株的筛选

具体步骤如下：

1）将1mL盐水样（采集自天津汉沽盐场晒盐池）置于盛100mL液体培养基（每L含酵母浸膏：5g，胰蛋白胨：10g，NaCl：3%-10%，pH：7.0-7.5,121℃20min蒸汽灭菌）的250mL三角瓶中,30℃150r/min摇床培养5天,富集菌体；

2）采用倍比稀释法将富集菌体后的盐水样稀释成10^-1、10^-2、……10^-6各个梯度的菌悬液，取稀释度为10^-4、10^-5、10^-6的菌悬液各0.1ml，均匀涂布于预先制备好的高盐固体培养基（每L含酵母浸膏：5g，胰蛋白胨：10g，NaCl：3%-10%，琼脂：16-18g，pH：7.0-7.5,121℃20min蒸汽灭菌）10ml的固体平板上；

3）将平板置于培养箱中30℃恒温培养直至单菌落的形成。选取适当梯度的平板进行观察，对各个菌落的形态特征进行详细对比以识别出各个不同的单菌落；

4）挑取单菌落反复进行平板划线，直到确保平板上的单菌落形态一致，取单菌落接于高盐固体培养基斜面上保藏；

5）考察各个菌株对高盐度的耐受能力；

6）测定各个菌株在盐度（以NaCl计）分别为1%、3%、5%、8%、10%和13%时的脱氮性能；

7）由此分离出一株对高盐耐受能力强并且具有异样硝化-好氧反硝化能力的细菌——盐水弧菌株，并于2012年3月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），保藏号为CGMCC No.5946。

实施例2.菌株在盐度为3%的脱氮实验

以葡萄糖为碳源，氨氮为氮源，实施例1中所述盐弧菌（Salinivibrio）菌株对氨氮的去除能力测定。具体实施步骤如下：

将盐弧菌（Salinivibrio）菌株接种于100ml的盐度（以NaCl计）为3%的无机盐培养基中（每升含0.94g葡萄糖，0.153g NH₄Cl，0.035g KH₂PO₄，0.1gMgSO₄·7H₂O，0.006gFeSO₄·7H₂O，pH 7.0~7.5），于30℃150rpm的摇床中振荡培养。未接种菌悬液的培养基进行同等条件下的实验作为空白对照。于6h、12h、18h、24h、36h和48h取少量反应液，其中一部分直接用于测定菌体光密度，其余部分在8000rpm下离心10min，取上清液测定各种含氮化合物的浓度。

结果如图2、3所示，盐弧菌（Salinivibrio）菌株在高盐条件下生长良好，且对氨氮有较强降解能力。在24h内，菌株处于对数生长期，24h时氨氮的去除率达到最大，氨氮浓度值从最初的40mg/L下降至2.56mg/L。此外，在整个降解过程中，硝氮和亚硝氮的浓度无明显积累，废水中大部分的氨氮通过异养硝化-好氧反硝化作用直接转化为气体产物。因此，该菌株在高盐条件下仅经过好氧阶段就有效实现了氮素的彻底去除。

实施例3.菌株在不同盐度条件下的脱氮实验

以葡萄糖为碳源，氨氮为氮源，实施例中所述盐弧菌（Salinivibrio）菌株在不同盐度下对氨氮的去除能力测定。具体实施步骤如下：

将盐弧菌（Salinivibrio）菌株接种于盐度（以NaCl计）分别为3%、5%、8%、10%的100ml无机盐培养基中，于30℃150rpm的摇床中进行预培养。待菌株生长至对数生长期后期时，取10ml菌液接入新鲜的盐度（以NaCl计）分别为1%、3%、5%、8%、10%和13%的90ml无机盐培养基中，于30℃150rpm的摇床中进行振荡培养。未接种菌悬液的培养基进行同等条件下的实验作为空白对照。于6h、12h、18h、24h、36h和48h取少量反应液，其中一部分直接用于测定菌体光密度，其余部分在8000rpm下离心10min，取上清液测定各种含氮化合物的浓度。

结果如图4所示，该菌株在盐度（以NaCl计）分别为3%、5%、8%、10%时，均可以有效去除氨氮，在盐度为1%和13%时，菌株对氨氮的去除效果不理想。其中在盐度为3%时的脱氮性能最好，去除速率也较快，氨氮的最大去除率达到93.6%。而在一般认为当废水中含盐量超过20g/L时，用普通的淡水微生物无法进行处理。由此可见，该菌株为对高盐有良好耐受能力的耐盐菌，其能够在高盐条件下有效实现生物脱氮。

整个反应过程中没有硝酸盐氮的累积，只有微量的亚硝酸盐氮出现。

实施例4.菌株在不同接种量时的脱氮实验

将盐弧菌（Salinivibrio）菌株接种于100ml的盐度（以NaCl计）为3%无机盐培养基中，于30℃150rpm的摇床中进行预培养。待菌株生长至对数生长期后期时，分别取5ml、10ml、15ml菌液接入95ml、90ml、85ml的无机盐培养基中，于30℃150rpm的摇床中进行振荡培养。未接种菌悬液的培养基进行同等条件下的实验作为空白对照。于6h、12h、18h、24h、36h和48h取少量反应液，其中一部分直接用于测定菌体光密度，其余部分在8000rpm下离心10min，取上清液测定各种含氮化合物的浓度。

由图5可见，盐弧菌（Salinivibrio）菌株在接种量较大约为10%时，脱氮性能较好。但即使在接种量较小约为5%时，仍能高效去除废水中的氨氮，处理效果并不随接种量的降低而明显下降。该特性无疑使得菌株易于实际应用。

实施例5.菌株在不同温度条件下的脱氮实验

将盐弧菌（Salinivibrio）菌株接种于100ml的盐度（以NaCl计）为3%无机盐培养基中，于30℃150rpm的摇床中进行预培养。待菌株生长至对数生长期后期时，取10ml菌液接入新鲜的90ml无机盐培养基中,控制其培养温度分别为20℃、30℃和40℃，于150rpm 的摇床中进行振荡培养。未接种菌悬液的培养基进行同等条件下的实验作为空白对照。于6h、12h、18h、24h、36h和48h取少量反应液，其中一部分直接用于测定菌体光密度，其余部分在8000rpm下离心10min，取上清液测定各种含氮化合物的浓度。

由图6可见，盐弧菌（Salinivibrio）菌株在温度为30℃效果最好，不同温度下其脱氮性能相差较小，使得该菌种具备较宽的温度适应范围。

实施例6.菌株在不同pH条件下脱氮实验

将盐弧菌（Salinivibrio）菌株接种于100ml的盐度（以NaCl计）为3%无机盐培养基中，于30℃150rpm的摇床中进行预培养。待菌株生长至对数生长期后期时，取10ml菌液接入新鲜的100ml无机盐培养基中,调节培养基pH分别为6.5-7.0、7.0-7.5和7.5-8.0的范围内，于30℃150rpm的摇床中进行振荡培养。未接种菌悬液的培养基进行同等条件下的实验作为空白对照。于6h、12h、18h、24h、36h和48h取少量反应液，其中一部分直接用于测定菌体光密度，其余部分在8000rpm下离心10min，取上清液测定各种含氮化合物的浓度。

由图7可见，盐弧菌（Salinivibrio）菌株在不同pH条件下脱氮性能相差较大，48h脱氮率分别为88.6%、74.3%和18.3%，在pH为6.5-7.0时该菌种的脱氮性能最好，说明该菌株的最佳脱氮环境为中度偏酸性环境。

实施例7.菌株在不同C/N条件下的脱氮实验

将盐弧菌（Salinivibrio）菌株接种于100ml的盐度（以NaCl计）为3%无机盐培养基中，于30℃150rpm的摇床中进行预培养。待菌株生长至对数生长期后期时，取10ml菌液接入新鲜的90ml无机盐培养基中,调节其C/N分别为3.7、7.5和9，于150rpm的摇床中进行振荡培养。未接种菌悬液的培养基进行同等条件下的实验作为空白对照。于6h、12h、18h、24h、36h和48h取少量反应液，其中一部分直接用于测定菌体光密度，其余部分在8000rpm下离心10min，取上清液测定各种含氮化合物的浓度。

由图8可见，盐弧菌（Salinivibrio）菌株在不同C/N条件下脱氮性能相差较小，其中在C/N为9的时候脱氮性能最好，24h脱氮率达到93.6%，整个反应过程中没有硝酸盐氮的累积，只有微量的亚硝酸盐氮出现，这也有力证明了该菌株的异样硝化-好氧反硝化特性。

Claims

1.一种盐弧菌Salinivibrio，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.5946。

2.根据权利要求1所述的盐弧菌Salinivibrio，其特征在于：该盐水弧菌菌株的16S rRNA基因序列长度为1409bp，如序列表中序列1所示。

3.根据权利要求1或2所述的盐弧菌Salinivibrio，其特征在于：在30-40℃下，营养琼脂培养基上培养16-32h后，菌落表面光滑，无色素；通过革兰氏染色后在显微镜下呈阴性，菌体呈杆状，直或弯曲成弧状，大小为（0.6-1.2）μm×（1.5-6.0）μm，菌落较小，扁平，半透明。

4.根据权利要求1-3之一所述的盐弧菌Salinivibrio，其特征在于：能够以有机物为电子受体，NH₄ ⁺为电子供体，将NH₄ ⁺氧化为NO₂ ^-或NO₃ ^-；能够在高盐、好氧的条件下，以有机物为电子供体，NO₂ ^-或NO₃ ^-为电子受体，将其还原为氮气，从而实现在高盐条件下脱氮的目的。

5.根据权利要求1所述的盐弧菌Salinivibrio在废水处理中的应用，其特征是选用盐弧菌Salinivibrio对高盐废水进行处理，实现同步硝化反硝化过程，实现在高盐条件下脱氮的目标。

6.根据权利要求5所述的盐弧菌Salinivibrio的应用，其特征在于：其所述的高盐废水的盐度（以NaCl计）范围为1%-13%，优选为3%-10%。

7.根据权利要求5或6所述的盐弧菌Salinivibrio的应用，其特征在于：其所述的高盐废水的碳氮比范围为3.7-9，优选为9。

8.根据权利要求5-7之一所述的盐弧菌Salinivibrio的应用，其特征在于：其所述的高盐废水的pH范围为6.5-8.0，优选为6.5-7.5。

9.根据权利要求5-8之一所述的应用，其特征是利用盐弧菌Salinivibrio或以其为主要成份微生物制剂对废水进行处理，可在高盐、好氧环境下完成同步硝化反硝化过程，进而实现总氮的去除。