CN102978145B - 一株兼具异养硝化-好氧反硝化与除磷功能的喹啉降解菌qg6及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株兼具异养硝化-好氧反硝化与除磷功能的喹啉降解菌QG6及其应用。本发明的喹啉降解菌属于假单胞菌（Pseudomonas sp.），命名为QG6。该菌株可以利用喹啉作为唯一碳源、氮源和能源进行生长繁殖，能将100mg/L和150mg/L的喹啉在12h内降解完全；还可以利用有机碳为唯一碳源，氨氮为唯一氮源，通过异养硝化-好氧反硝化作用把氨氮直接转为气体产物，完成脱氮；还能在好氧条件下将无机磷摄入体内转化为自身组分进而实现除磷。该菌株可以高效地降解喹啉，且在单一好氧条件下有其他可利用碳源存在时降解喹啉的同时能同步去除氮磷，可独立完成污水中难降解有机物的去除和生物脱氮除磷的目的。
Description
技术领域
本发明涉及一株兼具异养硝化-好氧反硝化与除磷功能的喹啉降解菌QG6及其应用。该喹啉降解菌QG6属于假单胞菌（Pseudomonas sp.），具有降解喹啉的功能，同时还兼有异养硝化-好氧反硝化的功能，并可以在同步硝化反硝化脱氮的过程中完成污水中含磷污染物的去除，从而达到污水中难降解有机物的去除和同步生物脱氮除磷的目的。
背景技术
喹啉是典型的多环芳香含氮杂环化化合物，具有毒性大、致畸性和致癌性强等特点，难于生物降解，会通过土壤污染地下水资源，对人类健康和生态环境具有巨大的潜在危害，已日益引起人们的关注。寻找有效去除喹啉的方法具有十分重要的意义。
生物处理法因其具有处理量大、成本较低、条件温和及不产生二次污染等优点而受到人们的青睐。近年来，在不改变现有处理设施的基础上通过特定功能微生物的添加的生物强化技术，能够大大提高原有生物处理系统对目标污染物的去除效果，污水处理能力大幅提高，因而越来越受到人们的重视。
国内外研究者从20世纪70年代就开始分离降解喹啉的微生物，其中大多数为假单胞菌属（Pseudomonas sp.）。有关喹啉的微生物降解途径及其降解动力学、遗传学的研究也在深入，但到目前为止，此类化合物的生物降解过程研究仍相当有限,而对于喹啉降解菌的其他功能研究则更少。
随着社会的进步和经济的发展，我国各类水体富营养化污染日益严重，蓝藻赤潮问题频发，对水体安全和人体健康造成了巨大的损害。氮、磷等营养物质过剩是引发水体富营养化的根本原因，当水体中N浓度>0.2mg/l，P浓度>0.02mg/l时就会发生富营养化现象。
生物脱氮技术是应用最广的污水脱氮技术，基本原理是即在于通过硝化作用先将氨氮氧化为硝酸盐，再通过反硝化过程将硝酸盐还原成气态氮。硝化过程中的主体菌是硝化细菌，反硝化过程中的主体菌是反硝化细菌，他们之间脱氮机制的差异直接导致基于硝化反硝化理论的污水脱氮技术工艺厂，能耗高，占地大，环境敏感性高，脱氮效率不高等一系列问题。
生物除磷的基本原理是聚磷菌（Poly-phosphate-Accumulatuing Organisms，PAOs）的好氧吸磷-厌氧释磷过程：通过排泥的方式将被细菌过量摄取的磷随剩余污泥排出系统即可实现除磷的目的。近年来，有学者已研究证实除了聚磷菌PAOs，还存在另一种能够在存在硝酸盐条件下的缺氧环境过量吸磷的兼性厌氧反硝化聚磷菌DPBs，二者的除磷机制极为相似。但DPBs细菌能够将摄磷和反硝化两个过程同时完成，可以节省约50%COD和30%氧的消耗量，污泥量减少50%，CO2排放量明显降低，因此基于反硝化除磷机理的相关工艺的研发已成为当前脱氮除磷新技术的研究热点。
传统生物脱氮除磷存在着硝化与反硝化和除磷过程对溶解氧的需求矛盾、聚磷菌与反硝化菌在碳源上的竞争和异氧菌与自养菌在泥龄上的矛盾等机理上的矛盾，这些问题会导致工艺运行过程中的一次性造价高、能耗高、占地大、脱氮除磷效果不稳定、出水水质达标率不够等一系列问题。目前生物脱氮除磷工艺的发展是围绕着解决在同一污水处理系统中实现脱氮与除磷的矛盾展开的，开发节能高效的城镇污水处理工艺已刻不容缓。
本发明是从某钢铁厂焦化废水生物处理系统中的曝气池回流污泥中取样，经驯化、分离及纯化得到的一株假单胞菌Pseudomonas sp.QG6，发现其具有降解喹啉的能力；进一步研究发现菌株QG6具有异养硝化-好氧反硝化的能力且在单一好氧条件下兼有除磷的能力，能够较好的克服上述提到的传统工艺中存在的矛盾问题，由此完成了本发明。
发明内容
本发明的目的是提供一株可有效解决有机污染物喹啉并用于环境污染治理的新菌株——假单胞菌Pseudomonas sp.QG6。本发明提供的菌株QG6能快速降解难降解有机物，且在有其他碳源存在的情况下能达到同步脱氮除磷的目的，为污水处理同步去除难降解有机物和氮磷提供了新的思路。
本发明所提供的喹啉降解菌QG6取自某钢铁厂焦化废水生物处理系统中的曝气池回流污泥。在含有喹啉的富集培养基中驯化培养，再在以喹啉为唯一碳源、氮源和能源的无机盐培养基中进行驯化培养，并通过平板划线分离纯化得到。
其中，喹啉富集培养基成分为：蛋白胨10.0g/L，葡萄糖1.5g/L，酵母膏3.5g/L，NaCl 9.5g/L。喹啉无机盐培养基成分为：K2HPO4·3H2O 0.79g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，FeSO4·7H2O 0.02g/L，CaCl2·2H2O 0.002g/L，NaCl 1.0g/L，0.1%备用微量元素溶液；微量元素储备液组分为：MnSO4·H2O 0.2g/L，CuSO4·5H2O 0.1g/L，ZnSO4·7H2O 0.2g/L，CoCl2·6H2O 0.09g/L，Na2MoO4·2H2O 0.12g/L，H3BO3 0.006g/L。
本发明所提供的菌株，具有以下表型特征：在30-40℃下，LB培养基上培养16-32h后，菌落为规则的圆形，边缘整齐，表面光滑，菌落颜色呈灰白色；通过革兰氏染色后在显微镜下呈阴性，菌体呈杆状，端生鞭毛，大小为（1.4～1.5）μm×（0.5~0.7）μm，细胞单个出现。。
该菌株QG6的16S rRNA基因序列特征：其16S rRNA具有如序列表1所示的核苷酸序列，序列长度为1462bp，Genbank中的登录号为EF079075。
根据其形态特征和生理生化特征及其16S rRNA基因序列在Genbank中的检索结果，鉴定该菌株QG6为假单胞菌（Pseudomonas sp.）。
本发明通过的假单胞菌Pseudomonas sp.QG6.，于2012年11月09日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC No.6813。
本发明所提供的假单胞菌Pseudomonas sp.QG6能够以喹啉作为唯一碳源、氮源和能源进行生长繁殖，在12h内将100mg/L和150mg/L的喹啉降解完全。该菌可以对较高浓度喹啉工业废水具有良好的降解效果，可以应用于焦化废水的生物强化处理，应用前景广阔。
本发明所提供的假单胞菌Pseudomonas sp.QG6能够利用有机碳为唯一碳源，氨氮为唯一氮源进行新陈代谢，通过异养硝化-好氧反硝化作用把氨氮直接转为气体产物，完成脱氮；也能在好氧条件下将无机磷摄入体内转化为自身组分进而实现除磷。该菌株的这种特性，实现了好氧条件下氮磷的同步去除，解决了传统污水处理中生物脱氮除磷需要采取厌氧释磷、缺氧反硝化、好氧硝化吸磷分段处理的瓶颈问题；另外，硝化反硝化偶联和氮磷的同步去除最大限度的简化了工艺流程，缩短了系统反应时间，节省了设备和投资的成本，因此，具有较好的经济效益和环保效益。
本发明所提供的假单胞菌Pseudomonas sp.QG6在降解喹啉的过程中，以氨氮形式释放出来的喹啉环N，在有可利用碳源的情况下，能够被菌株QG6完全利用，同时伴随着磷酸盐的去除。本发明适用于含较高浓度喹啉的各种工业废水中喹啉的生物降解，同时也适用于各种污水的脱氮除磷处理，应用前景广阔，具有很好的社会效益。
本发明所提供的假单胞菌Pseudomonas sp.QG6可用于降解喹啉和脱氮除磷，在实际应用中，可将菌株置于废水中实现去除难降解有机物喹啉和氮磷的目的。
所述废水的pH可为7-9，优选为8-9。
所述废水的温度可为25-35℃，优选为25-30℃。
下面结合具体实施方式对本发明进行详细描述。本领域的普通技术人员可以理解，实施例仅仅是举例说明的目的，本发明的范围并不以具体实施方法为限，而是由权利要求的范围加以限定。
附图说明
附图1假单胞菌Pseudomonas sp.QG6对喹啉的降解曲线
附图2假单胞菌Pseudomonas sp.QG6对氨氮的降解曲线
附图3假单胞菌Pseudomonas sp.QG6对磷酸盐和氮素的降解曲线
附图4假单胞菌Pseudomonas sp.QG6在单基质和双基质条件下对喹啉的降解过程
在图1~图4中：
Quinoline为喹啉；
Quinoline control为喹啉的空白对照；
NH3-N为氨氮；
NO3-N为硝氮；
PO4-P为磷酸盐。
具体实施方式
实施例中各种污染物的监测分析方法参考《水和污水监测分析方法》（第四版，中国环境科学出版社，2002）。OD600采用紫外分光光度计在600nm波长下检测。
实施例中使用的各种单位，统一采用国家标准。
实施实例1：假单胞菌Pseudomonas sp.QG6对喹啉的降解能力测定
将假单胞菌Pseudomonas sp.QG6（于2012年11月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），保藏号为CGMCC No.6813，下同）接种于100ml的LB培养基（酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L）中，加入100mg/L喹啉，防止杂菌侵入并保持菌体的生长活力，于30℃，120rpm，摇床振荡进行富集培养。振荡培养48h后，4000r/min离心10min，收集菌体，用无机盐培养基（K2HPO4·3H2O 0.0737g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，FeSO4·7H2O 0.02g/L，CaCl2·2H2O 0.002g/L，NaCl 1.0g/L，0.1%备用微量元素溶液；微量元素储备液组分为：MnSO4·H2O 0.2g/L，CuSO4·5H2O 0.1g/L，ZnSO4·7H2O 0.2g/L，CoCl2·6H2O 0.09g/L，Na2MoO4·2H2O 0.12g/L，H3BO3 0.006g/L）洗涤3次，去除残留的底物及中间产物。重悬于无机盐培养基中，配成菌体质量浓度在20g/L左右的菌悬液。4℃保存备用。
取菌悬液按1%加入到新鲜含100mg/L喹啉的无机盐培养基中，30℃、120rpm，振荡培养24h，用作正式降解实验的活性接种液。取活性接种液按5%分别进行2组实验，每组分别接入三个含有200ml测试培养基（不同浓度喹啉分别加入无机盐培养基，其中喹啉的两个初始浓度分别设定为100mg/L（测试培养基1）及150mg/L（测试培养基2））的锥形瓶中，用9层纱布封口，30°C，120rpm的摇床中振荡培养。未接种菌悬液的培养基进行同等条件下的实验作为空白对照。于0h、4h、8h、12h、16h、20h、24h、28h、32h、36h、46h和50h取少量反应液，其中一部分直接用于测定菌体光密度，其余部分在8000rpm下离心5min，取上清液，用0.22μm滤膜过滤，测定喹啉的残留浓度，绘制出降解曲线。
实验结果见附图1。由图可见，假单胞菌Pseudomonas sp.QG6对喹啉的降解能力很强，12h内实验组1和实验2的喹啉均能被完全降解，去除率达100%。从菌体的生长曲线看，在接种后菌株QG6几乎没有出现迟缓期，直接进入了快速增长的对数生长期，菌体含量迅速增加，以此同时实验组的喹啉呈现同步的快速降解趋势，在12h内被完全降解；12h后，菌株QG6从快速增长期进入了稳定期，菌体含量几乎没有发生变化。对照组中的喹啉没有发生降解。
在50h的实验周期内，实验组1的100mg/L喹啉和实验组2的150mg/L喹啉均在前12h内就被菌株QG6降解完全，去除率达100%。由此说明，本发明的假单胞菌Pseudomonassp.QG6对喹啉有很高的降解效率。
实施实例2：假单胞菌Pseudomonas sp.QG6的异养硝化—好氧反硝化性能测定
取5mL按照实例1的方法所制备的假单胞菌Pseudomonas sp.QG6菌悬液分别进行2组实验，每组分别加入三个含有200mL测试培养基（测试培养基1：5.628g/L丁二酸钠六水，0.382g/L NH4Cl（C/N=10），0.79g/L K2HPO4·3H2O，0.2g/L MgSO4·7H2O，0.02g/LFeSO4·7H2O，0.002g/L CaCl2·2H2O，1.0g/LNaCl，0.1%实例1中的备用微量元素溶液:；测试培养基2：11.256g/L丁二酸钠六水，0.764g/LNH4Cl（C/N=10），0.79g/L K2HPO4·3H2O，0.2g/L MgSO4·7H2O，0.02g/L FeSO4·7H2O，0.002g/L CaCl2·2H2O，1.0g/L NaCl，0.1%实例1中的备用微量元素溶液；pH 7.5~8.0）的锥形瓶中，用9层纱布封口，30℃，150rpm的摇床中振荡培养。未接种菌悬液的测试培养基进行同等条件下的实验作为空白对照。于0h、4h、9h、12h、16h、25h、28h、32h、36h、40h、48h和50h取少量反应液，其中一部分直接用于测定菌体光密度，其余部分在8000rpm下离心5min，取上清液测定各种含氮化合物的浓度。
实验结果见附图2。如图所示，假单胞菌Pseudomonas sp.QG6在前9h内均处于迟缓期，生长较为缓慢，此时实验组1和2中的氨氮浓度都基本保持不变；菌株QG6在随后的9-32h内，菌体生长进入对数生长期，菌体含量快速增长，与此同时两组实验组的氨氮浓度降解都非常迅速，其降解曲线几乎呈直线下滑，实验组1氨氮的去除率达100%，实验组2氨氮的去除率达66.7%，在此期间实验组1的硝酸盐浓度一直保持很低的水平，几乎没有变化，实验组2的硝酸盐浓度在开始进入对数生长期时有所升高，随后随着菌体生长又被菌株所利用，最后硝酸盐浓度仍然保持在一个很低的水平；32h后，菌株QG6开始进入稳定期，主要进行内源生长代谢，菌体含量保持在一定水平，实验组1的氨氮和硝酸盐浓度基本没有变化，实验组2氨氮的浓度仍然呈现出下降趋势，最终去除率达到87.6%，硝酸盐浓度基本没有变化。实验组1和2氨氮浓度下降的同时均为出现硝酸盐的积累。由此可见，假单胞菌Pseudomonas sp.QG6对氨氮具有很强的降解能力，异养硝化速率很高。
两组实验的初始氨氮浓度不同，但在50h的实验周期内最终氨氮的去除率均能达到很高，分别为100%和87.6%，并且几乎都没有发现亚硝酸盐氮和硝酸盐氮的积累，说明发生了异养硝化-好氧反硝化现象。其可能的降解途径是将氨氮转化为硝酸盐氮进而将硝酸盐氮直接还原为气体产物，与传统理论不同的是这两个过程由同一株菌株独立完成。
由此可以看出假单胞菌Pseudomonas sp.QG6具有较强的异养硝化-好氧反硝化能力。
实施实例3：假单胞菌Pseudomonas sp.QG6的同步脱氮除磷能力测定
取5mL按照实例1的方法所制备的假单胞菌Pseudomonas sp.QG6菌悬液分别进行2组实验，每组分别加入三个含有200mL测试培养基（测试培养基1：5.628g/L丁二酸钠六水，0.382g/L NH4Cl，0.0737g/L K2HPO4·3H2O，0.2g/L MgSO4·7H2O，0.02g/LFeSO4·7H2O，0.002g/L CaCl2·2H2O，1.0g/L NaCl，0.1%实例1中的备用微量元素溶液；测试培养基2：5.628g/L丁二酸钠六水，0.382g/LNH4Cl，0.1474g/L K2HPO4·3H2O，0.2g/LMgSO4·7H2O，0.02g/L FeSO4·7H2O，0.002g/L CaCl2·2H2O，1.0g/L NaCl，0.1%实例1中的备用微量元素溶液；pH 7.5~8.0）的锥形瓶中，用9层纱布封口，30℃，150rpm的摇床中振荡培养。未接种菌悬液的测试培养基进行同等条件下的实验作为空白对照。于0h、4h、8h、12h、16h、20h、24h、32h、36h和40h取少量反应液，其中一部分直接用于测定菌体光密度，其余部分在8000rpm下离心5min，取上清液测定各种含氮化合物和磷酸根的浓度。
实验结果见附图3。如图所示，假单胞菌Pseudomonas sp.QG6在前4h均处于迟缓期，生长较为缓慢，此时实验组1和2内的磷酸盐和氨氮浓度基本保持不变；菌株QG6在随后4-20h内，菌体生长进入对数生长期，菌体含量快速增长，与此同时氨氮和磷酸盐浓度也呈同步快速直线下降趋势，实验组1的磷酸盐去除率达100%，氨氮去除率达83.0%，实验组2的磷酸盐去除率达到85.9%，氨氮去除率达99.7%；20~40h，菌株进入稳定生长期，主要进行内源代谢，菌体出现了死亡的现象，菌体含量有所下降，在此期间实验组1的氨氮浓度有一定下降，氨氮最终的去除率达到86.7%，；磷酸盐的浓度有小范围的波动，最终去除率仍为100%，实验组2的磷酸盐和氨氮浓度都有一定程度的波动，可能由于菌体死亡释放出了内源的氮素和磷素，磷酸盐最终的去除率为57.3%，氨氮最终的去除率为92.0%。
在40h的实验周期内，实验组1和2的氨氮的最大去除率达到86.7%和99.7%，并且几乎没有发现亚硝酸盐氮和硝酸盐氮的积累，说明发生了异养硝化好氧反硝化现象。此外，实验组1和2磷酸盐的最大去除率达到100%和85.9%，说明假单胞菌Pseudomonas sp.QG6在具有异养硝化-好氧反硝化能力的同时兼有较强的除磷功能。由此可见，假单胞菌Pseudomonas sp.QG6在单一好氧条件下具有较强的同步脱氮除磷能力。
实施实例4：假单胞菌Pseudomonas sp.QG6在喹啉降解过程中的脱氮除磷能力测定
取5mL按照实例1的方法所制备的假单胞菌Pseudomonas sp.QG6菌悬液分别进行2组实验，每组分别加入三个含有200mL测试培养基（测试培养基1为单基质培养基：150mg/L喹啉（C/N=7.7）加入实例1中的无机盐培养基；测试培养基2为双基质培养基：150mg/L喹啉和1.125g/L丁二酸钠六水（C/N=20），一起加入实例1中的无机盐培养基；pH 7.5~8.0）的锥形瓶中，用9层纱布封口，30℃，120rpm的摇床中振荡培养。未接种菌悬液的测试培养基进行同等条件下的实验作为空白对照。于0h、4h、8h、12h、16h、20h和24h取少量反应液，其中一部分直接用于测定菌体光密度，其余部分在8000rpm下离心5min，取上清液，一部分用于测定各种含氮化合物和磷酸根的浓度，一部分用0.22μm滤膜过滤，测定喹啉的残留浓度。
实验结果见附图4。图4（A）显示在单基质条件下，假单胞菌Pseudomonas sp.QG6对喹啉的降解很迅速，在12h内就将喹啉降解完全，去除率达100%。菌株QG6接种到单基质培养基后，几乎没有迟缓期，很快就进入对数生长期，菌体含量快速增长，与此同时喹啉呈现出同步快速降解趋势，12h内的去除率达100%，喹啉降解过程中释放出的NH3-N的浓度随着喹啉的不断降解而逐渐升高，磷酸盐的浓度在此期间呈现出了下降趋势；12h后，菌株QG6进入稳定期，进行内源代谢，菌体含量变化不大，在此期间NH3-N的浓度仍有一定程度的上升，可能由于菌株QG6能将喹啉降解的中间产物分解为氨氮，也可能由于一部分菌体死亡释放出氨氮，磷酸盐的浓度没有发生大的变化，其最终去除率为33.1%。
图4（B）显示在双基质条件下，假单胞菌Pseudomonas sp.QG6接种后也几乎没有迟缓期，很快就进入到对数生长期，在前12h内菌体含量快速增长，在此期间喹啉被完全降解，降解率达100%，喹啉降解过程中释放出的NH3-N浓度有一定上升，最大值为4.838mg/L，同时磷酸盐的浓度下降迅速，几乎呈直线下降，去除率达70.2%，；在12~24h内，菌株进入稳定期，菌体含量有一定增加，但增加幅度不大，喹啉降解过程中释放的NH3-N很快就被菌株所完全利用，与此同时培养基中的磷酸盐的浓度有下降趋势，最终的去除率达86.1%。
在24h的实验周期内，假单胞菌Pseudomonas sp.QG6在不同基质条件下均能对喹啉进行快速降解，在12h内就能达到去除率100%，对喹啉的降解效果明显。在单基质条件下，喹啉降解过程中释放出的NH3-N不能被利用而积累，而在双基质条件下，NH3-N在有可利用碳源的情况下被菌株QG6完全利用，说明菌株QG6能利用由喹啉降解过程中释放出的NH3-N作为氮源，同时利用丁二酸钠作为碳源来维持自身的生长，有一定的脱氮能力。磷酸盐在不同基质条件下均能被利用，去除率分别为33.1%和86.1%。这些结果表明,假单胞菌Pseudomonas sp.QG6在外加碳源的情况下能同时降解喹啉、氨氮和磷酸盐。
实施实例5：假单胞菌Pseudomonas sp.QG6降解喹啉过程中同步脱氮除磷最佳条件的确定
采用摇瓶实验的模式，依据正交实验原理，以pH值、摇床培养温度、摇床转速和初始喹啉浓度四个因素为影响因子，建立了4因素3水平共计9次正交试验以确定假单胞菌Pseudomonas sp.QG6的降解喹啉最佳条件。实验中选用的培养基中的碳氮比恒定为20，由喹啉和丁二酸钠六水根据需要配置，其余组分和浓度一律与实施例1相同。
正交实验设计及结果见表1所示。
表1正交实验设计及实验结果
通过对正交实验的结果分析发现四个因子对菌株QG6降解喹啉效果的影响强弱为：初始喹啉浓度>温度>pH>转速。菌株QG6的降解喹啉的最佳条件组合为A2B1C2D3，即pH为8，温度为25℃，摇床转速为120r/min，初始喹啉浓度为200mg/L。
四个因子对菌株QG6降解喹啉过程中脱氮速率的影响强弱为：pH>温度>初始喹啉浓度>转速。菌株QG6降解喹啉过程中的最佳脱氮条件组合为A3B1C1D1，即pH为9，温度为25℃，摇床转速为100r/min，初始喹啉浓度为100mg/L。
四个因子对菌株QG6降解喹啉过程中除磷效果的影响强弱为：转速>温度>初始喹啉浓度>pH。菌株QG6降解喹啉过程中的最佳除磷条件组合为A3B1C1D2，即pH为9，温度为25℃，摇床转速100r/min，初始喹啉浓度为150mg/L。
Claims (1)
1.一种兼具异养硝化-好氧反硝化与除磷功能的假单胞菌Pseudomonas sp.QG6的应用，
其特征所述的假单胞菌保藏号为CGMCC No.6813，
其中所述应用是选用QG6菌株对废水进行异养硝化‐好氧反硝化的处理，在有机碳为唯一碳源，氨氮为唯一氮源的条件下，通过异养硝化-好氧反硝化作用把氨氮直接转为气体产物，达到脱氮的目的。
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