CN102703350B

CN102703350B - 一株耐盐脱氮除磷高地芽孢杆菌其在废水处理中的应用

Info

Publication number: CN102703350B
Application number: CN 201210171599
Authority: CN
Inventors: 倪晋仁; 邓若男
Original assignee: Peking University
Current assignee: Science & Technology Development Deparatment, Peking University
Priority date: 2012-05-29
Filing date: 2012-05-29
Publication date: 2013-05-22
Anticipated expiration: 2032-05-29
Also published as: CN102703350A

Abstract

本发明涉及一株高盐兼具异养硝化-好氧反硝化与除磷功能的高地芽孢杆菌（Bacillus alitudinis）及其在废水处理中的应用。该菌株对高盐环境耐受能力强，在高盐条件生长良好，并且可以利用有机碳为唯一碳源，氨氮为唯一氮源进行新陈代谢，通过异养硝化-好氧反硝化作用把氨氮直接转为气体产物，达到脱氮的目的；该菌株也能以硝酸盐氮为唯一氮源，通过好氧反硝化作用将硝酸盐氮转化为气体产物；还能在好氧条件下将无机磷摄入体内转化为自身组分进而实现去除污水中磷元素的目的。将该菌株应用于高盐废水的处理，可实现单一好氧条件下氮磷的同步去除，为高盐条件下生物脱氮除磷难题的解决提供了一条新的途径。

Description

一株耐盐脱氮除磷高地芽孢杆菌其在废水处理中的应用

技术领域

本发明涉及一株高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）及其在高盐废水处理中的应用。该菌株具有异养硝化-好氧反硝化的功能，可以在高盐条件下实现同步硝化反硝化脱氮的过程，同时完成污水中含磷污染物的去除。

背景技术

我国目前各类水体富营养化污染日益严重，蓝藻赤潮问题频发，对水体安全和人体健康造成了巨大的损害。氮、磷等营养物质过剩是引发水体富营养化的根本原因，当水体中N浓度>0.2mg/l，P浓度>0.02mg/l时就存在发生富营养化的可能性。生活污水是氮、磷等营养物质的最大排放源，因此生活污水脱氮除磷新工艺的开发一直受到关注。

生物脱氮技术是目前应用最广的污水脱氮技术。生物脱氮的基本原理是在微生物的作用下将污水中的有机氮和氨态氮转化为N₂的过程，包括硝化和反硝化两个反应过程。硝化反应是由一群自养好氧微生物完成，具体分两个阶段分别由亚硝酸菌和硝酸菌两种菌完成。第一步是由亚硝酸菌将NH₄ ⁺氧化为NO₂ ^-，第二步是由硝酸菌将NO₂ ^-进一步氧化为NO₃ ^-。反硝化反应是由一群异养型兼性厌氧微生物完成的，是指在无氧或低氧条件下，反硝化细菌将NO₂ ^-和NO₃ ^-还原为氮气的过程。可以看出，生物脱氮过程本身就存在着矛盾：硝化反应需要较长的污泥龄和好氧条件，大量有机物存在时会造成硝化细菌的流失；而反硝化细菌则需要较短的污泥龄和缺氧条件，高度依赖有机物为其脱氮过程提供电子供体。因硝化细菌和反硝化细菌生理机制的差异导致了基于该理论的污水脱氮技术工艺冗长、能耗大、占地面积大，且对环境变化非常敏感，脱氮效率不佳。

污水除磷的方法有化学除磷、生物除磷以及生化除磷等。化学除磷的基本原理是通过投加化学药剂形成不溶性磷酸盐沉淀物，最终通过固液分离的方法将磷从污水中去除，有石灰沉淀法及金属盐沉淀法。化学除磷操作简单、除磷效果好、抗冲击负荷能力强；但是需要投加大量的化学药剂，处理费用较高，并且会产生二次污染。生物除磷工艺是目前较为经济的除磷方法，其基本原理是聚磷菌（Poly-phosphate-Accumulatuing Organisms，PAOs）的吸/释磷过程：在厌氧条件下，PAOs分解细胞聚磷酸盐的同时产生ATP，并利用ATP将环境中的挥发性脂肪酸等小分子有机物摄入胞内，将其以PHB（聚-β羟基丁酸盐）及糖原等有机颗粒的形式存在于细胞内，同时将聚磷酸盐水解生成的正磷酸盐（PO₄ ^3-）排出细胞外；在好氧条件下，PAOs以氧气为电子受体，利用PHB代谢释放的能量，从污水中吸收超过其生长所需要的磷并以聚磷酸盐的形式贮存在细胞体内。通过排泥的方式将被细菌过量摄取的磷随剩余污泥排出系统即可实现除磷的目的。

生物脱氮除磷发生机制的差异导致了这两个过程本身就是一个矛盾统一体，产生矛盾的根本原因是不同功能的微生物所需要的最佳生长条件不同。硝化需要长泥龄的硝化细菌和好氧条件，反硝化需要短泥龄的反硝化菌和缺氧条件，释磷需要短泥龄的聚磷菌和厌氧条件，而吸磷则需要好氧条件。此外，反硝化菌和聚磷菌之间还存在着因生活污水中碳源不足而产生的竞争关系。生物脱氮除磷工艺的发展也主要是围绕着在同一污水处理系统中实现脱氮与除磷的矛盾展开的。因这些固有矛盾的存在，造成了我国多数污水处理厂运行费用高、脱氮除磷效果不稳定、达标率较低，开发节能高效的城镇污水处理工艺已迫在眉睫。

近年来，生物脱氮除磷在技术与理论方面也有了新的进展和突破。在生物脱氮技术上，开发出了SHARON、CANON、OLAND和ANNAMOX等新型脱氮工艺，这些工艺在某种程度上解决了脱氮过程对碳源的依赖，但仍未摆脱好氧厌氧结合的两段式生物脱氮的限制。在生物除磷理论上，发现了特殊的反硝化聚磷菌（DPB），其基本原理为在厌氧阶段，DPB充分利用环境中的挥发性脂肪酸等小分子有机物进行大量繁殖，同时水解细胞内的聚磷酸盐将产生的无机磷酸盐排出细胞外，并利用此过程产生的ATP合成PHB贮存体内；在缺氧阶段，DPB以硝酸盐氮作为氧化PHB的电子受体，降解PHB所产生的能量一部分用于维持生命活动，一部分则用于过量摄取水中无机磷酸盐并以聚合磷酸盐的形式储存于细胞体内，同时将硝酸盐氮还原为氮气。相比传统除磷理论，反硝化除磷过程能够节省一定的COD与曝气量，进而减少了污泥产量。然而，无论是PAOs理论还是DPB理论，都需要好氧/缺氧/厌氧交替的环境来提供微生物的生长条件。

随着海水直接利用以及高含盐工业废水的大量排放，高盐废水中的高浓度有机物或营养物，如COD、N、P等，对水体环境造成巨大压力，加速了江河湖泊的富营养化进程。除此之外，高盐废水渗入土壤系统中，造成土壤生物、植物因脱水而死亡，进而造成土壤生态系统的瓦解。

高盐度对常规生物处理系统中微生物的的正常代谢会产生不利的影响，主要包括：渗透压偏高，微生物细胞质壁分离，使生长受到阻碍甚至死亡；微生物代谢酶活性受阻；水体密度增加，影响污泥沉降效果等。因此，在高盐度条件下实现废水的同步脱氮除磷成为这一领域的研究热点和难点。

近些年来，有研究者通过选择培养驯化出耐高盐的菌种，以及从自然界高盐环境中分离出耐盐菌和嗜盐菌，将其应用于高盐废水处理，取得了一定的处理效果。然而，国内外对高盐废水的报导大多数关注点在于有机物去除的研究，目前还没有对高盐条件下同时具有脱氮除磷能力菌种的报道。

本发明分离出一株高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis），发现其具有耐高盐兼具异养硝化-好氧反硝化的能力；进一步发现这种细菌在单一好氧条件下兼有同步除磷的能力。利用这类具有特殊性质的细菌的生理特性和代谢机理，基于硝化过程可以是异养细菌的生理行为，而反硝化和除磷过程可以在好氧条件下进行，使得可以在高盐条件的同一好氧环境下完成脱氮除磷，能够较好的克服上述提到的传统生物处理中存在的矛盾问题，由此完成了本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种高盐兼具异养硝化-好氧反硝化和好氧摄磷能力的菌株及其在废水处理中的应用。

本发明提供的高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）菌株已于2012年3月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），保藏号为CGMCCNo.5948。

本发明所提供的菌株，具有以下表型特征：在25-35℃下，营养琼脂培养基上培养16-32h后，通过革兰氏染色后在显微镜下呈阳性，菌体呈杆状，有芽孢无荚膜，边缘粗糙，乳白色，大小为（0.6-1.2）μm×（1.5-6.0）μm。

该菌株的16S rRNA基因序列特征：其16S rRNA具有如序列表中序列1所示的核苷酸序列，序列长度为1428bp。

根据其形态特征和生理生化特征及其16S rRNA基因序列在Genbank中的检索结果，鉴定该菌株为高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）。根据该菌株耐盐性能实验结果，高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）耐盐范围（以NaCl计）为1-13%。

本发明所提供的高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）能够在高盐条件下，以有机物为电子受体，NH₄ ⁺为电子供体，将NH₄ ⁺氧化为NO₂ ^-或NO₃ ^-；能够在好氧的条件下，以有机物为电子供体，NO₂ ^-或NO₃ ^-为电子受体，将其还原为氮气；还能够在好氧条件下，将无机磷摄入体内转化为自身组分进而实现去除污水中磷元素的目的。

本发明所提供的高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）可用于同步脱氮除磷，在实际应用中，可将菌株置于高盐废水中实现氮磷同步去除的目的。

其所述废水的盐度（以NaCl计）范围为1%-13%，优选为3%-10%

所述废水的碳氮比可为3.7-9，优选为9。

所述废水的温度可为20-40℃，优选为20-30℃，更优选为30℃。

所述废水的pH可为6.5-8.0，优选为6.5-7.5，更优选为6.5-7.0。

本发明的高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）及其应用与现有技术相比较有如下有益效果：

（1）本发明的高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）菌株对高盐的耐受力强，能够在高盐、好氧条件下实现好氧条件下氮磷的同步去除，解决了高盐对传统生物处理过程的限制以及传统废水处理中生物脱氮除磷需要采取厌氧释磷、缺氧反硝化、好氧硝化吸磷分段处理的瓶颈问题；

（2）硝化和反硝化偶联进行，反硝化过程中产生的碱度可以很好的弥补硝化过程中产生的酸度，整个过程无需加碱调节pH；相比自养硝化细菌，异养硝化细菌的生长速率快、细胞产率高，可以有效解决自养硝化细菌增值缓慢、系统水力停留时间长的问题；

（3）脱氮和除磷同步进行，解决了反硝化菌和聚磷菌对碳源的竞争问题；

（4）采用本发明，在传统活性污泥法的二级生化处理系统，可以完成碳氮磷的同步去除，无须构建新的反应器，最大限度的简化了工艺流程，节省了设备和投资的成本，因此，具有较好的经济效益和环保效益；

（5）本发明适用于高含盐废水的脱氮除磷处理，应用前景广阔，具有很好的社会效益。

以下结合具体实施方式对本发明进行详细描述。实施例仅为举例说明，本发明的范围并不以具体实施方法为限，而是由权利要求的范围加以限定。

附图说明

附图1高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）在盐度为3%时对氮素和磷酸盐的降解曲线

附图2高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）在不同盐度下对氨氮的降解曲线

附图3高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）在不同盐度下对磷酸盐的降解曲线

附图4高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）在不同pH条件下的脱氮曲线

附图5高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）在不同pH条件下的除磷曲线

附图6高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）在不同温度条件下的脱氮曲线

附图7高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）在不同温度条件下的除磷曲线

附图8高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）在不同C/N条件下的脱氮曲线

附图9高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）在不同C/N条件下的除磷曲线

具体实施实例

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于一下实施例。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中，所述百分含量如无特殊说明，均为质量百分含量。

实施例中各种污染物的监测分析方法参考《水和废水监测分析方法》（第四版，中国环境科学出版社，2002）。温度和溶解氧通过便携式溶氧测定仪（YSI550A，USA）进行测定。污泥浓度（MLSS）和挥发性悬浮固体浓度（MLVSS）根据重量法测定。

实施例中使用的各种单位，统一采用国家标准。

实施实例1：高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）在盐度为3%时的同步脱氮除磷能力测定

将高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）菌株（保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），保藏号为CGMCC No.5948）接种于1L的LB培养基中，防止杂菌的侵入并保持菌体的生长活力，进行富集培养。将培养得到的菌液离心，用无菌水洗涤三次，制成光密度（OD₆₀₀）为1-2的菌悬液。

取10mL上述菌悬液加入两个含有90mL的盐度（以NaCl计）为3%的测试培养基（每升含0.94g葡萄糖，0.153g NH₄Cl，0.035g KH₂PO₄，0.1gMgSO₄·7H₂O，0.006g FeSO₄·7H₂O，pH 7.0~7.5）的锥形瓶中，用9层纱布封口，30℃150rpm的摇床中振荡培养。未接种菌悬液的培养基进行同等条件下的实验作为空白对照。于0h、6h、12h、18h和24h取少量反应液，其中一部分直接用于测定菌体光密度，其余部分在8000rpm下离心5min，取上清液测定各种含氮化合物及磷酸盐的浓度。

实验结果见附图1。高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）菌株在高盐条件下生长良好，且对氨氮和林素那样有较强的降解能力。在24h内，菌株处于对数生长期，与此同时氨氮和磷酸盐的降解同步进行，24h时去除率达到最大值91.90和84.30%。此外，在整个降解过程中，硝氮和亚硝氮的浓度无明显积累，废水中大部分的氨氮通过异养硝化-好氧反硝化作用直接转化为气体产物。此外，24h内磷酸盐的浓度由最初的10mg/L下降至1.56mg/L，说明该菌株在高盐条件下具有异样硝化-好氧反硝化能力的同时兼有较强的除磷功能。

实施实例2：菌株在不同盐度条件下的脱氮除磷效果

以葡萄糖为碳源，氨氮为氮源，实施例中所述高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）菌株在不同盐度下对氨氮的去除能力测定。具体实施步骤如下：

将高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）菌株接种于盐度（以NaCl计）分别为1%、3%、5%、8%、10%和13%的100ml无机盐培养基中，于30℃150rpm的摇床中进行预培养。待菌株生长至对数生长期后期时，取10ml菌液接入新鲜的盐度（以NaCl计）分别为1%、3%、5%、8%、10%和13%的90ml无机盐培养基中，于30℃150rpm的摇床中进行振荡培养。未接种菌悬液的培养基进行同等条件下的实验作为空白对照。于6h、12h、18h、24h、36h和48h取少量反应液，其中一部分直接用于测定菌体光密度，其余部分在8000rpm下离心10min，取上清液测定含氮化合物和磷酸盐的浓度。

如附图2所示，初始氮源浓度为40mg/L，当盐度分别为1%、3%、5%、8%、10%和13%时，48h后氨氮的浓度分别为34.68mg/L、3.53mg/L、4.53mg/L、8.78mg/L、7.23mg/L和36.37mg/L；在盐度为1%时，高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）菌株对氨氮的去除效果不是很理想，48h去除率仅为13.30%；当盐度为3%时，高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）菌株对氨氮的去除效果最好，其48h的氨氮去除率达到91.18%；此后随着盐度升高，菌株对氨氮的去除呈下降趋势，但当盐度升高至10%，其对氨氮的去除率一直保持在78%以上；当盐度达到13%时，菌株对氨氮的去除效果明显下降，去除率仅为9.08%，推测原因可能是此盐度下该菌株生长速率下降，对其降解能力产生较强的抑制作用。由此可知，高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）降解氨氮的最佳盐度为3%，并且在盐度为3%-10%的范围内对氨氮均有较好的去除效果。

结果如图3所示，该菌株在盐度（以NaCl计）分别为1%、3%、5%、8%、10%时，均可以有效去除磷酸盐；当盐度为13%时，菌株的除磷效果不理想。其中在盐度为1%时的除磷性能最好，去除速率也最快，磷酸盐的最大去除率达到96.70%。由此可见，该菌株为对高盐有良好耐受能力的耐盐菌，其能够在高盐条件下有效实现生物除磷。

实施实例3：.菌株在不同pH条件下的脱氮除磷实验

将高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）菌株接种于100ml的盐度（以NaCl计）为3%无机盐培养基中，于30℃150rpm的摇床中进行预培养。待菌株生长至对数生长期后期时，取10ml菌液接入新鲜的90ml无机盐培养基中,调节培养基pH分别为6.5-7.0、7.0-7.5和7.5-8.0的范围内，于30℃150rpm的摇床中进行振荡培养。未接种菌悬液的培养基进行同等条件下的实验作为空白对照。于6h、12h、18h、24h、36h和48h取少量反应液，其中一部分直接用于测定菌体光密度，其余部分在8000rpm下离心10min，取上清液测定各种含氮化合物和磷酸盐的浓度。

由图4、图5可见，高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）菌株在pH为6.5-7.0，脱氮除磷性能最好，24h对氨氮和磷酸盐的去除率分别达到91.90和89.50%。但随着pH的升高，菌株脱氮除磷率降低。当pH为7.5-8.0范围内，菌株对氨氮和磷酸盐的去除效果都不是很理想。由此可知，该菌株脱氮除磷效果最适的pH范围为6.5-7.0，pH值的升高会对其脱氮除磷效果产生抑制作用。

实施实例4：菌株在不同温度条件下的脱氮除磷实验

将高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）菌株接种于100ml的盐度（以NaCl计）为3%无机盐培养基中，于30℃150rpm的摇床中进行预培养。待菌株生长至对数生长期后期时，取10ml菌液接入新鲜的100ml无机盐培养基中,调节摇床培养温度分别为20℃、30℃和40℃，150rpm振荡培养。未接种菌悬液的培养基进行同等条件下的实验作为空白对照。于6h、12h、18h、24h、36h和48h取少量反应液，其中一部分直接用于测定菌体光密度，其余部分在8000rpm下离心10min，取上清液测定各种含氮化合物和磷酸盐的浓度。

由图6、图7可见，当温度分别为20℃、30℃和40℃时，48h后氨氮的浓度分别为13.92mg/L、3.53mg/L和13.08mg/L，磷酸盐的浓度分别为4.14mg/L、2.27mg/L和3.54mg/L。温度为30℃时，菌株对氨氮和磷酸盐的去除率最高；48h内无硝酸盐氮的累积，只有微量的亚硝酸盐氮出现，其值均不超过0.04mg/L。说明高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）菌株对温度具有较宽的适应范围。

实施实例5：菌株在不同C/N条件下的脱氮除磷实验

将高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）菌株接种于100ml的盐度（以NaCl计）为3%无机盐培养基中，于30℃150rpm的摇床中进行预培养。待菌株生长至对数生长期后期时，取10ml菌液接入新鲜的100ml无机盐培养基中,调节C/N分别为3.7、7.5和9.0，于30℃150rpm的摇床中进行振荡培养。未接种菌悬液的培养基进行同等条件下的实验作为空白对照。于6h、12h、18h、24h、36h和48h取少量反应液，其中一部分直接用于测定菌体光密度，其余部分在8000rpm下离心10min，取上清液测定各种含氮化合物和磷酸盐的浓度。

由图8、图9可见，当C/N分别为3.7、7.5和9时，48h后氨氮的浓度分别为17.55mg/L、11.42mg/L和3.53mg/L，磷酸盐的浓度分别为5.74mg/L、3.97mg/L和2.27mg/L；当C/N为9时，高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）对氨氮和磷酸盐的去除率明显高于其在C/N为3.7和9时的去除率。

实施实例6：菌株最佳除磷条件的确定

采用摇瓶实验的模式，依据正交实验原理，以pH值、摇床培养温度、接种量和碳氮比四个因素为影响因子，建立了4因素3水平共计9次正交试验以确定菌株高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）的最佳除磷条件。实验中选用的培养基除葡萄糖与氯化铵含量根据需要改变外，其余组分和浓度一律与实施例1相同。

正交实验设计及结果见表1所示。

表1正交实验设计及结果

由表1可知，四个因子对高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）除磷效果的影响强弱为：pH>碳氮比>温度>接种量；高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）的最佳除磷效果组合为A₂B₂C₃D₂，对应的最优条件为pH为6.5-7.0，温度为30℃，接种量为10%，碳氮比为9。

Claims

1.一种高地芽孢杆菌Bacillus altitudinis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.5948。

2.权利要求1所述的高地芽孢杆菌Bacillus altitudinis在废水处理中的应用，其特征是选用高地芽孢杆菌Bacillus altitudinisi对废水进行处理，实现同步脱氮和除磷的目标。

3.根据权利要求2所述的高地芽孢杆菌Bacillus altitudinis的应用，其特征在于：其所述的废水的盐度，以NaCl计，范围为1-13%。

4.根据权利要求2或3所述的高地芽孢杆菌Bacillus altitudinis的应用，其特征在于：其所述的废水的碳氮比范围为3.7-9。

5.根据权利要求4所述的高地芽孢杆菌Bacillus altitudinis及其应用，其特征在于：其所述的废水的pH范围为6.5-8.0。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征是利用高地芽孢杆菌Bacillus altitudinis和/或以其为主要成份微生物制剂对废水进行处理，在高盐好氧环境下完成硝化、反硝化和除磷过程，进而实现氨氮、总氮及磷的同时去除。