CN104342382B - 一种芽孢杆菌及其在含磷废水处理中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种芽孢杆菌及其在含磷废水处理中的应用，属于微生物领域。该菌株为芽孢杆菌PWL‑L16，其分类命名为芽孢杆菌（Bacillus sp.），保藏编号为CGMCC No.8568。本发明从鸡粪与活性污泥混合泥源中筛选分离得到一株具有在厌氧条件下将水中的磷酸盐还原为磷化氢的细菌，本发明的菌株可应用于不同浓度的含磷废水处理。该菌株应用于废水的除磷的产物磷化氢溶解度较低易与废水分离，不需排泥来除磷和考虑系统厌氧释磷、好氧摄磷协调问题，且厌氧微生物的生长速率比好氧微生物小，不会产生大量的剩余污泥；同时，此还原反应是厌氧过程，无需耗能充氧，且可在一个简单反应器中进行，占地小、操作简便，具有广阔的应用前景。

Description

一种芽孢杆菌及其在含磷废水处理中的应用
技术领域
本发明涉及一种芽孢杆菌PWL-L16及其在含磷废水处理中的应用，是在厌氧条件下将水中的磷酸盐还原磷化氢，以及该菌株在模拟不同浓度含磷废水中的除磷效率，属于微生物领域。
背景技术
水体富营养化日益严重，氮磷含量超标，而水体中较低浓度的磷(0.018mg/L)就能刺激藻类大量繁殖，因此磷元素是造成水体富营养化的限制元素，在废水处理中除磷较脱氮更具有实际意义。常见的废水除磷方法有吸附法，化学法和生物法三种。而传统除磷工艺是将水相中的磷转化为固相中的磷，通过排放富含磷元素的污泥实现除磷的目的，因此面临着处理处置大量剩余污泥的问题。
在厌氧环境中，某些微生物可将磷酸盐还原为磷化氢，此反应和硝酸盐生物还原反应应用于生物脱氮一样，也可应用于生物除磷。由此，将以磷酸盐还原反应为基础的除磷技术称为厌氧生物除磷技术。磷酸盐还原反应的产物磷化氢溶解度较低易与废水分离，不需排泥来除磷和考虑系统厌氧释磷、好氧摄磷协调问题，且厌氧微生物的生长速率比好氧微生物小，不会产生大量的剩余污泥。此还原反应是厌氧过程，无需耗能充氧，且可在一个简单反应器中进行，占地小、操作简便。
Dévai等人(1988)首次在污水处理厂的挥发物中检测到磷化氢的存在。其后，随着检测技术的提高，相继报道了磷化氢存在于港口沉积物、湿地、垃圾场、污水处理厂、养殖场、沼泽释放出来的气体样品中。Gassmann和Glindemann(1993)在实验室中利用混合厌氧菌种培养基证实了生物的活动可以产生磷化氢，并提出甲烷的生成与磷酸盐转化成磷化氢存在一定相关性。Dévai和Delaune(1995)证明在沼泽地土壤样品中增加磷酸盐和溶解性有机物(蛋白胨)可增加磷化氢的含量。Eismann(1997)的研究得出磷化氢的产生是以微生物为媒介的过程。Rutishauser和Bachofen(1999)观察了污水处理厂污泥浓缩池上部污泥中磷化氢的形成，证明了磷化氢形成动力学遵循典型微生物生长曲线，磷源和碳源的交替影响促进磷化氢的形成。Jenkins等人(2000)监测得出一些厌氧微生物可以产生磷化氢。
目前我国对磷化氢的形成也进行了一定的研究，刘季昂等人(1999)检测了北京郊区稻田土壤和水库湿地中结合态磷化氢，发现随土壤深度的增加，磷化氢的质量分数有降低的趋势。曹海峰(2000)等人指出磷化氢可作为大气中磷元素的一种载体，参与全球的磷循环，并且在合适厌氧条件下，某些含磷物质能被微生物厌氧还原为磷化氢。刘志培等人(2004)测定了不同环境来源中12个样品磷化氢的含量，得出不同来源的样品，其磷化氢的质量分数差别很大，并提出磷化氢的产生对污水除磷处理有一定的作用。周康群等用污泥浓缩池及鸡粪种泥分离出厌氧条件下总磷还原为磷化氢的功能菌。刘晖等在厌氧除磷功能菌的富集中得到4种菌，均有能在厌氧条件下产生PH3的功能。
发明内容
本发明的目的是在于提供一株具有厌氧磷酸盐还原的细菌，该菌株能够将水中的磷酸盐还原为磷化氢，区别于传统生物除磷将水中的磷以液态的形式转化为固态去除，该菌可以将水中的磷从液态形式转化为气态，可以作为一种新的除磷途径。
本发明的技术方案如下：
一种芽孢杆菌PWL-L16，该菌株的分类命名为芽孢杆菌（Bacillus sp.），属于芽孢杆菌PWL-L16，保藏编号为CGMCC No.8568，保藏日为2013年12月11日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
本发明分离的梭状芽孢杆菌PWL-L16的生物学特征：
本发明分离的梭状芽孢杆菌PWL-L16，为革兰氏阴性厌氧菌，细胞形状为椭圆，在固态培养皿培养基上菌落呈圆形、淡黄色、不透明、质地湿润、不凸起、表面光滑、边缘不整齐。本发明分离的梭状芽孢杆菌主要生理生化指标见表1。
表1PWL-L16菌株的主要生理生化指标
本发明通过从鸡粪与活性污泥混合泥源中分离筛选得到一株芽孢杆菌（Bacillussp.）PWL-L16。该菌株易于生长，能在厌氧条件下将水中的磷酸盐还原转化为磷化氢，本发明的菌株能够开发成一种新型应用于含磷废水除磷的微生物菌剂。
一种芽孢杆菌PWL-L16在含磷废水处理中的应用，该菌株适于去除高浓度含磷废水中的磷，所述的含磷废水的浓度为10mg/L～110mg/L，所述的含磷废水的温度为25℃～50℃，优选为27℃～37℃，所述的含磷废水的pH范围为5～8，优选为6～7。
芽孢杆菌GWLPWL-L16在废水除磷处理中的应用，包括如下步骤：
（1）首先活化菌株：将斜面培养基上保存的芽孢杆菌GWLPWL-L16用接种环刮取多环菌苔，接种至装有富集培养基的锥形瓶中，通入氮气并密封，在32℃、150r/min的摇床中震荡培养24h，获得菌悬液；
（2）将菌悬液以10%的接种量接种于含磷废水中，通入氮气以驱除容器顶空和水体中氧气，在150r/min的摇床中震荡培养，定时取样检测水样中总磷的含量。
采用TP：钼酸铵分光光度法，检测水样中总磷的含量，以得到水样中总磷的去除情况。
其中，所述使用方法步骤（1）中的富集培养基成分为：葡萄糖1g，乙酸钠0.5g，酵母膏0.25g，CaCl20.075g，MgSO4.7H2O0.2g，(NH4)2Fe(SO4)2.6H2O0.04g，NH4Cl0.0625g，NaNO30.0625g，蛋白胨0.0625g，KH2PO40.0438g，K2HPO40.0563g，水1000mL。
上述培养基需要按照常规方法灭菌（即在121℃下高温蒸汽灭菌20min）。
本发明提供了一种新型厌氧磷酸盐还原为磷化氢的芽孢杆菌PWL-L16，该菌株可以去除高浓度含磷废水，去除效果好，可以在厌氧条件下将水体中液态磷转化为气态磷化氢而达到去除的目的，解决传统生物除磷后处理含磷污泥的难题。
本发明的菌株应用于废水的除磷基于磷酸盐还原反应，该反应的产物磷化氢溶解度较低易与废水分离，不需排泥来除磷和考虑系统厌氧释磷、好氧摄磷协调问题，且厌氧微生物的生长速率比好氧微生物小，不会产生大量的剩余污泥。此还原反应是厌氧过程，无需耗能充氧，且可在一个简单反应器中进行，占地小、操作简便，具有广阔的应用前景。
保藏信息：
芽孢杆菌PWL-L16，该菌株的分类命名为芽孢杆菌（Bacillus sp.），保藏编号为CGMCC No.8568，保藏日为2013年12月11日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
附图说明
图1为本发明厌氧反应瓶示意图。
具体实施方式
实施例1：梭状芽孢杆菌PWL-L16的分离筛选
将鸡粪过筛去除杂质后，取1000g与水厂取来的活性污泥按1:1的重量比例进行混合，加入到5L下口瓶中，再加入2L的培养基，通入氮气密封下口瓶，放到35℃水浴锅中静止厌氧培养，每天定时摇晃下口瓶使混合污泥与培养基充分混合，并每隔3d用HL-210磷化氢检测仪检测产生气体，直至检测到磷化氢气体，混合污泥培养成熟。将混合污泥泥水混合物稀释不同倍数在固体培养基平板上涂布，于35℃生化培养箱中培养2天，挑取不同菌落进一步分离纯化直至纯菌，并将单菌落用接种环接种到试管斜面固体培养基中于-4℃冰箱中保存。对筛选出来的菌株进行性能测试，将斜面的纯菌挑取一环菌苔至液体培养基中活化24h，培养温度为35℃，pH=7，摇床150r/min。取活化的菌悬液以10%接种量接种到新鲜灭菌的培养基中，通入氮气密封培养7d测定水中上清液TP的含量，计算出TP去除率。根据性能测试筛选出去除率较高的磷酸盐还原菌，即获得PWL-L16候选菌株，水中总磷的去除率为35.71%。
上述分离筛选的芽孢杆菌PWL-L16的液体培养基成分：葡萄糖1g，乙酸钠0.5g，酵母膏0.25g，CaCl20.075g，MgSO4.7H2O0.2g，(NH4)2Fe(SO4)2.6H2O0.04g，NH4Cl0.5g，NaNO30.5g，蛋白胨0.5g，KH2PO40.5g，K2HPO40.64g，水1000mL。
上述分离筛选的芽孢杆菌PWL-L16的平板固体培养基成分：葡萄糖1g，乙酸钠0.5g，酵母膏0.25g，CaCl20.075g，MgSO4.7H2O0.2g，(NH4)2Fe(SO4)2.6H2O0.04g，NH4Cl0.5g，NaNO30.5g，蛋白胨0.5g，KH2PO40.5g，K2HPO40.64g，琼脂18～20g，水1000mL。
上述分离筛选的芽孢杆菌PWL-L16的试管斜面固体培养基成分：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂20g，高纯水1000ml。
上述所有的培养基均按照常规方法灭菌（即在121℃下高温蒸汽灭菌20min）。
实施例2：
采用芽孢杆菌（Bacillus sp.）PWL-L16，保藏编号为CGMCC No.8568，进行定向驯化及在不同浓度的模拟含磷废水处理中的应用。
芽孢杆菌PWL-L16定向驯化的步骤为：
（1）使用前用富集培养基活化菌株：将斜面培养基上保存的芽孢杆菌PWL-L16用接种环刮取多环菌苔，接种至装有150mL富集培养基的250mL锥形瓶中，通入氮气并密封，在32℃、150r/min的摇床中震荡培养24h，即可获得菌悬液。
使用的富集培养基的成分为：葡萄糖1g，乙酸钠0.5g，酵母膏0.25g，CaCl20.075g，MgSO4.7H2O0.2g，(NH4)2Fe(SO4)2.6H2O0.04g，NH4Cl0.0625g，NaNO30.0625g，蛋白胨0.0625g，KH2PO40.0438g，K2HPO40.0563g，水1000mL，pH=7。
（2）在不同浓度的模拟含磷废水处理中的应用：
将活化后的菌悬液以10%的接种量分别接种于总磷浓度为20mg/L、30mg/L、40mg/L的不同模拟含磷废水中，采用厌氧反应瓶（磨口锥形瓶），如图1所示，通入氮气以驱除容器顶空和水体中氧气，温度为35℃，pH为7.0，在150r/min的摇床中震荡培养四个周期，每个周期培养6d，每个周期第6d取混合水样10mL，并用Sigma3K15型离心机在11000r/min下离心6min，检测水样上清液中总磷浓度，计算出水中总磷的去除率。
不同浓度的模拟含磷废水成分为：
总磷浓度为20mg/L的模拟含磷废水成分：葡萄糖1g，乙酸钠0.5g，酵母膏0.25g，CaCl20.075g，MgSO4.7H2O0.2g，(NH4)2Fe(SO4)2.6H2O0.04g，NH4Cl0.0625g，NaNO30.0625g，蛋白胨0.0625g，KH2PO40.0438g，K2HPO40.0563g，水1000mL，pH=7。
总磷浓度为30mg/L的模拟含磷废水成分：葡萄糖1g，乙酸钠0.5g，酵母膏0.25g，CaCl20.075g，MgSO4.7H2O0.2g，(NH4)2Fe(SO4)2.6H2O0.04g，NH4Cl0.0625g，NaNO30.0625g，蛋白胨0.0625g，KH2PO40.0656g，K2HPO40.0844g，水1000mL，pH=7。
总磷浓度为40mg/L的模拟含磷废水成分：葡萄糖1g，乙酸钠0.5g，酵母膏0.25g，CaCl20.075g，MgSO4.7H2O0.2g，(NH4)2Fe(SO4)2.6H2O0.04g，NH4Cl0.0625g，NaNO30.0625g，蛋白胨0.0625g，KH2PO40.0875g，K2HPO40.1125g，水1000mL，pH=7。
上述所有的培养基均按照常规方法灭菌（即在121℃下高温蒸汽灭菌20min）。
水中总磷的测定采用钼酸铵分光光度法，取水样稀释到标准曲线的浓度范围内，在700nm波长下测定吸光度并根据标准曲线折算出水样中总磷的浓度。
实验结果：
用上述总磷浓度为20mg/L的模拟含磷废水对芽孢杆菌PWL-L16进行四个周期定向驯化，测定水中总磷的去除率分别为：6.34%，10.64%，21.29%和28.75%。
用上述总磷浓度为30mg/L的模拟含磷废水对芽孢杆菌PWL-L16进行四个周期定向驯化，测定水中总磷的去除率分别为：6.29%，16.74%，15.75%和22.32%。
用上述总磷浓度为40mg/L的模拟含磷废水对芽孢杆菌PWL-L16进行四个周期定向驯化，测定水中总磷的去除率分别为：14.98%，22.85%，23.49%和26.78%。
实施例3：芽孢杆菌PWL-L16在含磷废水处理中的应用
采用芽孢杆菌（Bacillus sp.）PWL-L16，保藏编号为CGMCC No.8568，在不同条件下，在不同浓度的模拟含磷废水处理中的应用。
具体应用时，使用方法为：
（1）使用前用富集培养基活化菌株：将斜面培养基上保存的芽孢杆菌PWL-L16用接种环刮取多环菌苔，接种至装有150mL富集培养基的250mL锥形瓶中，通入氮气并密封，在32℃、150r/min的摇床中震荡培养24h，即可获得菌悬液。
使用的富集培养基的成分为：葡萄糖1g，乙酸钠0.5g，酵母膏0.25g，CaCl20.075g，MgSO4.7H2O0.2g，(NH4)2Fe(SO4)2.6H2O0.04g，NH4Cl0.0625g，NaNO30.0625g，蛋白胨0.0625g，KH2PO40.0438g，K2HPO40.0563g，水1000mL，pH=7。
（2）将活化后的菌悬液以10%的接种量接种于模拟不同浓度的含磷废水中，采用厌氧反应瓶（磨口锥形瓶），如图1所示，通入氮气以驱除容器顶空和水体中氧气，温度在27℃～37℃，pH范围为6.0～7.0，在150r/min的摇床中震荡培养，培养周期为6d，结束后取混合水样10mL，并用Sigma3K15型离心机在11000r/min下离心6min，检测水样上清液中总磷浓度，计算出水中总磷的去除率。
（3）检测方法：
TP：钼酸铵分光光度法。
对芽孢杆菌PWL-L16进行8组不同条件的实验，实验条件及结果如下：
实验（i）的条件为初始总磷浓度为20mg/L（以P计），模拟含磷废水组成：葡萄糖1g，乙酸钠0.5g，酵母膏0.25g，CaCl20.075g，MgSO4.7H2O0.2g，(NH4)2Fe(SO4)2.6H2O0.04g，NH4Cl0.0625g，NaNO30.0625g，蛋白胨0.0625g，KH2PO40.0438g，K2HPO40.0563g，水1000mL；pH=6.5，T=32℃，水中总磷的去除率达到34.73%。
实验（ii）的条件为初始总磷浓度为20mg/L（以P计），模拟含磷废水组成：葡萄糖1g，乙酸钠0.5g，酵母膏0.25g，CaCl20.075g，MgSO4.7H2O0.2g，(NH4)2Fe(SO4)2.6H2O0.04g，NH4Cl(0.09375g/L)+NaNO3(0.09375g/L)，KH2PO40.0438g，K2HPO40.0563g，水1000mL；pH=7.0，T=37℃，水中总磷的去除率达到37.69%。
实验（iii）的条件为初始总磷浓度为30mg/L（以P计），模拟含磷废水组成：葡萄糖1g，乙酸钠0.5g，酵母膏0.25g，CaCl20.075g，MgSO4.7H2O0.2g，(NH4)2Fe(SO4)2.6H2O0.04g，NH4Cl(0.09375g/L)+NaNO3(0.09375g/L)，KH2PO40.0656g，K2HPO40.0844g，水1000mL；pH=6.5，T=27℃，水中总磷的去除率达到39.73%。
实验（iv）的条件为初始总磷浓度为30mg/L（以P计），模拟含磷废水组成：葡萄糖1g，乙酸钠0.5g，酵母膏0.25g，CaCl20.075g，MgSO4.7H2O0.2g，(NH4)2Fe(SO4)2.6H2O0.04g，NH4Cl0.0625g，NaNO30.0625g，蛋白胨0.0625g，KH2PO40.0656g，K2HPO40.0844g，水1000mL；pH=6.0，T=37℃，水中总磷的去除率达到46.77%。
实验（v）的条件为初始总磷浓度为40mg/L（以P计），模拟含磷废水组成：葡萄糖1g，乙酸钠0.5g，酵母膏0.25g，CaCl20.075g，MgSO4.7H2O0.2g，(NH4)2Fe(SO4)2.6H2O0.04g，NH4Cl0.0625g，NaNO30.0625g，蛋白胨0.0625g，KH2PO40.0875g，K2HPO40.1125g，水1000mL；pH=7.0，T=27℃，水中总磷的去除率达到29.3%。
实验（vi）的条件为初始总磷浓度为40mg/L（以P计），模拟含磷废水组成：葡萄糖1g，乙酸钠0.5g，酵母膏0.25g，CaCl20.075g，MgSO4.7H2O0.2g，(NH4)2Fe(SO4)2.6H2O0.04g，蛋白胨0.1875g，KH2PO40.0875g，K2HPO40.1125g，水1000mL；pH=6.5，T=37℃，水中总磷的去除率达到58.58%。
实验（vii）的条件为初始总磷浓度为100mg/L（以P计），模拟含磷废水组成：葡萄糖1g，乙酸钠0.5g，酵母膏0.25g，CaCl20.075g，MgSO4.7H2O0.2g，(NH4)2Fe(SO4)2.6H2O0.04g，NH4Cl0.5g，NaNO30.5g，蛋白胨0.5g，KH2PO40.5g，K2HPO40.64g，水1000mL；pH=7.0，T=37℃，水中总磷的去除率达到35.71%。
实验（viii）的条件为初始总磷浓度为100mg/L（以P计），模拟含磷废水组成：葡萄糖1g，乙酸钠0.5g，酵母膏0.25g，CaCl20.075g，MgSO4.7H2O0.2g，(NH4)2Fe(SO4)2.6H2O0.04g，NH4Cl0.0625g，NaNO30.0625g，蛋白胨0.0625g，KH2PO40.5g，K2HPO40.64g，水1000mL；pH=7.0，T=32℃，水中总磷的去除率达到28.43%。
通过以上实施例，可以看到本发明的菌株可以很好地应用于不同浓度的含磷废水的处理，适于总磷浓度范围10mg/L～110mg/L，最佳除磷温度范围在27℃～37℃，pH范围在6～7之间；该菌株能在厌氧条件下将水中的磷酸盐还原为磷化氢，水中总磷的去除率为约35.71%。而且除磷反应的产物磷化氢溶解度较低易与废水分离，厌氧微生物的生长速率比好氧微生物小，不会产生大量的剩余污泥。

Claims (6)

1.一株梭状芽孢杆菌PWL-L16，其特征在于：该菌株的分类命名为芽孢杆菌(Bacillus)，保藏编号为CGMCC No.8568。
2.如权利要求1所述的梭状芽孢杆菌PWL-L16在含磷废水处理中的应用。
3.如权利要求2所述的梭状芽孢杆菌PWL-L16在含磷废水处理中的应用，其特征在于：所述的含磷废水的浓度为10mg/L～110mg/L，所述的含磷废水的温度为25℃～50℃，所述的含磷废水的pH为5～8。
4.如权利要求3所述的梭状芽孢杆菌PWL-L16在含磷废水处理中的应用，其特征在于：所述的含磷废水的温度为27℃～37℃，所述的含磷废水的pH为6～7。
5.如权利要求4所述的梭状芽孢杆菌PWL-L16在含磷废水处理中的应用，其特征在于，包括如下步骤：
(1)首先活化菌株：将斜面培养基上保存的芽孢杆菌PWL-L16用接种环刮取多环菌苔，接种至装有富集培养基的锥形瓶中，通入氮气并密封，在32℃、150r/min的摇床中震荡培养24h，获得菌悬液；
(2)将菌悬液以10％的接种量接种于含磷废水中，通入氮气以驱除容器顶空和水体中氧气，在150r/min的摇床中震荡培养，定时取样检测水样中总磷的含量。
6.如权利要求5所述的梭状芽孢杆菌PWL-L16在含磷废水处理中的应用，其特征在于：采用钼酸铵分光光度法检测水样中总磷的含量。
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