CN106244508B - 一株吡咯伯克霍尔德氏菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株吡咯伯克霍尔德氏菌及其应用，属于环境微生物应用领域。本发明的吡咯伯克霍尔德氏菌B1213，保藏编号为CGMCCNo.12806；保藏时间为2016年7月21日；属于杆状的革兰氏阴性菌，不能形成芽孢。本发明的吡咯伯克霍尔德氏菌B1213能够降解邻苯二甲酸二丁酯；对邻苯二甲酸二丁酯的降解率可高达45.5‑75.35%。采用本发明的吡咯伯克霍尔德氏菌B1213降解邻苯二甲酸二丁酯的方法为：在酵母提取物存在的条件下，吡咯伯克霍尔德氏菌B1213与DBP接触。本发明降解邻苯二甲酸二丁酯的方法，与本发明之前细菌、真菌降解邻苯二甲酸二丁酯的方法相比，在菌种来源上具有新意，降解率高，降解周期短，操作简单。

Description

一株吡咯伯克霍尔德氏菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株吡咯伯克霍尔德氏菌及其应用，属于环境微生物应用领域。

背景技术

邻苯二甲酸二丁酯（Dibutyl phthalate），简称：DBP，属于邻苯二甲酸酯(Phhtalic Aicd Easters, PAEs)的一种，是一类重要的环境激素类有机合成化合物，具有色泽浅、挥发性低、气味小和耐低温等特点，是近年来产量最大、用量最多的增塑剂，广泛用于橡胶、塑料、香料等行业。

DBP与载体连接不稳定，极易扩散到环境中，可通过食物、空气、饮用水、化妆品等多种途径进入人体并富集。DBP对水生植物具有毒性效应，对动物雌激素具有显著干扰作用，能降低细胞膜表面蛋白的表达从而抑制巨噬细胞的吞噬能力，甚至诱导神经细胞凋亡，是一种重要的环境内分泌干扰物及致癌、致畸、致突变物质，引起了各国环保部门的高度重视。美国环保局（EPA）、欧盟以及中国国家环境监测中心均已将其列入优先控制污染物黑名单。我国也相应地规定了生活饮用水中DBP的最大检出浓度。

环境中DBP的分解、转化方法及技术探索已成为环境污染治理的重要研究方向。但是DBP在自然环境中的水解、光解速度非常缓慢，属于难降解物质。有研究表明，BBP的水相中光解半衰期长于100天。与水解及光解等物理降解相比，基于微生物代谢的生物降解过程具有功能微生物多样性、过程简单、成本低、环境友好等特点，使得微生物降解被认为是自然环境中DBP完全矿化的最有效途径。因此筛选高效分解以DBP为代表的PAEs类物质的微生物并阐明其分解代谢途径，对于深化有关消除DBP环境危害的研究及应用具有现实意义。

近年来，DBP的微生物降解已经得到广泛的研究，大量能高效降解DBP的菌株已经从各类环境中分离得到，包括红树林、土壤、海洋、河流与废水处理厂的活性污泥等，微生物类别包括大量细菌以及部分真菌。研究表明，不同来源以及不同类型的微生物在DBP降解途径方面具有较大差异性，所呈现的降解机制也不尽相同。所述降解机制包括发挥降解作用的关键酶及酶系、降解途径中的关键节点及关键影响因素、微生物自身代谢与降解效果之间的关系、微生物降解广谱性与特异性及其与DBP结构的关系等。

吡咯伯克霍尔德氏菌（Burkholderia pyrrocinia），其应用主要在促进植物生长和植物病害的生物防治；目前未见有关利用吡咯伯克霍尔德氏菌降解DBP的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够降解邻苯二甲酸二丁酯的新菌株；及该菌株的应用和采用该菌株降解邻苯二甲酸二丁酯的方法。

技术方案

本发明从土壤中筛选并分离出了一株新的菌株；属于杆状的革兰氏阴性菌，不能形成芽孢；经鉴定，该菌株是一种吡咯伯克霍尔德氏菌（Burkholderia pyrrocinia）；命名为吡咯伯克霍尔德氏菌B1213；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏编号为CGMCCNo.12806；保藏时间为2016年7月21日。

本发明的吡咯伯克霍尔德氏菌B1213能够降解邻苯二甲酸二丁酯；吡咯伯克霍尔德氏菌B1213对邻苯二甲酸二丁酯的降解率可高达45.5-75.35%。

采用本发明的吡咯伯克霍尔德氏菌B1213降解邻苯二甲酸二丁酯的其中一种方法为：在酵母提取物存在的条件下，吡咯伯克霍尔德氏菌B1213与邻苯二甲酸二丁酯接触。其中，酵母提取物的量会影响降解率。所以，上述方法，优选的，在改良BSM 基础盐液体培养基存在的条件下，吡咯伯克霍尔德氏菌B1213与邻苯二甲酸二丁酯接触；所述改良BSM 基础盐液体培养基，每1L中含有以下成分：酵母提取物2-10g，硫酸铵0.5g，氯化钠4.0g，三水合磷酸钾0.5g，七水合硫酸镁0.4g，蒸馏水余量；pH7.0。

具体的，是将邻苯二甲酸二丁酯加入改良BSM 基础盐液体培养基；将吡咯伯克霍尔德氏菌B1213种子液接种于改良BSM 基础盐液体培养基，在150-200 rpm、30-35℃的条件下恒温震荡培养。

上述方法，优选的，改良BSM 基础盐液体培养基中酵母提取物的含量为7g/L。

上述方法，优选的，培养条件为转速175rpm，温度30℃。其他条件相同情况下，在此培养条件下，邻苯二甲酸二丁酯的降解率更高。

上述方法，吡咯伯克霍尔德氏菌B1213种子液相对于改良BSM 基础盐液体培养基的接种量的变化，对单位时间内的邻苯二甲酸二丁酯降解率有明显影响；通常情况下，接种量越多，单位时间内降解率越高；但是对最终降解率（发酵液中邻苯二甲酸二丁酯含量达到稳定时的降解率）没有明显影响。

上述方法，所述吡咯伯克霍尔德氏菌B1213种子液是由吡咯伯克霍尔德氏菌B1213培养获得的。在获得吡咯伯克霍尔德氏菌B1213的条件下，本领域技术人员通过常规操作即可以获得吡咯伯克霍尔德氏菌B1213种子液。

本发明中，对于某个成分的含量的百分比，如果没有特别说明，均指重量百分比（w/w）。

本发明所用专业术语说明：rpm是转速单位，1 rpm是指每分钟旋转一转。

有益效果：

（1）首次分离培养出能够降解邻苯二甲酸二丁酯的吡咯伯克霍尔德氏菌B1213；

（2）吡咯伯克霍尔德氏菌B1213对邻苯二甲酸二丁酯的降解率为45.5%-75.35%；

（3）本发明降解邻苯二甲酸二丁酯的方法，与本发明之前细菌、真菌降解邻苯二甲酸二丁酯的方法相比，在菌种来源上具有新意，降解率高，降解周期短，操作简单。

保藏信息：

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院 中国科学院微生物研究所；

保藏日期：2016年7月21日；

保藏编号：CGMCCNo.12806；

分类命名：吡咯伯克霍尔德氏菌（Burkholderia pyrrocinia）。

附图说明

图1为本发明的吡咯伯克霍尔德氏菌B1213在显微镜下的形态特征；图1中，吡咯伯克霍尔德氏菌B1213为杆状的革兰氏阴性菌，不能形成芽孢；

图2为通过高效液相色谱法测得的实施例2的DBP降解效果；图2中：a图是DBP空白对照的高效液相图谱，b图是DBP经过降解后的高效液相图谱；DBP基本在第7.825min出峰，降解后，DBP的峰面积减少；

图3为吡咯伯克霍尔德氏菌B1213的16SrDNA序列系统发育分析；

图4为吡咯伯克霍尔德氏菌B1213的recA序列系统发育树分析。

具体实施方式

下述实施例中，如无特殊说明，均为本领域常用方法。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1菌株B1213的鉴定

菌株B1213分离自土壤，其形态如图1所示，属于杆状的革兰氏阴性菌，不能形成芽孢。提取其基因组DNA，并利用16s rDNA和BCR1引物对于该基因组DNA进行聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)以增殖特定之DNA序列，并利用美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,简称NCBI)数据库进行菌株比对。

(1)16S rDNA 序列分析：

16s rDNA正向引物27F：5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’,如SEQ ID NO.1所示；

16s rDNA反向引物1492R：5'-ACG GTT ACC TTG TTA CGA CTT-3'，如SEQ ID NO.2所示；

扩增所得16S rDNA序列如SEQ ID NO：3所示，序列全长为1411bp。将该扩增所得16S rDNA序列与GenBank数据库中的相关菌株的基因序列进行比较，用MEGA4.1软件进行序列比对，采用临位连接法构建系统发育树，经1000次随机抽样，计算Bootstrap值，所构建的系统发育树如图3。图中发育树节点只显示Bootstrap值大于50％数值，上标的“T”表示模式菌株。从NCBI上可以查出菌株“B1213”与模式菌株Burkholderia stabilis LMG 28156、同源性达99.7％。

(2)recA基因序列分析

BCR1基因正向引物：5'-TgA CCg CCg AgA AgA gCA A-3' ，如SEQ ID NO.4所示；

BCR2基因反向引物：5'-CTC TTC TTC gTC CAT CgC CTC-3'，如SEQ ID NO.5所示；

扩增所得recA基因序列如SEQ ID NO：6所示，序列全长为974bp。将该扩增所得recA基因序列与GenBank数据库中的相关菌株的基因序列进行比较，用用MEGA4.1软件进行序列比对，采用临位连接法构建系统发育树，经1000次随机抽样，计算Bootstrap值，所构建的系统发育树如图4。图中发育树节点只显示Bootstrap值大于50％数值，上标的“T”表示模式菌株。从NCBI上可以查出菌株“B1213”与模式菌株Burkholderia pyrrocinia DSM10685T(CP011503)同源性达97.9％。

因此可以判定B1213为一种全新的吡咯伯克霍尔德氏菌。经过鉴定确认其所属菌种后，吡咯伯克霍尔德氏菌B1213于2016年7月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏编号为CGMCCNo.12806；此生物材料已经存活试验测试并通过该试验。

实施例2吡咯伯克霍尔德氏菌B1213液体摇瓶培养液制备

（1）斜面培养：吡咯伯克霍尔德氏菌B1213接种于斜面培养基上，在40℃下培养48小时，得斜面菌株。所用斜面培养基，每1L中含有的成分为：葡萄糖2.0g、蛋白胨1.0g、酵母提取物0.5g、琼脂 1.8g，蒸馏水余量，pH为中性，115℃ 灭菌20 min。

（2）取斜面菌株接种到已灭菌的种子培养基中，在175 rpm、30℃的条件下恒温震荡培养24h，得到种子培养液。所用种子培养基，每1L中含有的成分为：硫酸铵0.5g、氯化钠4.0g、三水合磷酸钾0.5g、七水合硫酸镁0.4g、琼脂粉15g、酵母提取物5g、蒸馏水余量，pH7.0，121℃灭菌25min。

（3）将10μL的DBP （工业纯）以无菌操作加入含有50mL的改良BSM 基础盐液体培养基的摇瓶中，将吡咯伯克霍尔德氏菌B1213的种子培养液以1mL 的接种量接种到摇瓶中，在175r/min、30℃的条件下恒温震荡培养72h；得发酵液。所用改良BSM 基础盐液体培养基，每1L中含有的成分为：酵母提取物5g、硫酸铵0.5g、氯化钠4.0g、三水合磷酸钾0.5g、七水合硫酸镁0.4g、蒸馏水余量，pH7.0，121℃灭菌15min。

实施例3 DBP 标准曲线制定与含量测定

（1）高效液相色谱法（HPLC）制作标准曲线：取600μL DBP以甲醇为溶剂，制备成1mg/mL的DBP溶液，稀释十倍后分别取0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL 定容至2mL 离心管中，即浓度梯度（μg/mL）为10、20、30、40、50、60、70 分别用0.45μm 有机滤膜过滤后置于液相小瓶中待测。本实施例3中的高效液相检测条件为：色谱柱为Sepax Gp-C18 柱（150mm*4.6mm，5.0μm）；流动相为乙腈-水（83：17，V/V）；进样量10μL；流速1.0mL/min；柱温25C°；紫外检测器波长210nm。以DBP的峰面积为横坐标，以DBP的浓度为纵坐标，制作标准曲线；进而获得峰面积-浓度方程。

实施例4高效液相法检测DBP的降解率

（1）向实施例2获得的发酵液中加入与发酵液等量的乙腈对DBP 进行提取，超声（40KHZ，300W）辅助提取30min 后取其中2mL用乙腈定容至10mL，混合均匀后离心（12000rpm,10min），将离心后的上清液用有机滤膜（0.45μm）进行过滤，弃去初滤液，取续滤液置于液相小瓶中，以实施例3步骤（1）的检测条件，采用高效液相色谱仪（HPLC）进行检测。运行时间为20 分钟，读取保留时间在7 min左右的峰面积值，根据实施例3的峰面积-浓度方程，得续滤液中DBP的浓度，进而计算出发酵液中DBP的残留浓度。

（2）降解率的计算公式：降解率%= (C0-C)/C0*100%，C0 为用吡咯伯克霍尔德氏菌B1213降解之前的DBP 质量浓度（μg/mL）（即实施例2步骤（3）发酵之前摇瓶中混合液的DBP质量浓度：0.1713μg/mL），C 为发酵液中的DBP 残留浓度（μg/mL）。经计算，实施例2的降解率为55.96%。

实施例5吡咯伯克霍尔德氏菌B1213降解DBP的优化

将实施例2步骤（3）中的种子液接种量依次改为2、3、4、5、6mL，其他操作同实施例2。按照实施例4的步骤测定发酵液的DBP浓度，进而计算DBP的降解率。在不同接种量条件下，DBP降解率如表1所示。

实施例6

将实施例2步骤（3）中所用改良BSM 基础盐液体培养基的酵母提取物的含量依次修改为2、3、4、5、6、7、8、10g/L；其他操作同实施例2。按照实施例4的步骤测定发酵液的DBP浓度，进而计算DBP的降解率。在不同酵母提取物的含量条件下，DBP降解率如表2所示。

表1

种子液接种量（mL）	DBP降解率（%）
		0	0
1	55.96
		2	56.52
3	58.95
		4	63.51
5	69.64
		6	75.35

；

表2

酵母提取物的含量（g/L）	DBP降解率（%）
		0	0
2	45.5
		3	45.8
4	46.32
		5	55.96
6	65.32
		7	75.35
8	69.84
		10	67.78

<110>北京工商大学

<120>一株吡咯伯克霍尔德氏菌及其应用

<160>6

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>1

AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG 20

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成

<400>2

ACGGTTACCT TGTTACGACT T 21

<210>3

<211>1411

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

ACATGCAGTC GAACGGCAGC ACGGGTGCTT GCACCTGGTG GCGAGTGGCG AACGGGTGAG 60

TAATACATCG GAACATGTCC TGTAGTGGGG GATAGCCCGG CGAAAGCCGG ATTAATACCG 120

CATACGATCT ACGGATGAAA GCGGGGGACC TTCGGGCCTC GCGCTATAGG GTTGGCCGAT 180

GGCTGATTAG CTAGTTGGTG GGGTAAAGGC CTACCAAGGC GACGATCAGT AGCTGGTCTG 240

AGAGGACGAC CAGCCACACT GGGACTGAGA CACGGCCCAG ACTCCTACGG GAGGCAGCAG 300

TGGGGAATTT TGGACAATGG GCGAAAGCCT GATCCAGCAA TGCCGCGTGT GTGAAGAAGG 360

CCTTCGGGTT GTAAAGCACT TTTGTCCGGA AAGAAATCCT TGGCTCTAAT ACAGTCGGGG 420

GATGACGGTA CCGGAAGAAT AAGCACCGGC TAACTACGTG CCAGCAGCCG CGGTAATACG 480

TAGGGTGCGA GCGTTAATCG GAATTACTGG GCGTAAAGCG TGCGCAGGCG GTTTGCTAAG 540

ACCGATGTGA AATCCCCGGG CTCAACCTGG GAACTGCATT GGTGACTGGC AGGCTAGAGT 600

ATGGCAGAGG GGGGTAGAAT TCCACGTGTA GCAGTGAAAT GCGTAGAGAT GTGGAGGAAT 660

ACCGATGGCG AAGGCAGCCC CCTGGGCCAA TACTGACGCT CATGCACGAA AGCGTGGGGA 720

GCAAACAGGA TTAGATACCC TGGTAGTCCA CGCCCTAAAC GATGTCAACT AGTTGTTGGG 780

GATTCATTTC CTTAGTAACG TAGCTAACGC GTGAAGTTGA CCGCCTGGGG AGTACGGTCG 840

CAAGATTAAA ACTCAAAGGA ATTGACGGGG ACCCGCACAA GCGGTGGATG ATGTGGATTA 900

ATTCGATGCA ACGCGAAAAA CCTTACCTAC CCTTGACATG GTCGGAATCC CGCTGAGAGG 960

TGGGAGTGCT CGAAAGAGAA CCGATACACA GGTGCTGCAT GGCTGTCGTC AGCTCGTGTC 1020

GTGAGATGTT GGGTTAAGTC CCGCAACGAG CGCAACCCTT GTCCTTAGTT GCTACGCAAG 1080

AGCACTCTAA GGAGACTGCC GGTGACAAAC CGGAGGAAGG TGGGGATGAC GTCAAGTCCT 1140

CATGGCCCTT ATGGGTAGGG CTTCACACGT CATACAATGG TCGGAACAGA GGGTTGCCAA 1200

CCCGCGAGGG GGAGCTAATC CCAGAAAACC GATCGTAGTC CGGATTGCAC TCTGCAACTC 1260

GAGTGCATGA AGCTGGAATC GCTAGTAATC GCGGATCAGC ATGCCGCGGT GAATACGTTC 1320

CCGGGTCTTG TACACACCGC CCGTCACACC ATGGGAGTGG GTTTTACCAG AAGTGGCTAG 1380

TCTAACCGCA AGGAGGACGG TCACCACGGT A 1411

<210>4

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<400>4

TgACCgCCgA gAAgAgCAA 19

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成

<400>5

CTCTTCTTCg TCCATCgCCT C 21

<210>6

<211>974

<212>DNA

<213>人工合成

<400>6

TCATGCGCAT GGGCGACGGC GAGGCGGCCG AAGACATCCA GGTCGTCTCC ACGGGTTCGC 60

TGGGGCTCGA CATCGCGCTT GGCGTCGGCG GCTGCCGCGC GGCCGGGTGG TCGAGATCTA 120

CGGCCCGGAA TCGTCCGGTA AAACCACGCT CACGCTGCAG GTCATCGCCG AACTGCAGAA 180

GATCGGCGGC ACGGCCGCGT TCATCGACGC CGAACACGCG CTCGACGTTC AATATGCGTC 240

GAAGCTCGGC GTGAACGTGC CGGAACTGCT GATCTCGCAG CCGGACACCG GCGAACAGGC 300

ACTGGAAATC ACCGATGCGC TGGTGCGCTC GGGCTCGGTC GACATGATCG TCATCGACTC 360

GGTCGCGGCG CTCGTGCCGA AGGCCGAAAT CGAAGGCGAG ATGGGCGATT CGCTGCCGGG 420

CCTGCAGGCT CGCCTGATGT CGCAGGCGCT GCGCAAGCTG ACCGGCACGA TCAAGCGCAC 480

GAACTGCCTG GTGATCTTCA TCAACCAGAT TCGCATGAAG ATCGGCGTGA TGTTCGGCAA 540

CCCGGAAACC ACGACGGGCG GCAACGCGCT GAAGTTCTAT GCGTCGGTGC GTCTCGATAT 600

CCGCCGGATC GGCTCGATCA AGAAGAACGA CGAGGTGATC GGCAACGAAA CCCGCGTGAA 660

GGTCGTCAAG AACAAGGTGT CGCCGCCGTT CCGCGAAGCG ATCTTCGACA TCCTGTATGG 720

CGAGGGCATT TCGCGTCAGG GCGAGATCAT CGATCTCGGC GTGCAGGCAA AGATCGTCGA 780

CAAGGCGGGC GCCTGGTACA GCTACAACGG CGAGAAGATC GGCCAGGGCA AGGACAACGC 840

GCGTGAATTC CTGCGCGAGA ATCCGGAAAT CGCACGCGAG ATCGAAAACC GCATCCGCGA 900

ATCGCTCGGC GTCGTCGCCA AGGCGCTGGC GGCCGCACTC GCGCAGATCG AGAAGCAGTT 960

CGGCAAAGGG TCGA 974

Claims (9)

1.一株吡咯伯克霍尔德氏菌（Burkholderia pyrrocinia）B1213，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏编号为CGMCCNo.12806；保藏时间为2016年7月21日。

2.根据权利要求1所述吡咯伯克霍尔德氏菌B1213，属于杆状的革兰氏阴性菌，不能形成芽孢。

3.一种权利要求1或2所述吡咯伯克霍尔德氏菌B1213的用途，用于降解邻苯二甲酸二丁酯。

4.一种采用权利要求1或2所述吡咯伯克霍尔德氏菌B1213降解邻苯二甲酸二丁酯的方法：在酵母提取物存在的条件下，吡咯伯克霍尔德氏菌B1213与邻苯二甲酸二丁酯接触。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在改良BSM基础盐液体培养基存在的条件下，吡咯伯克霍尔德氏菌B1213与邻苯二甲酸二丁酯接触；所述改良BSM基础盐液体培养基，每1L中含有以下成分：酵母提取物2-10g，硫酸铵0.5g，氯化钠4.0g，三水合磷酸钾0.5g，七水合硫酸镁0.4g，蒸馏水余量；pH7.0。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，改良BSM基础盐液体培养基中酵母提取物的含量为7g/L。

7.根据权利要求4、5或6所述的方法，其特征在于，是将邻苯二甲酸二丁酯加入改良BSM基础盐液体培养基；将吡咯伯克霍尔德氏菌B1213种子液接种于改良BSM 基础盐液体培养基，在150-200rpm、30-35℃的条件下恒温震荡培养。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，转速175rpm，温度30℃。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述吡咯伯克霍尔德氏菌B1213种子液是由吡咯伯克霍尔德氏菌B1213培养获得的。