CN111394382B - 阿魏酸酯酶BpFae基因的重组表达载体和重组菌，及重组表达的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种阿魏酸酯酶BpFae基因的重组表达载体和重组菌，并提供优化的表达条件的重组表达所述酶的方法。以出发载体是pGEX‑4T‑1构建含有本发明的阿魏酸酯酶BpFae基因表达载体，当以IPTG为诱导剂时，最优条件是：采用SOB培养基；初始pH：5.0；接种量：0.8％(v/v)；诱导时机：4h；IPTG浓度：0.05mM；诱导温度：26℃；摇床转速：240rpm；诱导时间：24h，如此获得的BpFae活性最高可达2.54U/mL；当以乳糖为诱导剂，采用LB培养基；乳糖浓度：6g/L；初始pH：5.5；诱导时机：5h；诱导温度：23℃；摇床转速：240rpm；装液量：50mL/250mL；接种量：0.2％(v/v)；诱导时间：32h，如此获得的BpFae活性最高可达7.43U/mL。本发明的最优诱导表达条件，可以更高效的制备阿魏酸酯酶BpFae。

Description

阿魏酸酯酶BpFae基因的重组表达载体和重组菌，及重组表达 的方法

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及阿魏酸酯酶、其编码基因及其应用。

背景技术

植物细胞壁中的碳水化合物组分是现存最大的可再生资源库，而每年在全球范围内会产生数百万吨的农业废弃物，这不仅造成了大量的资源浪费，同时给环境保护带来很大压力[Nieter,A.,et al.,Feruloyl esterases from Schizophyllum commune totreat food industry side-streams.Bioresource Technology,2016.220:p.38-46；Nieter,A.,et al.,A p-coumaroyl esterase from Rhizoctonia solani with apronounced chlorogenic acid esterase activity.N Biotechnol,2017.37(Pt B):p.153-161.]。随着社会的高速发展，人类对能源利用的需求持续增加，同时不可再生资源日益减少。因此，人们可持续发展的意识不断增强，越来越多的研究关注可再生资源如生物质的开发与利用。生物质利用的关键是将木质纤维素转化为可发酵的低分子量碳源。而植物细胞壁的成分多样且结构复杂，诸多因素如纤维素的结晶度和聚合度等，使得生物质资源的利用变得困难。降解木质纤维素需要多种纤维素酶、半纤维素酶及相关辅助酶的协同作用[Oliveira,D.M.,et al.,Feruloyl esterases:Biocatalysts to overcome biomassrecalcitrance and for the production of bioactive compounds.BioresourTechnol,2019.278:p.408-423；Xu,Z.,T.Wang,and S.Zhang,Extracellular secretionof feruloyl esterase derived from Lactobacillus crispatus in Escherichia coliand its application for ferulic acid production.Bioresource Technology,2019.288.]，先前的工作主要集中在纤维素酶和半纤维素酶上，而对辅助酶的研究相对较少。在众多的辅酶中，能够水解多糖和羟基肉桂酸酯之间酯键的阿魏酸酯酶(FAEs)越来越受到关注。

阿魏酸酯酶(FAEs，EC 3.1.1.73)是羧酸酯酶的一个亚类，通过水解羟基肉桂酸和植物多糖之间的酯键[Schulz,K.,et al.,A type D ferulic acid esterase fromStreptomyces werraensis affects the volume of wheat dough pastries.AppliedMicrobiology and Biotechnology,2018.102(3):p.1269-1279；Topakas,E.,C.Vafiadi,and P.Christakopoulos,Microbial production,characterization and applicationsof feruloyl esterases.Process Biochemistry,2007.42(4):p.497-509]，从木质纤维素中释放羟基酚酸，如阿魏酸、对香豆酸、咖啡酸和芥子酸，另外还可以通过酯化及转酯作用合成羟基肉桂酸酯衍生物。因此，阿魏酸酯酶在各种工业领域中具有广泛的应用潜力[Dilokpimol,A.,et al.,Diversity of fungal feruloyl esterases:updatedphylogenetic classification,properties,and industrial applications.BiotechnolBiofuels,2016.9:p.231.]。例如，在纸浆漂白过程中添加阿魏酸酯酶可以有效降低能耗[Record,E.,et al.,Overproduction of the Aspergillus niger feruloyl esterasefor pulp bleaching application.Appl Microbiol Biotechnol,2003.62(4):p.349-55.]；在饲料中添加阿魏酸酯酶，可以改善主链降解酶的可及性，从而促进纤维素的消化并且提高植物营养素的生物利用度[Dilokpimol,A.,et al.,Biotechnol Biofuels,2016.9:p.231]；在生物乙醇制备过程中，阿魏酸酯酶是木质纤维素完全水解所必需的辅助酶。另外，阿魏酸酯酶在食品工业中也有广泛用途，例如去除异味，增强调味品和酒精饮料的香气[Dilokpimol,A.,et al.,Biotechnol Biofuels,2016.9:p.231]，以及在烘焙过程中改善面团的流变性等[Schulz,K.,et al.,Applied Microbiology and Biotechnology,2018.102(3):p.1269-1279]。

阿魏酸酯酶的另一重要应用是在降解生物质的同时释放阿魏酸。阿魏酸因具有特殊的结构特性，被广泛应用在多个领域。在化妆品工业中，阿魏酸被当作抗氧化剂、紫外线吸收剂和脱色剂[Zdunska,K.,et al.,Antioxidant Properties of Ferulic Acid andIts Possible Application.Skin Pharmacol Physiol,2018.31(6):p.332-336.]；此外，阿魏酸还具有抗菌、抗炎、抗糖尿病、抗血栓形成、抗癌和降胆固醇等医疗功能，因此也被广泛应用在医疗领域[Ou,S.and K.Kwok,Ferulic acid:pharmaceutical functions,preparation and applications in foods.J Sci Food Agric,2004.84(11):p.1261-1269.]。而在食品工业中，阿魏酸的天然抗菌和抗氧化活性，使得它成为一种优良的保鲜剂。

自然界中的阿魏酸酯酶广泛存在于植物及微生物中，主要来源为微生物。无论在工业和农业当中，阿魏酸酯酶都具有很大的应用潜力。迄今为止，研究人员已经从微生物中分离和鉴定了80多种阿魏酸酯酶，其中主要来源于真菌，细菌来源的阿魏酸酯酶数量有限。另外，由野生型菌株分泌的阿魏酸酯酶活性相对较低且产酶过程耗时较长[Yang,S.,etal.,Biochemical characteristics and gene cloning of a novel thermostableferuloyl esterase from Chaetomium sp.J Mol Catal B Enzym,2013.97:p.328-336；Donaghy,J.,P.F.Kelly,and A.M.McKay,Detection of ferulic acid esteraseproduction by Bacillus spp.and lactobacilli.Appl Microbiol Biotechnol1998.50:p.257-260；Rumbold,K.,et al.,Purification and properties of a feruloylesterase involved in lignocellulose degradation by Aureobasidiumpullulans.Appl Environ Microbiol,2003.69(9):p.5622-6.]。此外，与丰富的基因资源相比，目前进行分离和特性表征的阿魏酸酯酶仍然非常有限，并且制备包括用基因重组方法获得阿魏酸酯酶的效率需要提高。

发明内容

针对上述需求，本发明从吡咯伯克霍尔德氏菌Burkholderia pyrrocinia B1213中克隆到一种新的阿魏酸酯酶BpFae，并构建了合适的重组载体，进行优化的诱导表达而完成本发明。

本发明中用到的阿魏酸酯酶BpFae，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。相应地，其编码基因的具体核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

因此，本发明首先提供阿魏酸酯酶BpFae基因的重组表达载体，其中所述基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，而更优选地所述重组表达载体的出发载体是pGEX-4T-1。

本发明另一方面提供一种阿魏酸酯酶BpFae基因的重组表达载体的制备方法，其中所述基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，其特征在于：用引物扩增含有所述基因的模板获得所述基因的扩增产物，然后与用限制性内切酶酶切的表达载体相连接，获得重组表达载体，其中所述表达载体优选为pGEX-4T-1。另一方面，优选地，所述基因与标签蛋白融合，更具体例如与组氨酸标签融合，以实现融合表达，便于纯化。

在一个具体实施方式中，用如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示引物X1和X2扩增含有所述基因的模板获得所述基因的扩增产物，然后用SaI I和BamH I双酶切表达载体pGEX-4T-1，再将所述扩增产物与双酶切的表达载体pGEX-4T-1相连接，得到重组表达载体。

本发明还提供含有所述的重组表达载体，或如所述制备方法得到的重组载体的重组细胞，优选地重组细胞是大肠杆菌，更优选为大肠杆菌BL21。

本发明进一步提供一种重组表达阿魏酸酯酶BpFae基因的方法，其包括培养如所述的重组细胞，用IPTG或乳糖作为诱导剂进行诱导表达，再收集表达的阿魏酸酯酶BpFae的步骤。

更具体地，采用乳糖作为诱导剂，且采用的LB培养基进行培养；或者采用IPTG作为诱导剂，且采用的SOB培养基进行培养。

其中，对于乳糖作为诱导剂时，优选的，其中LB培养基中添加诱导剂乳糖的浓度为3-9g/L，优选为4-8g/L，更优选为5-7g/L。在优选实施方式中，在接种培养后2-8小时，优选3-7小时，更优选为4-6小时，最优选为5小时后用乳糖进行诱导表达，诱导时的培养温度为20-25℃，优选21-24℃，摇床转速200-280rpm，优选为220-260rpm，更优选为230-250rpm；诱导时间优选为32小时后收集表达的阿魏酸酯酶BpFae。另外优选地，菌种的初始接种量为0.1-0.3％(v/v)；初始pH：5-6；装液量为装液量为40-60mL/250mL。

其中，对于IPTG作为诱导剂时，优选的培养条件如下：采用SOB培养基进行培养；初始pH：4.5-5.5；接种量：0.6-1.0％(v/v)；诱导时机：3-5h；IPTG添加的浓度：0.03-0.07mM；诱导温度：24-28℃；摇床转速：220-260rpm；诱导时间优选为24小时后收集表达的阿魏酸酯酶BpFae。

通过研究和实验表明，本发明构建的pGEX-4T-1-BpFae重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)细胞中，诱导表达，酶活测定结果显示，总蛋白酶活为0.60U/mL，粗酶液酶活为0.40U/mL，而沉淀中也有少量酶活(0.16U/mL)。粗酶液酶活分别是重组菌pET-28a-BpFae和pCold-TF-BpFae所表达的BpFae粗酶液酶活的80倍和10倍。而在优化诱导表达研究中，以出发载体是pGEX-4T-1构建含有本发明的的阿魏酸酯酶BpFae基因表达载体，当以IPTG为诱导剂时，最优条件是：采用SOB培养基；初始pH：5.0；接种量：0.8％(v/v)；诱导时机：4h；IPTG浓度：0.05mM；诱导温度：26℃；摇床转速：240rpm；诱导时间：24h。经过单因素优化实验，BpFae活性最高可达2.54U/mL；当以乳糖为诱导剂，采用LB培养基；乳糖浓度：6g/L；初始pH：5.5；诱导时机：5h；诱导温度：23℃；摇床转速：240rpm；装液量：50mL/250mL；接种量：0.2％(v/v)；诱导时间：32h。经过单因素优化实验、PB实验、最陡爬坡实验和响应面分析，BpFae活性最高可达7.43U/mL。由此确定的最优的诱导表达条件，可以更高效的制备阿魏酸酯酶BpFae。

附图说明

图1BpFae与三种序列一致性最高且结构已知的酯酶之间多序列比对。

图2凝胶电泳验证目的基因BpFae。

图3SDS-PAGE分析pET28a载体表达各组分。其中，M：分子量Marker；1、3、5和7泳道：空白载体对照，BL21(DE3)-pET-28a；泳道2、4、6和8：BL21(DE3)-pET-28a-BpFae。泳道1和2：培养基的上清液；泳道3和4：总蛋白；泳道5和6：粗酶液；泳道7和8：沉淀。预测His-BpFae的分子量为59kDa，与在凝胶中观察到的结果一致。

图4SDS-PAGE分析pCold-TF载体表达各组分。其中，M：分子量Marker；1、3、5和7泳道：空白载体对照，BL21(DE3)-pCold-TF；泳道2、4、6和8：BL21(DE3)-pCold-TF-BpFae。泳道1和2：培养基的上清液；泳道3和4：总蛋白；泳道5和6：粗酶液；泳道7和8：沉淀。预测融合蛋白TF-BpFae的分子量为111kDa，与在凝胶中观察到的结果一致。

图5融合蛋白GST-BpFae表达。其中，a:SDS-PAGE分析pGEX-4T-1载体表达各组分。M：分子量Marker；1、3、5和7泳道：空白载体对照，BL21(DE3)-pCold-TF；泳道2、4、6和8：BL21(DE3)-pCold-TF-BpFae。泳道1和2：培养基的上清液；泳道3和4：总蛋白；泳道5和6：粗酶液；泳道7和8：沉淀。b,各组分酶活分析。

图6不同粗酶液的阿魏酸酯酶酶谱分析。其中，以阿魏酸甲酯为底物样品各表达载体的粗酶液。其中，1：pGEX-4T-1-BpFae；2：pCold-TF-BpFae；3：pET-28a-BpFae。

图7IPTG诱导产酶条件优化，其中，培养基(A)，IPTG浓度(B)，诱导温度(C)和诱导时间(D)对BpFae活性的影响。

图8培养基类型对BpFae酶活的影响。

图9乳糖浓度对BpFae酶活的影响。

图10培养基初始pH对BpFae酶活的影响。

图11诱导时机对BpFae酶活的影响。

图12诱导温度对BpFae酶活的影响。

图13摇床转速对BpFae酶活的影响。

图14装液量对BpFae酶活的影响。

图15诱导时间对BpFae酶活的影响。

图16各因素两两交互作用对BpFae活性影响的3D曲面图。(a)诱导温度和诱导时间对BpFae活性影响的曲面图；(b)诱导温度和摇床转速对BpFae活性影响的曲面图；(c)诱导时间和摇床转速对BpFae活性影响的曲面图。

具体实施方式

下面通过具体的实施方式或实施例对本发明作进一步的阐述，以便更好的理解本发明。

下述实施例中对相关的操作或方法若无特别说明，都是本领域常规操作或方法。对试剂和仪器若无特别说明，则是常规可获得或商业途径可以购买得到的。

试验材料

菌株：菌株B.pyrrocinia B1213从土壤中分离得到，经鉴定并于2016年7月21日保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC，No.12806(见中国专利申请CN201610880271.X)。大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)(Takara，日本)分别用于质粒制备和蛋白质表达。质粒pET28a，pCold-TF，pGEX-4T-1用于构建表达载体。

试剂：EZgene质粒提取试剂盒和E.Z.N.A.凝胶提取试剂盒分别购自美国Biomiga公司和美国Omega Bio-tek公司。用于基因操作的限制酶和其他试剂均购自日本Takara公司。

阿魏酸甲酯和阿魏酸、均购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)。所有其它化学品均为分析纯。

培养基：以下培养基的配制方法主要参考文献[Golotin,V.A.,et al.,Optimization of cold-adapted alpha-galactosidase expression in Escherichiacoli.Protein Expr Purif,2016.123:p.14-8]。

LB培养基(1L)：5g酵母提取物，10g胰蛋白胨，10g NaCl；

SOB培养基(1L)：5酵母提取物，20胰蛋白胨，0.5NaCl，10ml 0.25mol/L KCl溶液，5ml 2mol/L MgCl2·6H2O；

TB培养基(1L)：24g酵母提取物，12g胰蛋白胨，4mL甘油，100mL 0.17mol/L KH2PO4和0.72mol/L K2HPO4·3H2O缓冲溶液；

TB-GN培养基(1L)：24g酵母提取物，12g酪蛋白胨，6mL甘油，10g NaCl，100mL0.17mol/L KH2PO4和0.72mol/L K2HPO4·3H2O缓冲溶液；

LBBM培养基(1L)：5g酵母提取物，10g胰蛋白胨，10g NaCl，100mL 0.17mol/LKH2PO4和0.72mol/L K2HPO4·3H2O缓冲溶液，5ml 2mol/L MgCl2·6H2O；

LBBNM培养基(1L)：5g酵母提取物，10g胰蛋白胨，30g NaCl，100mL 0.17mol/LKH2PO4和0.72mol/L K2HPO4·3H2O缓冲溶液，5ml 2mol/L MgCl2·6H2O；

LBBMG培养基(1L)：5g酵母提取物，10g胰蛋白胨，10g NaCl，100mL 0.17mol/LKH2PO4和0.72mol/L K2HPO4·3H2O缓冲溶液，5ml 2mol/L MgCl2·6H2O，4mL甘油；

LBBSMG培养基(1L)：5g酵母提取物，10g胰蛋白胨，10g NaCl，100mL 0.17mol/LKH2PO4和0.72mol/L K2HPO4·3H2O缓冲溶液，5ml 2mol/L MgCl2·6H2O，4mL甘油，72g山梨糖醇；

MX培养基(1L)：5g酵母提取物，10g胰蛋白胨，100mL 0.17mol/L KH2PO4和0.72mol/L K2HPO4·3H2O缓冲溶液，5ml 2mol/L MgCl2·6H2O，4mL甘油，72g山梨糖醇。

下述实验中，数据测定中每种处理重复三次，结果表示为平均值±标准偏差。所有统计分析均使用OriginPro 8.6和Excel 2016完成。

实施例一：BpFae生物信息学分析

通过(http://www.expasy.ch)在线预测阿魏酸酯酶BpFae的理论分子量和等电点；通过Signal P分析预测蛋白BpFae是否存在信号肽；通过MEGA X和ESPript 3(http:// espript.ibcp.fr)进行多序列比对；系统发生树同样由MEGA X并采用Neighbor-Joining方法构建；采用Discovery Studio软件，根据同源建模法构建蛋白BpFae的三维结构。采用PyMOL(http://pymol.org)对BpFae的三维模型进行渲染与展示。

通过分析发现其中存在一个1719bp的开放阅读框(ORF)，编码一个假想的573个氨基酸的阿魏酸酯酶，命名为BpFae。在线预测其分子量为59.04kDa，pI为5.09。SignalP 4.1分析表明BpFae存在19个氨基酸的信号肽。BpFae的分子量大于大多数细菌来源的阿魏酸酯酶(27-45kDa)。此外，BpFae和三种结构已知的酯酶之间进行多序列比对(图1)，表明BpFae存在酯酶当中高度保守的“Gly-x-Ser-x-Gly”模体。另外，BpFae具有典型的Ser-Asp-His催化三联体结构(Ser 209，His 492，Asp 455)。

实施例二：BpFae克隆表达

1、BpFae基因克隆

前期对菌株B.pyrrocinia B1213进行了全基因组测序及功能基因注释。采用细菌基因组抽提试剂盒提取该菌株总DNA。根据编码BpFae蛋白的基因序列设计引物F/R(表1)，用于目的基因克隆。以基因组DNA为模板，扩增目的基因BpFae。PCR反应体系(50μL)包含5μLLA-Taq缓冲液，5μL dNTP(2.5mM)，1μL基因组DNA，1μL F引物(10mM)，1μL R引物(10mM)，0.5μL LA-Taq聚合酶(2.5UμL^–1)，加水至50μL。扩增条件：95℃预变性5min，30个循环：94℃变性30s，65℃退火1.5min，72℃延伸1min；72℃再延伸10min。用质量分数1％的琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测，然后将PCR产物连接到pMD-18T载体，并送至北京诺赛基因组研究中心有限公司进行测序。

表1 PCR扩增引物

注：酶切位点BamH I由实线划出，Sal I由虚线划出。

2、表达载体构建

以含有BpFae基因的重组质粒pMD-18T-BpFae为模板，设计引物A1/A2，D1/D2和X1/X2(表1)，PCR扩增带有酶切位点(SaI I和BamH I)和相应表达载体同源片段的BpFae基因。分别对质粒pET-28a，pCold-TF和pGEX-4T-1进行双酶切。使用NovoRec plus一步PCR克隆试剂盒(Novoprotein，上海)，将PCR产物分别连接到不同表达载体上。

通过PCR扩增得到B.pyrrocinia B1213的BpFae基因，并将其成功克隆到载体pMD18-T中，通过凝胶电泳验证目的基因BpFae(图2)。采用相应引物扩增得到带有酶切位点和载体同源序列的BpFae基因，并分别将其成功克隆到表达载体pET-28a，pCold-TF和pGEX-4T-1中。将成功构建的重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)细胞中。

3、诱导表达

分别将测序成功的重组质粒转入表达宿主大肠杆菌BL21中，接种在100ml含有抗性的LB液体培养基中(对于质粒pGEX-4T-1-BpFae和pCold-TF-BpFae加入100μg/ml的氨苄青霉素，而对于质粒pET28a-BpFae需加入40μg/ml的卡那霉素)，于37℃，220rpm培养至OD₆₀₀为0.6-0.8，加入0.1mM IPTG进行诱导，并分别在20℃(pGEX-4T-1-BpFae和pET28a-BpFae)和15℃(pCold-TF-BpFae)下再培养20小时。

将培养液在4℃以9400×g离心10min，分离培养基上清液与细胞。加裂解缓冲液(50mM磷酸钾，pH 7.0)将离心所得的细胞进行重悬。通过超声处理(100W，20kHz：开2s，停3s；总时间：15min)裂解细胞。取细胞裂解液为总蛋白；将细胞裂解液以15,000×g离心15min，上清液为粗酶液，沉淀物为不溶组分。

通过SDS-PAGE检测蛋白的表达：将20μL样品与5μL 5×SDS上样缓冲液混匀煮沸后，进行SDS-PAGE分析。浓缩胶浓度为4.5％，分离胶浓度为10％，100V恒压电泳。

酶活的测定方法：用磷酸钠缓冲液(50mM，pH 7.0)将阿魏酸甲酯(25mM，溶于DMSO)稀释至1mM，作为底物溶液。取450μL底物溶液于37℃下预热5min，然后加50μL稀释的酶液，混合后在37℃下反应10min。加入500μL乙腈终止反应。通过高效液相色谱分析底物及产物，采用UV检测器，色谱柱为ZORBAX Eclipse Plus C-18色谱柱。样品通过0.22μm过滤器过滤，待测。流动相为7：3(v/v)的溶剂A(乙腈)和溶剂B(水和乙酸，99：1，v/v)组成，并以0.6mL/min的恒定流速进行洗脱。检测波长为320nm，温度为35℃。将阿魏酸酯酶酶活单位(U)定义为在上述标准条件下1分钟内释放1μmol阿魏酸所需的酶量。

将构建成功的pET28a-BpFae重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)细胞中，诱导表达。SDS-PAGE结果显示(图3)，目的蛋白条带出现在60kDa附近，但该条带只存在于总蛋白组分和沉淀组分样品中，而在上清中不存在。表明重组目的蛋白在表达过程中形成包涵体。酶活测定结果显示，仅总蛋白组分(0.005U/mL)和上清液(0.005U/mL)有极低酶活力。

将构建成功的pCold-TF-BpFae重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)细胞中，诱导表达。融合蛋白TF-BpFae的理论分子量为111kDa。SDS-PAGE结果显示(图4)，与pET28a-BpFae系统的表达相比，在TF和冷休克启动子cspA的辅助下，融合蛋白TF-BpFae实现了可溶性表达。但是，酶活测定表明可溶性蛋白的酶活仍然很低(0.04U/mL)。尽管融合蛋白TF-BpFae的活性高于pET28a-Bpfae。但考虑到分子伴侣TF的存在可能影响蛋白质功能。为此，去除了融合标签TF，但酶活没有发生改变，仍然很低(数据未显示)。这表明目的蛋白即使实现了可溶性表达，但蛋白错误折叠导致没有活性。

将构建成功的pGEX-4T-1-BpFae重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)细胞中，诱导表达。融合蛋白GST-BpFae的理论分子量为85kDa左右，但SDS-PAGE结果显示(图5)在该处并没有蛋白条带，而在60kDa左右出现疑似目的蛋白条带，这与没有融合GST标签的目标蛋白大小一致，并且大多数目标蛋白实现了可溶性表达。导致这一现象的原因可能是GST融合标签在表达过程中被水解或以其他机制裂解。酶活测定结果显示，总蛋白酶活为0.60U/mL，粗酶液酶活为0.40U/mL，而沉淀中也有少量酶活(0.16U/mL)。粗酶液酶活分别是重组菌pET-28a-BpFae和pCold-TF-BpFae所表达的BpFae粗酶液酶活的80倍和10倍。

4、BpFae酶谱分析

使用Tris-Gly缓冲液(25mM Tris，200mM甘氨酸，pH 8.3，含10％甘油)将粗酶液稀释两倍。对蛋白样品进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)，分离胶浓度为7.5％。采用Tris-Gly缓冲液，将电泳槽置于冰水混合物中进行低温电泳，防止蛋白变性。电泳结束，用蒸馏水洗涤凝胶3次，然后用MOPS缓冲液(2.5mM，pH 7.2)平衡30min。然后将平衡好的凝胶浸泡在MOPS缓冲液中，含有阿魏酸甲酯5mM，酚红0.02％，37℃下温浴20分钟后检测活性。在有阿魏酸酯酶存在的位置会显出黄色条带。

为了进一步验证不同载体表达目的蛋白的阿魏酸酯酶的活性，对三种融合BpFae的粗酶液进行酶谱分析(图6)。结果显示，只有pGEX-4T-1-BpFae显示出黄色条带，与酶活测定结果一致，因此pGEX-4T-1-BpFae实现了目的蛋白的可溶性及活性表达。

实施例三：诱导表达条件的优化

1、IPTG诱导产酶条件优化

以IPTG为诱导剂，对重组菌pGEX-4T-1-BpFae产BpFae的发酵条件进行了优化，旨在提高BpFae的表达水平。主要对培养基种类、初始pH值、IPTG浓度、接种量、诱导时机、诱导温度、摇床转速和诱导时间等几个因素进行了优化(表1)。

表1 IPTG诱导产酶条件优化的因素及水平

因素	水平
		培养基类型	LB,TB,LBBM,LBBNM,LBBMG,LBBSMG,MX,TB-GN和SOB
IPTG浓度(mM)	0.025,0.05,0.1,0.25,0.5和1
		接种量(％,v/v)	0.1,0.2,0.4,0.8,1.6和3.2
初始pH	4.0,5.0,6.0,7.0,8.0和9.0
		诱导温度(℃)	18,20,22,24,26,28和30
摇床转速(rpm)	180,200,220,240,260和280
		诱导时机(h)	2,4,5,6和8
诱导时间(h)	12,24,36,48,60和72

结果表明，培养基的组成可以显著影响重组蛋白的表达。为了选择适合于BpFae诱导表达的培养基，比较了9种常用培养基：MX，LBBSMG，TB-GN，LBBM，LB，LBBMG，TB，LBBNM和SOB。如图7A所示，重组蛋白GST-BpFae在SOB培养基中酶活最高为0.47U/mL。因此，选择SOB培养基用于诱导表达。

考察IPTG浓度对BpFae酶活的影响。如图7B所示，酶活随着IPTG浓度增加而增加，当IPTG浓度为0.05mM时，酶活最高为1.15U/mL；当IPTG浓度继续增高，则酶活迅速下降。因此，选择0.05mM IPTG用于诱导表达。

研究了诱导温度对BpFae酶活的影响(图7C)。较低的温度(18-22℃)不利于细胞的生长，而较高的温度(28-30℃)促进了目标蛋白质的聚集，不利于蛋白质可溶性表达，因此，在26℃时，酶活最高为1.79U/mL。另外，还对其它发酵条件进行了优化，包括SOB培养基的初始pH(5.0)，诱导时机(4h)，接种量(0.8％，v/v)和摇床转速(240rpm)。最后考察了诱导时间对BpFae活性的影响。如图7D所示，起初，酶活随着诱导时间增加而增加，当诱导时间为24h，酶活达到最高为2.54U/mL。诱导时间继续增加，酶活则急剧下降。

在最优发酵条件下：SOB培养基，初始pH为5.0，接种量为0.8％(v/v)，诱导时机为4h，IPTG浓度为0.05mM，诱导温度为26℃，摇床转速240rpm，诱导时间为24h，重组菌(pGEX-4T-1-BpFae)经诱导表达产生的BpFae活性与优化前相比提高了6倍以上(2.54U/mL)。

2、乳糖诱导产酶条件优化

2.1单因素优化实验

采用单一变量法对乳糖诱导产BpFae的发酵条件进行单因素优化(表3)。

表3 乳糖诱导产酶条件优化的因素及水平

因素	水平
		培养基类型	LBBMG,LB,TB,SOB,MX,LBBM,TB-GN,LBBSMG and LBBNM
乳糖浓度(g/L)	0,2,4,6,8,10 and 12
		接种量(％)	0.1,0.2,0.4,0.8,1.6 and 3.2
初始pH	4.0,5.0,5.5,6.0,7.0,8.0 and 9.0
		诱导温度(℃)	16,20,24,28 and 32
摇床转速(rpm)	80,120,160,200 and 240
		诱导时机(h)	2,4,5,6,8 and 10
装液量(mL/250mL)	12.5,25,50,75,100 and 125
		诱导时间(h)	4,8,12,16,20,24 and 28

如图8所示，在乳糖作为诱导剂时，LB培养基是最佳的表达培养基。这与IPTG作为诱导剂时的情况(最佳培养基是SOB培养基)不同。

乳糖浓度也是影响BpFae活性的重要因素。在本研究中，设置了7个不同的乳糖浓度(0、2、4、6、8、10和12g/L)。如图9所示，当乳糖浓度较低(2-4g/L)时，BpFae的活性较高，而在乳糖浓度较高时，BpFae活性反而降低。当乳糖浓度为4g/L时，最高BpFae活性为2.31U/mL。该结果比之前使用最佳浓度的IPTG诱导时的BpFae活性(即1.15U/mL)高2.0倍以上。

在4-9的pH范围内考察了BpFae表达的最佳pH值。由图10可以看出，BpFae的活性随着pH值的升高先升高后降低，而且BpFae的活性在pH值为5.5-6.0的范围内最高，与IPTG诱导时的最佳pH相比略高(最适pH值为5.0)。

诱导时机对外源蛋白的表达也具有重要影响。在本发明的研究中，最佳的诱导时机为4-6h(OD₆₀₀为～2.5)，此时细胞处于对数生长中期(图11)。这一结果与使用IPTG作为诱导剂时获得的结果略有不同，这可能是因为乳糖是一种碳源营养素，可供大肠杆菌细胞的进一步生长。

诱导温度是影响外源蛋白分泌和溶解度、蛋白产量和酶活性的关键因素，降低诱导温度可以促进目标蛋白的可溶性表达，在本发明的研究中，BpFae表达的最佳诱导温度为28℃(图12)，而在以前的报道中，大肠杆菌细胞中异源蛋白表达的最佳诱导温度为～30℃。诱导温度影响诱导率和细胞生长速率，因此不同的外源蛋白和表达系统将有不同的最佳诱导温度，通常能使诱导率和细胞生长速率达到平衡的诱导温度为最佳诱导温度。

通过考察摇床转速和装液量两个因素进而研究溶氧水平对BpFae表达的影响。结果表明，随着摇床转速和装液量的增加，BpFae活性先升高后降低(图13，14)。

在诱导重组菌表达BpFae的过程中，接种量在一定程度上会影响发酵液中的生物量，而生物量通常与重组菌产生异源蛋白质的量有关。因此，研究了接种量对BpFae活性的影响。结果表明，不同接种量(0.1～3.2％(v/v))对BpFae活性无显著影响，但接种量为0.2％时BpFae活性最高，达到2.13U/mL(数据未显示)。

诱导时间也是影响蛋白质可溶性表达的重要因素。尽管长时间的诱导通常会增加目的蛋白的活性，但是不同的目的蛋白的表达所需的最佳诱导时间也各不相同。如图15所示，随着诱导时间的延长，BpFae活性不断增加，在24h达到最大值。随着诱导时间的延长，BpFae活性开始降低，这可能是细胞死亡后释放的蛋白酶导致了目的蛋白的降解。

2.2Plackett-Burman实验

根据单因素实验结果，选取7个因素进行Plackett-Burman(PB)实验设计，包括初始pH(X₁)、诱导温度(X₂)、摇床转速(X₃)、诱导时机(X₄)、诱导时间(X₅)、装液量(X₆)和乳糖浓度(X₇)。对每个因素分别选取高水平(1)和低水平(-1)，以BpFae酶活力作为响应值。PB实验由Minitab软件17.1(Minitab,Inc.State College,PA,USA)设计，并根据实验数据建立回归模型。

根据单因素实验结果筛选出7个显著性因素，并利用Minitab软件17.1(Minitab,Inc.State College,PA,USA)对该7个因素进行Plackett-Burman(PB)实验设计，结果见表5。BpFae活性的变化范围为0.69U/mL～5.89U/mL。各个因素的显著水平由P-value决定的，当P-value<0.05时，表明该因素为显著性因素。由表4可知，对BpFae活性具有显著影响的因素有诱导温度(X₂)、诱导时间(X₅)、摇床转速(X₃)、装液量(X₆)和乳糖浓度(X₇)，而初始pH(X₁)和诱导时机(X₄)对BpFae活性无显著影响。因此，在后续实验中应对上述5个显著性因素进行进一步研究，而可以忽略两个非显著性因素，在后续实验中，将初始pH(X₁)和诱导时机(X₄)根据上述单因素结果分别设置为5.5和5h。

表4 PB实验设计的因素水平及统计分析

注：“*”表示在5％水平显著(P<0.05)；“**”表示在1％水平显著(P<0.01)。

表5 PB实验设计及结果

2.3最陡爬坡实验

根据PB实验得到的回归模型筛选出5个显著性因素，并根据这5个因素效应的大小比例设定其变化方向及其变化步长，进而设计最陡爬坡实验。实验沿着最陡的上升路径进行，并结合实际经验，直到BpFae活性不再增加。通过最陡爬坡设计，BpFae活性最高的点将接近最优点，因此将BpFae活性最高点作为RSM的中心点进行后续实验。

为了确定以上5个显著性因素的最佳区域，采用了最陡爬坡实验设计。根据PB实验结果的回归分析，确定了各个因素的变化方向。为了获得最大的BpFae活性，在实验中增大了诱导温度(X₂)和摇床转速(X₃)两个变量，同时减小了初始pH(X₁)、诱导时机(X₄)和诱导时间(X₅)三个变量(表6)。结果表明，第三组实验中BpFae活性最高，达到6.72U/mL。因此，将第三组实验用作后续响应面实验的中心点。

表6 最陡爬坡实验设计及结果

2.4响应面分析法

通过最陡爬坡实验逼近BpFae活性最高区域后，采用响应面分析方法中的Box-Behnken实验设计(BBD,Design expert software 11.0,StatEase Inc.,Minneapolis,MN,USA)，针对由PB实验和最陡爬坡实验确定的三个关键因素(诱导温度(A)、诱导时间(B)和摇床转速(C))和中心点进行进一步研究，以增强BpFae活性。每个因素取三个水平，分别以-1、0和1编码。

根据PB实验和最陡爬坡实验结果，采用Box-Behnke实验设计三因素(诱导温度、诱导时间和摇床转速)三水平的响应面分析实验，BpFae活性Y作为响应值。每个因素取三个水平，分别编码-1、0、1，共运行15组实验，表7为实验设计及结果。由表可以看出，BpFae活性有很大的变化，这种变化取决于不同的培养条件。在第5组实验中BpFae活性达到最大值，为7.38U/mL，而在第10组实验中BpFae活性最小，为5.05U/mL。

表7 响应面设计及结果

通过对15组实验数据进行多元回归分析，经过回归方程拟合，各个因素对响应值的影响可用以下函数表示：

Y＝6.73-0.3225×A+0.2762×B+0.2513×C-0.1950×AB+0.0750×AC-0.1675×BC-0.1015×A²+0.1621×B²+0.0371×C² (1)

其中Y是预测值(BpFae活性)；回归方程的方差分析和模型可信度分析见表8。由表8可知，该实验有较低的变异系数(CV)，CV值越低，表明实验的可靠性越高，本实验中CV＝1.91％，说明实验结果可信。该方程的相关系数R²＝0.9906，说明该模型可以解释BpFae活性的变化，表明方程拟合良好。式(1)的相关系数(R＝0.9953)接近1，表明实验结果与理论值有很强的相关性，线性项和二次项在1％水平上显著，外积在5％水平上显著。

表8 响应面实验结果中的回归系数分析及显著性分析

注:“*”表示在5％水平显著(P<0.05)；“**”表示在1％水平显著(P<0.01)

根据表中的F-value和相应的P-value可得知，A(诱导温度)、B(诱导时间)和C(摇床转速)对BpFae活性具有显著性影响，A和B的二次项也具有显著性影响。此外，(A，B)和(B，C)之间的两种相互作用也对BpFae活性具有显著性影响。

各因素两两交互作用对BpFae活性的影响可由3D响应面图呈现(图16)。图16a的结果表明，随着诱导时间的延长，BpFae的活性逐渐增加，当诱导温度设定在中心值时，这种现象更加明显，导致BpFae活性从6.22U/mL变为7.22U/mL。这表明，在适当的诱导温度下，延长诱导时间将有利于BpFae的表达。诱导温度升高，BpFae活性显著升高，但超过一定温度范围后BpFae活性将会下降。对图16a的分析表明，诱导表达BpFae的最佳诱导温度和诱导时间范围分别为22.5-25.1℃和30-32h；A(诱导温度)和C(摇床转速)对BpFae活性的影响如图16b所示，相比于比摇床转速，诱导温度对BpFae活性的影响更为明显，酶活性在5.05-7.03U/mL之间，而摇床转速的变化对BpFae的活性没有显著影响。细胞数量、细胞活性、外源蛋白表达率和正确的蛋白质折叠之间的平衡是蛋白质大量表达的关键，而诱导温度通过有效地调节它们之间的平衡，从而实现高效的外源蛋白表达；图16c显示了B(诱导时间)和C(摇床转速)对BpFae活性的影响。BpFae活性随着诱导时间和摇床转速的增加而迅速增加。增加摇床转速可以提高溶解氧水平，从而促进生物量的增加，同时，延长诱导时间可以使该重组菌表达大量的BpFae。

利用Design-expert 11，以A(诱导温度)＝23.2℃、B(诱导时间)＝32h、C(摇床转速)＝240rpm为临界值，预测BpFae活性最优值。Y(BpFae活性)的最大预测值为7.33U/mL。为验证模型的准确性，根据以上优化结果，在最佳发酵条件下进行了验证实验，即在乳糖6g/L，pH值5.5，诱导时机5h，诱导温度23℃，摇床转速240rpm，装液量50mL/250mL，接种量0.2％(v/v)，诱导时间32h的条件下进行重复实验，将得出的平均值与预测值进行比较。最大BpFae活性为7.43U/mL，与预测值接近，证明该模型较准确、有效。该结果与IPTG诱导相比，BpFae活性为IPTG诱导蛋白的2.92倍。

序列表

<110> 北京工商大学

<120> 阿魏酸酯酶BpFae基因的重组表达载体和重组菌，及重组表达的方法

<160> 10

<170> Patent-In 3.3

<210> 1

<211> 1722

<212> DNA

<213> Burkholderia pyrrocinia：BpFae

<220>

<223>

<400> 1

ttgaacagaa aatctgcatt cctctgcatt gcgccgctgt ccgccgcgat gctcgccggt 60

tgcggcggcg acgattcggt cagctccgcg cccacgcacc tgagcgcggc gacgccggcc 120

gcgatggcgc agacctgcga cgcgctcgcc gcgaagcttg cgtatgcgaa cacgtcgttc 180

acgtcggtga cgaccgcggc cgccggcgcg ctgacggtgg ccggccagcc gatcgccgag 240

cactgcgtga tcgaagggaa catgaaccag cgcgtgagcg cggtggacgg ccagacctat 300

gcgatcggct tcgagatgcg cttgccgaag gcgtggaacg gccgcttctt ctaccaggcg 360

aacggcgggc tcgacggcaa cgtcgtgacc gcgaccggcg agatcggcgg cggcgggccg 420

ctgaccgatg cgctgaacca gggcttcgcg gtgatcagct cggattccgg gcacagtgcc 480

gcacagaacc cgctgttcgg cctcgatccg caggcgcggc tcgactacgg ctacggcgcc 540

gtcgatgcgc tgacgccgat ggcgaagcag gtgatccgtc tcgcctacgg caaggcgccc 600

gaccgcagct atttcggcgg ctgctcgaac ggcgggcgtc acgcgatggt cacggccgtg 660

cgcaacccgg gcgactacga cggcattatc gcgggcgatc cgggcttcca tttgccgaag 720

gcggcgatcg gcgagatgta cggcgcgcag cagttcgcga agatcgcgtc ggcgacgggg 780

tcgaacgggc tgccggacat ccgcagcggc ttcaccgatg ccgagcgcca gttcgtcggc 840

gcgaagatcc tcgacaaatg cgatgcgctc gacggcgtgg ccgacgggat ggtgcaggac 900

gtcgccgcgt gccaggcgca cttcagcgtc gagacggaca tcccgacctg cgcgaacggc 960

acgcgcaccg gcgcatgcct gacgcctgcg cagaaaaccg cgctcgagaa cgtgttcgcc 1020

ggggcgcgca acagcgcggg cacggcgctt tatgcgagct ttccgtacga tccgggcgtg 1080

gccggcggcg gctgggctgc gtggaagcaa tcgaattcca tcacgctcga tccggtcgcg 1140

atggcgttca cgttcatgtc gccgccgaaa agcaccgcga cgctcgcgaa cctgcccggt 1200

ttcgcgctcg gcttcgacat ggacaacgat gcgccggcga tcttcgcgac gagcggcgtg 1260

tacacgcaat ccgcgtggtc gttcatgacg ccgcccgacg agacgaacct ggccgcgctg 1320

aagtcgcgcg gcgcgaagct gctcgtctat cacggcaccg gcgacccggt gttctcgttc 1380

aacgacacga gcgactggta ccagcgggtc gcgcaggcga atggcggcga tgcgtcgagt 1440

ttcgcgcgct tctacccggt gcccgggatg aaccactgcg cgggcgggcc ggcggccgac 1500

cagttcgaca tgctgacgcc gctcgtcgcg tgggtcgagc aggggcaggc gcccgccgcg 1560

atcgtggccg ctgcgcgcga tgcgaccaac gcggtgccga acgcggacgt gcccgcgtcg 1620

tggggggccg ggcgcacgcg tccgctgtgt ccgtatccgc aggtggcgcg ctacaacggc 1680

tcgggcgacg tgaattcggc ggcgagcttc agttgccgct ga 1722

<210>2

<211>573

<212> PRT

<213> Burkholderia pyrrocinia：BpFae

<220>

<223>

<400> 2

MNRKSAFLCI APLSAAMLAG CGGDDSVSSA PTHLSAATPA AMAQTCDALA AKLAYANTSF 60

TSVTTAAAGA LTVAGQPIAE HCVIEGNMNQ RVSAVDGQTY AIGFEMRLPK AWNGRFFYQA 120

NGGLDGNVVT ATGEIGGGGP LTDALNQGFA VISSDSGHSA AQNPLFGLDP QARLDYGYGA 180

VDALTPMAKQ VIRLAYGKAP DRSYFGGCSN GGRHAMVTAV RNPGDYDGII AGDPGFHLPK 240

AAIGEMYGAQ QFAKIASATG SNGLPDIRSG FTDAERQFVG AKILDKCDAL DGVADGMVQD 300

VAACQAHFSV ETDIPTCANG TRTGACLTPA QKTALENVFA GARNSAGTAL YASFPYDPGV 360

AGGGWAAWKQ SNSITLDPVA MAFTFMSPPK STATLANLPG FALGFDMDND APAIFATSGV 420

YTQSAWSFMT PPDETNLAAL KSRGAKLLVY HGTGDPVFSF NDTSDWYQRV AQANGGDASS 480

FARFYPVPGM NHCAGGPAAD QFDMLTPLVA WVEQGQAPAA IVAAARDATN AVPNADVPAS 540

WGAGRTRPLC PYPQVARYNG SGDVNSAASF SCR 573

<210>3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列：引物

<220>

<223>

<400> 3

ttgaacagaa aatctgcatt cctct 25

<210>4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列：引物

<220>

<223>

<400> 4

tcagcggcaa ctgaagctcg 20

<210>5

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列：引物

<220>

<223>

<400> 5

atgggtcgcg gatccttgaa cagaaaatct gcat 34

<210>6

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列：引物

<220>

<223>

<400>6

cgcaagcttg tcgactcagc ggcaactgaa gct 33

<210>7

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列：引物

<220>

<223>

<400> 7

taccctcgag ggatccttga acagaaaatc tgcat 35

<210>8

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列：引物

<220>

<223>

<400>8

tagactgcag gtcgactcag cggcaactga agct 34

<210>9

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列：引物

<220>

<223>

<400> 9

ggttccgcgt ggatccttga acagaaaatc tgcat 35

<210>10

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列：引物

<220>

<223>

<400>10

ggccgctcga gtcgactcag cggcaactga agct 34

Claims (15)

1.一种阿魏酸酯酶BpFae基因的重组表达载体，其中所述基因编码的氨基酸序列如SEQID NO:2所示，所述重组表达载体的出发载体是pGEX-4T-1。

2.一种阿魏酸酯酶BpFae基因的重组表达载体的制备方法，其中所述基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，其特征在于：用引物扩增含有所述基因的模板获得所述基因的扩增产物，然后与用限制性内切酶酶切的pGEX-4T-1表达载体相连接，获得重组表达载体。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述基因与标签蛋白融合。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述基因与组氨酸标签融合。

5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，用如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示引物X1和X2扩增含有所述基因的模板获得所述基因的扩增产物，然后用SaI I和BamH I双酶切表达载体pGEX-4T-1，再将所述扩增产物与双酶切的表达载体pGEX-4T-1相连接，得到重组表达载体。

6.含有权利要求1所述的重组表达载体，或含有如权利要求2至5任一项所述制备方法得到的重组载体的重组细胞，所述重组细胞是非动物品种和植物品种。

7.如权利要求6所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞是大肠杆菌。

8.如权利要求7所述的重组细胞，其特征在于，所述大肠杆菌是大肠杆菌BL21。

9.一种重组表达阿魏酸酯酶BpFae基因的方法，其包括培养如权利要求4至8任一项所述的重组细胞，用IPTG或乳糖作为诱导剂进行诱导表达，再收集表达的阿魏酸酯酶BpFae的步骤。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，采用乳糖作为诱导剂，且采用的LB培养基进行培养；或者采用IPTG作为诱导剂，且采用的SOB培养基进行培养。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，其中LB培养基中添加诱导剂乳糖的浓度为4-8 g/L。

12.如权利要求9所述的方法，其特征在于，在接种培养后3-7小时后用乳糖进行诱导表达，诱导时的培养温度为20-25℃，摇床转速200-280 rpm，诱导32小时后收集表达的阿魏酸酯酶BpFae。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，在接种培养4-6小时后用乳糖进行诱导表达，诱导时的培养温度为21-24℃，摇床转速220-260 rpm。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，初始接种量为0.1-0.3％（v/v）；初始pH：5-6；装液量为40-60 mL/250 mL。

15.如权利要求13所述的方法，其特征在于，培养条件如下：采用SOB培养基进行培养；初始pH：4.5-5.5；接种量：0.6-1.0 %（v/v）；诱导时机：3-5 h；IPTG添加的浓度：0.03-0.07mM；诱导温度：24-28 ℃；摇床转速：220-260 rpm；诱导24小时后收集表达的阿魏酸酯酶BpFae。

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