CN110628743A

CN110628743A - 一种立体选择性酯酶、编码基因、载体、工程菌与应用

Info

Publication number: CN110628743A
Application number: CN201910766503.2A
Authority: CN
Inventors: 章银军; 张宏云; 郑建永; 汪钊
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2019-08-20
Filing date: 2019-08-20
Publication date: 2019-12-31

Abstract

本发明提供了一种立体选择性酯酶、编码基因、载体、工程菌及其拆分(R,S)‑5‑氯‑2,3‑二氢‑2‑羟基‑1‑氧‑1H‑茚‑2‑羧酸甲酯的应用；利用重组大肠杆菌或重组酯酶为生物催化剂催化拆分(R,S)‑5‑氯‑2,3‑二氢‑2‑羟基‑1‑氧‑1H‑茚‑2‑羧酸甲酯，生成(S)‑5‑氯‑2,3‑二氢‑2‑羟基‑1‑氧‑1H‑茚‑2‑羧酸甲酯，转化率达55％左右，产物光学纯度都在97％以上。

Description

一种立体选择性酯酶、编码基因、载体、工程菌与应用

(一)技术领域

本发明涉及一种立体选择性酯酶及其编码基因，含有该编码基因的载体、工程菌及其应用。

(二)背景技术

茚虫威(Indoxacard)，又名Avatar(安打)、Ammate(全垒打)、Avaunt Steward,是杜邦公司开发的新型氨基甲酸酯类杀虫剂，通过阻断昆虫神经细胞内的钠离子通道，使神经细胞失去功能，具有触杀胃毒作用，可有效防治粮、棉、果、蔬等作物上的多种害虫，已在美国、澳大利亚、中国等国作为“降低风险产品”(reduced-risk product)登记注册。茚虫威的结构是一个复杂的噁二嗪化合物，含有的手性中心仅有一个，有R和S两种异构体，但研究表明仅S-异构体有活性，R-异构体没有活性。

S-(+)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯是制备茚虫威的关键手性中间体，该对映体过量值的高低直接影响最终产品的质量和杀虫剂活性，因此探索其合成工艺具有长远的应用意义，为新型杀虫剂在农业生产中的进一步应用提供理论和实践基础。迄今为止，合成S-(+)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯的方法仅限化学法，由于原料和合成工艺的不同，获得的产品的光学纯度有很大的差异，目前，化学法制备获得的S-(+)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧-1H-茚-2-羧酸甲酯的纯度为90％左右。

根据反应原料的不同，分为以下几种不同的S-(+)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧-1H-茚-2-羧酸甲酯的化学制备方法。

(1)郭立湘以丙烯酸为原料，通过氢化、酰氯化和烷基化等一系列反应制得5-氯-2,3-二氢-1-茚酮，然后与碳酸二甲酯(DMC)和甲醇钠(NaH)缩合制得5-氯-1-氧代-2,3-二氢茚-2-羧酸甲酯，以辛可宁手性为催化剂，不对称羟基化合成S-(+)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚2-羧酸甲酯，其e.e值为89.4％，反应式如下：

(2)胡新根等以5-氯-2-甲氧羰基-1-茚酮(Ⅰ)为起始原料探讨了不同溶剂、氧化剂、催化剂等对反应收率和产品e.e值的影响，最优反应条件：n(Ⅰ)∶n(辛可宁)∶n(过氧化氢异丙苯)＝1∶0.2∶1.2，CH₂Cl₂作溶剂，室温反应5h后，制得光学纯度为92％的S-(+)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-羧酸甲酯，反应式如下：

目前化学合成法虽然能够实现快速合成，但由于化学拆分法中存在着复杂的消旋竞争因素，很难得到光学纯度较高的单一对映异构体。其中，不对称羟基化反应步骤不仅需要大量的手性催化剂，而且要求在有机溶剂中催化过氧化物与5-氯-2,3-二氢-1-氧-1-茚酮-羧酸甲酯进行非对称性反应，化学反应剧烈，安全性差，对环境容易造成有机污染，不利于大规模工业生成。因此，随着生物手性拆分技术发展，以上这些化学合成方法，必将被反应条件温和，污染少，符合环境可持续发展的生物催化法所取代。

用于生物法制备S-(+)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧-1H-茚-2-羧酸甲酯的生物催化剂既可以是整细胞，也可以是酶。酶或者微生物菌体是很好的催化剂，不仅因为其具有底物专一性高、区域选择性好及立体选择性强等优点，主要是因为其反应条件温和，对环境几乎不造成任何的污染，符合人们对环境可持续发展的要求。因为细胞内含有多种酶，整细胞催化往往会遇到副反应的问题，副反应的存在会降低目标反应产物的得率。对于拆分S-(+)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧-1H-茚-2-羧酸甲酯这种一步反应来说，酶法催化更具优势，既可以彻底避免副反应的问题，也可以克服细胞膜阻碍底物和产物跨膜传递的问题。因而，通过基因工程技术高产酯酶，将为其在生物法拆分(R,S)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧-1H-茚-2-羧酸甲酯中的应用奠定良好的基础。

酯水解酶是广泛存在于动物、植物以及微生物中的一类能够催化酯键的水解或生成的酶。根据底物特异性和是否存在界面激活现象^[48]，可分为酯酶(EC3.1.1.1，Carboxylesterase)和脂肪酶(EC 3.1.1.3，Triacylglycerol hydrolase)。酯酶是一类催化酯键(羧酯键、酰胺键、硫酯键等)水解和合成的酶。工业应用的酯酶多数来自微生物，这类微生物从分类上看主要是真菌，主要包括黑曲霉、链孢霉、青霉、黄曲霉、毛霉、犁头菌、红曲霉、根霉、白地霉、核盘菌、酵母菌和须霉等12属23种；其次是细菌，包括伯克霍尔德属、葡萄球菌属、假单胞菌属及芽孢杆菌属等；此外，放线菌中也存在个别种属可以产一定量的酯酶。这些野生菌中酯酶含量较低并且比较杂，利用其作为生物催化剂进行大规模的工业化生产存在一定的难度，因而构建酯酶基因工程菌从而大量生产重组酯酶具有十分重要意义。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种立体选择性酯酶BCE、编码基因、含有该基因的重组载体、该重组载体转化得到的重组基因工程菌，及其在生物法拆分(R,S)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧-1H-茚-2-羧酸甲酯中的应用。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种立体选择性酯酶BCE，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

SEQ ID No.1：

由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的多肽的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该多肽的片段或多肽变体与前述氨基酸序列同源性在90％以上、且具有相同的酶活性，均属于本发明保护范围之列。具体的，所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。

本发明所述蛋白的片段、衍生物或类似物是指基本上保持本发明所述的蛋白酶相同的生物学功能或活性的蛋白，可以是下列情形：(Ⅰ)一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选的是保守氨基酸残基)取代，并且取代的氨基酸可以是也可以不是由遗传密码子编码的；(Ⅱ)一个或多个氨基酸残基上的某个基团被其它基团取代；(Ⅲ)成熟蛋白与另一种化合物(比如延长蛋白半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合；(Ⅳ)附加的氨基酸序列融合进成熟的蛋白而形成的蛋白序列(如用来纯化此蛋白的序列或蛋白原序列)。

所述蛋白可以是重组蛋白、天然蛋白或合成蛋白，可以是纯天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如：细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的蛋白可以是糖基化的。本发明的蛋白还可以包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还涉及所述立体选择性酯酶BCE的编码基因，具体的，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示：

该立体选择性酯酶基因由如下方法得到：从芽孢杆菌WZZ006(BacilluscereusWZZ006)中分离纯化得到该立体选择性酯酶基因，MALDI-TOF-MS(基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱)的分析结果经比对获得相似度最高的同源基因序列，设计引物1、引物2，利用PCR技术，以来源于芽孢杆菌WZZ006(Bacillus cereus WZZ006)的基因组DNA为模板克隆酯酶基因片段。将该片段连接到pET-28a载体上获得克隆载体pET-28a-BCE并将其转化于大肠杆菌DH5α中。对重组质粒测序，并利用软件对测序结果进行分析，该序列含有一个长为2433bp的开放阅读框(SEQ ID NO.2)，利用软件对该基因序列进行分析，推知所述立体选择性酯酶基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ ID NO.2所示多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有70％以上同源性、且具有相同的功能，均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的氨基酸的功能。

另外，可与SEQ ID NO：2所示多核苷酸序列杂交的多核苷酸(至少具有50％同源性，优选具有70％同源性)，也在本发明保护范围之列，特别是在严格条件下可与本发明所述核苷酸序列杂交的多核苷酸。所述“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加用变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清，0.1％Ficoll，42℃；或(3)仅在两条序列之间的同源性至少在95％以上，更好是97％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的蛋白与SEQ ID NO：1所示的蛋白有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及含有所述编码基因的重组载体，以及利用所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。

本发明还涉及所述立体选择性酯酶BCE编码基因在制备立体选择性酯酶BCE中的应用，具体的，所述的应用为：构建含有所述立体选择性酯酶BCE基因的重组载体pET-28a-BCE，将所述重组载体转化至大肠杆菌BL21中，获得重组大肠杆菌BL21/pET-28a-BCE。重组大肠杆菌经诱导培养，培养液经离心分离得到含有立体选择性酯酶BCE的菌体细胞。菌体细胞在超声波破碎后，离心去除细胞碎片，所得的上清液通过Ni-NTA金属螯合亲和层析分离纯化得到酯酶BCE。

本发明立体选择性酯酶BCE活力测定方法为：反应体系3mL：2.8mL 50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)和0.1mL 30mmol/L对硝基苯酚己酸酯(p-NPC6)的乙腈溶液混合后，于30℃恒温水浴保温5min。之后加入0.1mL的酶液，并立即计时。反应时间为3min，反应结束后立即加入1mL无水乙醇终止反应，并立即在波长为405nm下测定吸光值。同样的反应条件下，以灭活的酶液作对照。在上述测定条件下，以每分钟水解底物产生lμmol的对硝基苯酚所需的酶量定义为1个酶活力单位(U)。

本发明还涉及所述的立体选择性酯酶BCE在催化拆分(R,S)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧-1H-茚-2-羧酸甲酯中的应用，具体所述的应用为：以含立体选择性酯酶BCE编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体、冻干菌体或湿菌体提取的纯酶为催化剂，以外消旋5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯为底物，以pH值5.0～10.0的缓冲液为反应介质构成反应体系，在20～45℃、100～300r/min(优选30℃，200rpm)条件下反应完全(优选6-24h)后，获得含S-(+)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯的转化液，将转化液分离纯化，获得S-(+)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯。

所述底物初始浓度以缓冲液体积计为4.2～150mM(优选5-50mM，最优选20mM)，催化剂加入量以缓冲液体积计为10-50g/L，优选50g/L。

所述转化液分离纯化的方法为：反应完毕后得到的转化液，12000rpm离心10min后，上层溶液用水循环泵真空旋蒸干燥，所得干燥样品用二氯甲烷溶解，硅胶(200～300目，国药集团化学试剂有限公司)拌样，采用正相硅胶柱层析，用乙酸乙酯：石油醚＝1:3(体积比)洗脱，试管收集，流速8mL/min，TLC检测，展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝3：2(v/v)，收集R_f＝0.30的组分合并，合并液减压浓缩至干燥后，得产品S-(+)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯。

本发明所述催化剂按如下方法制备：

(1)湿菌体：将含酯酶BCE基因的工程菌(优选重组大肠杆菌BL21/pET-28a-BCE)接种至含100μg/ml卡那霉素的LB液体培养基，37℃下培养12-16h，再以1％(v/v)接种量接种到新鲜的含100μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃下培养至菌体浓度OD₆₀₀ 0.6-0.8，再向LB液体培养基加入终浓度为0.2mM的IPTG，28℃下诱导培养10-12h，然后在4℃下12000rpm离心10min，收集含有酯酶BCE的湿菌体，湿菌体在-40℃冻干48h即为冻干菌体；所述LB培养基组成(g/L)：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10，溶剂为蒸馏水，pH调至7.5，高压蒸汽灭菌为121℃，20min；

(2)纯酶：将步骤(1)湿菌体用50mM的pH 8.0的Tris-HCl缓冲液重悬，然后进行超声破碎(功率100W，超声5s，间隔5s，有效超声时间15min)，破碎悬浮液在4℃下12000rpm离心10min，尽量弃尽细胞碎片，收集上清液；按照Ni-NTA金属螯合亲和层析使用说明，取上清液上样至预平衡Ni²⁺柱中，再依次用50mM咪唑水溶液、100mM咪唑水溶液、150mM咪唑水溶液、200mM咪唑水溶液洗脱杂蛋白和目的蛋白，收集150mM咪唑水溶液洗脱的流出液，超滤膜(10kDa截留分子量，可截留流出液中分子量>10kDa的蛋白(含目的蛋白)，而水溶液及低分子量的溶质则允许透过膜)脱盐浓缩，收集截留液，获得酯酶BCE纯酶；所述湿菌体用量以重悬用缓冲液体积计为0.03g/mL。

本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种来源于芽孢杆菌WZZ006(Bacillus cereus WZZ006)的立体选择性酯酶BCE基因核苷酸序列，该酯酶基因可与表达载体连接构建得到含该基因的胞内表达重组质粒，再转化至大肠杆菌菌株中，获得重组大肠杆菌；该重组大肠杆菌经细胞破碎，分离纯化获得酯酶BCE；利用重组大肠杆菌或酯酶BCE为生物催化剂同时催化拆分(R,S)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧-1H-茚-2-羧酸甲酯，可以生成(S)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧-1H-茚-2-羧酸甲酯，产物光学纯度都在97％以上。

(四)附图说明

图1为PCR扩增酯酶基因的琼脂糖凝胶电泳图；其中，1为利用引物1和引物2扩增得到的酯酶基因片段；M为Trans 2K Plus DNA Marker；

图2为构建的重组质粒pET-28a(+)-BCE；

图3为PCR扩增鉴定阳性重组子的琼脂糖凝胶电泳图；M为DNA分子量标准；泳道1至3为PCR扩增的目的DNA片段；

图4为酯酶BCE催化外消旋底物5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-羧酸甲酯制备S-(+)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯的液相色谱图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：酯酶BCE工程菌的构建

1、本发明立体选择性酯酶基因源自芽孢杆菌WZZ006(Bacillus cereus WZZ006)，该菌种现保藏于中国典型培养物保藏中心(地址中国，武汉，武汉大学，430072)，保藏编号CCTCC NO:M2017621，保藏日期2017年11月20日，已在先前申请专利(申请号：201811568108.5)中提交了相关菌种保藏信息并披露了其遗传资源来源。

用核酸提取试剂盒提取芽孢杆菌CCTCC NO:M2017621的基因DNA，以该基因组DNA为模板，在引物1、引物2的作用下进行PCR扩增。

引物1：

5’-AAGAAGGAGATATACCATGGATGTTTACTCATGTTGAAAGTTTCAAATC-3’；

引物2：

5’-TGGTGGTGGTGGTGCTCGAGAATTTGCGTAACTGTATTACCAATACC-3’。

PCR反应体系各组分加入量(总体积20μL)：

引物1和引物2各0.3μL，基因组DNA 1μL，primesTAR Max Premix(2×)聚合酶10μL，加水补至20μL。

PCR反应条件为：预变性98℃，3min，然后进入温度循环98℃，10s；55℃，10s；72℃，25s；共30个循环，最后72℃延伸5min，终止温度为4℃。取5μL PCR反应液用1％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果表明为单一条带，扩增片段大小约为2433bp，如图1所示。

2、载体线性化：用限制性核酸内切酶Nco1和Xho1将质粒pET-28a(-)进行双酶切。

双酶切反应体系各组分加入量(总体积20μL)：

Buffer 2μL，质粒10μL，Nco1和Xho1各1μL，加水补至20μL，37℃孵育1h，用DNA液体快速回收试剂盒纯化。

3、将步骤1扩增产物和步骤2线性化质粒pET-28a(-)用一步克隆试剂盒ClonExpressⅡOne Step Cloning Kit(南京诺唯赞生物科技有限公司)进行连接，得到重组质粒pET-28a-BCE，构建示意图如图2所示。

4、取10μL重组质粒pET-28a-BCE转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，加入1000μLLB培养基(不添加抗性)，37℃，200rpm摇菌1h。5000rpm离心5min弃900μL上清，用剩余培养基将菌重悬，涂布于含100μg/ml卡那霉素的LB平板上，挑取单菌落进行菌落PCR鉴定，鉴定结果见图3。由图3可知，在2433bp左右的位置具有单一条带，表明所挑选的菌株为阳性重组子。获得的阳性重组子经培养后，提取质粒，送样测序，利用软件分析测序结果，结果表明：经引物1和引物2扩增到的核苷酸序列长度为2433bp(其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)，该序列编码一个完整的开放阅读框，编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。

实施例2：酯酶BCE工程菌湿菌体的制备

将实施例1获得的重组大肠杆菌BL21/pET-28a-BCE接种至含100μg/ml卡那霉素的LB液体培养基，37℃下培养12-16h，再以1％(v/v)接种量接种到新鲜的含100μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃下培养至菌体浓度OD₆₀₀ 0.8，再向LB液体培养基加入终浓度为0.2mM的IPTG，28℃下诱导培养10-12h，然后在4℃下12000rpm离心10min，收集含有酯酶BCE的菌体细胞，即为重组大肠杆菌BL21/pET-28a-BCE湿菌体。

实施例3：酯酶BCE纯酶

将实施例2中获得重组大肠杆菌BL21/pET-28a-BCE湿菌体1.5g，用50ml、50mM的pH8.0的Tris-HCl缓冲液重悬，然后进行超声破碎(功率100W，超声5s，间隔5s，有效超声时间15min)，破碎悬浮液在4℃下12000rpm离心10min，尽量弃尽细胞碎片，取上清液得蛋白粗酶液。按照Ni-NTA金属螯合亲和层析使用说明，取蛋白粗酶液上样至预平衡Ni²⁺柱中，再依次用50mM咪唑水溶液、100mM咪唑水溶液、150mM咪唑水溶液、200mM咪唑水溶液洗脱杂蛋白和目的蛋白。收集150mM咪唑水溶液洗脱的流出液，超滤膜(10kDa截留分子量，可截留流出液中分子量>10kDa的蛋白(含目的蛋白)，而水溶液及低分子量的溶质则允许透过膜)脱盐浓缩，收集截留液，获得酯酶BCE纯酶0.001g，然后于-20℃低温保藏。

酯酶BCE纯酶水解硝基苯酚己酸酯的活力测定方法为：反应体系3mL：2.8mL 50mMTris-HCl缓冲液(pH 7.5)和0.1mL 30mmol/L对硝基苯酚己酸酯(p-NPC6)的乙腈溶液混合后，于30℃恒温水浴保温5min。之后加入0.1mL的酶液，并立即计时。反应时间为3min，反应结束后立即加入1mL无水乙醇终止反应，并立即在波长为405nm下测定吸光值。同样的反应条件下，以灭活的酶液作对照。在上述测定条件下，以每分钟水解底物产生lμmol的对硝基苯酚所需的酶量定义为1个酶活力单位(U)。该方法下测得酯酶BCE纯酶水解对硝基苯酚己酸酯活力为1.79U/mg。

实施例4：工程菌拆分(R,S)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧-1H-茚-2-羧酸甲酯

将1.5g实施例2中获得的重组大肠杆菌BL21/pET-28a-BCE湿菌体-40℃冷冻干燥48h，获得冻干菌体0.2g。

在1mL反应体系中，取0.05g冻干菌体，加入950μL pH7.0的0.2M的磷酸盐缓冲液，充分振荡混匀，再加入50μL 20mM外消旋底物，在30℃、200r/min下，转化12h。反应结束后，反应液用4M稀盐酸调pH至2，再加入2mL乙酸乙酯萃取，取有机层，用真空旋转蒸发仪旋干，然后加入1mL的流动相溶解，对底物及其转化产物(S)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧-1H-茚-2-羧酸甲酯进行液相色谱分析。结果(图4)显示(S)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧-1H-茚-2-羧酸甲酯的对映体过量值e.e._s 97.17％，产率54.51％。而取立体选择性酯酶基因来源芽孢杆菌WZZ006(Bacillus cereus WZZ006)干菌体0.05g，在本实施例相同反应条件下反应24h后，采用本实施例相同方法处理反应液并进行液相色谱分析，得到S-(+)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯，转化率为53.04％，底物e.e._s才可达93.01％。

HPLC液相色谱分析条件：采用液相色谱仪Waters 1525型液相色谱仪；手性液相色谱柱Cellud-Y(250×4.6m)；流动相为正己烷：异丙醇：乙醇＝16:8:1(体积比)，流速0.5ml/min，柱压370psi，柱温30℃；进样量10μL。

实施例5：

在1mL反应体系中，取0.05g实施例4中获得的重组大肠杆菌BL21/pET-28a-BCE冻干菌体，加入950μL pH7.0的0.2M的磷酸盐缓冲液，充分振荡混匀，再加入50μL 4.2mM外消旋底物，在30℃、200r/min下，转化12h。反应结束后，采用实施例4相同方法处理反应液并进行液相色谱分析，得到(S)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧-1H-茚-2-羧酸甲酯的对映体过量值e.e._s 97.03％，产率53.87％。

实施例6：

在1mL反应体系中，取0.05g实施例4中获得的重组大肠杆菌BL21/pET-28a-BCE冻干菌体，加入950μL pH7.0的0.2M的磷酸盐缓冲液，充分振荡混匀，再加入50μL 50mM外消旋底物，在30℃、200r/min下，转化12h。反应结束后，采用实施例4相同方法处理反应液并进行液相色谱分析，得到(S)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧-1H-茚-2-羧酸甲酯的对映体过量值e.e._s 97.07％，产率52.71％。

实施例7：

在1mL反应体系中，取0.05g实施例4中获得的重组大肠杆菌BL21/pET-28a-BCE冻干菌体，加入950μL pH7.0的0.2M的磷酸盐缓冲液，充分振荡混匀，再加入50μL 150mM外消旋底物，在30℃、200r/min下，转化12h。反应结束后，采用实施例4相同方法处理反应液并进行液相色谱分析，得到(S)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧-1H-茚-2-羧酸甲酯的对映体过量值e.e._s 93.12％，产率52.07％。

实施例8：纯酶拆分(R,S)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧-1H-茚-2-羧酸甲酯

在1mL反应体系中，加0.02g实施例3中获得的酯酶BCE纯酶，加入1mLpH7.0的0.2M的磷酸盐缓冲液，充分振荡混匀，再加入50μL 20mM外消旋(R,S)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧-1H-茚-2-羧酸甲酯作为底物，在30℃、200r/min下，转化12h。反应结束后，用4M稀盐酸调pH至2，再加入2mL乙酸乙酯萃取，取有机层，用真空旋转蒸发仪旋干，然后加入1mL的流动相溶解，除水后制成液相检测样品，对底物及其转化产物进行液相色谱分析。结果显示(S)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧-1H-茚-2-羧酸甲酯的对映体过量值e.e._s 98.55％，产率55.03％。

实施例9：(S)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧-1H-茚-2-羧酸甲酯的分离纯化

取实施例2方法制备的重组大肠杆菌BL21/pET-28a-BCE干菌体10g，加入到含有外消旋5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯终浓度为20mM的200mL pH7.0磷酸缓冲液中，30℃、180rpm条件下，反应24h后，转化反应结束后得到的转化液，12000rpm离心10min后上层溶液用水循环泵旋蒸干燥，所得样品1.92g用10mL二氯甲烷溶解，3g硅胶(200～300目，国药集团化学试剂有限公司)拌样，采用正相硅胶柱层析(国药集团化学试剂有限公司，批号：F20110913，200～300目，50g)，用400mL乙酸乙酯：石油醚＝1:3(体积比)的洗脱液洗脱。试管收集，流速8mL/min，每管收集15mL，TLC(薄层色谱法)检测，展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝3：2(v/v)，收集Rf＝0.30的组分合并，合并液减压浓缩至干，得产品S-(+)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯，称重后为1.07g，得率为56％，纯度96％。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明的技术内容作任何形式上的限制。凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均落入本发明的保护范围内。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 一种立体选择性酯酶、编码基因、载体、工程菌与应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 810

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

Met Phe Thr His Val Glu Ser Phe Lys Ser Ala Phe Leu Glu Lys Leu

1 5 10 15

Glu Thr Met Tyr Gly Lys Ser Phe Lys Glu Ser Thr Thr Arg Asp Gln

20 25 30

Tyr Asn Thr Leu Gly Tyr Met Val Arg Glu Tyr Met Asn Ser Gln Trp

35 40 45

Ile Ala Thr Asn Glu Ser Tyr Arg Ser Gly Glu Arg Lys Gln Met Tyr

50 55 60

Tyr Leu Ser Ile Glu Phe Leu Leu Gly Arg Leu Leu Gly Ser Asn Ile

65 70 75 80

Leu Asn Leu Gly Ile Lys Asp Val Cys Glu Gln Gly Leu Ser Glu Leu

85 90 95

Gly Ile Ser Leu Gln Gln Leu Glu Glu Val Glu Ala Asp Ala Gly Leu

100 105 110

Gly Asn Gly Gly Leu Gly Arg Leu Ala Ala Cys Phe Leu Asp Ser Leu

115 120 125

Ala Ser Leu Asn Leu Pro Gly His Gly Cys Gly Ile Arg Tyr Lys His

130 135 140

Gly Leu Phe Asp Gln Lys Ile Val Asp Gly Tyr Gln Val Glu Phe Pro

145 150 155 160

Glu Gln Trp Leu Leu His Glu Asn Val Trp Glu Val Arg Arg His Asp

165 170 175

Gln Ala Val Glu Val Ser Tyr Phe Gly Asn Val Glu Pro Leu Tyr Ile

180 185 190

Asp Gly Arg Leu Glu Phe Arg His Thr Asn Ala Glu Val Ile Met Ala

195 200 205

Val Pro Tyr Asp Val Pro Val Val Gly Tyr Glu Thr Ser Thr Val Asn

210 215 220

Thr Leu Arg Leu Trp Asn Ala Glu Pro Val Pro Phe Pro Gln Asn Cys

225 230 235 240

Lys Asp Ile Leu Lys Tyr Lys Arg Glu Thr Glu Ala Val Ser Glu Phe

245 250 255

Leu Tyr Pro Asp Asp Thr His Asp Glu Gly Lys Ile Leu Arg Leu Lys

260 265 270

Gln Gln Tyr Phe Leu Val Ser Ala Ser Leu Gln Asn Ile Val Arg Met

275 280 285

His Arg Glu Arg Tyr Gly Asp Leu Arg Gln Leu His Glu Lys Ile Ala

290 295 300

Ile His Ile Asn Asp Thr His Pro Val Leu Ala Ile Pro Glu Leu Met

305 310 315 320

Arg Ile Leu Leu Asp Glu Glu Lys Leu Ala Trp Glu Glu Ala Trp His

325 330 335

Ile Thr Thr Gln Thr Ile Ser Tyr Thr Asn His Thr Thr Leu Ser Glu

340 345 350

Ala Leu Glu Lys Trp Pro Ile His Ile Phe Lys Pro Leu Leu Pro Arg

355 360 365

Ile Tyr Met Ile Ile Glu Glu Ile Asn Glu Arg Phe Cys His Glu Leu

370 375 380

Trp Glu Arg Tyr Pro Tyr Glu Trp His Arg Ile Glu Glu Met Ala Ile

385 390 395 400

Ile Ala His Asp Leu Val Lys Met Ala His Leu Ala Ile Val Gly Ser

405 410 415

His Ser Val Asn Gly Val Ala Lys Ile His Thr Glu Ile Leu Lys Gln

420 425 430

Arg Glu Met Arg Leu Phe Tyr Glu Phe Tyr Pro Asp Lys Phe Asn Asn

435 440 445

Lys Thr Asn Gly Ile Ala His Arg Arg Trp Leu Met Lys Ala Asn Pro

450 455 460

Gln Leu Thr Asn Leu Ile Ser Glu Ala Ile Gly Thr Glu Trp Lys Lys

465 470 475 480

Glu Pro Ile Lys Leu Gln Glu Leu Gln Leu Val Gln Tyr Asp Ala Ser

485 490 495

Phe Gln Glu Lys Phe Ala Glu Val Lys Gln Glu Arg Lys Glu Ile Leu

500 505 510

Ala Ala Arg Ile His His Thr Met Gly Ile Thr Ile Asp Pro Asn Ser

515 520 525

Ile Phe Asp Val Gln Val Lys Arg Leu His Ala Tyr Lys Arg Gln Leu

530 535 540

Leu Asn Val Leu His Ile Leu Tyr Leu Tyr Asn Arg Leu Lys Glu Asp

545 550 555 560

Ala Ser Phe Thr Phe Tyr Pro Arg Thr Phe Ile Phe Gly Ala Lys Ala

565 570 575

Ser Pro Gly Tyr Tyr Tyr Ala Lys Lys Ile Ile Lys Leu Ile Asn Glu

580 585 590

Leu Ala Arg Lys Val Asn Asn Asp Pro Tyr Val Ser Gln Tyr Met Lys

595 600 605

Val Ile Phe Leu Glu Asn Tyr Arg Val Ser Val Ala Glu Asp Ile Phe

610 615 620

Pro Ala Ala Asp Val Ser Glu Gln Ile Ser Thr Ala Ser Lys Glu Ala

625 630 635 640

Ser Gly Thr Gly Asn Met Lys Phe Met Met Asn Gly Ala Ile Thr Leu

645 650 655

Gly Thr Leu Asp Gly Ala Asn Ile Glu Ile Lys Asp Arg Val Gly Asp

660 665 670

Asp Asn Cys Phe Ile Phe Gly Leu Thr Ala Glu Glu Val Leu His Tyr

675 680 685

Asn Gln Asn Gly Gly Tyr Arg Ala Ser Asp Tyr Tyr His His Asn Gly

690 695 700

His Ile Lys Lys Val Val Asp Gln Leu Thr Asn Gly Phe Phe Ala Gln

705 710 715 720

Ser Gly Ala Glu Phe Glu Ala Ile Tyr Asp Ser Leu Val Ile Gln Asn

725 730 735

Asp Glu Tyr Phe Val Leu Arg Asp Phe Gly Pro Tyr Ala Glu Lys Gln

740 745 750

Glu Ala Val Gly Arg Ala Tyr Glu Asn Arg Thr Lys Trp Leu Glu Met

755 760 765

Ser Ile Leu Asn Ile Ala Gln Ser Gly His Phe Ala Ser Asp Arg Thr

770 775 780

Ile Leu Gln Tyr Ser Asn Glu Ile Trp Gly Ile Gly Asn Thr Val Thr

785 790 795 800

Gln Ile Leu Glu His His His His His His

805 810

<210> 2

<211> 2433

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

atgtttactc atgttgaaag tttcaaatca gcttttctag aaaagttaga gacgatgtat 60

ggtaaaagtt tcaaagaatc tacaactcgt gatcaataca atacgcttgg gtacatggta 120

cgtgagtata tgaatagtca atggattgca acgaatgaaa gttatcggtc tggagagcga 180

aagcaaatgt attacttatc cattgagttt ttacttgggc gtttgcttgg aagtaacata 240

ttaaatttag gcatcaagga tgtatgtgag caagggcttt ctgagcttgg aatttcgttg 300

caacaattag aagaggtgga agcagatgca ggtcttggaa atggtggact tggacggtta 360

gcagcctgtt tccttgattc acttgcatct ttaaacttac caggtcatgg gtgcggaatt 420

cgttacaaac acggcttatt tgatcaaaaa attgttgatg gttatcaagt tgaatttcca 480

gaacagtggc ttcttcatga aaatgtatgg gaagtaagaa ggcatgatca agctgtagaa 540

gtaagttatt tcggcaatgt tgaaccgctc tacattgatg ggcgtttaga attcaggcat 600

acaaatgcag aagtaattat ggccgtacca tatgacgttc cagtagtagg ttatgagacg 660

agtactgtaa atacacttag actttggaat gcggaaccag ttcctttccc acaaaattgc 720

aaagatattt tgaaatataa gcgtgaaaca gaggcggtat cggagttttt atatccagat 780

gatacgcatg atgaggggaa aatacttcgt ttgaaacaac agtatttcct cgtatcagca 840

agcttgcaaa atatcgttcg tatgcataga gaaagatatg gtgaccttcg tcaattacat 900

gagaaaattg cgattcatat taatgatacc catccagttt tggcgattcc agaactgatg 960

cgtattttat tagatgaaga aaaactagca tgggaagaag cttggcacat aacgacgcaa 1020

acgatttctt atacgaatca tacgacgtta tcagaagcac ttgaaaagtg gccaattcac 1080

atttttaaac cgttattacc gagaatttat atgattattg aagagattaa tgaacgtttc 1140

tgtcatgaac tttgggaacg ttatccgtat gaatggcatc gtattgaaga gatggcgatt 1200

attgcgcatg atctcgtgaa aatggctcat ttagcaattg tcggtagcca tagtgtaaac 1260

ggtgtagcaa aaattcatac ggagatttta aaacagcgtg aaatgcgatt gttttatgag 1320

ttttatccag ataagtttaa taataaaacg aatggaatcg ctcatagacg ctggttaatg 1380

aaggcgaatc cgcagctgac gaaccttatt tcagaggcga ttggaacaga gtggaagaaa 1440

gaaccgatta agcttcaaga gctacaatta gttcaatacg atgcgagttt ccaagagaaa 1500

tttgcagagg taaaacaaga gcgtaaagag attttagcag cgcgcattca tcatacaatg 1560

gggattacaa ttgatcctaa ttctattttt gatgtgcaag taaaaaggct acatgcttac 1620

aagcgacaat tattaaatgt tcttcatatt ttatatttgt ataaccgttt gaaagaggat 1680

gctagtttta cattttatcc gcgtactttt atttttggag cgaaagcatc acctggctat 1740

tactatgcga aaaaaattat taaattaata aatgaacttg caaggaaagt gaataacgat 1800

ccgtacgtaa gccaatatat gaaagttatc tttctagaaa actatcgagt gtctgtagcg 1860

gaagatatat tcccagcggc cgatgtaagt gaacaaattt caacagcgag taaagaagca 1920

tctggaacag gcaatatgaa atttatgatg aatggtgcga ttacgctcgg cacgttagac 1980

ggagcgaata ttgaaataaa agatagagtc ggtgatgata actgtttcat tttcggctta 2040

acggccgaag aagttcttca ttacaatcaa aatggtggat atcgtgcaag tgattattat 2100

caccacaatg ggcacattaa aaaggtagta gatcagctaa cgaatggttt ctttgcacag 2160

tcgggagctg aatttgaagc aatttacgat tctctcgtta ttcaaaatga tgaatatttc 2220

gttctgcgag attttggccc atatgcggaa aagcaagaag ctgttggtag agcttatgag 2280

aaccgaacga agtggctcga aatgtcgatt ttaaatattg cacaatctgg tcattttgcg 2340

agcgatcgaa cgattttaca gtatagtaat gagatttggg gtattggtaa tacagttacg 2400

caaattctcg agcaccacca ccaccaccac tga 2433

Claims

1.一种立体选择性酯酶，其特征在于所述酯酶的氨基酸序列为SEQ ID No.1所示。

2.一种权利要求1所述立体选择性酯酶的编码基因，其特征在于所述编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。

3.一种权利要求2所述编码基因构建的重组载体。

4.一种权利要求3所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。

5.一种权利要求2所述编码基因在制备立体选择性酯酶中的应用。

6.一种权利要求1所述立体选择性酯酶在催化拆分(R,S)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧-1H-茚-2-羧酸甲酯中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述应用以含立体选择性酯酶编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体、冻干菌体或湿菌体提取的纯酶为催化剂，以(R,S)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧-1H-茚-2-羧酸甲酯为底物，以pH7.0、0.2M的磷酸盐缓冲液为反应介质构成反应体系，在20～45℃、100～300r/min条件下进行拆分反应，反应结束后，反应液分离纯化，得到(S)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧-1H-茚-2-羧酸甲酯。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述底物初始浓度以缓冲液体积计为4.2～150mM；所述催化剂加入量以缓冲液体积计为10-50g/L。

9.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述湿菌体按如下方法制备：将含立体选择性酯酶编码基因的工程菌接种至含100μg/ml卡那霉素的LB液体培养基，37℃下培养12-16h，再以体积浓度1％接种量接种到新鲜的含100μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃下培养至菌体浓度OD₆₀₀ 0.6-0.8，再向LB液体培养基加入终浓度为0.2mM的IPTG，28℃下诱导培养10-12h，然后在4℃下12000rpm离心10min，收集湿菌体。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述纯酶按如下方法制备：将含立体选择性酯酶编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体用50mM的pH8.0的Tris-HCl缓冲液重悬，超声破碎，取上清液；取上清液进行Ni-NTA金属螯合亲和层析，依次用50mM咪唑水溶液、100mM咪唑水溶液、150mM咪唑水溶液、200mM咪唑水溶液洗脱，收集150mM咪唑水溶液洗脱的流出液，超滤膜脱盐浓缩，收集截留液，获得酯酶纯酶；所述超声破碎功率为100W、超声5s、间隔5s，有效超声时间15min。