CN105112385A - 一种重组酯酶、编码基因、载体、工程菌及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种来自反硝化无色杆菌zjut1104的重组酯酶、编码基因、载体、工程菌及在催化农药中间体(R，S)-2，6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯的不对称水解中的应用；所述酯酶的核苷酸序列为SEQ？ID？NO.1或SEQ？ID？NO.2所示，相应的氨基酸序列为SEQ？ID？NO.3或SEQ？ID？NO.4所示；本发明所述含重组酯酶基因的工程菌表达的酶活比原始菌株分别高了21.6倍和26.1倍，为超表达；本发明提供的重组酯酶EHesterase和BXesterase催化(R，S)-2，6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯的不对称水解，当底物浓度为5％(m/v)时，37℃下反应3h，底物的转化率分别是43.1％和53.2％，产物2，6-二甲基苯基氨基丙酸的ee_p分别是76.0％和68.4％，对映体选择性是R型。

Description

一种重组酯酶、编码基因、载体、工程菌及应用

(一)技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及反硝化无色杆菌来源酯酶的编码基因及应用。

(二)背景技术

N-取代苯基-α-氨基丙酸是一类重要的手性合成中间体，由该类中间体合成的农药已经形成了一类重要的农药体系-酰胺类农药，其中甲霜灵、氯霜灵、呋霜灵、异霜灵和苯霜灵为杀菌剂，异丙甲草胺、新燕灵和麦草伏为除草剂。

甲霜灵是酰胺类杀菌剂中最为普遍的成员，在世界防治卵菌亚纲病害(霜霉病和晚疫病)市场上甲霜灵产品占15％。甲霜灵有R和S构型两种对映异构体。体外生物活性测试表明R异构体大约比S异构体高1000倍。体内测试显示R体活性比S体高3倍。外消旋甲霜灵目前在一些国家正在被主要由R体组成的精甲霜灵所代替，典型的精甲霜灵产品由97.5％的R体以及2.5％的S体构成。光学纯产品替代外消旋(或异构体混合物)产品不仅提高了使用药效而且还能减少释放到环境中的农药总量，减少非活性异构体在生物圈内的扩展，从而减小对非靶标生物的潜在副作用。而且，光学纯产品的使用还有利于产品的生产、运输和储存。

目前，大量的手性化合物的制备是通过化学拆分法完成的。利用生物酶法拆分手性化合物比化学拆分法具有明显的优越性：(1)酶催化的反应通常具有高度的立体专一性。因此得到的产物旋光纯度很高。(2)副反应少，产率高，产品分离提纯简单。(3)酶催化的反应大多在很温和的条件下进行，温度区间0～50℃，pH值接近中性。因此没有设备腐蚀问题，生产安全性也高。

酯酶(Esterase)是一类能够催化酯键形成和断开的水解酶，能够参与酯化反应、转酯反应及对光活性物质进行动力学拆分等多种反应。酯酶种类多、来源广，所催化的反应不需要辅酶。另外酯酶还具有水解作用底物广泛且能进行不对称酯化或水解，对很多反应具有高度的立体选择性和专一性，因此酯酶被广泛应用于食品、新型生物材料、化工、生物传感器、生物医学、生物柴油及手性药物等领域。目前酯酶已经成为在生物技术和有机合成方面应用最广泛的酶之一。

黄丽琴，杨红等人(酶法拆分(±)-N-(2,6-二甲苯基)-丙氨酸甲酯[J].有机化学，2005,25(12):1575-1579.)用皱褶假丝酵母催化拆分(R，S)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯，反应120h底物转化率达到了31.2％，产物对映体过量值为81.34％。

农药中间体N-(2,6-二甲苯基)氨基丙酸甲酯的结构式：

Oh-JinPark等人(Enzyme-catalyzedpreparationofmethyl(R)-N-(2,6-dimethylphenyl)alaninate:akeyintermediatefor(R)-metalaxyl[J],Tetrahedron:Asymmetry2005,16:1221–1225)用来自Burkholderiacepacia的LipasePS催化(R，S)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯的水解，酶和底物用量之比为1：2(g/g)，反应3h，转化率为17.1％，ee_p达到96.6％，选择性为R型。王岩等人(精甲霜灵的合成研究(D)，吉林：吉林大学，2008)利用假单胞菌脂肪酶PSL催化拆分(R，S)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯，酶和底物用量之比为1：5.5(g/g)，反应时间在38h，转化率为50％，产物的ee_p达到99％，选择性是S型。而利用南极假丝酵母脂肪酶CAL-B，反应2h，转化率为48.2％，产物的ee_p为69.2％，选择性是R型。

本发明提供一种能够水解农药中间体(R，S)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯的新酯酶，与王岩等人所报道的南极假丝酵母脂肪酶CAL-B在选择性的性能方面比较相似，但是由于用酶量差别很大，该新酯酶的活性要远高于脂肪酶CAL-B。本发明所述新酯酶的典型用量是：折算后的湿菌体(所用酶从中提取)与底物的质量比为1：2.4(g/g)，众所周知，某一种酶在湿菌体中的含量是很低的。而王岩等人所用酶CAL-B为酶粉。

(三)发明内容

本发明提供一种能够催化农药中间体(R，S)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯不对称水解的新酯酶，该酯酶具有高的反应活性和相当高的对映体R型选择性。

本发明提供一种来源于反硝化无色杆菌(Achromobacterdenitrificans)zjut1104的重组酯酶，所述重组酯酶的氨基酸序列为SEQIDNO.3(重组酯酶EHesterase，简称EHest)或SEQIDNO.4(重组酯酶BXesterase，简称BXest)所示。

由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQNO：3或SEQIDNO.4所示氨基酸序列的多肽的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该多肽的片段或多肽变体与前述氨基酸序列同源性在80％以上，均属于本发明保护范围之列。具体的，所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。

本发明提供了编码上述重组酯酶的基因，所述基因的核苷酸序列为SEQIDNO.1(EHest)或SEQIDNO.2所示(BXest)。

由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQIDNO：1或SEQIDNO.2所示多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有90％以上同源性，均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以使生的等位变异体或非生的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的氨基酸的功能。

本发明还提供由所述重组酯酶编码基因构建的重组载体(具体为EHest-pET28a(+)和BXest-pET28a(+))，及由所述重组载体转化获得的重组基因工程菌(具体为EHest-pET28a(+)-BL21Gold(DE3)plysS和BXest-pET28a(+)-BL21Gold(DE3)plysS)。

此外，本发明提供一种所述重组酯酶在催化(R，S)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯水解制备R-2,6-二甲基苯基氨基丙酸中的应用，具体所述的应用以含重组酯酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体用pH7.0磷酸盐缓冲液悬浮并将悬浮液进行超声破碎、离心后的上清液为催化剂，以(R，S)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯为底物，以吐温80作为乳化剂，以pH7.0磷酸盐缓冲液为反应介质构成反应体系，在20～60℃、120～240rpm条件下进行水解反应，反应完全后，获得含R-2,6-二甲基苯基氨基丙酸的混合液，将混合液分离纯化，获得R-2,6-二甲基苯基氨基丙酸。

进一步，所述催化剂的用量以超声破碎前湿菌体的重量计为3-12g/L反应体系，所述底物终浓度为50-250g/L反应体系，所述乳化剂的质量用量为20g/L反应体系。

进一步，所述催化剂按如下方法制备：将含重组酯酶基因的工程菌接种于含有50μg/mL卡那霉素和35μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，37℃，180r/min培养12-16h，获得种子液；然后将种子液以体积浓度1％接种量接种于含50μg/mL卡那霉素和35μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，37℃培养至菌液OD₆₀₀为0.5～0.8，离心，湿菌体悬浮于100mM的pH8.0Tris-HCl缓冲液中，在冰浴中于200W功率条件下超声破碎，工作1s，停1s，一次3min，重复3次至菌悬液澄清，于4℃、10000rpm离心30min，取上清液，即为催化剂。

本发明所述工程菌EHest-pET28a(+)-BL21Gold(DE3)plysS和BXest-pET28a(+)-BL21Gold(DE3)plysS分别发酵表达重组酯酶EHesterase和重组酯酶BXesterase，均为胞内表达，酶活比原始菌株(反硝化无色杆菌(Achromobacterdenitrificans)zjut1104)分别高22.6和27.1倍。

本发明所述反硝化无色杆菌(Achromobacterdenitrificans)zjut1104保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2014年10月19日，保藏编号CCTCCNO：M2014495，保藏地址为中国武汉市武汉大学，已在专利申请(申请号为201410753674.9，公开号CN104531565A)中公开。

本发明从反硝化无色杆菌(Achromobacterdenitrificans)zjut1104提取基因组，并构建基因文库，通过筛选找到含目的基因的克隆子，测序并在NCBI上分析，通过克隆得到基因EHest和基因BXest。基因EHest和基因BXest与表达载体pET28a(+)连接后，转化大肠杆菌BL21Gold(DE3)plysS中诱导表达，并研究表达酯酶对(R，S)-2，6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯的水解活性。

本发明所述的重组酯酶基因EHest和重组酯酶基因BXest是通过基因文库克隆得到的，其全长分别708bp和819bp，其起始密码子分别为GTG和ATG，终止密码子均为TGA，基因BXest在上游片段比基因EHest多111bp，其余序列完全相同。经BLAST比对，EHest基因序列与AchromobacterxylosoxidansC54的同源基因的同源性为97％，BXest基因序列与AchromobacterxylosoxidansNBRC15126＝ATCC27061的同源基因的同源性为96％，这些同源基因预测编码的是酯酶，本发明所述重组酯酶验证了这个预测，并在实施例中阐述了重组酯酶的确切功能。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：

本发明提供的重组酯酶EHesterase和重组酯酶BXesterase的表达酶活比原始菌株(反硝化无色杆菌(Achromobacterdenitrificans)zjut1104)分别高22.6和27.1倍。重组酯酶EHesterase和重组酯酶BXesterase催化底物(R，S)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯的水解，底物浓度为5％(m/v)，37℃催化反应3h，底物的转化率分别达到了43.1％和53.2％，产物2,6-二甲基苯基氨基丙酸的ee_p分别达到了76.0％和68.4％，对映体选择性是R型。

(四)附图说明

图1Sau3AI对基因组DNA部分酶切优化电泳结果图(M₁为λ-HindⅢdigest；1为基因组DNA；2为10min酶切；3为20min酶切；4为30min酶切；5为40min酶切；6为50min酶切；M₂为DL10000DNAMarker)。

图2含目的基因重组质粒GLest的筛选结果图，产生黄色变色圈(黑圈圈出区域)的克隆子为阳性。

图3含目的基因重组质粒GLest的复筛结果图，有菌落的平板区域从紫色变成了黄色(A区域)，无菌落平板区域组没有颜色变化(B区域)。

图4含目的基因重组质粒GLest单酶切结果图(M:DL10000DNAMarker，1：重组pUC19的单酶切，2：重组pUC19，3：酶切pUC19载体，4：pUC19载体)。

图5与本发明所述酯酶高度同源的序列，在AchromobacterxylosoxidansC54中的确切位置，椭圆圈所标为该同源酯酶基因的位置。

图6EHest基因PCR扩增的琼脂糖电泳图(M:DL10000DNAMarker,1～3:PCR扩增的EHest条带)。

图7BXest基因PCR扩增的琼脂糖电泳图(M:DL10000DNAMarker,1～2：PCR扩增的BXest条带)。

图8EHest-pET28a(+)重组质粒PCR验证的电泳结果图(M：DL10000DNAMarker，1～4：EHest-pET28a(+)质粒PCR产物)

图9BXest-pET28a(+)重组质粒PCR验证的电泳结果图(M：DL10000DNAMarker，1～4：BXest-pET28a(+)质粒PCR产物)。

图10EHest-pET28a(+)-BL21Gold(DE3)plysS目的基因表达产物的SDS-PAGE分析(M.蛋白Marker；1，诱导组；2，未诱导组；3，空载体菌株对照；4，宿主菌株对照)。

图11BXest-pET28a(+)-BL21Gold(DE3)plysS目的基因表达产物的SDS-PAGE分析(M，蛋白Marker；1，宿主菌株对照；2，空载体菌株对照；3，未诱导组；4，诱导组)。

图12不同的底物浓度对重组酯酶EHestase催化反应的影响，37℃反应3h。

图13不同的底物浓度对重组酯酶BXestase催化反应的影响，37℃反应3h。

图14重组酯酶EHestase的催化反应进程图，底物浓度50g/L。

图15重组酯酶BXestase的催化反应进程图，底物浓度50g/L。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步描述。

实施例1：基因文库的构建及序列分析

(1)基因组DNA的提取

挑取反硝化无色杆菌zjut1104(保藏编号CCTCCNO：M2014495)单菌落，基因组DNA提取详细步骤参考AxyPrep^TMBacterialGenomicDNAMiniprep说明书，获得基因组DNA。

(2)基因组DNA的酶切优化

Sau3AI对基因组DNA酶切反应体系：

配置50μL基因组DNA酶切反应体系，并分成5管，每一管10μL，标号分别为2、3、4、5、6，相对应的酶切反应时间分别为10min、20min、30min、40min、50min，反应温度37℃。反应结束后，立即放入冰浴中，并加入一定量的10×Loadingbuffer终止反应。琼脂糖凝胶电泳检测，确定最佳反应时间使DNA片段大多数集中在2～10kb。如图1，可以看出，在酶量一定的情况下，随着酶切反应时间的增加，基因组片段在逐渐减小。在酶切反应20min时，大多数的片段集中在2～10kb范围内，所以确定在酶活0.01U/LSau3AI下，最佳酶切反应时间为20min。

(3)基因组DNA部分酶切

根据小量酶切实验，选择最佳酶切时间，配置50μL基因组DNA酶切反应体系，37℃进行酶切反应，反应时间20min，反应结束后，立即放入冰浴中，并加入5μL的10×Loadingbuffer终止反应。使用琼脂糖凝胶电泳分离纯化大于2kb大小的片段，所需DNA凝胶回收试剂盒为AxyPrepTMDNAGelExtractionGKit，其详细步骤参照说明书。

(4)pUC19载体的单酶切及其去磷酸化处理

pUC19载体的单酶切反应体系：

pUC19载体44μL

10×NEBuffer3.15μL

BamHI1μL

总体系50μL

反应温度37℃，酶切时间2h。反应结束后对酶切体系直接去磷酸化处理。

酶切pUC19载体去磷酸化反应体系：

反应温度37℃，反应时间15min，失活温度65℃，失活反应时间5min。反应结束后，使用PCR清洗试剂盒对其进行清洗，清洗后用于连接反应。PCR清洗试剂盒为AxyPrep^TMPCRCleanupKit，具体步骤参照其说明书。

(5)重组质粒的构建

连接反应体系：

pUC19载体2μL

外源DNA片段(步骤3)3μL

LigationhighVer.25μL

总体系10μL

将连接液置于PCR仪16℃恒温连接1h，然后全部转化到E.coilDH5α宿主菌中。冰浴30min，42℃水浴热激1min后立即冰浴2～3min。加入800μLLB液体培养基，37℃摇床培养1h。3000×g离心1min，去除上清液，保留300μL上清液，混匀沉淀与上清液，涂布于含100μg/mL氨苄青霉素抗性的筛选培养基平板上，37℃培养1～2d。筛选培养基是在LB固体培养基中添加终浓度60g/L的(R，S)-2，6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯，以50mg/L过滤除菌的溴甲酚紫作为指示剂。

(6)含目的基因克隆子的筛选及验证

步骤(5)37℃培养箱培养1～2d，筛选平板上有黄色透明圈的出现，如图2，挑取平板上的黄色单菌落，于筛选培养基(100μg/mL氨苄青霉素抗性)上划线分离，如图3。从图中可知有菌落生长的地方，全部变成黄色透明。挑取单菌落，接于含100μg/mL氨苄青霉素抗性的LB液体培养基上富集培养，使用AxyPrepTMPlasmidMiniprepKit提取重组质粒，质粒单酶切体系验证阳性克隆，琼脂糖电泳检测，如图4，重组质粒的大小在12kbp左右，经单酶切变成了两条条带，可以确定基因文库构建成功，将该重组质粒命名为GLest-pUC19，插入的外源基因命名GLest，送样测序(生工生物工程有限公司)。

质粒单酶切验证反应体系：

pUC19载体21.5μL

10×NEBuffer3.12.5μL

BamHI1μL

总体系25μL

(7)酯酶/脂肪酶基因序列分析

因技术原因，未测得重组质粒GLest-pUC19中插入的外源片段的完整序列，只分别测得首尾两端的各一段序列，获得的首段和尾段序列大小分别为1236bp和1250bp，其核苷酸序列如SEQIDNO.9和SEQIDNO.10。在NCBI上进行比对发现，这两个序列与AchromobacterxylosoxidansC54的相应同源片段相似度均最高，为94％。由于该菌株的全基因组序列已经测序，点击进入GenBank，再进入Fast，分别查找与SEQIDNO.9和SEQIDNO.10相似度最高的同源序列在这个菌株基因组确切的位置，再点击进入Graphics，以这两个同源序列为首尾，截得大小为11550bp的一段长序列，见图5。

发现AchromobacterxylosoxidansC54的这段长序列中含有酯酶基因片段，以GTG为起始密码子，碱基大小708bp，编码蛋白质氨基酸235aa，基因编号：LH59-14460，其核苷酸序列如SEQIDNO.11。

通过比对又发现，AchromobacterxylosoxidansNBRC15126＝ATCC27061酯酶氨基酸序列N端，比LH59-14460基因编码的氨基酸序列多出37个氨基酸，其余的序列氨基酸完全相同。以LH59-14460基因的起始密码子GTG为起点向上游延长111bp核苷酸序列，得到了一个以ATG为开头的基因序列，大小为819bp，其核苷酸序列如SEQIDNO.12。通过ORFFinder查找开放阅读框，发现序列SEQIDNO.12翻译成的氨基酸序列与AchromobacterxylosoxidansNBRC15126＝ATCC27061酯酶的氨基酸序列完全相同。

实施例2：酯酶基因的克隆及表达载体的构建

1、目的基因的扩增

根据SEQIDNO.11和SEQIDNO.12基因序列，分别设计扩增EHest和BXest基因的引物(含有保护碱基和酶切位点)，其引物序列分别为SEQIDNO.5和SEQIDNO.6，SEQIDNO.7和SEQIDNO.8。以反硝化无色杆菌(Achromobacterdenitrificans)zjut1104基因组为模板，PCR扩增目的条带。

PCR反应体系：

PCR反应条件：

扩增后琼脂糖凝胶电泳检测，如图6和图7，从图中可以看出，在500～1000bp左右都有明亮的条带，无非特异性扩增，与预期大小相符。使用AxyPrep^TMDNAGelExtractionGKit切胶回收目的片段。

2、目的基因与质粒载体双酶切

酶切反应体系：

反应温度37℃，反应时间3h。反应结束后，使用PCR清洗试剂盒对其进行清洗，清洗后用于连接反应。PCR清洗试剂盒为AxyPrep^TMPCRCleanupKit，具体步骤参照其说明书。

3、重组大肠杆菌的构建

将酶切后的目的基因与线性pET-28a(+)连接后得到重组质粒，然后全部转化到E.coliBL21Gold(DE3)plysS宿主菌，分别获得EHest-pET28a(+)-BL21Gold(DE3)plysS和BXest-pET28a(+)-BL21Gold(DE3)plysS。

4、重组质粒的PCR验证

随机挑取平板上的4个单菌落，LB液体培养基(50μg/mL卡那霉素抗性和35μg/mL氯霉素抗性)过夜富集培养。提取重组质粒，做质粒PCR验证，琼脂糖电泳检测，EHest基因电泳结果如图8，BXest基因电泳结果如图9，其中EHest基因序列大小约为700bp，BXest基因序列大小约为800bp，从图中看出，两个目的条带与预期基因相符。取该克隆子送生工生物工程有限公司测序，测序结果表明，重组大肠杆菌构建成功，EHest片段大小为708bp(见SEQIDNO.1)，BXest片段大小819bp(见SEQIDNO.2)，登陆NCBI比对片段，其中EHest基因序列与AchromobacterxylosoxidansC54的同源基因的同源性为97％，BXest基因序列与AchromobacterxylosoxidansNBRC15126＝ATCC27061的同源基因的同源性为96％，这两个基因分别编码235(氨基酸序列为SEQIDNO.3)和272个氨基酸(氨基酸序列为SEQIDNO.4)。

实施例3：重组酯酶的表达

1.重组大肠杆菌的诱导发酵

将实施例2中构建成功的两株菌株(EHest-pET28a(+)-BL21Gold(DE3)plysS和BXest-pET28a(+)-BL21Gold(DE3)plysS)分别划线分离于LB固体培养基(50μg/mL卡那霉素抗性和35μg/mL氯霉素抗性)平板上，37℃培养过夜。挑取平板上的单菌落，分别接种于50mL含有50μg/mL卡那霉素抗性和35μg/mL氯霉素抗性的LB液体培养基中，37℃，180r/min培养12-16h；分别取富集菌液以体积浓度1％接种量接种于50mL含50μg/mL卡那霉素抗性和35μg/mL氯霉素抗性的LB液体培养基中，37℃培养3～4h，至菌液OD₆₀₀约为0.5～0.8，分别标记为诱导组和未诱导组。同时以宿主菌组(E.coliBL21Gold(DE3)plysS)和空载体菌组(pET28a(+)-BL21Gold(DE3)plysS)作为对照，培养条件同上。在宿主菌组，空载体菌组和诱导组中添加500mMIPTG至终浓度为1.0mM，未诱导组加等量的无菌水，22℃，180r/min培养16h。

2.菌体破碎

分别取宿主菌组，空载体菌组，未诱导组和诱导组菌液，4℃，10000rpm离心10min后弃培养基，细胞悬浮于100mM的pH8.0Tris-HCl缓冲液中，菌体浓度大约为0.05g/mL，冰浴条件下200W功率超声破碎，工作1s，停1s，一次3min，重复3次至菌悬液澄清。于4℃、10000rpm离心30min，取上清液，添加甘油至10％，4℃保存，用于酶活测定和SDS-PAGE凝胶电泳。

3.表达产物SDS-PAGE电泳分析

分别取宿主菌组，空载体菌组，未诱导组和诱导组菌液蛋白粗提液(即超声破碎后的上清液)与2×上样缓冲液充分混匀，沸水煮8min制成样品；将玻璃板、样品梳洗净晾干，固定于灌胶支架上，检漏，按比例制胶，先制备分离胶，用移液器快速加入直至距离前玻璃板顶端1.5cm，加去离子水覆盖分离胶，使凝胶表面平整，静置至胶凝，出现明显的分离界面，将水层倾倒尽，滤纸吸干，按比例配制浓缩胶后立即灌胶，插入样品梳，大约20min后胶即可聚合；胶制好后，装入电泳系统，加入电极缓冲液，上样，接通电源开始电泳，开始电压恒定在65V，待溴酚蓝条带进入分离胶后改为150V；电泳完毕小心卸下胶板，剥离胶放入染色液中，置于恒温振荡摇器上染色1h；染色完毕，将蛋白胶放入脱色液，置于恒温振荡摇器上脱色1h，更换一次脱色液至完全脱净。EHest-pET28a(+)-BL21Gold(DE3)plysS诱导表达的目的蛋白SDS电泳图，如图10。BXest-pET28a(+)-BL21Gold(DE3)plysS诱导表达的目的蛋白SDS电泳图，如图11。

由图可知，经IPTG诱导，这两株重组大肠杆菌都有目的蛋白含量的表达，EHest酯酶蛋白约为26KDa，BXest酯酶目的蛋白约为30KDa，说明这两个基因在E.coliBL21Gold(DE3)plysS成功异源表达，且表达量比较大。

实施例4：重组菌的表达酶活检测

1、重组菌与原始菌的酯酶表达和酶活测定体系

取湿菌体15g(实施例3方法诱导培养后的重组菌EHest-pET28a(+)-BL21Gold(DE3)plysS、BXest-pET28a(+)-BL21Gold(DE3)plysS和原始菌株反硝化无色杆菌zjut1104)，用50mL磷酸盐缓冲液(100mM，pH7.0)悬浮，经超声破壁后(方法同实施例2)，离心，上清液50ml即为酶液。取适量的酶液(EHest和BXest酶液分别取10μL，原始菌株酶液取50μL)，0.25g(R，S)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯为底物，0.1g吐温80作为乳化剂，一定量的磷酸盐缓冲液(100mM，pH7.0)，总反应体系为5mL，37℃恒温摇床中催化反应1h，转速180rpm，反应结束后立即用6M盐酸终止反应。用反相HPLC测定底物的水解产物2,6-二甲基苯基氨基丙酸。

2、反相HPLC分析产物2,6-二甲基苯基氨基丙酸

流动相：乙腈：水：三氟乙酸＝60：40％(加入0.1％三氟乙酸)，流速：1ml/min，检测紫外波长：220nm，柱温：25℃，进样量:10μl，色谱柱：250mm×4mm，C18。色谱仪型号岛津L-20。

3、酶活定义

酶活力单位1U：在酶活测定条件下，1分钟转化底物生成1微摩尔产物所需的酶量。

4、重组菌与原始菌株的表达酶活比较

原始菌株的表达酶活为17.6U/mL。而重组菌EHest-pET28a(+)-BL21Gold(DE3)plysS和重组菌BXest-pET28a(+)-BL21Gold(DE3)plysS的表达酶活分别为398U/mL和476U/mL，均为超表达，比原始菌株分别高21.6和26.1倍。

实施例5：重组酯酶对(R，S)-2，6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯的水解拆分反应

1、重组酯酶催化反应体系

取200μL的酶液(酶液制备方法同实施例4，200μL酶液相当于60mg湿菌体超声破碎制备)，0.25g(R，S)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯为底物，0.1g吐温80作为乳化剂，一定量的磷酸盐缓冲液(100mM，pH7.0)，总反应体系为5mL，37℃恒温摇床中催化反应3h，转速180rpm，反应结束后立即用6M盐酸终止反应。乙酸乙酯萃取，取一定量，用氮气吹干，加入流动相溶解，用正相手性HPLC检测手性产物。

2、正相手性HPLC检测产物(R或S)-2，6-二甲基苯基氨基丙酸

流动相为正己烷：异丙醇＝98：2(加入0.1％的三氟乙酸)，流速:0.5ml/min，检测紫外波长：220，柱温：30℃，进样量:10μl，色谱柱：250mm×4mm，大赛璐手性OD柱。色谱仪Waters。

对映体过量值(ee)和底物总转化率(C)以及对映体选择率按以下公式计算：

公式1： ${\mathrm{ee}}_s\left(\%\right)=\left|\frac{{\[S\]}_S-{\[S\]}_R}{{\[S\]}_S+{\[S\]}_R}\right|\×100\%$

公式2： ${\mathrm{ee}}_p\left(\%\right)=\left|\frac{{\[P\]}_S-{\[P\]}_R}{{\[P\]}_S+{\[P\]}_R}\right|\×100\%$

公式3： $C\left(\%\right)=\frac{{\mathrm{ee}}_s}{{\mathrm{ee}}_s+{\mathrm{ee}}_p}\×100\%$

公式1-公式3中，[S]_S和[S]_R分别为HPLC测得样品中S和R型底物的浓度，[P]_S和[P]_R分别是S和R型产物的浓度，ee_s和ee_p分别为拆分反应的底物和产物对映体过量值，C为转化率。

3、催化反应结果

经过3h催化反应，重组酯酶EHesterase和BXesterase催化(R，S)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯水解，底物的转化率分别达到了43.1％和53.2％，产物2,6-二甲基苯基氨基丙酸的ee_p分别达到了76.0％和68.4％，对映体选择性为R型。

实施例6：底物浓度对重组酯酶拆分反应的影响

取200μL的酶液(酶液制备方法同实施例4，相当于60mg湿菌体超声破碎制备)和不同浓度的(50g/L、100g/L、150g/L、200g/L、250g/L)(R，S)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯为底物，0.1g吐温80作为乳化剂，一定量的磷酸盐缓冲液(100mM，pH7.0)，总反应体系为5mL，37℃恒温摇床中催化反应3h，转速180rpm，反应结束后立即用6M盐酸终止反应。乙酸乙酯萃取，取一定量，用氮气吹干，加入流动相溶解，用正相手性HPLC检测手性产物。其结果如图12和图13所示。

从图中可以看出，随着底物浓度的增加，产物的ee值增加，而底物的转化率减少。因为底物已接近饱和，增加初始底物浓度并没有增大反应速率，因此转化率下降。

实施例7：重组酯酶的催化反应进程

底物(R，S)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯的浓度50g/L，其它条件和操作方法与实施例6相同，在反应时间分别为1、2、3、4h时取样分析，其结果如图14和图15。由图知，随着反应时间的延长，转化率增加，而ee_p下降。

Claims (8)

1.一种来源于反硝化无色杆菌(Achromobacterdenitrificans)zjut1104的重组酯酶，其特征在于所述酯酶的氨基酸序列为SEQIDNO.3或SEQIDNO.4所示。

2.一种权利要求1所述重组酯酶的编码基因，其特征在于所述基因的核苷酸序列为SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示。

3.一种由权利要求2所述编码基因构建的重组载体。

4.一种由权利要求3所述重组载体转化获得的重组基因工程菌。

5.一种权利要求1所述重组酯酶在催化(R，S)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯水解制备R-2,6-二甲基苯基氨基丙酸中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述的应用以含重组酯酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体用pH7.0磷酸盐缓冲液悬浮并将悬浮液进行超声破碎、离心后的上清液为催化剂，以(R，S)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯为底物，以吐温80作为乳化剂，以pH7.0磷酸盐缓冲液为反应介质构成反应体系，在20-60℃、120-240rpm条件下进行水解反应，反应完全后，获得含R-2,6-二甲基苯基氨基丙酸的混合液，将混合液分离纯化，获得R-2,6-二甲基苯基氨基丙酸。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述催化剂的用量以超声破碎前湿菌体的重量计为3-12g/L反应体系，所述底物终浓度为50-250g/L反应体系，所述乳化剂的质量用量为20g/L反应体系。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述催化剂按如下方法制备：将含重组酯酶基因的工程菌接种于含有50μg/mL卡那霉素和35μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，37℃，180r/min培养12-16h，获得种子液；然后将种子液以体积浓度1％接种量接种于含50μg/mL卡那霉素和35μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，37℃培养至菌液OD₆₀₀为0.5～0.8，离心，收集湿菌体悬浮于100mM的pH7.0磷酸盐缓冲液中，冰浴中于200W功率条件下超声破碎，工作1s，停1s，一次3min，重复3次至菌悬液澄清，于4℃、10000rpm离心30min，取上清液，即为催化剂。