CN106244569A - 一种酯酶EstC10及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种酯酶EstC10及其编码基因和应用。本发明从嗜热芽孢杆菌(Bacillussp.)CX01中克隆得到酯酶基因EstC10，全长为747bp，其编码的酯酶EstC10共包含248个氨基酸。将酯酶基因EstC10与表达载体pET‑28α(+)连接后转化大肠杆菌BL21(DE3)，培养并诱导表达后，得到了重组酯酶EstC10。酯酶EstC10能催化酯类水解、酯化和/或转酯化反应，酯酶EstC10作为催化剂拆分(±)‑2‑氯丙酸甲酯，可制备得到R‑2‑氯丙酸甲酯；酯酶EstC10作为催化剂拆分(±)‑乳酸甲酯，可制备得到D‑乳酸甲酯。

Description

一种酯酶EstC10及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于生物化工和生物技术领域，具体涉及一种酯酶EstC10及其编码基因和应用。

背景技术

酯酶广泛存在于动物、植物及微生物中，是一类催化水解或形成酯键的酶，作用的底物通常是脂肪链小于十个碳原子的酯类。酯酶属于α/β折叠水解酶超家族，催化中心一般由丝氨酸、天冬氨酸/谷氨酸和组氨酸组成，保守序列为丝氨酸附近的五肽(GXSXG)序列。酯酶能催化水解、酯化、转酯化等多种化学反应，是一种很重要的工业生物催化剂，被广泛运用于精细化工、洗涤、医药、食品、造纸、皮革加工、纺织、废水处理和饲料工业等领域。从催化特性来看，酯酶具有高度的化学选择性和立体异构选择性，且反应不需要辅酶、反应条件温和、副产物少。在生产应用中的酯酶的另一显著特点是它能在异相系统(即油-水界面)或有机相中作用。在水相中，酯酶通常催化水解反应，而在有机相中，它却能催化酯化和转酯化反应。通过微生物酯酶的生物转化制备新型药物中间体或者去除药物消旋体的非有效成分，是一种重要的手性技术，有着非常广阔的应用前景，它可以为合成手性药物提供新的平台，为大量制备光学纯化合物提供新的方法。酶法选择性拆分消旋体化合物，具有立体专一性高，副反应少，产率高，产物光学纯度好以及反应条件温和的优点，所以是一种被广泛认可的拆分方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的酯酶EstC10及其编码基因和应用。

本发明从一株嗜热芽孢杆菌(Bacillus sp.)CX01中开发得到一种酯酶EstC10及其编码基因EstC10，构建了含有酯酶基因EstC10的重组表达载体和基因工程菌，培养基因工程菌后获得酯酶EstC10，其可应用于拆分(±)-2-氯丙酸甲酯、(±)-乳酸甲酯。

本发明的第一个目的是提供一种酯酶EstC10，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第二个目的是提供一种编码所述的酯酶EstC10的酯酶基因EstC10。

所述的酯酶基因EstC10的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供一种含有所述的酯酶基因EstC10的重组表达载体。所述的表达载体，优选pET-28α(+)载体。

本发明还提供一种含有所述的酯酶基因EstC10的基因工程菌。所述的基因工程菌，优选大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)。

本发明的第三个目的是提供所述的酯酶EstC10在催化酯类水解、酯化和/或转酯化反应中的应用。

优选，所述的应用为酯酶EstC10在拆分(±)-2-氯丙酸甲酯制备得到R-2-氯丙酸甲酯中的应用。

优选，所述的应用为酯酶EstC10在拆分(±)-乳酸甲酯制备得到D-乳酸甲酯中的应用。

本发明的酯酶基因EstC10来自嗜热芽孢杆菌(Bacillus sp.)CX01，保存在中国科学院南海海洋研究所。本发明利用生物信息学分析方法，分析得到一个酯酶基因EstC10。通过PCR的方法，从上述嗜热芽孢杆菌(Bacillus sp.)CX01基因组中克隆得到酯酶基因EstC10，全长为747bp(从起始密码子到终止密码子)，编码248个氨基酸。将酯酶基因EstC10与表达载体pET-28α(+)连接后转化大肠杆菌BL21(DE3)，培养并诱导表达后，得到了重组酯酶EstC10。酯酶EstC10能催化酯类水解、酯化和/或转酯化反应，酯酶EstC10作为催化剂拆分(±)-2-氯丙酸甲酯，可制备得到R-2-氯丙酸甲酯；酯酶EstC10作为催化剂拆分(±)-乳酸甲酯，可制备得到D-乳酸甲酯。

附图说明

图1是酯酶EstC10的SDS-PAGE电泳；M为蛋白marker，泳道1为诱导前总蛋白对照，泳道2为IPTG诱导后含重组酯酶基因EstC10的E.coli BL21(DE3)蛋白上清，泳道3为IPTG诱导后含重组酯酶基因EstC10的E.coli BL21(DE3)总蛋白，泳道4为纯化的酯酶EstC10。

图2是酯酶EstC10对不同侧链长度酰基的对硝基苯酚酯的特异性。

图3是pH对酯酶EstC10活性的影响。

图4是不同pH对酯酶EstC10的稳定性影响。

图5是温度对酯酶EstC10活性的影响。

图6是不同温度对酯酶EstC10稳定性的影响。

图7是在酯酶EstC10作用下(±)-2-氯丙酸甲酯e.e._s和Y随底物浓度的变化曲线。

图8是在酯酶EstC10作用下(±)-2-氯丙酸甲酯e.e._s和Y随反应时间的变化曲线。

图9是(±)-2-氯丙酸甲酯气相色谱图，S表示S-2-氯丙酸甲酯，R表示R-2-氯丙酸甲酯。

图10是最适反应条件下酯酶EstC10对(±)-2-氯丙酸甲酯的选择性水解气相色谱图，R表示R-2-氯丙酸甲酯。

图11是在酯酶EstC10作用下(±)-乳酸甲酯e.e._s和Y随底物浓度的变化曲线。

图12是在酯酶EstC10作用下(±)-乳酸甲酯e.e._s和Y随反应时间的变化曲线。

图13是(±)-乳酸甲酯气相色谱图，D表示D-乳酸甲酯，L表示L-乳酸甲酯。

图14是最适反应条件下酯酶EstC10对(±)-乳酸甲酯的选择性水解气相色谱图，D表示D-乳酸甲酯。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

本发明的酯酶基因EstC10来源于基因组测序的嗜热芽孢杆菌(Bacillus sp.)CX01，该菌保存在中国科学院南海海洋研究所实验室。

实施例1：酯酶基因EstC10开放阅读框边界确定及引物设计

提取嗜热芽孢杆菌(Bacillus sp.)CX01的基因组DNA，经全基因组测序后，利用生物信息学手段对基因组进行基因注释，分析其中的酯酶基因，确定了其中酯酶基因EstC10的开放阅读框，其基因序列如SEQ ID NO.1所示，全长为747bp(从起始密码子到终止密码子)，其编码的酯酶EstC10的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，共248个氨基酸。根据分析得到的酯酶基因序列，设计全长扩增引物如下：上游引物：5′-CATGGATCCATGAAAATCGTCAAACCA-3′(下划线为BamH I酶切位点)；下游引物：5′-CATCTCGAGTTATGTCTGCCAATCCAG-3′(下划线为Xho I酶切位点)。

实施例2：酯酶基因EstC10的克隆及载体构建

2.1PCR扩增

将实施例1设计的引物(上游引物：5′-CATGGATCCATGAAAATCGTCAAACCA-3′；下游引物：5′-CATCTCGAGTTATGTCTGCCAATCCAG-3′)送至上海生物工程有限公司合成，合成的引物使用TE缓冲液溶解成终浓度为10μM，以提取的嗜热芽孢杆菌(Bacillus sp.)CX01总DNA作为DNA模板，建立如表1所示反应体系：

表1PCR反应体系

使用以下PCR扩增程序扩增酯酶基因EstC10：94℃变性5min；94℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸2min，进行32个循环；72℃延伸10min，冷却到18℃。

将PCR产物在0.8％琼脂糖凝胶中，120V电压下电泳20min，置于凝胶成像系统中观察，回收747bp左右的条带。PCR产物按照胶回收试剂盒的方法进行回收，使用30μL无菌水洗脱，得到纯化回收的PCR产物。

2.2酶切

PCR产物使用以下体系进行酶切，酶切时间1.5h。酶切体系为：BamH I 2μL，Xho I2μL，DNA<0.3μg，灭菌的双蒸水加至40μL。酶切后按照胶回收试剂盒方法回收经过双酶切的PCR产物。

质粒pET-28α(+)的双酶切：挑取含有质粒pET-28α(+)的大肠杆菌DH5α单菌落，过夜培养。使用质粒提取试剂盒提取质粒，用BamH I和Xho I按以下体系双酶切，酶切时间1.5h。酶切体系为：BamH I 2μL，Xho I 2μL，DNA<0.3μg，灭菌的双蒸水加至40μL。酶切后在0.8％琼脂糖凝胶中电泳，按照胶回收试剂盒方法回收经过双酶切的线性pET-28a(+)载体。

上述双酶切使用的限制性内切酶为Thermo公司生产的快速内切酶，酶切后的纯化回收使用核酸纯化回收试剂盒(Magen，Hipure Gel Pure DNA Micro Kit)，质粒提取试剂盒为上海捷瑞生物工程有限公司的质粒小量制备试剂盒，操作方法按其使用说明书。

2.3连接

将经过双酶切的PCR产物和双酶切的pET-28α(+)载体按以下体系进行连接：双酶切PCR产物5μL，双酶切的pET-28α(+)载体1μL，T4连接酶(5U/μL)0.5μL，连接缓冲液(5×)1μL用去离子水补足5μL，连接温度为20℃，20min。

2.4转化及筛选

取5μL连接产物加入50μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中，冰浴20～30min，后于42℃水浴锅热激90s，冰浴2min后加入500μL LB液体培养基，37℃200rpm转速下，孵育培养1h。取一定量的菌液涂布于含50μg/mL卡那霉素的LB平板，培养20h后挑选单菌落。单菌落于5mLLB培养基中过夜培养后提取质粒，进行双酶切验证，酶切片段与基因大小相同的即为阳性克隆。

2.5基因核苷酸序列测定

将筛选的阳性克隆送至上海美吉生物医药有限公司进行测序，测序结果与酯酶基因EstC10序列进行比对，进一步确认是将酯酶基因EstC10插入到pET-28α(+)质粒中，结果完全正确后确认得到带有酯酶基因EstC10的pET-28α(+)质粒(命名为pET-28α(+)-EstC10，可用于进行下一步试验。

实施例3：酯酶EstC10在E.coli BL21(DE3)中的高效表达

3.1大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞制备

1.将少量大肠杆菌BL21(DE3)菌种接入5mL LB试管液中，200rpm、37℃过夜培养；

2.按1％体积比的接种量将试管中的菌液接种到200mL LB摇瓶中，200rpm、20℃过夜培养，得到原培养物；

3.将培养好的摇瓶在冰水中迅速冷却至0℃，分装至冰预冷的离心管(50mL)，冰置数分钟；

4.4℃、4000rpm离心10min回收细胞，弃上清；

5.用冰预冷的10mL 0.1M的CaCl₂重悬细胞，4℃、4000rpm离心10～15min回收细胞；

6.重复5，用10mL 0.1M的CaCl₂重悬细胞，冰浴30min以上；

7.4℃，4000rpm离心10min回收细胞；

8.每50mL原培养物用5mL含体积分数7.5％DMSO的0.1M CaCl₂来重悬，分装于1.5mL离心管，50～100μL每管。-80℃保藏。由此得到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。

3.2转化

取实施例2中得到的pET-28α(+)-EstC10质粒0.5～1μL与50μL大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞混合，冰浴30min，于42℃水浴锅热激90s，冰浴2min后加入500μL LB液体培养基，37℃200rpm培养1h。培养物离心后涂布50μg/mL的卡那霉素LB平板，培养过夜20h后挑选单菌。由此得到含有pET-28α(+)-EstC10的大肠杆菌BL21(DE3)。

实施例4：酯酶EstC10的表达和纯化

4.1蛋白诱导

含有pET-28α(+)-EstC10的大肠杆菌BL21(DE3)在LB培养基中培养至OD₆₀₀为0.85左右，加IPTG至终浓度0.2mM，22℃培养16h。300mL菌液4000rpm、4℃离心20min，收集菌体，用30mL(50mM，pH 7.4)Tris-HCl缓冲液重悬菌体，超声400w，超4s，停6s，破碎15min分钟，离心，收集上清。

4.2酯酶EstC10的纯化与SDS-PAGE电泳

用镍离子亲和层析柱纯化4.1中收集的上清，具体实施方案如下：使用25mM的咪唑洗脱5个柱体积，40mM咪唑洗脱20～30个柱体积，最后使用3.5mL 100mM咪唑洗脱，收集最后的3mL洗脱液。用脱盐柱SephadexG25进行脱盐，具体操作方法参照GE公司的操作手册进行。将纯化的酯酶进行SDS-PAGE凝胶电泳，得到纯化的酯酶EstC10(图1)，纯化的蛋白大小约35kD，符合理论预期。

4.3酯酶EstC10活性测定

酯酶EstC10活力测定采用对硝基苯酚酯，具体方法如下：①用乙腈配制5mM的对硝基苯酚酯；②在0.2mL反应体系中加入187.5μL Tris-HCl buffer(50mM，pH 8.0)，8μL对硝基苯酚酯，2.5μL纯酶液(稀释20倍后的浓度0.0025μg/μL)；③20℃下，反应4min后，加入50μL正丙醇终止反应，于405nm测定吸光度。

酶活力单位定义：1min内水解对硝基苯酚酯，释放1μM对硝基苯酚所需的酶量定义为一个酶活力单位。

实施例5：酯酶EstC10的酶学性质

5.1水解不同侧链长度的对硝基苯酚酯

按照4.3的测定条件，比较酯酶EstC10水解不同长度酰基的对硝基苯酚酯C₂-C₁₂，结果如图2。说明酯酶EstC10对长链对硝基苯酚酯特异性差，而对于短链长度的对硝基苯酚酯的作用效果较好，最佳的底物是C₂，即对硝基苯酚乙酸酯。

5.2最适pH和pH稳定性

配制不同的缓冲溶液，这些缓冲溶液具有不同的pH，如表2所示，其浓度均为50mM。

表2不同pH的缓冲体系

将4.3中测定条件所述的缓冲液(Tris-HCl buffer)按照表2中的缓冲溶液分别进行替换，测定重组酯酶EstC10的酶活力，底物为对硝基苯酚乙酸酯。pH对重组酯酶EstC10活性的影响结果见图3。在50mM的PBS pH8.0时，酯酶EstC10的酶活性最高，pH值在7.0–8.0之间有较高的酶活性。当pH低于8.0时，其活性迅速降低。pH8.0时，酯酶EstC10在Tris-HCl缓冲液中的酶活力为PBS缓冲液中的77.6％。酯酶EstC10在不同pH的缓冲液中的稳定性见图4。pH在6.0-8.0时酶活性较稳定，处理7h后残余活性在55％以上。而在过碱条件下，酶活性丧失则较为明显。

5.3最适温度和温度稳定性

使用50mM的PBS pH8.0作为缓冲液，对硝基苯酚乙酸酯作为底物，按照4.3中的反应体系，在不同温度下测定酶活。测得酯酶EstC10催化水解对硝基苯酚乙酸酯的最适温度为35℃(图5)。在30-45℃间的酶活力达80％以上，温度大于50℃时酶活性急剧下降。将酯酶EstC10在不同温度(30-50℃)下，间隔一定时间取出测酶活力，结果见图6。酯酶EstC10在低于45℃时，酶活性保持较高，处理90min后残余酶活性仍保持65％以上。随着处理温度的升高，酯酶残余酶活力逐渐下降，当温度高于50℃时酶活性急剧降低，在50℃处理30min后，残余酶活力基本丧失(图6)，说明酯酶在低于45℃时稳定性较好。

5.4金属离子对酯酶EstC10活性的影响

按照表3中的离子种类和浓度处理酯酶，以未添加任何离子或表面活性剂的反应体系中的酶活力为100％，作为对照，在室温下孵育3h，按4.3测定方法(以对硝基苯酚乙酸酯作为底物)测定相对酶活。金属离子对酶活性的影响见表3。与对照相比，低浓度的Ni²⁺、Co²⁺、Fe³⁺、Zn²⁺和Cu²⁺对酯酶催化对硝基苯酚乙酸酯的活力有不同程度的抑制作用。随金属离子浓度的增大，抑制作用加强。而Na⁺、Ba²⁺、K⁺、Mg²⁺和Ca²⁺对酯酶EstC10酶活力的影响很小。

表3金属离子对酯酶EstC10活力的影响

5.5表面活性剂对酯酶EstC10活性的影响

按照表4中的表面活性剂的种类和浓度处理酯酶EstC10，以未添加任何离子或表面活性剂的反应体系中的酶活力为100％，作为对照。在室温下孵育3h，按4.3测定方法(以对硝基苯酚乙酸酯作为底物)测定相对酶活。表面活性剂对酶活性的影响见表4。在质量分数0.1％和0.5％两个浓度下，Tween-20和三聚磷酸钠对酶活性具有激活作用，而质量分数0.1％浓度的Tween-80对酶活性具有抑制作用，并且随着浓度增加抑制作用增强。SDS、SDBS、CTAB在质量分数0.1％浓度下对酶具有强抑制性。

表4表面活性剂对酯酶EstC10活性的影响

5.6有机溶剂对酯酶EstC10活性的影响

按照表5中所示有机溶剂种类和终浓度，在反应体系中加入有机溶剂处理酯酶EstC10酶液，处理条件为室温，PBS(pH8.0)缓冲溶液中孵育3h，以未加入有机溶剂的反应体系中酯酶EstC10活力为100％作为对照，再按照4.3的测定方法(以对硝基苯酚乙酸酯作为底物)测定相对酶活，结果如表5所示。在体积分数10％的浓度下，正己烷、庚烷、三氯甲烷和DMSO对酯酶EstC10作用很小，庚烷和DMSO无明显影响，而其他有机溶剂对酯酶EstC10有不同程度的抑制作用。在高浓度(体积分数50％)下，酯酶EstC10在正己烷中保持较高的酶活，残余酶活力为50％以上。以上结果说明该酯酶能够耐有机溶剂。

表5有机溶剂对酯酶EstC10活性的影响

实施例6：酯酶EstC10拆分(±)-2-氯丙酸甲酯

6.1有机溶剂对酯酶EstC10拆分(±)-2-氯丙酸甲酯的影响

在反应体系加入10mg酯酶EstC10粗酶粉，80mM底物(±)-2-氯丙酸甲酯，10％(v/v)有机溶剂，以未加有机溶剂为对照，在37℃下反应15min，用气相色谱手性柱检测，根据峰面积计算底物对映体过量值(Enantionmeric excess，e.e._s)和得率(Yield，Y)，结果见表6。公式1：公式2：

A_S和A_R分别表示R-2-氯丙酸甲酯和S-2-氯丙酸甲酯的峰面积。A₀和A分别表示反应前后R-2-氯丙酸甲酯的峰面积。从表6可以看出绝大多数有机溶剂的存在降低了酯酶EstC10的立体选择性。

表6有机溶剂对酯酶EstC10拆分(±)-2-氯丙酸甲酯的影响

6.2反应温度对酯酶EstC10拆分(±)-2-氯丙酸甲酯的影响

在PBS(pH8.0)反应体系中加入10mg酯酶EstC10粗酶粉，80mM底物(±)-2-氯丙酸甲酯，在不同温度下反应15min，手性气相色谱测定酯酶EstC10拆分(±)-2-氯丙酸甲酯的立体选择性，结果见表7。从表中可以看出，在25-37℃，e.e._s随温度的升高，高于37℃，e.e._s降低，因此酯酶EstC10拆分(±)-2-氯丙酸甲酯的最适温度为37℃。

表7温度对酯酶EstC10拆分(±)-2-氯丙酸甲酯的影响

6.3表面活性剂对酯酶EstC10拆分2-氯甲酯的影响

在优化条件下(37℃，pH8.0PBS缓冲液)在反应体系中加入终浓度为80mM的底物(±)-2-氯丙酸甲酯，0.1％(w/v)的表面活性剂(Tween-20、Tween-80、TritonX-100、三聚磷酸钠)，加入10mg酯酶EstC10粗酶粉反应15min后，样品用于气相色谱检测，结果见表8。从表8中可以看出，与对照相比，在表面活性剂存在的情况下，e.e._s有不同程度的降低，三聚磷酸钠和Tween-20对酯酶EstC10拆分(±)-2-氯丙酸甲酯的影响相对较小。

表8表面活性剂对酯酶EstC10拆分(±)-2-氯丙酸甲酯的影响

6.4金属离子对酯酶EstC10拆分(±)-2-氯丙酸甲酯的影响

在优化条件下(37℃，pH8.0PBS缓冲液)在反应体系中加入终浓度为80mM的底物(±)-2-氯丙酸甲酯，2mM的金属离子，加入10mg酯酶EstC10粗酶粉反应15min后，样品用于气相色谱检测，结果见表9。与对照相比，大多数金属离子的存在使得e.e._s降低，Na⁺和Mg²⁺对(±)-2-氯丙酸甲酯的拆分基没有影响。

表9金属离子对酯酶EstC10拆分(±)-2-氯丙酸甲酯的影响

6.5底物浓度对酯酶EstC10拆分(±)-2-氯丙酸甲酯的影响

在优化条件下(37℃，pH8.0PBS缓冲液)，在反应体系中加入10mg酯酶EstC10粗酶粉，60-120mM底物(±)-2-氯丙酸甲酯，反应15min后，样品用于GC检测，结果见图7。从图7中可以看出，当底物浓度为60-70mM时，基本完全水解。随着底物浓度的增加，e.e._s会迅速下降。底物浓度为80mM时，e.e._s达到93％，得率为33％，因此80mM为酯酶EstC10选择性水解(±)-2-氯丙酸甲酯的最适底物浓度。

6.6反应时间对酯酶EstC10拆分(±)-2-氯丙酸甲酯的影响

在优化条件下(37℃，pH8.0PBS缓冲液)，在反应体系中加入10mg的酯酶EstC10粗酶粉，80mM底物(±)-2-氯丙酸甲酯，每隔15min或10min取出500μL，用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠除水，气相色谱手性柱检测，结果见图8。从图8中可以看出，随着反应时间的延长，e.e._s逐渐升高。反应30min后，e.e._s变化不明显，因此酯酶EstC10催化(±)-2-氯丙酸甲酯的最适时间是30min，最适反应条件下酯酶EstC10催化拆分(±)-2-氯丙酸甲酯为R-2-氯丙酸甲酯的e.e._s为99％，得率为28％。最适条件下反应前、后的气相色谱图见图9和图10。

实施例7：酯酶EstC10拆分(±)-乳酸甲酯

7.1有机溶剂对酯酶EstC10拆分(±)-乳酸甲酯的影响

在反应体系加入10mg酯酶EstC10粗酶粉，80mM底物(±)-乳酸甲酯，10％(v/v)有机溶剂，以未加有机溶剂为对照，在37℃下反应15min，用气相色谱手性柱检测，根据峰面积计算底物对映体过量值(Enantionmeric excess，e.e._s)和得率(Yield，Y)，结果见表10。

公式1：公式2：

A_D和A_L分别表示D-乳酸甲酯和L-乳酸甲酯的峰面积。A₀和A分别表示反应前、后D-乳酸甲酯的峰面积。

在有机溶剂存在的情况下，e.e._s有不同程度的降低，异辛烷、正己烷和正庚烷的影响相对较小。

表10有机溶剂对酯酶EstC10拆分(±)-乳酸甲酯的影响

7.2温度对酯酶EstC10拆分(±)-乳酸甲酯的影响

在PBS(pH8.0)反应体系中加入10mg酯酶EstC10粗酶粉，80mM底物(±)-乳酸甲酯，在不同温度下反应15min，手性气相色谱测定酯酶拆分(±)-乳酸甲酯的立体选择性，结果见表11。从表11中可以看出，e.e._s随温度的升高而增加，当温度高于37℃时，e.e._s随温度的升高而降低，在37℃时具有最大的e.e._s和转化率，因此酯酶拆分(±)-乳酸甲酯的最适温度为37℃。

表11温度对酯酶EstC10拆分(±)-乳酸甲酯的影响

7.3表面活性剂对酯酶EstC10拆分(±)-乳酸甲酯的影响

在优化条件下(37℃，pH8.0PBS缓冲液)在反应体系中加入终浓度为80mM的底物(±)-乳酸甲酯，0.1％(w/v)的表面活性剂(Tween-20、Tween-80、TritonX-100、三聚磷酸钠)，加入10mg酯酶EstC10粗酶粉反应15min后，样品用于气相色谱检测，结果见表12。从表中可以看出，与对照相比，在三聚磷酸钠存在的情况下，e.e._s有明显提高，Tween-20对酯酶EstC10拆分(±)-乳酸甲酯基本没有影响。

表12表面活性剂对酯酶EstC10拆分(±)-乳酸甲酯的影响

7.4金属离子对酯酶EstC10拆分(±)-乳酸甲酯的影响

在优化条件下(37℃，pH8.0PBS缓冲液)在反应体系中加入终浓度为80mM的底物(±)-乳酸甲酯，2mM的金属离子，0.1％(w/v)的三聚磷酸钠，加入10mg酯酶EstC10粗酶粉反应15min后，样品用于气相色谱检测，结果见表13。从表中可以看出，与对照相比，大多数金属离子的存在使e.e._s降低，Li⁺、Ca²⁺、Na⁺和Mn²⁺对(±)-乳酸甲酯的拆分基本没有影响。

表13金属离子对酯酶EstC10拆分(±)-乳酸甲酯的影响

7.5底物浓度对酯酶EstC10拆分(±)-乳酸甲酯的影响

在优化条件下(37℃，pH8.0PBS缓冲液)，在反应体系中加入10mg酯酶EstC10粗酶粉，60-120mM底物(±)-乳酸甲酯，0.1％(w/v)的三聚磷酸钠，加入10mg酯酶EstC10粗酶粉反应15min后，样品用于GC检测，结果见图11。从图11中可以看出，当底物浓度为60mM时，基本完全水解。随着底物浓度的增加，e.e._s会迅速下降。底物浓度为70mM时，e.e._s达到96％，得率为21％，因此70mM为酯酶EstC10选择性水解(±)-乳酸甲酯的最适底物浓度。7.6反应时间对酯酶EstC10拆分(±)-乳酸甲酯的影响

在优化条件下(37℃，pH8.0PBS缓冲液)，在反应体系中加入10mg的酯酶EstC10粗酶粉，70mM底物(±)-乳酸甲酯，0.1％(w/v)的三聚磷酸钠，每隔10min取出500μL，用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠除水，气相色谱手性柱检测，结果见图12。从图12中可以看出，随着反应时间的延长，e.e._s逐渐升高。反应30min后，e.e._s达到99％，Y得率从20％降至11％，综合考虑，酯酶EstC10催化(±)-乳酸甲酯的最适时间是20min，最适反应条件下酯酶EstC10催化拆分(±)-乳酸甲酯为D-乳酸甲酯的e.e._s为97％，得率为20％。最适条件下反应前、后的气相色谱图见图13和图14。

Claims (10)

1.一种酯酶EstC10，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种编码权利要求1所述的酯酶EstC10的酯酶基因EstC10。

3.根据权利要求2所述的酯酶基因EstC10，其特征在于，所述的酯酶基因EstC10的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.一种含有权利要求2所述的酯酶基因EstC10的重组表达载体。

5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述的表达载体为pET-28α(+)载体。

6.一种含有权利要求2所述的酯酶基因EstC10的基因工程菌。

7.根据权利要求6所述的基因工程菌，其特征在于，所述的基因工程菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

8.权利要求1所述的酯酶EstC10在催化酯类水解、酯化和/或转酯化反应中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的应用为酯酶EstC10在拆分(±)-2-氯丙酸甲酯制备得到R-2-氯丙酸甲酯中的应用。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的应用为酯酶EstC10在拆分(±)-乳酸甲酯制备得到D-乳酸甲酯中的应用。