CN102321643B

CN102321643B - 一条编码adi的优化dna分子及表达adi的工程菌

Info

Publication number: CN102321643B
Application number: CN201110282842.7A
Authority: CN
Inventors: 侯建华; 杨璐
Original assignee: BEIJING KAWIN TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: BEIJING KAWIN TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2011-09-22
Filing date: 2011-09-22
Publication date: 2014-12-10
Anticipated expiration: 2031-09-22
Also published as: CN102321643A

Abstract

本发明涉及一条编码精氨酸脱亚胺酶的优化DNA分子，以及含有所述的优化DNA分子的表达载体pET-30a-ADI，和含有所述表达载体的工程菌pET-30a-adi/BL21(DE3)，其保藏编号为：CGMCC No.5199，本发明所述的工程菌菌株，具有高效表达精氨酸脱亚胺酶的效果，其表达率高达40%以上，纯化后比活在37℃可达110IU/mg。

Description

一条编码ADI的优化DNA分子及表达ADI的工程菌

技术领域

本发明涉及一条编码ADI的优化DNA分子及含有所述优化DNA分子的工程菌，属于生物技术领域。

背景技术

L-精氨酸是哺乳动物细胞很重要的营养物质，它也被支原体用作主要的非糖酵解能量来源。从被支原体感染的细胞培养物中得到的精氨酸脱亚胺酶(Aiginine deiminase，ADI，EC 3.5.3.6)能够降解精氨酸为瓜氨酸和氨水，该酶存在于很多种类的微生物中，ADI已被证明能够抑制肿瘤细胞体外生长以及具有抗血管生成的活性。

人体正常细胞能够通过瓜氨酸透过胞质酵素精氨基琥珀酸合成酶（ASS）及精氨基琥珀酸裂解酶（ASL）合成精氨酸。精氨酸的代谢途径已被很好地描述，在膳食摄取中，精氨酸从肝门静脉被肝吸收，并通过精氨酸酶迅速转化为鸟氨酸，在后一过程中，形成尿素，从精氨酸产生的鸟氨酸然后转化为瓜氨酸，或者可被代谢为谷氨酸盐/酯和丙氨酸，或者形成的鸟氨酸掺入多胺化合物，例如，腐胺。未被代谢为鸟氨酸的膳食精氨酸可被加工为例如精氨酰-tRNA，用于蛋白合成。此外，存在通向精氨酸的内源合成途径，后一过程主要在肾脏中发生，其中从鸟氨酸和瓜氨酸前体合成精氨酸。

人形支原体M. arginini的ADI是一种能够降解精氨酸的酶，其由arcA基因编码，蛋白总量占M. arginini可溶蛋白的10%，除了支原体M. arginini以外，其它许多微生物如Mycoplasma hominis、Mycoplasma arthritidis、Mycobacterium tuberculosis、Lymedisease spirochetes和Streptococcus等都编码ADI，后者催化精氨酸代谢为生物体提供能量。M. arginini编码的ADI是由410个氨基酸组成的球型生物大分子，分子量约为46000，等电点为4.7，没有分子内二硫键，以二聚体形式出现。

氨基酸降解酶能通过解除胞外相关氨基酸的供给来抑制某些肿瘤细胞的增殖。人体部分肿瘤细胞缺乏精氨酸合成的相关酶，不能合成精氨酸（Cancer Res 62:5443-5440)，属于精氨酸营养缺陷型肿瘤细胞，这种不能表达精氨基琥珀酸合成酶的性质最近被科研人员所证实(Shen L J, Lin W C, Beloussow K, Shen W C. 2003)。肝癌、乳腺癌、黑素瘤等肿瘤是人体常见肿瘤，研究表明，这些肿瘤多是精氨酸营养缺陷型，这些肿瘤的细胞往往不能合成精氨酸，必须依赖外界的精氨酸来维持细胞的生长繁殖，而人体正常细胞是能够自身合成精氨酸的。因此，通过ADI降解血液循环中的精氨酸，精氨酸的营养缺陷导致肿瘤细胞增殖受到抑制，进而达到治疗肿瘤的效果。

ADI能有效抑制精氨酸缺陷型肿瘤，如黑素瘤和肝细胞癌(HCC)的增殖。同时，ADI还能诱使人类白血病细胞的凋亡，抑制内皮细胞血管增生。1970年，Gill等人最先报道了从支原体分离得到的ADI能抑制小鼠淋巴瘤L5178Y细胞的分裂（Gill P, Pan J, 1970,16(6):415—419）。小鼠体内研究表明，ADI注射在抑制黑素瘤和HCC实验鼠中是有效的（Takaku H, Takase M, 1992,51(2):244—249）。然而，ADI用作常规抗肿瘤药物却因其低效性而受到限制，而这是由ADI作为一种微生物活性酶，在哺乳动物中具强抑制内皮细胞生长活性和较短的血清半衰期引起的。经20 KD PEG修饰ADI-PEG-20（ADI-SS PEG20,00 mw）和天然ADI在体外对黑素瘤和HCC细胞一样有效。1999年ADI-PEG-20，即PEG化重组支原体ADI被FDA指定为美国罕见病药物，用于治疗恶性黑素瘤和HCC。目前正在全球范围进行治疗黑色素瘤和原发性肝癌的II期和III期临床试验。

目前ADI在大肠杆菌中的高效重组表达仍然存在一定问题。尽管已有众多微生物可编码精氨酸脱酰酶，但在用微生物发酵生产ADI时，由于宿主菌目的蛋白普遍都存在表达量低的问题，一般宿主菌目的蛋白表达量在20%以下，目的蛋白表达量相对较高的如张希东，李捷雷等(张希东，李捷雷，张洪义，等. 精氨酸脱亚胺酶的表达、纯化和活性研究[J]. 中国生物工程杂志. 2008,28(6):42~47.)在研究精氨酸脱亚胺酶的表达中，通过人工合成编码支原体精氨酸脱亚胺酶的基因，构建pBV220-ADI原核表达载体，并转染大肠杆菌DH5α中并诱导表达目的蛋白，目的蛋白的表达量可达到30%以上。由于表达量低的问题，这严重制约着ADI的大规模工业化发展，因此，寻找可高效表达精氨酸脱亚胺酶的工程菌，以解决表达量低的问题，实现产业化生产，是本领域技术人员一直渴望解决的问题。

发明内容

本发明文本中，字母ADI用来表示精氨酸脱亚胺酶蛋白，adi表示蛋白ADI的表达基因。

本发明的目的在于提供一条ADI编码基因的大肠杆菌密码子优化DNA分子adi，其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。本发明选用adi序列来源于人形支原体Mycoplasma hominis ATCC 23114全长1227个bps，共编码409个氨基酸，分子量为46313Da，等电点为5.22。

本发明中，在优化adi基因时，通过优先突变adi基因在大肠杆菌中表达的稀有密码子选择E. coli表达的最优密码子，并将携带优化的adi基因的表达载体转染至宿主菌后。通过序列优化，全基因合成adi序列，优化的adi只含有1个XhoI和Nde I酶切位点，与表达载体连接后，ADI表达量占全菌总蛋白30%以上，优选35%以上。

本发明的再一目的在于提供一种含有本发明优化DNA分子的表达载体，表达载体选用pET系列表达载体，采用带有T7启动子的高表达pET系列载体作为目的蛋白表达载体，构建的表达载体为pET30a-adi。

本发明所构建的含优化adi序列的表达载体pET30a-adi，诱导后几小时目标产物就可超过细胞总蛋白的30%，达到高效表达的目的，适合工业化规模生产。

本发明的又一目的在于提供一株高效表达ADI的大肠埃希氏菌，所述大肠埃希氏菌是将构建的表达载体pET30a-adi转染至E.coli BL21(DE3)宿主菌中，转染至大肠杆菌后在含卡那抗性的LB平皿中帅选获得，该菌株已保藏至中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，邮编：100101），保藏日期：2011年08月22日，建议的分类名为大肠埃希氏菌Escherichia coli，保藏编号为：CGMCC No.5159。

本发明的还一目的在于提供一种本发明所述的优化adi序列、以及含有本发明所述的优化的adi序列的表达载体pET30a-adi、和含有本发明构建的表达载体pET30a-adi的大肠埃希氏菌在生产制备精氨酸脱亚胺酶中的应用。

在本发明的一个实施例中，给出了筛选本发明工程菌菌种的方法，通过筛选高表达量的阳性转化子，并将夺得的高表达量的阳性转化子(工程菌)进行保藏，其保藏编号为CGMCC No.5159。

本发明的再一实施例中，给出了利用本发明工程菌发酵生产ADI的工艺，pET30a-adi/BL21(DE3)工程菌表达的ADI占全菌比例高达46.46%，高于目前已知文献中报道的表达量（约35%）。

本发明的还一实施例给出了提取纯化本发明工程菌所得ADI的方法，通过破菌、包涵体洗涤和抽提、复性和精制步骤，最终所得ADI的纯度可达98%以上，比活可大于110 IU/mg。

本发明的还一实施例中，给出了验证本发明菌种遗传稳定性的研究，本发明所得工程菌具有遗传稳定性，其质粒遗传稳定性至少可维持7天。

本发明构建的ADI高效表达工程菌，ADI表达量高，占全菌总蛋白40%以上，优选45%以上，更优选50%以上，所得ADI经纯化后，比活性高，37℃下测定，ADI比活可到110 IU/mg，并且，所构建的工程菌遗传稳定，适合工业化规模生产制备ADI。

附图说明

图1为表达载体pET30a-adi构建技术路线图。

图2为adi与pET30a连接转化产物PCR筛选在1%的琼脂糖凝胶点用上电泳检测各个样品扩增结果图，图中0~5泳道未菌液PCR扩增结果，其中：0为阴性对照，M为Marker 2000 Plus，1为1号转化子，2为2号转化子，3为3号转化子，4为4号转化子，5为5号转化子。

图3为阳性转化子酶切鉴定结果图，其中泳道M₁为λ/Hind III Marker，泳道1为pET30a-adi质粒，泳道2为pET30a-adi经Nde I和Xho I双酶解后图，泳道3为pET30a经Nde I酶解电泳图，泳道4为序列adi经Nde I-Xho I双酶切电泳图，泳道5为pET30a质粒电泳图，泳道6为pMD18TS-adi质粒电泳图，泳道M₀为DL2000+II。

图4为ADI工程菌筛选图，各菌诱导表达前后进行SDS-PAGE电泳检测图，其中图4A中1~3为ADI 1~3号转化子诱导后全菌，4~6为ADI 1~3号转化子诱导前全菌；图4B中1~3为ADI 4~6号转化子诱导后全菌，4~6为ADI 4~6号转化子诱导前全菌。

图5为工程菌pET30a-adi/BL21(DE3) ADI表达情况，泳道1为pET30a-adi/BL21(DE3)工程菌诱导前全菌，泳道2为诱导后全菌，泳道3为超声上清，泳道4为包涵体，泳道M为蛋白Marker。

具体实施例

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1 实验材料

adi的全序列及adi扩增引物

委托北京三博远志生物技术有限责任公司全序列合成SEQ ID No：1中优化的adi序列，并克隆至pMD18-T simple载体，获得含有adi序列的载体pMD18-T simple-adi。

委托生工生物（上海）有限公司合成adi 的PRC扩增引物。

引物名称	序列
		adi F	ctgaaatcggtgaactg
adi R	gagacagcggcatagac

本实验核酸序列测定均委托北京六合华大基因科技股份有限公司完成。

表达载体pET30a购自Novagen公司，克隆宿主菌DH5α及表达宿主菌BL21（DE3）均为Invitrogen公司产品。

实验中所用工具酶： Xho I，Nde I，T4 DNA连接酶均为Fermentas 公司产品，TransStart FastPfu DNA 聚合酶购自北京全式金生物技术有限公司。

实验中所用琼脂糖凝胶电泳DNA回收试剂盒，高纯度质粒小提试剂盒为天根生化科技（北京）有限公司产品。

实施例2 ADI表达载体的构建

载体与片段的酶切

取pMD18-T Simple-adi与pET30a质粒（100ng/μL）各2μg，分别放于不同的EP管中，向其中加入ddH₂O 60μL， Buffer O 10μL，Xho I 5μL及Nde I 2.5μL。样品混匀后，置于离心机中离心5s，置于37℃ 恒温水浴中温浴3h。

载体与片段的连接

酶切结束的pMD18-T Simple-adi与pET30a质粒样品加入20μL Loading Buffer（6×），上样于宽孔琼脂糖凝胶（0.9%），在80mA恒流下电泳40min。

取pMD18-T Simple-adi电泳凝胶切取1224bps左右片段，取pET30a电泳凝胶切取5256bps左右片段。切取凝胶称重后，用琼脂糖凝胶电泳DNA回收试剂盒进行回收，产物以30μL E.B.洗脱。

取酶切后电泳切胶回收产物各8.5μL，加入T4 DNA Ligase Buffer 2μL及T4 DNA Ligase 1μL，16℃条件下连接过夜。

连接载体的转化及筛选

取10μL连接产物，按照E.coli DH5α化学转化感受态使用说明进行转化。

在转化的LB（Kan 50μg/mL）抗性平板上挑取5个菌落，至10mL LB（Kan 50μg/mL）试管中，37℃培养2h。取培养物2μL作为扩增模板。

加入物料	加入体积（μL）
		模板	2
adi F	5
		adi R	5
ddH₂O	62
		Buffer	20
dNTP	5
		TransStart FastPfu	1

按照上表配方进行加样，以LB培养基为阴性对照模板。

反应程序为如下：

1）95℃ 10min；

2）95℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 30s，此过程循环30次；

3）72℃ 10min；

4）4℃ ∞。

扩增结束后，在1%的琼脂糖凝胶电泳上电泳检测个各样品扩增结果见图2。

从图2电泳图谱中可知，在挑选的5个菌落中(1~5号转化子)，其中 1~4号转化子为阳性转化子，并对初筛阳性的各菌用试剂盒提取质粒，并按照实施例2的方法进行酶切鉴定，酶切鉴定结果见图3。

用pET30a通用测序引物对该转化子进行插入片段adi序列测定，SEQ ID No：1所示的优化序列一致，确定该载体即为本实验所要构建的载体pET30a-adi。

实施例3 菌种筛选

ADI表达载体转化宿主菌

取0.2μL pET30a-adi质粒，按照E.coli BL21（DE3）化学转化感受态使用说明进行转化。

在转化的LB（Kan 50μg/mL）抗性平板上挑取6个菌落，至10mL LB（Kan 50μg/mL）试管中，37℃培养3.5h。用30%的甘油保存菌种。

ADI工程菌筛选

按1%接菌量转接4.1中保存的pET30a-adi/ BL21（DE3）转化子至LB（Kan 50μg/mL）试管中，37℃培养2h后，加入终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导，诱导表达6h。

对各菌诱导表达前后进行SDS-PAGE电泳检测如图4。根据图4电泳结果，整理得到表1对pET30a-adi/ BL21（DE3）各菌蛋白表达情况的分析数据。通过电泳及目的蛋白表达情况，选取第5号转化子作为ADI工程菌。

1%接菌量取pET30a-adi/ BL21（DE3）5号转化子，至200mL LB（Kan 50μg/mL）三角瓶中，培养2 h（OD₆₀₀约0.6），冻存牛奶管，-80℃保存，作为ADI工程菌原始种子，并保藏至中国微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC No.5159。

表1、ADI潜在工程菌蛋白表达情况

pET30a-adi/ BL21（DE3）各菌目的蛋白表达情况

转化子编号	目的蛋白表达占全菌总蛋白的比例(%)
		1	42.45
2	33.99
		3	39.58
4	54.53
		5	64.64
6	57.98

实施例4 ADI的工程菌发酵表达

从pET30a-adi/BL21(DE3)原始细胞库划线平板上挑取单菌落，转接至10mL LB培养基(Kan 50μg/mL), 200rpm, 37℃培养过夜。将上述活化的pET30a-adi/BL21(DE3)按1%接菌量分别接种于1L三角瓶中，37℃ 200r/min培养，加入诱导剂后调整培养条件至37℃，200r/min，进行诱导表达。

表2、ADI工程菌pET-30a-adi/BL21(DE3)的1L发酵

指标、参数	结果
		发酵培养基	LB培养基
发酵体积	1 L
		湿菌体重	3.62 g
包涵体重	0.48 g
		裂解蛋白量	433.98 mg
ADI占全菌	46.46%
		ADI占包涵体	91.49%

ADI表达产率

对pET-30a-adi/BL21(DE3)工程菌1L发酵情况进行电泳（图5），结果显示（表2）ADI表达量占全细胞的比例为46.46%，显著高于目前已知文献中报道的表达量（30%），且ADI占包涵体的比例较高91.49%。该菌对目的蛋白表达量高，且目的蛋白在包涵体内纯度较高，可以很好的满足工程菌工业化生产的要求。

实施例5 ADI纯化

提取和纯化步骤包括破菌、包涵体洗涤和抽提、复性和精制。采用超声破破菌，收集包涵体，再用6mol/L的盐酸胍变性过夜，变性液离心去除沉淀，进行20倍稀释，在4℃、20倍体积透析液(20mmlo/L磷酸缓冲液、pH8.0)中透析过夜；透析后经DEAE-Sepharose Fast Flow——Spehacryl S-200纯化并收集目的峰，ADI纯度达到95%以上，浓度>3.0mg/ml。

实施例6 精氨酸脱亚胺酶活性测定

采用体外精氨酸降解实验检查体外酶学活性，基本原理是：ADI催化精氨酸转变成瓜氨酸，后者与diacetyl mono-oxime结合，在460nm处有强吸收，在一定的线性范围内，反应液460nm处吸光度的变化量与反应的氨基酸成正比，具体操作步骤按照试剂盒的说明进行。活力单位定义：1分钟反应时间内催化1微摩尔精氨酸转变为1微摩尔瓜氨酸的酶量定义为1个活力单位(IU)，37℃下获得的ADI比活性可达到110 IU/mg。

Claims

1.一条编码精氨酸脱亚胺酶的优化DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。

2.一种pET-30a系表达载体，其特征是所述表达载体含有权利要求1所述的优化的DNA分子序列。

3.含有权利要求2所述表达载体的大肠埃希氏工程菌，其保藏编号为CGMCC No.5159。

4.权利要求1所述优化DNA分子在生产精氨酸脱亚胺酶中的应用。

5.权利要求2所述的表达载体在生产精氨酸脱亚胺酶中的应用。

6.权利要求3所述的工程菌在生产精氨酸脱亚胺酶中的应用。

7.一种精氨酸脱亚胺酶的制备方法，包括：选取权利要求3所述工程菌菌株，转至LB培养基中，发酵培养，将所得发酵液经破菌、包涵体洗涤以及抽提、复性和精制步骤，得到目的蛋白精氨酸脱亚胺酶。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述发酵培养步骤中，在培养物中加入诱导剂IPTG后进行诱导表达，所述破菌为超声破菌。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述精制步骤是采用柱层析精制。

10.权利要求9所述的方法，其中所用柱层析为离子交换柱或分子筛中的任意一种或组合。