CN101665798B - 一种制备重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白的方法，包括如下步骤：a)构建含有重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白基因的表达质粒；b)将步骤a)得到的含有重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白基因的表达质粒转化到酵母工程菌中，建立表达重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白的酵母工程菌种子库；c)将步骤b)得到的酵母工程菌种子库中的酵母种子菌以5％～30％(v/v)的接种量接种于酵母培养基中，溶氧不小于10％的饱和度，25℃～37℃培养60～90小时；d)收集上清发酵液，分离纯化出所述重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白。本发明还涉及一种用上述方法制得的重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白，该种重组融合蛋白的纯度高、生物活性强，作为药物的活性成分，可以安全、有效地应用于人体。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域。具体涉及一种制备重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白的方法。
背景技术
干扰素(IFN)是一组具有多种功能的活性蛋白质(主要是糖蛋白)，是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。它们在多种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长和分化、调节免疫功能等多种生物活性。根据干扰素蛋白质的氨基酸结构、抗原性和细胞来源，可将其分为：IFNα(白细胞型)、IFNβ(成纤维细胞型)、IFNγ(免疫型)。IFNω属于IFNα家族，其结构和大小与其它IFNα稍有差异，但抗原性有较大的不同。现在公认IFNβ和IFNγ只有一个亚型，而IFNα有约二十余个亚型。自80年代以来，许多研究显示，干扰素(尤其是IFNα及IFNγ)除具有抗病毒、免疫调节的作用外，还具有明显的抗细胞增殖作用。因此，目前干扰素已被用于治疗多种人类疾病。
人重组干扰素在临床上都已被广泛地运用于抗病毒及抗肿瘤。多年来，干扰素是一直被用于治疗丙型，乙型肝炎的首选用药。但干扰素的疗效并不太理想，只在较小比例的患者在停止用药之后仍能维持对病毒的抑制作用。主要的问题在于干扰素的血液半衰期只有仅仅3-6个小时，为达到治疗效果一般肝炎病人需要每周至少接受三次注射，给病人带来巨大的痛苦。
针对上述干扰素在人体内半衰期短的缺点，美国的罗氏制药(Roche)和先灵葆雅(Schering-Plough)将干扰素聚乙二醇化，以保障一个稳定的血浆浓度，聚乙二醇化的干扰素展示出较好的临床治疗效果。目前，聚乙二醇化的干扰素在临床上已经在很大程度上替代了普通干扰素单体。此外，采用重组人血清白蛋白与干扰素的融合蛋白也可以克服干扰素在人体内半衰期较短的缺点，有研究表明，在克鲁维氏酵母中表达的HSA-IFNα融合蛋白(Albuferon)在猕猴体内的半衰期比普通IFNα延长了大约18倍。
重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白的制备涉及到酵母工程菌的发酵过程以及后续的纯化过程。重组质粒和酵母染色体基因竞争利用共同的蛋白表达系统、代谢能量以及生物合成的前体等，从而造成受体细胞生长缓慢和重组质粒的不稳定。而那些丢失了重组质粒的细胞与受体细胞共享培养基和竞争生长，可以导致基因表达的产率降低。故外源基因在宿主细胞中的表达受很多因素的影响，不仅要考虑到工程菌本身的因素，还要顾及工程菌培养过程中外部条件，如发酵过程中每个营养成分的含量，温度，pH，溶氧浓度等。并且后续的纯化过程也非常重要，直接影响最终重组融合蛋白的纯度与生物活性。
因此，本领域迫切需要提供一种高效制备重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白的方法，并将其运用到重组融合蛋白药品的生产中。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效制备重组人血清白蛋白与干扰素α(较佳干扰素α-2b)融合蛋白的方法。
为了实现上述目的，本发明首先提供了一种制备重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白的方法，包括如下步骤：
a)构建含有重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白基因的表达质粒；
b)将步骤a)得到的含有重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白基因的表达质粒转化到酵母工程菌中，建立表达重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白的酵母工程菌种子库；
c)将步骤b)得到的酵母工程菌种子库中的酵母种子菌以5％～30％(v/v)(较佳10％～20％(v/v)，最佳10％(v/v))的接种量接种于酵母培养基中，溶氧不小于10％的饱和度，25℃～37℃(较佳28℃～32℃，最佳30℃)培养60～90小时(较佳60～72小时，最佳60小时)；
d)收集上清发酵液，分离纯化出所述重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白。
在一个优选的实施方案中，所述重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白中的干扰素α选自干扰素α-2a、干扰素α-1b、或干扰素α-2b。
在另一个优选的实施方案中，所述酵母工程菌是酿酒酵母；更优选所述酵母工程菌是酿酒酵母BJ5457。
在还有一个优选的实施方案中，所述表达质粒是含有重组人血清白蛋白与干扰素α(较佳干扰素α-2b)融合蛋白基因，并且可以在酵母工程菌(较佳酿酒酵母，更佳酿酒酵母BJ5457)中组成型表达的载体质粒；更优选所述表达质粒是含有重组人血清白蛋白与干扰素α(较佳干扰素α-2b)融合蛋白基因的PYES31载体质粒。
在一个优选的实施方案中，所述酵母培养基是由0.5％～1.5％(w/v)的蛋白胨、1.5％～2.5％(w/v)的酵母提取物、2.0％(w/v)的葡萄糖或2.0％(w/v)蔗糖、以及微量金属元素组成的。在一个更优选的实施方案中，所述微量金属元素包括亚铁离子(较佳为2ppm～4ppm Fe2+)、铜离子(较佳为2ppm～4ppm Cu2+)、锰离子(较佳为2ppm～4ppm Mn2+)、以及锌离子(较佳为7ppm～14ppm Zn2+)。在一个还要优选的实施方案中，所述酵母培养基的起始pH值为5.5～6.5。
在一个较佳的实施方案中，在所述步骤c)培养的第12～16个小时流加0.5～1.5升20％(w/v)的葡萄糖或0.5～1.5升20％(w/v)蔗糖；在所述步骤c)培养的第38～42个小时再流加0.5～1.5升乙醇。在另一个较佳的实施方案中，在所述步骤c)的整个培养过程中不补加氮源。
在还有一个较佳的实施方案中，在所述步骤d)中，所述分离纯化的方法是采用层析方法。在一个更佳的实施方案中，所述层析方法选自亲和层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水层析、反向层析或其组合。在一个还要佳的实施方案中，所述分离纯化的方法为：采用阳离子交换层析(较佳采用SP-XL填料)捕获发酵液中的重组人血清白蛋白与干扰素α(较佳干扰素α-2b)融合蛋白，先后经过疏水层析(较佳采用Butyl sepharose FF填料)以及阴离子交换层析(较佳采用DEAEsepharose FF填料)两步精细纯化，最终得到含有所述重组人血清白蛋白与干扰素α(较佳干扰素α-2b)融合蛋白(纯度不低于95.0％)的样品。
本发明还涉及用以上方法制得的重组人血清白蛋白与干扰素α(较佳干扰素α-2b)融合蛋白。
采用本发明方法的优点主要有：①发酵效率高、而成本相对低廉；②最终经纯化获得的重组人血清白蛋白与干扰素α(较佳干扰素α-2b)融合蛋白的比活性不低于5.0×105IU/mg，纯度不低于95.0％，作为药物的活性成分，可以安全、有效地应用于人体。
附图说明
图1显示了本发明实施例2(四)所述的表达载体质粒图谱。
图2显示了本发明实施例5(三)所述的SDS-PAGE电泳图。其中，M：Marker(从上至下依次分别为116、66.2、45、35、25、18.4、14.4kDa)，泳道1～3为HSA-IFNα-2b融合蛋白样品的还原型SDS-聚丙烯酰胺电泳图。
图3显示了本发明实施例5(四)所述的HPLC峰图。
具体实施方案
具体而言，本发明提供了一种制备重组人血清白蛋白与干扰素α(较佳干扰素α-2b)融合蛋白的方法，包括如下步骤：
a)构建含有重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白基因的表达质粒；
b)将步骤a)得到的含有重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白基因的表达质粒转化到酵母工程菌中，建立表达重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白的酵母工程菌种子库；
c)将步骤b)得到的酵母工程菌种子库中的酵母种子菌以5％～30％(v/v)(较佳10％～20％(v/v)，最佳10％(v/v))的接种量接种于酵母培养基中，溶氧不小于10％的饱和度，25℃～37℃(较佳28℃～32℃，最佳30℃)培养60～90小时(较佳60～72小时，最佳60小时)；
d)收集上清发酵液，分离纯化出所述重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白。
在一个优选的实施方案中，所述重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白中的干扰素α选自干扰素α-2a、干扰素α-1b、或干扰素α-2b，即重组人血清白蛋白与干扰素α-2a融合蛋白、重组人血清白蛋白与干扰素α-1b融合蛋白、或重组人血清白蛋白与干扰素α-2b融合蛋白。在本发明的一个实施方案中，选用了重组人血清白蛋白与干扰素α-2b融合蛋白。
在本发明所述重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白中，所述干扰素α可直接连接在人血清白蛋白的N末端或C末端形成重组融合蛋白(IFNα-HSA、或HSA-IFNα)；也可以通过一个连接肽(例如(G4S)n，n宜为3或4)连接两种蛋白，形成干扰素α-连接肽-人血清白蛋白融合蛋白(IFNα-L-HSA)、或人血清白蛋白-连接肽-干扰素α融合蛋白(HSA-L-IFNα)。考虑到连接肽毒理评价问题(如在体内增加新的免疫原性的可能性)尚存争议，本发明优选干扰素α(较佳干扰素α-2b)直接连接在人血清白蛋白的N末端或C末端形成的重组融合蛋白。
关于干扰素α(如干扰素α-2a、干扰素α-1b、或干扰素α-2b等)或者人血清白蛋白的氨基酸序列是本领域技术人员所熟知的，或者也可以通过搜索网上数据库(例如GenBank)获得。如无特别说明，本发明所述的各种“干扰素”或“IFN”都是指“人干扰素”。
本发明所述“干扰素α”或者“人血清白蛋白”多肽包括与其相同(同源)或基本相同(同源)的多肽，例如，有至少60％、较佳70％、更佳80％、还要佳90％、最佳95％以上的同源性或相同性的多肽，当然，其相同(同源)或基本相同(同源)的多肽与所述蛋白多肽应具有相同或相似的生物活性或功能。所述“干扰素”或者“人血清白蛋白”多肽还包括与所述蛋白多肽具有相同或相似生物活性或功能的突变形式。这些突变形式包括但并不限于，相对于天然蛋白的氨基酸序列有若干个(通常为1-50个，较佳的1-30个，更佳的1-20个，最佳的1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代。
因此，所述重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白也包括了上述相同(同源)或基本相同(同源)多肽的重组融合蛋白，以及上述突变形式多肽的重组融合蛋白。
在本发明制备方法的步骤a)中，所述重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白基因也包括了可以编码上述多种形式的重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白的基因(核酸序列)。所述基因通常可以用PCR扩增法、或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据相关的基因(核酸序列)，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA文库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，通常可通过重叠扩增(Overlap-PCR)，例如进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。当然，为了便于后续目的蛋白的分离纯化，优选可以在重组融合蛋白基因的3’-端加上一段信号肽(前导肽)序列(优选来源于酵母的信号肽序列)，这样，重组人血清白蛋白与干扰素α(较佳干扰素α-2b)融合蛋白可经由信号肽(前导肽)分泌到酵母菌培养液中，简化了后续对于目的蛋白的分离纯化。
本发明制备方法所述步骤a)为：构建含有重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白基因的表达质粒。
其中，构建含有重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白基因的表达质粒的方法是本领域常规的方法，也是本领域技术人员所熟知的。具体的实施步骤为：首先，用常规手段分别克隆获得编码人血清白蛋白(HSA)多肽和干扰素α(IFNα)多肽的核酸序列。具体是从适当的组织、细胞提取mRNA，通过RT-PCR获得相应的cDNA；也可以从适当的cDNA文库直接获得相应的cDNA；还可以通过人工合成获得。获得的核酸序列可适当进行密码子的改变，以便在相应的蛋白表达宿主(如酵母工程菌)中达到表达蛋白的最佳效果。
然后，将编码HSA多肽的核酸序列与编码IFNα多肽的核酸序列连接形成单一编码IFNα-HSA、或HSA-IFNα多肽的核酸序列。优选的合成方法为Overlap-PCR的方法；也可以通过基因核酸序列末端天然的限制性酶切位点进行连接。然后，上述重组核酸序列被克隆到表达质粒载体中，使该核酸序列与表达调控序列操作性相连，获得所述含有重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白基因的表达质粒。此处术语“表达调控序列”通常指参与控制核酸序列表达的序列。表达调控序列包括与目标核酸序列操作性相连的启动子和终止信号等；它们通常还包括核酸序列准确翻译所需的序列。“操作性相连”是指线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果启动子或增强子增加了编码序列的转录，则它与编码序列是操作性相连的。
本发明选用的表达质粒载体包括任何适合在酵母工程菌(较佳酿酒酵母，更佳酿酒酵母BJ5457)中表达重组融合蛋白的载体质粒，优选的载体是能在酵母工程菌(较佳酿酒酵母，更佳酿酒酵母BJ5457)中组成型表达(一般指该载体拥有组成型启动子，不需要诱导物的诱导，外源基因在细胞生长的过程中持续表达)的载体质粒，更优选的质粒载体是PYES31。PYES31是由PYES3/CT(Novogen)改造而来，两者的唯一不同是把GAL1(半乳糖激酶)启动子变成了PGK1(磷酸甘油酸激酶)启动子，PYES31载体上的PGK1是组成型启动子，不需要诱导物的诱导，外源基因在细胞生长的过程中持续表达。
本发明制备方法所述步骤b)为：将步骤a)得到的含有重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白基因的表达质粒转化到酵母工程菌中，建立表达重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白的酵母工程菌种子库。
所述转化的方法是本领域常规的方法，也是本领域技术人员所熟知的。较佳的将步骤a)得到的含有重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白基因的表达质粒转化到酵母工程菌(更佳酿酒酵母，还要佳酿酒酵母BJ5457)中的方法是电转化方法。
所述建立酵母工程菌种子库的目的是为了得到较为稳定可靠的含有重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白基因表达质粒的酵母工程菌，也可以方便后续发酵培养的接种操作。具体的方法为：挑取经鉴定为含有重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白基因表达质粒的阳性酵母克隆，置于培养基中培养(为了使酵母菌中的质粒不丢失，较佳的是在相应的缺陷培养基(例如SDA液体培养基)中进行培养)，达到一定密度(较佳OD600值为4.0～5.0)后，加入无菌甘油(较佳的甘油终浓度为15～20％v/v)，分装，冻存，-80℃保存。
本发明制备方法所述步骤c)为：将步骤b)得到的酵母工程菌种子库中的酵母种子菌以5％～30％(v/v)(较佳10％～20％(v/v)，最佳10％(v/v))的接种量接种于酵母培养基中，溶氧不小于10％的饱和度，25℃～37℃(较佳28℃～32℃，最佳30℃)培养60～90小时(较佳60～72小时，最佳60小时)。
在所述步骤c)中，根据发酵培养的总体积，小试可以使用摇瓶培养，大规模工业生产可以使用发酵罐培养。此外，根据发酵培养的总体积，优选可以事先对所述酵母工程菌种子库中的酵母种子菌进行一级或者多级种子培养(为了使酵母种子菌中的质粒不丢失，较佳的是在相应的缺陷培养基(例如SDA液体培养基)中进行种子培养)，达到一定密度(较佳OD600值为4.0～5.0)后，再以5％～30％(v/v)(较佳10％～20％(v/v)，最佳10％(v/v))的接种量接种于酵母培养基中。
发明人对于酵母培养基的配方、起始pH值、以及发酵过程中补料的摸索尝试了多种方案，经过不懈的努力，最终确定了若干个优选的实施方案。
在一个优选的实施方案中，所述酵母培养基是由0.5％～1.5％(w/v)的蛋白胨、1.5％～2.5％(w/v)的酵母提取物、2.0％(w/v)的葡萄糖或2.0％(w/v)蔗糖以及微量金属元素组成的。
在一个更优选的实施方案中，所述微量金属元素包括亚铁离子(较佳为2ppm～4ppm Fe2+)、铜离子(较佳为2ppm～4ppm Cu2+)、锰离子(较佳为2ppm～4ppmMn2+)、以及锌离子(较佳为7ppm～14ppm Zn2+)。在一个还要优选的实施方案中，所述微量金属元素是由亚铁离子(较佳为2ppm～4ppm Fe2+)、铜离子(较佳为2ppm～4ppm Cu2+)、锰离子(较佳为2ppm～4ppm Mn2+)、以及锌离子(较佳为7ppm～14ppm Zn2+)组成的。
在另一个还要优选的实施方案中，所述酵母培养基的起始pH值为5.5～6.5。
在另一个优选的实施方案中，在所述步骤c)培养的第12～16个小时流加0.5～1.5升20％(w/v)的葡萄糖或0.5～1.5升20％(w/v)蔗糖；在所述步骤c)培养的第38～42个小时再流加0.5～1.5升乙醇。在还有一个优选的实施方案中，在所述步骤c)的整个培养过程中不补加氮源。
本发明制备方法所述步骤d)为：收集上清发酵液，分离纯化出所述重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白。
其中，收集上清发酵液的方法是本领域常规的方法，也是本领域技术人员所熟知的。例如可以采用离心(优选在4℃～8℃条件下离心)、过滤、或静置等方法。
优选地，所述分离纯化的方法不会使目的蛋白大幅度失活变性。在本发明中，从发酵液中分离纯化出所述重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白的方法优选采用层析方法，包括但不限于，亲和层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水层析、反向层析或其组合。
在一个更优选的实施方案中，所述分离纯化的方法为：采用阳离子交换层析(较佳采用SP-XL填料)捕获发酵液中的重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白，先后经过疏水层析(较佳采用Butyl sepharose FF填料)以及阴离子交换层析(较佳采用DEAE sepharose FF填料)两步精细纯化，最终得到含有所述重组人血清白蛋白与干扰素α(较佳干扰素α-2b)融合蛋白(纯度不低于95.0％)的样品。
在一个还要优选的实施方案中，所述捕获的过程是采用了扩张床吸附技术(STREAMLINE)，即采用STREAMLINE SP-XL阳离子交换层析捕获发酵液中的重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白。采用STREAMLINE技术的优点在于可以直接从含有菌体的发酵液中捕获目的蛋白，将除去菌体、浓缩、初步纯化结合为一。而传统的方法是先将发酵液除去菌体、浓缩然后再用层析柱捕获蛋白，在此过程中操作时间较长、蛋白易损失，而且步骤繁琐、仪器昂贵。
值得注意的是，本发明在描述所述重组人血清白蛋白与干扰素α(较佳干扰素α-2b)融合蛋白的制备方法时，采用了“包括如下步骤：……”的句式。也就是说，本领域技术人员还可以根据需要，在制备重组人血清白蛋白与干扰素α(较佳干扰素α-2b)融合蛋白时，增加其它的技术步骤。当然，增加的技术步骤必须确保基本上不会影响最终得到的所述重组人血清白蛋白与干扰素α(较佳干扰素α-2b)融合蛋白的浓度、纯度、及生物活性。
本发明所述重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白表达与纯化的结果可以采用常规的蛋白分析方法进行鉴定，包括但不限制于：SDS-PAGE，Western-blot，蛋白含量的测定，蛋白纯度的测定，干扰素生物活性(比活性)的测定等。
经检测，用本发明方法制得的重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白，其蛋白含量不低于1.5mg/ml，比活性不低于5.0×105IU/mg，纯度不低于95.0％，分子量为85.7KD±8.5KD。
下面将结合实施例进一步详细地描述本发明。然而应当理解，列举这些实施例只是为了起说明作用，而并不是用来限制本发明的范围。
实施例1 培养基配置与检测分析方法
(一)培养基配置
(1)LB液体培养基。蛋白胨：10g，酵母提取物：5g，氯化钠：5g，ddH2O：950ml。摇动容器直至溶质完全溶解，用5mol/L NaOH调节pH直至7.0，加入ddH2O至总体积1L，在1.034×105Pa高压下灭菌20min。
(2)LB固体培养基。LB液体培养基：100ml，琼脂粉：1.5g。摇动，在1.034×105Pa高压下灭菌20min。
(3)山梨醇选择平板。YNB：6.7g，山梨醇：18.2g，琼脂粉：2.0g，ddH2O：800ml。待溶解后，加入ddH2O至总体积900ml。在1.034×105Pa高压下灭菌20min。用时加入灭菌的20％(w/v)的葡萄糖100ml，倒平板。
(4)SDA液体培养基。YNB：6.7g，KH2PO4：2.2g，K2HPO4·3H2O：4.5g，尿素：1.5g，ddH2O：800ml。待溶解后，加入ddH2O至总体积900ml。在1.034×105Pa高压下灭菌20min。用时加入灭菌的20％(w/v)的葡萄糖100ml。
(5)SDA固体培养基。YNB：6.7g，KH2PO4：2.2g，K2HPO4·3H2O：4.5g，尿素：1.5g，ddH2O：800ml，琼脂粉：20g。待溶解后，加入ddH2O至总体积900ml。在1.034×105Pa高压下灭菌20min。用时加入灭菌的20％(w/v)的葡萄糖100ml，倒平板。
(6)YPD液体培养基。蛋白胨：20g，酵母提取物：10g，ddH2O：800ml。待溶解后，加入ddH2O至总体积900ml。在1.034×105Pa高压下灭菌20min。用时加入灭菌的20％(w/v)的葡萄糖100ml。
(7)YPD固体培养基。YPD液体培养基。蛋白胨：20g，酵母提取物：10g，ddH2O：800ml，琼脂粉：20g。待溶解后，加入ddH2O至总体积900ml。在1.034×105Pa高压下灭菌20min。用时加入灭菌的20％(w/v)的葡萄糖100ml，倒平板。
(二)检测分析方法
(1)干扰素生物活性(比活性)的测定。细胞病变抑制法(WISH/VSV系统)，《中华人民共和国药典》2005年版三部，附录XC。
(2)酵母菌体浓度的测定。分光光度计测定OD600的值。
用没有接种酵母菌的培养基作为空白对照，样品用空白对照的培养基稀释，测定OD600的值。酿酒酵母1OD600相当于108个细胞。
实施例2 HSA-IFN α-2b融合蛋白表达工程酵母菌的构建
(一)人血清白蛋白基因的克隆
人血清白蛋白基因可以通过RT-PCR获得。首先获得正常人肝组织，并从中制备RNA；然而，通过反转录方法获得cDNA；再用PCR分子克隆技术扩增获得人血清白蛋白基因。具体步骤如下：
首先制备总RNA。用正常人肝组织适量，加入1ml Trizol试剂裂解细胞，匀浆再以氯仿和异丙醇进行抽提RNA，用乙醇进行洗涤，获得的RNA便可以进行RT-PCR反转录了。RT-PCR使用宝生物公司mRNA Selective PCR试剂盒。
反转录体系为：2×mRNA Selective PCR Buffer I，25μl；MgCl2，10μl；dNTP/analogMixture，5μl；R Nase inhibitor，1μl；AMV RNase XL，1μl；Oligo dT Primer，1μl；RNA，1μl；RNase Free dH2O，6μl。根据下列的程序进行反应：30℃，10min；42℃，30min；5℃，5min。合成的cDNA在-20℃保存。
当然，人血清白蛋白基因也可以从商业购得的人胎肝cDNA文库中获得。
根据文献设计HSA的引物，用常规的PCR方法扩增HSA基因。
HSA1：gtcggtacc(KpnI)ATGCTTTTGCAAGCTTTCCTTTTCCTTTTGGCTGGTTTTGCAGCCAAAATATCTGCA(前导肽)GATGCACACAAGAGTGAGGTTG
HSA2：TGGGTTTGAGGCAGATCACATAAGCCTAAGGCAGCTT
PCR反应体系为：前述制得的cDNA，1μl；HSA1，2.5μl；HSA2，2.5μl；PremixTaq(Ex Taq)，25μl；ddH2O，19μl。根据下列的程序进行反应：开始，94℃5min；然后，94℃1min，55℃1min，72℃2min，一共30个循环；最后，72℃5min。
然后使用常用的分子生物学方法，分离获得HSA基因。具体是用1％的琼脂糖胶电泳PCR产物，切下1800bp左右的目的条带，再用博大泰克公司的“PCR产物快速胶回收试剂盒”回收切胶产物，-20℃保存。
(二)干扰素α基因的克隆
本实验说明IFN α-2b基因的克隆方法，本方法也适合其它IFNα基因的克隆。首先，取正常人外周血获得人白细胞，并从中制备RNA；通过反转录方法获得cDNA；再用PCR分子克隆技术扩增获得IFN α-2b基因。具体步骤如下：
首先制备总RNA。从正常人外周血人白细胞，经Sendai virus诱导培养后，白细胞加入1ml Trizol试剂裂解细胞，再以氯仿和异丙醇进行抽提RNA，用乙醇进行洗涤，获得的RNA便可以进行RT-PCR反转录了。RT-PCR使用宝生物公司mRNASelective PCR试剂盒。
反转录体系为：2×mRNA Selective PCR BufferI，25μl；MgCl2，10μl；dNTP/analogMixture，5μl；RNase inhibitor，1μl；AMV RNase XL，1μl；Oligo dT Primer，1μl；RNA，1μl；RNase Free dH2O，6μl。根据下列的程序进行反应：30℃，10min；42℃，30min；5℃，5min。合成的cDNA在-20℃保存。
根据文献设计IFN α-2b的引物，用常规的PCR方法扩增HSA基因。
IFN1：AAGCTGCCTTAGGCTTATGTGATCTGCCTCAAACCCA
IFN2：gggCTCGAG(XhoI)TTATTCCTTACTTCTTAAAC
PCR反应体系为：前述制得的cDNA，1μl；10×pfu Buffer，5μl；dNTP Mixture，2μl；IFN1，2.5μl；IFN2，2.5μl；pfu DNA Polymerase，0.5μl；ddH2O，36.5μl。根据下列的程序进行反应：开始，94℃5min；然后，94℃1min，55℃1min，72℃1min，一共30个循环；最后，72℃5min。
然后使用常用的分子生物学方法，分离获得IFN α-2b基因。具体是用1.5％的琼脂糖胶电泳PCR产物，切下500bp左右的目的条带，再用博大泰克公司的“PCR产物快速胶回收试剂盒”回收切胶产物，-20℃保存。
(三)融合基因克隆
本实验以HSA基因和IFN α-2b基因形成HSA-IFN α-2b融合基因为例，说明融合基因的克隆方法，本方法也适合HSA基因与其它IFNα基因形成融合基因的克隆。融合蛋白基因的克隆使用Overlap-PCR的方法获得。具体步骤如下：
Overlap-PCR的反应体系为：IFN α-2b PCR回收产物，2μl；HSA PCR回收产物，2μl；Premix Taq(Ex Taq)，50μl；ddH2O，36μl。PCR条件为：开始，94℃5min；然后，94℃1min，55℃1min，72℃2min，一共5个循环；接着，加入引物HSA 15μl和IFN25μl，进入下个程序：94℃1min，55℃1min，72℃2min，一共30个循环；最后，72℃5min。
使用常用的分子生物学方法，分离获得HSA-IFN α-2b融合基因。具体是用1.5％的琼脂糖胶电泳PCR产物，然后切下2300bp左右的目的条带，再用博大泰克公司的“PCR产物快速胶回收试剂盒”回收切胶产物。
(四)含有HSA-IFN α-2b融合基因的表达载体质粒的构建
以下以HSA-IFN α-2b融合基因为例，说明表达载体质粒的构建方法。本实验采用PYES31为表达载体质粒，其制备方法为常用分子生物学方法，即通过培养含有表达载体的菌种，提取获得该质粒。制备好的质粒-20℃保存待用。
为了将HSA-IFN α-2b融合基因克隆到PYES31表达载体质粒中，先对表达载体质粒PYES31和HSA-IFN α-2b融合基因DNA用KpnI和XhoI双酶切。酶切体系：表达载体质粒或HSA-IFN α-2b融合基因DNA，10μl；KpnI，1μl；XhoI，1μl；10×MBuffer，2μl；ddH2O，6μl。在37℃恒温水浴锅内反应2～3小时。
然后用常用的分子生物学方法，分离获得酶切后的DNA。具体是用1％的琼脂糖胶电泳酶切产物，切下目的条带，再用博大泰克公司的“PCR产物快速胶回收试剂盒”回收切胶产物。
接着对酶切产物进行连接，获得HSA-IFN α-2b融合基因表达载体(图1)。连接体系一般为10μl，solution I连接酶占体系的一半，剩下一半体系中：双酶切的表达载体与双酶切的HSA-IFN α-2b DNA的摩尔比为1：2～1：10，不足补加无菌水。16℃恒温水浴锅内反应2小时。
最后连接产物转化感受态DH5α细胞。转化使用博大泰克公司的高效DH5α感受态细胞及附带的试剂操作。转化体系为：连接产物，10μl；无菌水，30μl；酶A，10μl。取一管感受态DH5α细胞加入上述混合液中，轻柔混匀后冰上放置30分钟，再37℃放置10分钟，加入500μl LB液体培养基37℃，180r.p.m.培养30分钟，取100μl转化液涂于有氨苄青霉素抗性的LB固体培养板，37℃倒置培养12～16小时。阳性克隆的鉴定是通过挑选阳性克隆抽提质粒，进行酶切和测序确定。
(五)HSA-IFN α-2b融合蛋白表达工程酵母菌的构建
本实验利用电转化方法为例，说明HSA-IFN α-2b融合蛋白表达工程酵母菌的构建方法。具体步骤如下：
首先挑选含有HSA-IFN α-2b融合基因的表达载体质粒的细菌克隆，提取表达载体质粒。然后，用电转化的方法把质粒转入酿酒酵母BJ5457中。质粒提取方法为常用的分子生物学方法，即通过培养含有表达载体的菌种，提取获得该质粒。
电转化方法转化酿酒酵母BJ5457。具体步骤如下：
(1)酵母菌体的准备。
挑取酵母单菌落，接种至含有5ml YPD液体培养基的50ml三角瓶中，30℃，250～300r.p.m.培养过夜。然后取100～500μl的培养物接种至含有500ml新鲜培养基的2L三角摇瓶中，28～30℃，250～300r.p.m.培养过夜，至OD600达到1.3～1.5。再将细胞培养物于4℃，1500g离心5min，用500ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬。离心后，再用250ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬。再离心，用20ml的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬。再离心，用1ml的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，使其终体积约为1.5ml。
(2)电击转化。
将5～20μg含有HSA-IFN α-2b融合基因的表达载体质粒DNA线性化，再溶解在5～10μl TE溶液中，与80μl的上述步骤(1)所得的酵母菌体混匀，转至0.2cm冰预冷的电转化杯中。将电转化杯冰浴5min，然后根据相应的电转化仪，采用优化的电压、电流、电容等参数，进行电击。电击完毕后，加入1ml冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，转至1.5ml的EP管中，将菌体悬液涂布于山梨醇选择平板上，每200～600μl涂布一块平板。将平板置于30℃培养，直至单个菌落出现。本实验推荐电击参数为：电压1.5kV；电容25μF；电阻200Ω。电击时间为4～10毫秒。
(3)酵母工程菌种子库的建立。(所有操作均在无菌条件下进行)
从转化的山梨醇选择平板上挑取8～10个克隆于放有5ml的SDA液体培养基的15ml的玻璃试管中，30℃，250r.p.m.培养4～6天，使OD600大于1.0。取2μl菌液，加入20μl0.25％SDS，剧烈振荡，90℃加热3min。12000r.p.m.离心1分钟，取上清。鉴定PCR反应体系为：前述上清液，2μl；HSA1，2.5μl；HSA2，2.5μl；PremixTaq(Ex Taq)，25μl；ddH2O，18μl。根据下列的程序进行反应：开始，94℃2min；然后，94℃1min，55℃1min，72℃2min，一共30个循环；最后，72℃5min。用1.5％的琼脂糖胶电泳PCR产物，如有1800bp左右的电泳条带即为阳性克隆。(当然也可以使用引物IFN1与IFN2验证IFN的PCR信号。)将阳性克隆剩余的培养液中取出200μl，用于SDS-PAGE电泳检测。剩余的转接于100ml的SDA液体培养基中，继续培养。30℃，200r.p.m.培养3～5天，测定OD600值在4.0～5.0之间，转接到200mlYPD液体培养基中继续培养3h。在培养液中取出200μl，用于SDS-PAGE电泳检测。选出有蛋白表达，并且表达量大于0.05mg/ml的克隆，室温静置1h，使菌体沉降，倒去部分上清，转移到一无菌离心管测量体积，加入无菌甘油使甘油终浓度为15～20％(v/v)，分装，冻存，-80℃保存。
实施例3发酵工艺及参数的确定
(一)接种量的控制
从酵母工程菌种子库中取出冷冻甘油种子管，用移液管吸1ml种子液接种于200ml SDA液体培养基中，置于30℃的恒温旋转式振荡器上200转/分培养24小时，测定OD600值在4.0～5.0之间。分别用5％～30％(v/v)的接种量接种于100ml YPD液体培养基的三角瓶中，置于30℃的恒温旋转式振荡器上200转/分培养48小时。各个组的OD600与干扰素生物活性(比活性)如表1所示。结果显示，在三角瓶中培养48小时，5％～30％(v/v)的接种量OD600与干扰素生物活性(比活性)相差不大，都可以接受。综合考虑到成本因素，优选10％～20％(v/v)的接种量。
表1
(二)培养基配方的确定
(1)蛋白胨、酵母提取物含量的确定
在YPD液体培养基的基础上，保持碳源为2％的葡萄糖，调整蛋白胨、酵母提取物的含量，以提高表达量和降低成本。
从酵母工程菌种子库中取出冷冻甘油种子管，用移液管吸1ml种子液接种于200ml SDA液体培养基中，置于30℃的恒温旋转式振荡器上200转/分培养24小时，测定OD600值在4.0～5.0之间。用10％(v/v)的接种量分别接种于100ml表2的液体培养基的三角瓶中，置于30℃的恒温旋转式振荡器上200转/分培养72小时。
表2
注：“％”表示％(w/v)，即100ml液体中含有溶质的质量(g)。
表3
每个配方培养72小时的OD600值和干扰素生物活性(比活性)如表3所示。结果显示，在三角瓶中培养72小时，8号、9号、10号培养基配方活性最高，而且培养基的成本相对较低。所以培养基中较佳的蛋白胨、酵母提取物含量为：0.5％～1.5％(w/v)的蛋白胨、1.5％～2.5％(w/v)的酵母提取物。
(2)碳源的选择
在酵母培养基中常用的碳源有葡萄糖、蔗糖、甘油、乙醇等。
从酵母工程菌种子库中取出冷冻甘油种子管，用移液管吸1ml种子液接种于200ml SDA液体培养基中，置于30℃的恒温旋转式振荡器上200转/分培养24小时，测定OD600值在4.0～5.0之间。用10％(v/v)的接种量分别接种于100ml表4的液体培养基的三角瓶中，置于30℃的恒温旋转式振荡器上200转/分培养72小时。
表4
注：“％”表示％(w/v)，即100ml液体中含有溶质的质量(g)。
表5
每个配方培养72小时的OD600值和干扰素生物活性(比活性)如表5所示。结果显示，用甘油作为碳源严重抑制了酵母的生长过程，从而也大大降低了蛋白的表达；而用蔗糖和葡萄糖作为碳源则较为合适。
(3)微量元素的添加
大多数的微生物发酵需要添加微量的金属离子，这些金属离子在代谢过程中发挥作用。
从酵母工程菌种子库中取出冷冻甘油种子管，用移液管吸1ml种子液接种于200ml SDA液体培养基中，置于30℃的恒温旋转式振荡器上200转/分培养24小时，测定OD600值在4.0～5.0之间。用10％(v/v)的接种量分别接种于100ml表6的液体培养基的三角瓶中，置于30℃的恒温旋转式振荡器上200转/分培养72小时。
表6
注：“％”表示％(w/v)，即100ml液体中含有溶质的质量(g)。
表7
每个配方培养72小时的OD600值和干扰素生物活性(比活性)如表7所示。结果显示，在发酵培养基中添加微量的铁(Fe2+)、铜(Cu2+)、锰(Mn2+)、锌(Zn2+)等离子，既可以增加酵母菌的生长，又可以使目的蛋白的表达量增加。
(4)pH值的确定
在发酵的过程中，pH的变化取决于酵母细胞代谢特征、培养基配比和发酵环境条件。当然，细胞自身具有有限的调节pH的能力，当外界条件变化过于激烈时，细胞则失去自身的调节能力而受到外界环境的强烈干预，影响细胞的正常生长及表达。所以在酵母发酵的过程中，pH的控制是很重要的条件。
从酵母工程菌种子库中取出冷冻甘油种子管，用移液管吸1ml种子液接种于200ml SDA液体培养基中，置于30℃的恒温旋转式振荡器上200转/分培养24小时，测定OD600值在4.0～5.0之间。用10％(v/v)的接种量分别接种于100ml表8、表9不同pH值的液体培养基的三角瓶中，置于30℃的恒温旋转式振荡器上200转/分培养72小时。
表8
注：“自然”表示配置好培养基后不调节pH值。经测定培养基自然pH值大于7.0。
表9
注：“自然”表示配置好培养基后不调节pH值。经测定培养基自然pH值大于7.0。
表10(对应表8液体培养基)
表11(对应表9液体培养基)
每个配方培养72小时的OD600值和干扰素生物活性(比活性)如表10、表11所示。结果显示，发酵培养基优选的pH值为5.5～6.5。
(三)发酵过程中的补料
(1)碳源的补加
补糖控制在酵母工程菌的表达起重要作用，为此发明人考察了不同的补糖方式对蛋白表达的影响。
从酵母工程菌种子库中取出冷冻甘油种子管，用移液管吸1ml种子液接种于100ml SDA液体培养基中，置于30℃的恒温旋转式振荡器上200转/分培养。24小时后转接入1升的SDA液体培养基中，置于30℃的恒温旋转式振荡器上200转/分培养约24小时，测定OD600值在4.0～5.0之间。以10％(v/v)的接种量接入BIOTECH-JS15L发酵罐的10升酵母培养基(1％(w/v)蛋白提取物，2％(w/v)酵母粉，2％(w/v)蔗糖，调节pH6.0)中，溶氧不小于10％的饱和度，于30℃培养72小时。并在其过程中，发酵10个小时后，每4个小时取样，测定糖的含量。在发酵的过程中，考察不同的补糖方式的影响。补糖方式①：在发酵第14个小时流加1L 20％(w/v)的蔗糖，在发酵第40个小时再流加1L乙醇。补糖方式②：在发酵第12个小时流加0.5L 20％(w/v)的蔗糖，在发酵第38个小时再流加0.5L乙醇。补糖方式③：在发酵第16个小时流加1.5L 20％(w/v)的蔗糖，在发酵第42个小时再流加1.5L乙醇。补糖方式④：在发酵第14个小时流加1L 20％(w/v)的蔗糖，在发酵第40个小时再流加1L 20％(w/v)的蔗糖。补糖方式⑤：在第14小时，开始流加250ml 20％(w/v)的蔗糖，待糖基本消耗完全后每次流加250ml 20％(w/v)的蔗糖。不同补糖方式发酵的OD600值和干扰素生物活性(比活性)如表12所示。
表12
从酵母工程菌种子库中取出冷冻甘油种子管，用移液管吸1ml种子液接种于100ml SDA液体培养基中，置于30℃的恒温旋转式振荡器上200转/分培养。24小时后转接入1升的SDA液体培养基中，置于30℃的恒温旋转式振荡器上200转/分培养约24小时，测定OD600值在4.0～5.0之间。以10％(v/v)的接种量接入BIOTECH-JS15L发酵罐的10升酵母培养基(1％(w/v)蛋白提取物，2％(w/v)酵母粉，2％(w/v)葡萄糖，调节pH6.0)中，溶氧不小于10％的饱和度，于30℃培养72小时。并在其过程中，发酵10个小时后，每4个小时取样，测定糖的含量。在发酵的过程中，考察不同的补糖方式的影响。补糖方式⑥：在发酵第14个小时流加1L20％(w/v)的葡萄糖，在发酵第40个小时再流加1L乙醇。补糖方式⑦：在发酵第12个小时流加0.5L 20％(w/v)的葡萄糖，在发酵第38个小时再流加1.5L乙醇。补糖方式⑧：在发酵第16个小时流加1.5L 20％(w/v)的葡萄糖，在发酵第42个小时再流加0.5L乙醇。补糖方式⑨：在发酵第14个小时流加1L 20％(w/v)的葡萄糖，在发酵第40个小时再流加1L 20％(w/v)的葡萄糖。补糖方式⑩：在第14小时，开始流加250ml 20％(w/v)的葡萄糖，待糖基本消耗完全后每次流加250ml20％(w/v)的葡萄糖。不同补糖方式发酵的OD600值和干扰素生物活性(比活性)如表13所示。
表13
结果显示，补糖方式①～③、补糖方式⑥～⑧的效果较好。因此优选在培养的第12～16个小时流加0.5～1.5升20％(w/v)的葡萄糖或蔗糖，在培养的第38～42个小时再流加0.5～1.5升乙醇。在发酵的中后期维持低糖水平，适当增加乙醇的含量，使更多的碳源流向产物，有利于表达。
(2)氮源的补加
丰富的天然氮源是目的产物表达分泌所必需的，在本发明所述发酵培养基中，选择酵母提取物和蛋白胨为发酵的天然氮源。
从酵母工程菌种子库中取出冷冻甘油种子管，用移液管吸1ml种子液接种于100ml SDA液体培养基中，置于30℃的恒温旋转式振荡器上200转/分培养。24小时后转接入1升的SDA液体培养基中，置于30℃的恒温旋转式振荡器上200转/分培养约24小时，测定OD600值在4.0～5.0之间。以10％(v/v)的接种量接入BIOTECH-JS15L发酵罐的10升酵母培养基(1％(w/v)蛋白提取物，2％(w/v)酵母粉，2％(w/v)蔗糖，调节pH6.0)中，溶氧不小于10％的饱和度，于30℃培养72小时。补加氮源方式：发酵第12小时补加1L10×YP母液(酵母提取物与蛋白胨的混合物)。不同补加氮源方式发酵的OD600值和干扰素生物活性(比活性)如表14所示。
表14
结果显示，补加氮源对蛋白的表达影响不大。说明在本发明所述发酵培养基中的氮源已经足够用于细胞的生长和目的蛋白的表达。
(四)发酵时间的确定
在发酵的过程中，要求达到的目标不同，因而对决定发酵时间的发酵终点的判断有所不同。本发明的目的是得到高生物活性的目的重组融合蛋白，而不是得到高浓度的菌体或次生代谢物，因此发酵时间的长短非常重要，发酵时间过长，菌体发生自溶，影响蛋白的活性，发酵时间过短，表达量降低。
从酵母工程菌种子库中取出冷冻甘油种子管，用移液管吸1ml种子液接种于100ml SDA液体培养基中，置于30℃的恒温旋转式振荡器上200转/分培养。24小时后转接入1升的SDA液体培养基中，置于30℃的恒温旋转式振荡器上200转/分培养约24小时，测定OD600值在4.0～5.0之间。以10％(v/v)的接种量接入BIOTECH-JS15L发酵罐的10升酵母培养基(1％(w/v)蛋白提取物，2％(w/v)酵母粉，2％(w/v)蔗糖，调节pH6.0)中，溶氧不小于10％的饱和度，于30℃分别培养42～90小时。在发酵第14个小时流加1L 20％的蔗糖，在发酵第40个小时再流加1L乙醇。不同发酵时间的OD600值和干扰素生物活性(比活性)如表15所示。
表15
| 发酵时间 | 42h | 48h | 54h | 60h | 66h | 72h | 78h | 84h | 90h |
| OD600 | 12.4 | 16.8 | 22.1 | 25.7 | 26.4 | 27.1 | 28.3 | 29.9 | 31.2 |
| 比活性(×104IU/mg) | 1.10 | 3.81 | 3.94 | 7.97 | 6.82 | 6.14 | 5.90 | 5.63 | 5.27 |
结果显示，随着培养时间的延长，酵母菌浓度增加，并且目的蛋白的生物活性在60小时达到最高峰。这可能是随着培养时间的增加，菌体代谢物或菌体破裂释放的蛋白酶降解了部分目的蛋白。因此，本发明发酵(培养)时间优选60～90小时，更优选60～72小时，最优选60小时。
(五)最佳发酵方案
从酵母工程菌种子库中取出冷冻甘油种子管，用移液管吸1ml种子液接种于100ml SDA液体培养基中，置于30℃的恒温旋转式振荡器上200转/分培养。24小时后转接入1升的SDA液体培养基中，置于30℃的恒温旋转式振荡器上200转/分培养约24小时，测定OD600值在4.0～5.0之间。以10％(v/v)的接种量接入BIOTECH-JS15L发酵罐的10升酵母培养基(1％(w/v)蛋白提取物，2％(w/v)酵母粉，2％(w/v)蔗糖，调节pH6.0)中，溶氧不小于10％的饱和度，于30℃分别培养60小时。在发酵第14个小时流加1L20％的蔗糖，在发酵第40个小时再流加1L乙醇。
实施例4 HSA-IFN α-2b融合蛋白的捕获与纯化
(1)重组融合蛋白的捕获
采用STREAMLINE SP-XL柱捕获重组融合蛋白。具体步骤为：收集上述发酵结束后的发酵液(实施例3(五))，调节电导小于5.0ms/cm，用醋酸调节pH至5.0；挂经50mM pH5.0 NaAc缓冲液平衡的STREAMLINE SP-XL柱；上样结束后，用25mM NaAc(pH5.0)缓冲液淋洗柱子，洗去杂蛋白及未吸附的蛋白，至UV检测仪读数到基线；用50mMNaAc，200mMNaCl(pH5.0)的缓冲液洗脱，UV检测仪读数收集目的峰。
(2)精细纯化1
将STREAMLINE SP-XL柱层析中收集的目的洗脱峰用1倍体积的5M NaCl，50mM PB(pH6.5)缓冲液稀释，调pH6.5。采用Butyl Sepharose FF柱精细纯化1。具体步骤为：将上述稀释处理的样品挂经50mM PB，2.5M NaCl(pH6.5)缓冲液平衡的Butyl Sepharose FF柱；上样结束后，用2.5MNaCl，50mM PB(pH6.5)缓冲液淋洗柱子，洗去杂蛋白及未吸附的蛋白，至UV检测仪读数到基线；用50mM PB，0.8M NaCl(pH6.5)的缓冲液洗脱，UV检测仪读数为20左右时收集洗脱峰。
(3)精细纯化2
将Butyle Sepharose FF柱层析中收集的目的洗脱峰经透滤(Diafiltration)的方法脱盐，调节样品的缓冲系统为30mM NaCl，25mM PB(pH7.2)。采用DEAEsepharose FF柱精细纯化2。具体步骤为：将上述透滤处理的样品挂经30mM NaCl，25mM PB(pH7.2)缓冲液平衡的DEAE sepharose FF柱；上样结束后，用30mM NaCl，25mM PB(pH7.2)淋洗柱子，至UV检测仪读数到基线；用200mM NaCl，25mMPB(pH7.2)的缓冲液洗脱，并收集洗脱峰。
精细纯化2的洗脱峰即为HSA-IFN α-2b融合蛋白样品，用实施例5的方法对其进行质量检测。
实施例5 HSA-IFN α-2b融合蛋白样品的质量检测
(一)BCA法测样品蛋白含量
使用Pierce公司的BCA蛋白测定试剂盒测定实施例4得到的HSA-IFN α-2b融合蛋白样品的蛋白含量。结果显示，实施例4得到的HSA-IFN α-2b融合蛋白样品的蛋白含量为1.8mg/ml。
(二)干扰素生物活性(比活性)的测定
按照《中华人民共和国药典》2005年版三部，附录XC的方法将实施例4得到的HSA-IFN α-2b融合蛋白样品进行干扰素生物活性(比活性)的测定。结果显示，实施例4得到的HSA-IFN α-2b融合蛋白样品的比活性为5.23×105IU/mg。
(三)SDS-PAGE电泳
按照《中华人民共和国药典》2005年版三部，附录IV C的方法将实施例4得到的HSA-IFN α-2b融合蛋白样品进行SDS-PAGE电泳。
用非还原型SDS-聚丙烯酰胺电泳法，分离胶胶浓度为10％，上样量为10μg(考马氏亮蓝R250染色法)，结果经扫描仪扫描，软件计算得出样品纯度大于95.0％。用还原型SDS-聚丙烯酰胺电泳法，分离胶胶浓度为10％，上样量为2.0μg，结果计算得出样品的分子量为85.7KD±10％(图2)。
(四)高效液相色谱法测定蛋白纯度
按照《中华人民共和国药典》2005年版三部，附录III B的方法将实施例4得到的HSA-IFN α-2b融合蛋白样品使用高效液相色谱法测定蛋白纯度。用面积归一化法测量各杂质峰的面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积，计算各杂质峰面积及其之和占总峰面积的百分率。
实验结果见图3。根据样品的HPLC峰图，流动相为0.05mol/L磷酸盐，0.1mol/L氯化钠缓冲液(pH7.0)，上样量不低于20μg，用波长280nm检测。结果纯度高于95.0％。
尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。
Claims (8)
1.一种制备重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白的方法，其特征在于，它包括如下步骤：
a)构建含有重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白基因的表达质粒，其中，所述表达质粒能在酵母工程菌中组成型表达；
b)将步骤a)得到的含有重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白基因的表达质粒转化到酵母工程菌中，建立表达重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白的酵母工程菌种子库；
c)将步骤b)得到的酵母工程菌种子库中的酵母种子菌以5％～30％v/v的接种量接种于酵母培养基中，溶氧不小于10％的饱和度，25℃～37℃培养60～90小时；
d)收集上清发酵液，分离纯化出所述重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白；
其中，所述酵母工程菌是酿酒酵母；所述酵母培养基是由0.5％～1.5％w/v的蛋白胨、1.5％～2.5％w/v的酵母提取物、2.0％w/v的葡萄糖或2.0％w/v蔗糖、2ppm～4ppm Fe2+、2ppm～4ppm Cu2+、2ppm～4ppm Mn2+、以及7ppm～14ppm Zn2+组成的。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白中的干扰素α选自干扰素α-2a、干扰素α-1b、或干扰素α-2b。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤c)中培养的第12～16个小时在10升酵母培养基中流加0.5～1.5升20％w/v的葡萄糖或0.5～1.5升20％w/v蔗糖，在第38～42个小时再流加0.5～1.5升乙醇。
4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，在所述步骤c)的整个培养过程中不补加氮源。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酵母培养基的起始pH值为5.5～6.5。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤d)中，所述分离纯化的方法是采用层析方法。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述层析方法选自亲和层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水层析、反向层析或其组合。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述分离纯化的方法为：采用阳离子交换层析捕获发酵液中的重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白，先后经过疏水层析以及阴离子交换层析两步精细纯化，最终得到含有所述重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白的样品。
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