CN102154189B

CN102154189B - 一种rhG-CSF重组工程菌的发酵培养方法

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Publication number: CN102154189B
Application number: CN201010618757.9A
Authority: CN
Inventors: 赵志全; 刘忠
Original assignee: Lunan Pharmaceutical Group Corp
Current assignee: Lunan Pharmaceutical Group Corp
Priority date: 2010-12-31
Filing date: 2010-12-31
Publication date: 2015-11-11
Anticipated expiration: 2030-12-31
Also published as: CN102154189A

Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种重组人粒细胞集落刺激因子重组工程菌的发酵培养方法。通过种子的优化制备，发酵过程中通过在发酵液中添加乳糖、发酵期间乳糖的流加以及溶氧和补料控制，使得rhG-CSF蛋白的表达量占菌体总蛋白的50%以上，收集的菌体置于-20℃保存，或直接用于制备高纯度的rhG-CSF蛋白，采用本发明生产的rhG-CSF蛋白，经纯化后纯度可达99.6%以上，生物活性不低于5.0×10⁸IU/mg。

Description

一种rhG-CSF重组工程菌的发酵培养方法

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种rhG-CSF重组工程菌的发酵培养方法。

背景技术

1985年，Welte首次纯化出人粒细胞集落刺激因子。不久，Souza等人又克隆出其基因，并将其成功地在E.Coli中表达。E.Coli中表达的重组人粒细胞集落刺激因子(RecombinantHumanGranulocyte-ColonyStimulatingFactor，rhG-CSF)具有与天然G-CSF相同的体外生物学活性。随着基因克隆技术的迅猛发展，于90年代初将rhG-CSF正式应用于临床，作为防治肿瘤化放疗引起的中性粒细胞减少症的有效药物，促进粒细胞集落的形成，促进造血干细胞向中性粒细胞增殖、分化，对成熟的中性粒细胞可促进游走、吞噬、产酶、释放活性氧、杀菌能力和对外来异物的黏着作用，还可动员成熟中性粒细胞从骨髓进入外周，能使早期多能造血干细胞进入细胞周期，连日应用可促使骨髓造血干细胞进入外周血，所以G-CSF具有巨大的临床利用价值。

然而G-CSF在E.Coli中表达具有表达量低、生物学活性不如天然产物的缺点。采用先进的基因工程技术进行生产，降低生产成本，提高产品质量显得十分重要。从菌株角度入手，以获得表达量高的菌种，如中国发明专利说明书ZL98103011.4公开了粒细胞集落刺激因子的制备的技术方案，该技术方案利用工程菌部分蛋白酶基因被突变、外膜易破裂的特点，通过控制较低的发酵温度，提高了发酵产量，使分泌速度减慢，降低了蛋白被降解的几率，利用该发明得到的蛋白经纯化后获得的蛋白纯度为99％，产品活性及稳定性达到天然G-CSF的水平。如中国发明专利申请公布说明书CN101591660A公开了一种在大肠杆菌中分泌表达重组人粒细胞集落因子的方法，该技术方案通过在G-CSF的N端添加DsaA信号肽，借助信号肽的引导作用将外源蛋白分泌到周质腔中，控制表达载体的拷贝数、选择合适的启动子和培养基、采用适当诱导表达方式和培养条件，改善了表达效率，收集的菌体中G-CSF有较好的表达(占周腔蛋白的40％以上)，经过粗提、疏水层析、超滤浓缩后纯度达到98％。又如中国发明专利申请CN101766810A公开了一种含有重组人粒细胞集落刺激因子的药物制剂，克服了重组人粒细胞集落刺激因子N末端甲硫氨酸切除困难的问题，改善了产品的质量，该技术方案公开了菌种经过发酵和纯化获得重组人粒细胞集落刺激因子纯品的方法，然而发酵后目标蛋白表达占全菌的只有20％左右，纯化后蛋白纯度为95％，生物活性为8.0×10⁷IU/mg。另外从提取、纯化方面入手制备高纯度的蛋白，如中国发明专利审定授权说明书ZL96106418.8公开了一种重组人粒细胞集落刺激因子的生产方法，该技术方案构建的菌株G-CSF的表达量只占总蛋白的20％，经外压式中空纤维超滤透析复性，以离子交换柱层析、疏水柱层析和分子筛层析顺序组合纯化后获得的蛋白纯度为95％，其生物活性为1.0×10⁸IU/mg。

中国发明专利审定授权说明书ZL200410027943.X公开了重组人粒细胞集落刺激因子的制备方法，该技术方案突出选用工程菌DH5a-PBV220-hGCSF作为表达菌株的优势，是使rhG-CSF蛋白占菌体总蛋白的40％以上，但是利用PBV220/DH5a表达体系时，采用了42℃热诱导启动表达。然而冯小黎在《生物化学与生物物理进展》(2001年，第28卷第4期，482-485页)一文公开了重组包涵体蛋白质的折叠复性的技术方案，该技术方案关于减少包涵体形成的策略中，提到降低重组菌的生长温度是减少包涵体形成的最常用方法，而在蛋白质折叠复性的基本原则环境条件方面公开了折叠复性的温度范围为0～40℃、20～25℃比较常用，在这个范围之内，随着温度的升高，蛋白质的复性率和复性速度也提高，如果温度超出了这个范围，蛋白质折叠复性的效率则降低。同样如中国发明专利说明书CN1313612C公开了重组人粒细胞集落刺激因子的生产方法，通过该技术方案中公开的发酵方法，诱导结束后虽说表达量达50％，但仍采用42℃热诱导，经纯化后的比活性只有1.5×10⁸IU/mg。

通过以上公开的专利文献，可以得知目前用于人粒细胞集落刺激因子的蛋白表达量不高，纯化后的纯度以及比活性都需要提高，而且如果采用42℃热诱导启动表达，较高的温度使得包涵体复性困难，复性率降低。

发明内容

为了提高蛋白表达量、提高产物纯度和活性，便于后续复性、纯化步骤的顺利进行，本发明提供了一种人粒细胞集落刺激因子重组工程菌的发酵培养方法，包括rhG-CSF重组工程菌的种子培养及其发酵培养方法。

首先，根据G-CSF的cDNA序列，设计使用了大肠杆菌偏爱密码子，然后经过全基因合成，测序正确后构建了表达质粒pET-G-CSF，转化宿主菌BL21(DE3)PlysS，经过培养后酶切鉴定、表达筛选后获得表达G-CSF的阳性克隆，保存菌种并标记为P^ET-G-CSF/BL₂₁DE₃PlysS。

rhG-CSF重组工程菌的种子培养方法为：

①菌种的筛选：取菌种P^ET-G-CSF/BL₂₁DE₃PlysS，至含100mg/L氨苄青霉素的LB平板划线活化，35℃培养过夜，从平板上挑取单菌落接种于含100mg/L氨苄青霉素的8mLLB液体试管，35℃，180r/min培养至OD_600nm为1.5～1.8，加入IPTG至浓度为0.1mmol/L，诱导4小时后，离心收集菌体，经SDS-PAGE电泳分析，筛选得到rhG-CSF单菌落，35℃培养过夜，培养完毕后在4℃保存；

②一级种子液培养：从重新划线培养的平板挑取单菌落接种于装有8mL种子培养基并添加100mg/L氨苄青霉素液体试管，30～35℃，180r/min培养至OD_600nm为0.7～0.8，作为一级种子液；

③二级种子液培养：将一级种子液以1％的体积比接种到含250mL种子培养基的500mL三角瓶中，30～35℃，130r/min培养至OD_600nm至1.5～1.8之间，镜检无杂菌，即得rhG-CSF发酵用种子。

本发明中采用P^ET-G-CSF/BL₂₁DE₃PlysS表达体系，通过大量的实验对照，优选将一级、二级种子液培养的温度控制为30～35℃，较其它37℃或42℃培养给予更低的生长分裂速度和目的蛋白表达速度，目的蛋白表达速度的降低有利于减少蛋白质二硫键的错配，同时使得包涵体形成速度减慢，有利于随后的复性，更多的形成高活性的目的蛋白，同时较低的温度保证了质粒的稳定性。

本发明对种子培养基的配方进行了优选，优选地，上述种子培养基的配方为：蛋白胨5g/L、酵母膏5g/L、葡萄糖10g/L、磷酸氢二钾3g/L。

本发明对一级种子液培养时间进行了优选，优选地，上述一级种子液培养时间为10～16小时。

本发明对二级种子液培养时间进行了优选，优选地，上述二级种子液培养时间为4～10小时。

通过实验研究分析，优选一级种子液培养的OD_600nm严格控制在0.7～0.8之间，二级种子液培养的OD_600nm严格控制在1.5～1.8之间，可以保证使上罐种子液严格保持在菌种的对数生长期，使发酵接种后能够在较短时间内达到较高的菌体密度，有利于提高产物的表达量。

rhG-CSF重组工程菌的发酵培养方法为：

①发酵前的准备：将20L的发酵培养基加入30L发酵罐中，115℃灭菌20分钟；

②发酵：灭菌后，待发酵培养基的温度降至35℃时，将rhG-CSF发酵用种子按接种量5％的体积比接入发酵罐，30～35℃，200r/min培养，随着菌体生长，搅拌转速增加至500r/min，溶氧始终维持在35％以上，氨水调pH为6.85～6.95，培养4小时；

③诱导发酵：发酵培养4小时后加入IPTG至终浓度为0.1～0.2mmol/L；

④诱导后培养：加入IPTG后，流加补料培养基，流加速度为0.75～1.25mL/(L·min)，溶氧维持在50％～70％之间，pH为6.85～6.95。

本发明对发酵培养基配方进行了优选，优选地，上述发酵培养基配方为：蛋白胨5g/L、酵母膏7.5g/L、葡萄糖5g/L、乳糖4g/L、磷酸二氢钠5g/L、磷酸氢二钾5g/L、硫酸镁0.75g/L、氯化铵1g/L。

本发明对上述步骤②发酵的转速调节方法进行了优选，优选地，上述步骤②发酵的转速调节方法如下：0～1.5小时，200r/min；1.5～2小时，300r/min；2～2.5小时，350r/min；2.5～3.25小时，400r/min；3.25～4小时，500r/min；4小时后维持500r/min。

本发明对补料培养基的配方进行了优选，优选地，上述补料培养基的配方为：蛋白胨60g/L、酵母浸出粉80g/L、葡萄糖200g/L、乳糖60g/L、硫酸镁20g/L。

本发明对诱导后培养的补料培养基的流加速度进行了优选，优选地，上述流加速度为(以接种时间计)：4～4.5小时，0.75mL/(L·min)；4.5～5小时，0.9mL/(L·min)；5～6小时，1.0mL/(L·min)；6～7小时，1.1mL/(L·min)；7小时后，维持1.25mL/(L·min)直至培养结束。

为了保持菌体匀速的生长，避免菌体生长过快和过早的衰老，本发明对步骤②发酵中的溶氧进行了优选，优选地，上述溶氧维持在35～45％之间。

由于蛋白表达需要更多的氧气和养分，为了保证后期蛋白的高效表达，本发明对诱导后培养过程中溶氧进行了优选，优选地，上述诱导后培养的溶氧维持在55％～70％之间。

本发明对诱导后培养的时间进行了优选，优选地，上述诱导后培养的时间为4小时。

本发明对诱导后培养的温度进行了优选，优选地，上述诱导后培养的温度为30～35℃。

本发明与现有技术相比具有如下突出的优点：

通过本发明中种子培养基、发酵培养基和补料培养基的配方优选及各工艺中各个参数的优化，工程菌发酵培养结束后，经SDS-PAGE分析，rhG-CSF蛋白的表达量占菌体总蛋白的50～55％，收集的菌体置于-20℃保存，或直接进行破菌、分离纯化，可以制备高纯度的rhG-CSF蛋白，采用本发明生产的rhG-CSF蛋白，经纯化后纯度可达99.6％以上，生物活性不低于5.0×10⁸IU/mg。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明予以进一步说明，但是本发明不限于以下实施例。

实施例1.rhG-CSF重组工程菌的种子培养方法：

①菌种的筛选：取菌种P^ET-G-CSF/BL₂₁DE₃PlysS，至含100mg/L氨苄青霉素的LB平板划线活化，35℃培养过夜，从平板上挑取单菌落接种于含100mg/L氨苄青霉素的8mLLB液体试管，35℃，180r/min培养至OD_600nm为1.5，加入IPTG至浓度为0.1mmol/L，诱导4小时后，离心收集菌体，经SDS-PAGE电泳分析，筛选得到rhG-CSF单菌落，35℃培养过夜，培养完毕后在4℃保存；

②一级种子液培养：从重新划线培养的平板挑取单菌落接种于装有8mL种子培养基并添加100mg/L氨苄青霉素的液体试管，30℃，180r/min培养至OD_600nm为0.7，培养时间为10小时，作为一级种子液；

③二级种子液培养：将一级种子液以1％的接种比例接种到含250mL种子培养基的500mL三角瓶中，30℃，130r/min培养至OD_600nm至1.5，培养时间为4小时，镜检无杂菌，即得到rhG-CSF发酵用种子。

上述种子培养基的配方为：蛋白胨5g/L、酵母膏5g/L、葡萄糖10g/L、磷酸氢二钾3g/L。

实施例2.rhG-CSF重组工程菌的种子培养方法：

种子制备参数如实施例1，其中①菌种的筛选培养至OD_600nm为1.7；②一级种子培养温度为32℃，培养至OD_600nm为0.8，培养时间为12小时，作为一级种子液；③二级种子培养：温度为32℃，培养至OD_600nm至1.7，培养时间为8小时，作为rhG-CSF发酵用种子。

实施例3.rhG-CSF重组工程菌的种子培养方法：

种子制备参数如实施例1，其中①菌种的筛选培养至OD_600nm为1.8；②一级种子培养温度为35℃，培养至OD_600nm为0.8，培养时间为16小时，作为一级种子液；③二级种子培养：温度为35℃，培养至OD_600nm至1.8，培养时间为10小时，作为rhG-CSF发酵用种子。

实施例4.rhG-CSF重组工程菌的发酵培养方法：

②发酵：灭菌后，待发酵培养基的温度降至35℃时，将rhG-CSF发酵用种子按接种量5％的体积比接入发酵罐，30℃，200r/min培养，随着菌体生长，搅拌转速增加至500r/min(其中转速调节方法如下：0～1.5小时，200r/min；1.5～2小时，300r/min；2～2.5小时，350r/min；2.5～3.25小时，400r/min；3.25～4小时，500r/min；4小时后维持500r/min)，溶氧始终维持在35％，氨水调pH为6.85，培养4小时；

③诱导发酵：发酵培养4小时后加入IPTG至终浓度为0.10mmol/L；

④诱导后培养：加入IPTG后，流加补料培养基，流加速度为0.75～1.25mL/L·min(其中流加速度为(以接种时间计)如下：4～4.5小时，0.75mL/(L·min)；4.5～5小时，0.9mL/(L·min)；5～6小时，1.0mL/(L·min)；6～7小时，1.1mL/(L·min)；7小时后，维持1.25mL/(L·min))，温度为30℃，溶氧维持在50％，pH为6.85。培养结束后，经SDS-PAGE分析，rhG-CSF蛋白的表达量占菌体总蛋白的含量为50％，经复性、纯化后纯度达99.7％，生物活性为5.6×10⁸IU/mg。

其中，发酵培养基配方为：蛋白胨5g/L、酵母膏7.5g/L、葡萄糖5g/L、乳糖4g/L、磷酸二氢钠5g/L、磷酸氢二钾5g/L、硫酸镁0.75g/L、氯化铵1g/L；补料培养基配方为：蛋白胨60g/L、酵母浸出粉80g/L、葡萄糖200g/L、乳糖60g/L、硫酸镁20g/L。

实施例5.rhG-CSF重组工程菌的发酵培养方法：

具体发酵过程的参数如实施例3所述，其中②接种后发酵温度为33℃，溶氧始终维持在40％，氨水调pH为6.90；③诱导发酵，IPTG的终浓度0.15mmol/L；④诱导后培养：温度为33℃，溶氧维持在55％，pH为6.90。培养结束后，经SDS-PAGE分析，rhG-CSF蛋白的表达量占菌体总蛋白的含量为53％，经复性、纯化后纯度达99.6％，生物活性为6.0×10⁸IU/mg。

实施例6.rhG-CSF重组工程菌的发酵培养方法：

具体发酵过程的参数如实施例3所述，其中②接种后发酵温度为35℃，溶氧始终维持在45％，氨水调pH为6.95；③诱导发酵，IPTG的终浓度0.20mmol/L；④诱导后培养：温度为35℃，溶氧维持在70％，pH为6.95。培养结束后，经SDS-PAGE分析，rhG-CSF蛋白的表达量占菌体总蛋白的含量为55％，经复性、纯化后纯度达99.8％，生物活性为5.0×10⁸IU/mg。

实施例7.

种子制备参数如实施例1，同时种子培养基的配方为：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、葡萄糖10g/L、磷酸氢二钾3g/L。发酵过程的控制参数如实施例4所述。rhG-CSF蛋白的表达量占菌体总蛋白的含量及纯化后的检测结果如表1。

实施例8.

种子制备参数如实施例2，同时一级、二级种子培养温度为37℃。发酵过程的控制参数如实施例5所述。rhG-CSF蛋白的表达量占菌体总蛋白的含量及纯化后的检测结果如表1。

实施例9.

种子制备参数如实施例3，同时一级、二级种子培养温度为42℃。发酵过程的控制参数如实施例6所述。rhG-CSF蛋白的表达量占菌体总蛋白的含量及纯化后的检测结果如表1。

实施例10.

具体发酵过程的参数如实施例5所述，步骤②的转速调节方法：4小时内维持300r/min，4小时后维持500r/min。具体发酵过程的参数如实施例6所述。rhG-CSF蛋白的表达量占菌体总蛋白的含量及纯化后的检测结果如表1。

实施例11.

具体发酵过程的参数如实施例4所述，而发酵培养基配方为：蛋白胨5g/L、酵母膏7.5g/L、葡萄糖5g/L、磷酸二氢钠5g/L、磷酸氢二钾5g/L、硫酸镁0.75g/L、氯化铵1g/L。rhG-CSF蛋白的表达量占菌体总蛋白的含量及纯化后的检测结果如表1。

实施例12.

具体发酵过程的参数如实施例5所述，而补料培养基配方为：蛋白胨60g/L、酵母浸出粉80g/L、葡萄糖200g/L、硫酸镁20g/L。rhG-CSF蛋白的表达量占菌体总蛋白的含量及纯化后的检测结果如表1。

实施例13.

具体发酵过程的参数如实施例5所述，而诱导后培养的补料培养基的流加速度为(以接种时间计)：维持1.0mL/L·min，直至培养结束。rhG-CSF蛋白的表达量占菌体总蛋白的含量及纯化后的检测结果如表1。

表1.实施例4～13的检测结果

其中表达量(％)表示rhG-CSF蛋白的表达量占菌体总蛋白的含量。

Claims

1.一种重组人粒细胞集落刺激因子重组工程菌的发酵培养方法，其特征在于：

第一步、重组人粒细胞集落刺激因子重组工程菌的培养方法为：

①菌种的筛选：取菌种P^ET-G-CSF/BL₂₁DE₃PlysS，至100mg/L氨苄青霉素的LB平板划线活化，35℃培养过夜，从平板上挑取单菌落接种于8mL的含100mg/L氨苄青霉素的LB液体试管，35℃，180r/min培养至OD_600nm为1.5～1.8，加入IPTG至浓度为0.1mmol/L，诱导4小时后，离心收集菌体，SDS-PAGE电泳分析，挑选表达效果较好的单菌落重新划线，35℃培养过夜，培养完毕后在4℃保存，其中P^ET-G-CSF/BL₂₁DE₃PlysS是根据G-CSF的cDNA序列，设计使用了大肠杆菌偏爱密码子，然后经过全基因合成，测序正确后构建了表达质粒pET-G-CSF，转化宿主菌BL21（DE3）PlysS，经过培养后酶切鉴定、表达筛选后获得表达G-CSF的阳性克隆，保存菌种并标记为P^ET-G-CSF/BL₂₁DE₃PlysS；

③二级种子液培养：将一级种子液以1%的体积比接种到含250mL种子培养基的500mL三角瓶中，30~35℃，130r/min培养至OD_600nm至1.5～1.8之间，镜检无杂菌，菌种形态正常，即为rhG-CSF发酵用种子；

第二步、rhG-CSF发酵用种子的发酵培养方法为：

②发酵：灭菌后，待发酵培养基的温度降至35℃，将rhG-CSF发酵用种子按接种量5%的体积比接入发酵罐，30～35℃，200r/min培养，随着菌体生长不断增加搅拌转速至500r/min，溶氧始终维持在35-45%以上，氨水调pH为6.85～6.95，培养4小时；

③诱导发酵：发酵培养4小时后加入IPTG至终浓度0.1～0.2mmol/L；

④诱导后培养：IPTG诱导之后培养时间为4小时，培养温度为30～35℃，加入IPTG后，流加补料培养基，流加速度为0.75～1.25mL/L·min，溶氧维持在55%～70%之间，pH为6.85～6.95；

所述的种子培养基配方为：蛋白胨5g/L、酵母膏5g/L、葡萄糖10g/L、磷酸氢二钾3g/L；

所述的发酵培养基配方为：蛋白胨5g/L、酵母膏7.5g/L、葡萄糖5g/L、乳糖4g/L、磷酸二氢钠5g/L、磷酸氢二钾5g/L、硫酸镁0.75g/L、氯化铵1g/L；

所述的补料培养基的配方为：蛋白胨60g/L、酵母浸出粉80g/L、葡萄糖200g/L、乳糖60g/L、硫酸镁20g/L；所述的补料培养基的流加速度以接种时间计为：4～4.5小时，0.75mL/L·min；4.5～5小时，0.9mL/L·min；5～6小时，1.0mL/L·min；6～7小时，1.1mL/L·min；7小时后，维持1.25mL/L·min直至培养结束；

所述的30L发酵罐的转速调节方法如下：0～1.5小时，200r/min；1.5～2小时，300r/min；2～2.5小时，350r/min；2.5～3.25小时，400r/min；3.25～4小时，500r/min；4小时后维持500r/min。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于一级种子液培养时间为10～16小时，二级种子液培养时间为4～10小时。