CN103045629A - 一种乳糖酶基因葡萄糖解阻遏敲除载体pMD19/HPT - Google Patents

Abstract

本发明的目的是提供一种乳糖酶基因葡萄糖解阻遏敲除载体pMD19/HPT，可以用于敲除马克斯克鲁氏酵母MIG1基因，用于敲除该酵母MIG1基因，获得乳糖酶基因表达葡萄糖解阻遏菌株。可以用于敲除马克斯克鲁氏酵母MIG1基因，用于敲除该酵母MIG1基因，获得乳糖酶基因表达葡萄糖解阻遏菌株，能够使许多蛋白基因的表达都会受到葡萄糖解阻遏作用，在有葡萄糖存在情况下有关蛋白质或酶产量会大幅度提高，特别是乳糖酶，可以利用高产乳糖酶酵母菌通过发酵生产乳糖酶，降低乳糖酶生产成本和应用乳糖酶的费用，提高含乳糖牛奶和奶制品处理效果，对增加人类食用牛奶和奶制品的营养，增强身体健康具有重要的实际意义。

Description

一种乳糖酶基因葡萄糖解阻遏敲除载体 pMD19/HPT

技术领域

本发明公开一种乳糖酶基因葡萄糖解阻遏敲除载体pMD19/HPT，属于生物技术领域。

背景技术

β-半乳糖苷酶（EC 3.2.1.23），通常称为乳糖酶，可催化牛奶和奶制品中乳糖水解产生葡萄糖及半乳糖，并且具有半乳糖苷转移作用。乳糖酶在食品、医药、能源工业和畜牧业等领域的广泛应用，因而受到越来越多的关注。通过牛奶和奶制品中乳糖的水解增加这些食品的营养价值，解决乳糖不耐症食用牛奶和奶制品出现的问题，同时产乳糖酶的微生物可以用于处理乳清废水，减少环境污染。许多细菌、丝状真菌和酵母菌可以产生乳糖酶，其中克鲁氏酵母菌如马克斯克鲁氏酵母（Kluyveromyces marxianus），乳酸克鲁氏酵母（Kluyveromyces lactis）和极地耐冷酵母菌Guehomyces pullulans 17-1菌株产生的乳糖酶受到广泛重视。尤其马克斯克鲁氏酵母具有很强的同化乳糖和菊粉的能力、生长速率极快、代时短、生长时耐高温、具有很强的分泌胞外产物的能力和是被美国食品药物局确认为最安全的微生物，而在许多方面得到了广泛应用。但是所有产乳糖酶的微生物乳糖酶基因表达和合成乳糖酶时会受到培养基中的葡萄糖严重阻遏，由于工业用培养基和含乳糖培养基中存在有葡萄糖，所以葡萄糖阻遏会严重影响有关微生物的乳糖酶产量。

在葡萄糖阻遏过程中一种叫做Mig1蛋白起非常重要的作用，这种蛋白是一种带有C2H2的锌指蛋白，能结合在受葡萄糖阻遏的各种基因启动子上，被结合的基因启动子必须含有(G/C)(C/T)GGGG序列，在该序列的5‘-端还得有富含 AT的区域（AT-rich region）。现在发现Mig1蛋白是细胞中具有广泛调控作用的一种蛋白质，只要这些蛋白基因启动子含有(G/C)(C/T)GGGG序列，这些蛋白基因的表达都会受到Mig1蛋白的调控作用。所以该细胞中MIG1基因被敲除后，许多蛋白基因的表达都会受到葡萄糖解阻遏作用，在有葡萄糖存在情况下有关蛋白质或酶产量会大幅度提高。这样构建合适的敲除载体，敲除马克斯克鲁氏酵母MIG1基因，对于提高该酵母菌的乳糖酶具有非常重要的生产实际意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种乳糖酶基因葡萄糖解阻遏敲除载体pMD19/HPT，可以用于敲除马克斯克鲁氏酵母MIG1基因，用于敲除该酵母MIG1基因，获得乳糖酶基因表达葡萄糖解阻遏菌株。

本发明的技术解决方案如下：构建了可以用于敲除马克斯克鲁氏酵母MIG1基因的敲除载体pMD19-HPT,携带有潮霉素磷酸转移酶基因（HPT）、用于同源重组的马克斯克鲁氏酵母MIG1基因启动子序列和终止子序列和用于删除HPT基因的Loxp片段（5'-ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT- 3'），在HPT基因表达框上下游各加入一个LoxP位点，并使二者同向，可以利用Cre重组酶将HPT基因表达框删除。在转化敲除载体进入产乳糖酶的马克斯克鲁氏酵母细胞之前，用DNA限制性内切酶XhoI酶切质粒pMD19-HPT，获得MIG1基因启动子片段-HPT基因-MIG1基因终止子片段；转化该片段到产乳糖酶的马克斯克鲁氏酵母细胞后，通过同源重组插入到正常的MIG1基因中，利用HPT基因取代MIG1基因ORF框，并可以稳定遗传；获得转化子之后，把质粒pKlNatCre（携带有酶切Loxp片段的酶基因）转化到转化子中，表达后删除HPT基因，获得无HPT基因和MIG1基因的敲除菌株。

本发明公开的一种乳糖酶基因葡萄糖解阻遏敲除载体 pMD19/HPT ，其碱基序列见如 SEQ No.1 所示。该载体大小为4137 bp。

本发明提供的一种乳糖酶基因葡萄糖解阻遏敲除载体 pMD19/HPT 制备方法如下：

（ 1 ） PCR 产物的扩增

M IG1基因的启动子用5′端带有XhoI酶切位点的引物H1和与克隆HPT基因的特殊引物H3有共同序列的引物H2以K. marxianus 的基因组DNA为模板进行PCR扩增，引物H1和H2是根据K. marxianus MIG1基因序列设计的。引物H3和H4是根据质粒pCAMBIA 1381上HPT基因序列设计的，利用这对引物通过PCR技术扩增HPT基因（1026 bp）部分。MIG1基因的终止子由引物H5和H6以K. marxianus的基因组DNA为模板进行PCR扩增得到，引物H6的5′端带有XhoI酶切位点，引物H5和克隆HPT基因的特殊引物H4有共同序列，引物H5和H6也是根据K. marxianus MIG1基因设计的。

PCR扩增体系：

LA Taq酶 0.5 μL

10×LA Taq buffer 5.0 μL

dNTPs 8.0 μL

基因组DNA（25.0 ng/µL） 2.0 μL

上游引物（10.0 μM） 2.0 μL

下游引物（10.0 μM） 2.0 μL

无菌双蒸水 30.5 μL

总体积 50.0 μL

PCR扩增条件： 94 ℃预变性10.0 min；94 ℃变性1.0 min；54 ℃退火1.0 min；72 ℃延伸30 sec，（扩增HPT基因片段延伸时间为1.2 min, 扩增全长延伸2.0 min），30个循环；72 ℃延伸10.0 min。

将启动子、HPT基因和终止子3个PCR产物按一定比例（1:4:1）混合，由于启动子和HPT基因之间含有共同序列，HPT基因和终止子之间含有共同序列，因此变性退火之后，它们能彼此融合，以H1（5′）和H6（3′）为两侧引物，以混合的PCR产物为模板进行PCR扩增，可以扩增得到3个片段首尾相接的DNA目的片断（MIG1基因的启动子::HPT::MIG1基因的终止子，见图1所示），取10 μL PCR反应产物利用琼脂糖凝胶电泳（0.8%，w/v）进行分析，DNA目的片段采用胶回收试剂盒进行回收纯化。

（2）PCR产物与载体pMD19-T Simple的连接

按照TaKaRa公司的T-A克隆载体连接试剂盒的说明书将PCR产物与载体pMD19-T Simple连接。

连接体系为10.0 μL：胶回收PCR产物4.0 μL、连接buffer Solution

5.0 μL，pMD19-T Simple 0.5 μL，混匀后置于16 ºC下连接过夜。

（3）连接产物pMD19/HPT转化E.coliDH5α感受态细胞

取E.coliDH5α感受态细胞各100.0 μL，分别加入10.0 μL连接产物及阴性、阳性对照样品，轻轻混匀，冰水浴30 min；42 ºC热休克90 s，此时不要摇动管，迅速转移至冰水浴中，继续冰浴2-3 min；加入800.0 μL LB液体培养基，37 ºC下，120 rpm孵育50 min；将孵育后菌悬液离心，去除培养液600.0 μL，将细胞重新悬浮，取100.0 μL该培养物涂布到含有10.0 μL 20.0% IPTG（w/v）、40.0 μL X-gal（20.0 mg/mL，w/v）、100.0 mg/mL Amp（氨苄青霉素）的LB平板上，置于37 ºC培养箱正放培养30 min后，再倒置培养12-16 h后观察。

（4）阳性克隆的筛选、鉴定与测序

挑取白色阳性单克隆接种至含有100.0 μg/mL Amp的5.0 mL LB液体培养基中，37 ºC下，180 rpm振荡培养至OD_600nm约0.6。无菌取出1mL培养液，在4 ºC下，12000 × g离心1 min，菌体沉淀用无菌生理盐水洗涤两次后离心、弃上清，加适量无菌水煮沸10 min，12000 × g离心2 min后取上清作为PCR模板，用H1和H6引物进行PCR扩增，体系及条件参照上述，阳性克隆委托上海生工公司测序。

表 1 本发明所使用的引物

质粒的提取、酶切及回收用于转化酵母的线性 DNA 片段

利用质粒提取试剂盒提取质粒，质粒提取过程按照试剂盒说明进行。用XhoI酶切pMD19/HPT质粒，其酶切反应体系如下：

酶切体系（20.0 µL）：

XhoI 1.0 μL

10×H buffer 2.0 μL

质粒pMD19/HPT 5.0 µL

灭菌水 12.0 μL

37 ºC酶切4 h后，加入2.0 µL10×loading buffer终止反应，并用琼脂糖凝胶电泳（0.8%，w/v）检测，回收目的片段，用胶回收试剂盒（TaKaRa生物工程有限公司，大连）回收目的片段。

转化与筛选

（1）取80.0 μL的K. marxianus感受态细胞，加入浓缩并除盐的线性DNA片段（<10 μL，>10 μL影响转化效率）后混匀，转至0.2 cm冰预冷的电击杯中。通过电击的方法把线性DNA片段转化到K. marxianus感受态细胞。

（2）分别取10、25、50、100和200 μL混合液涂布在含有100.0 μg/mL潮霉素和0.1% X-gal（w/v）的YPD平板上。

（3）经过培养挑取长出的蓝色菌落接到新的YPD（含有100.0 μg/mL潮霉素、0.1% X-gal，w/v）平板上进行纯化。如图2、图3所示。

（4）挑取纯化后的菌落接种于100.0 mL乳糖培养基中，于28 ºC、180 rpm振荡培养48 h，测定乳糖酶活性，同时用没有转化的原始菌株作为对照，筛选出乳糖酶产量明显提高的敲除菌株。

本发明的积极效果在于：可以用于敲除马克斯克鲁氏酵母MIG1基因，用于敲除该酵母MIG1基因，获得乳糖酶基因表达葡萄糖解阻遏菌株，能够使许多蛋白基因的表达都会受到葡萄糖解阻遏作用，在有葡萄糖存在情况下有关蛋白质或酶产量会大幅度提高，特别是乳糖酶，可以利用高产乳糖酶酵母菌通过发酵生产乳糖酶，降低乳糖酶生产成本和应用乳糖酶的费用，提高含乳糖牛奶和奶制品处理效果，对增加人类食用牛奶和奶制品的营养，增强身体健康具有重要的实际意义。

附图说明

图1 为本发明K. marxianus 的MIG1基因敲除质粒构建图；

图2、图3为在潮霉素平板上筛选阳性转化子（A），B的对照图；

图4为K. marxianus (A)和MIG1基因敲除菌株(B)在2-脱氧-D-葡萄糖培养基(加X-gal)中生长情况对照图。

具体实施方式

实施例 1

1．菌株和培养基

用于质粒回收和克隆的细菌是大肠埃希氏菌DH5a，生长该细菌的培养基是 LB培养基。转化后的大肠埃希氏菌DH5a是培养在添加有30 μg/ml氨卞青霉素的LB培养基中。转化所用的酵母菌株是产乳糖酶的马克斯克鲁氏酵母。酵母菌生长在YPD培养基上 [1.0%(w/v)酵母菌提取物,2.0%(w/v) 蛋白胨,2.0%(w/v)葡萄糖]。酵母菌转化子生长在YPD培养基加潮霉素。利用质粒pMD19-HPT和MIG1基因启动子片段-HPT基因-MIG1基因终止子片段分别转化大肠埃希氏菌和产乳糖酶的马克斯克鲁氏酵母菌。

MIG1 基因敲除载体的构建

敲除载体构建的流程如图1所示，所使用的引物见表1。

（1 ） PCR 产物的扩增

M IG1基因的启动子用5′端带有XhoI酶切位点的引物H1和与克隆HPT基因的特殊引物H3有共同序列的引物H2以K. marxianus 的基因组DNA为模板进行PCR扩增，引物H1和H2是根据K. marxianus MIG1基因序列设计的。引物H3和H4是根据质粒pCAMBIA 1381上HPT基因序列设计的，利用这对引物通过PCR技术扩增HPT基因（1026 bp）部分。MIG1基因的终止子由引物H5和H6以K. marxianus的基因组DNA为模板进行PCR扩增得到，引物H6的5′端带有XhoI酶切位点，引物H5和克隆HPT基因的特殊引物H4有共同序列，引物H5和H6也是根据K. marxianus MIG1基因设计的。

PCR扩增体系：

LA Taq酶 0.5 μL

10×LA Taq buffer 5.0 μL

dNTPs 8.0 μL

基因组DNA（25.0 ng/µL） 2.0 μL

上游引物（10.0 μM） 2.0 μL

下游引物（10.0 μM） 2.0 μL

无菌双蒸水 30.5 μL

总体积 50.0 μL

PCR扩增条件： 94 ℃预变性10.0 min；94 ℃变性1.0 min；54 ℃退火1.0 min；72 ℃延伸30 sec，（扩增HPT基因片段延伸时间为1.2 min, 扩增全长延伸2.0 min），30个循环；72 ℃延伸10.0 min。

将启动子、HPT基因和终止子3个PCR产物按一定比例（1:4:1）混合，由于启动子和HPT基因之间含有共同序列，HPT基因和终止子之间含有共同序列，因此变性退火之后，它们能彼此融合，以H1（5′）和H6（3′）为两侧引物，以混合的PCR产物为模板进行PCR扩增，可以扩增得到3个片段首尾相接的DNA目的片断（MIG1基因的启动子::HPT::MIG1基因的终止子，见图1所示），取10 μL PCR反应产物利用琼脂糖凝胶电泳（0.8%，w/v）进行分析，DNA目的片段采用胶回收试剂盒进行回收纯化。

（2）PCR产物与载体pMD19-T Simple的连接

按照TaKaRa公司的T-A克隆载体连接试剂盒的说明书将PCR产物与载体pMD19-T Simple连接。

连接体系为10.0 μL：胶回收PCR产物4.0 μL、连接buffer Solution

5.0 μL，pMD19-T Simple 0.5 μL，混匀后置于16 ºC下连接过夜。

（3）连接产物pMD19/HPT转化E.coliDH5α感受态细胞

取E.coliDH5α感受态细胞各100.0 μL，分别加入10.0 μL连接产物及阴性、阳性对照样品，轻轻混匀，冰水浴30 min；42 ºC热休克90 s，此时不要摇动管，迅速转移至冰水浴中，继续冰浴2-3 min；加入800.0 μL LB液体培养基，37 ºC下，120 rpm孵育50 min；将孵育后菌悬液离心，去除培养液600.0 μL，将细胞重新悬浮，取100.0 μL该培养物涂布到含有10.0 μL 20.0% IPTG（w/v）、40.0 μL X-gal（20.0 mg/mL，w/v）、100.0 mg/mL Amp（氨苄青霉素）的LB平板上，置于37 ºC培养箱正放培养30 min后，再倒置培养12-16 h后观察。

（4）阳性克隆的筛选、鉴定与测序

挑取白色阳性单克隆接种至含有100.0 μg/mL Amp的5.0 mL LB液体培养基中，37 ºC下，180 rpm振荡培养至OD_600nm约0.6。无菌取出1mL培养液，在4 ºC下，12000 × g离心1 min，菌体沉淀用无菌生理盐水洗涤两次后离心、弃上清，加适量无菌水煮沸10 min，12000 × g离心2 min后取上清作为PCR模板，用H1和H6引物进行PCR扩增，体系及条件参照上述，阳性克隆委托上海生工公司测序。

表 1 本发明所使用的引物

质粒的提取、酶切及回收用于转化酵母的线性 DNA 片段

利用质粒提取试剂盒提取质粒，质粒提取过程按照试剂盒说明进行。用XhoI酶切pMD19/HPT质粒，其酶切反应体系如下：

酶切体系（20.0 µL）：

XhoI 1.0 μL

10×H buffer 2.0 μL

质粒pMD19/HPT 5.0 µL

灭菌水 12.0 μL

37 ºC酶切4 h后，加入2.0 µL10×loading buffer终止反应，并用琼脂糖凝胶电泳（0.8%，w/v）检测，回收目的片段，用胶回收试剂盒（TaKaRa生物工程有限公司，大连）回收目的片段。

转化与筛选

（1）取80.0 μL的K. marxianus感受态细胞，加入浓缩并除盐的线性DNA片段（<10 μL，>10 μL影响转化效率）后混匀，转至0.2 cm冰预冷的电击杯中。通过电击的方法把线性DNA片段转化到K. marxianus感受态细胞。

（1）分别取10、25、50、100和200 μL混合液涂布在含有100.0 μg/mL潮霉素和0.1% X-gal（w/v）的YPD平板上。

（3）经过培养挑取长出的蓝色菌落接到新的YPD（含有100.0 μg/mL潮霉素、0.1% X-gal，w/v）平板上进行纯化。如图2、图3所示。

（4）挑取纯化后的菌落接种于100.0 mL乳糖培养基中，于28 ºC、180 rpm振荡培养48 h，测定乳糖酶活性，同时用没有转化的原始菌株作为对照，筛选出乳糖酶产量明显提高的敲除菌株。

试验例 1

MIG1 基因敲除的验证

（1）PCR验证

挑取K. marxianus菌株和MIG1基因敲除菌株的单菌落分别接种到含50.0 mL 的液体YPD培养基中，于28 ºC、180 rpm振荡培养10-12 h。在2500× g和4 ºC下离心10 min收集并用无菌水洗涤细胞，提取基因组DNA。以它们的基因组DNA为模板，分别用引物H1和YH1、H6和YH2、MS和MX（见表1和图1）进行PCR扩增，得到相应得DNA片段。K. marxianus菌株不含有HPT基因，而MIG1基因敲除菌株含有HPT基因。

（2）在2-脱氧-D-葡萄糖培养基中培养

将在YPD平板上活化后的K. marxianus和MIG1基因敲除菌株的单菌落分别接种到含1.2 mg/mL 2-脱氧-D-葡萄糖培养基平板上，于28 ºC培养箱中培养2-3 d，观察K. marxianus和MIG1基因敲除菌株的生长情况，如图4所示。

潮霉素抗性基因的删除

1）用电转法将质粒pKlNatCre导入纯合体酵母细胞中，涂布于含有100μg/mL Zeocin^® YPD平板上，30°C培养2-3d。

2）挑取克隆于含有含有半乳糖的1mL YPG液体培养基的EP管中，30°C振荡培养2-4h。

3）涂布于5个YPD平板上，30°C培养2-3d。

4）挑取单菌落于5mL液体YPD中，30°C振荡培养过夜。

5）提取基因组，分别用引物MS和MX（见表1和图1）进行PCR扩增，得到相应得DNA片段。MIG1基因敲除菌株含有HPT基因，而潮霉素抗性基因删除菌株不含有HPT基因。

[0042] 6）在含有潮霉素和不含有潮霉素平板上复筛，重新得到对潮霉素敏感的菌株。

[0043] 7）在非选择性YPD中连续传代培养，使pKlNatCre质粒自然丢失。

SEQ No.1

<110>吉林巨润生物技术有限公司

<120>一种乳糖酶基因葡萄糖解阻遏敲除载体pMD19/HPT

<140>

<160> 1

<210> 1

<211> 4137

<212> DNA

<400>

TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATT

CTCGAGCCATAAGCATCCGAAGAATAGAAAAGTCGAAAAGAGAGCAGACGAGATATAAAATAGAGGATATTGTCAGAAGCGAGGAATAGTGACAGTAGTAGTGTATTTATTTGGACGAGAAAAAGGTTGTAAGCAAAAAGAGGTCCAAGTTCAAGGCATTTTAATATAGCTCGGAGCACTTACTTACGACGACGAGTATAGAATAGGTATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGACGTCTGTCGAGAAGTTTCTGATCGAAAAGTTCGACAGCGTCTCCGACCTGATGCAGCTCTCGGAGGGCGAAGAATCTCGTGCTTTCAGCTTCGATGTAGGAGGGCGTGGATATGTCCTGCGGGTAAATAGCTGCGCCGATGGTTTCTACAAAGATCGTTATGTTTATCGGCACTTTGCATCGGCCGCGCTCCCGATTCCGGAAGTGCTTGACATTGGGGAGTTTAGCGAGAGCCTGACCTATTGCATCTCCCGCCGTTCACAGGGTGTCACGTTGCAAGACCTGCCTGAAACCGAACTGCCCGCTGTTCTACAACCGGTCGCGGAGGCTATGGATGCGATCGCTGCGGCCGATCTTAGCCAGACGAGCGGGTTCGGCCCATTCGGACCGCAAGGAATCGGTCAATACACTACATGGCGTGATTTCATATGCGCGATTGCTGATCCCCATGTGTATCACTGGCAAACTGTGATGGACGACACCGTCAGTGCGTCCGTCGCGCAGGCTCTCGATGAGCTGATGCTTTGGGCCGAGGACTGCCCCGAAGTCCGGCACCTCGTGCACGCGGATTTCGGCTCCAACAATGTCCTGACGGACAATGGCCGCATAACAGCGGTCATTGACTGGAGCGAGGCGATGTTCGGGGATTCCCAATACGAGGTCGCCAACATCTTCTTCTGGAGGCCGTGGTTGGCTTGTATGGAGCAGCAGACGCGCTACTTCGAGCGGAGGCATCCGGAGCTTGCAGGATCGCCACGACTCCGGGCGTATATGCTCCGCATTGGTCTTGACCAACTCTATCAGAGCTTGGTTGACGGCAATTTCGATGATGCAGCTTGGGCGCAGGGTCGATGCGACGCAATCGTCCGATCCGGAGCCGGGACTGTCGGGCGTACACAAATCGCCCGCAGAAGCGCGGCCGTCTGGACCGATGGCTGTGTAGAAGTACTCGCCGATAGTGGAAACCGACGCCCCAGCACTCGTCCGAGGGCAAAGAAATAGATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATAACACTGAAGCACTGACTGCAGCTACTTACACAATTAAAAACACACACTCACACACATACAAGATACGTAATTCAACCTCTATAGACTATAAAATTGCGAAAGCAACACACAACCTACTTACTGGACATAATTACTAGTCTCGAGATCGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTC

Claims (3)

1.一种乳糖酶基因葡萄糖解阻遏敲除载体pMD19/HPT，碱基序列见如SEQ No.1所示。

2. 权利要求1所述的乳糖酶基因葡萄糖解阻遏敲除载体pMD19/HPT制备方法，包括以下步骤：

将扩增的PCR产物与载体pMD19-T Simple的连接；连接产物pMD19/HPT转化E.coliDH5α感受态细胞；

质粒的提取、酶切及回收用于转化酵母的线性DNA片段：

利用质粒提取试剂盒提取质粒，质粒提取过程按照试剂盒说明进行；用XhoI酶切pMD19/HPT质粒；37℃酶切4 h后，加入2.0 µL10×loading buffer终止反应，并用0.8%（w/v）的琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的片段；

转化与筛选

（1）取80.0 μL的K. marxianus感受态细胞，加入浓缩并除盐的线性DNA片段后混匀，转至0.2 cm冰预冷的电击杯中；通过电击的方法把线性DNA片段转化到K. marxianus感受态细胞；

（2）分别取10、25、50、100和200 μL混合液涂布在含有100.0 μg/mL潮霉素和0.1% X-gal（w/v）的YPD平板上；

（3）经过培养挑取长出的蓝色菌落接到含有100.0 μg/mL潮霉素、0.1% X-gal（w/v）的YPD平板上进行纯化；

（4）挑取纯化后的菌落接种于100.0 mL乳糖培养基中，于28 ºC、180 rpm振荡培养48 h，测定乳糖酶活性，同时用没有转化的原始菌株作为对照，筛选出乳糖酶产量明显提高的敲除菌株。

3. 制备权利1所述的乳糖酶基因葡萄糖解阻遏敲除载体pMD19/HPT，所涉及的引物序列如下：

H1 5’-CTCGAGCCATAAGCATCCGAAGAATAGAAAAGTCGA-3’

H2 5’-GTGAGTTCAGGCTTTTTCATACCTATTCTATACTCGTCGTCG-3’

H3 5’-GAGTATAGAATAGGTATGAAAAAGCCTGAA-3’

H4 5’-GTAGCTGCAGTCAGTGCTTCAGTGTTCTATTTCTTTGCCCTCGGACGAGTGC-3’H5 5’-GCACTCGTCCGAGGGCAAAGAAATAGAACACTGAAGCACTGACTGCAGCTAC-3’

H6 5-‘CTCGAGACTAGTAATTATGTCCAGTAAGTAGGTTGTG-3’

YH1 5‘-AACCCGCTCGTCTGGCTAAGATCGGC-3’

YH2 5‘-ACGCGGATTTCGGCTCCAACAATGTC-3’

MS 5‘-ATGTCATCAGAGGTAGTGCCTTTG-3’

MX 5‘-TCAATGCTGCTCCCGGGGTAAGAT-3’。

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