CN105420154A - 双基因敲除重组红球菌、构建方法及其应用 - Google Patents

双基因敲除重组红球菌、构建方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种构建双基因敲除的重组红球菌的方法，包括：(1)根据红球菌的腈水合酶基因序列，设计引物以分别扩增腈水合酶基因的上游序列和下游序列，获得腈水合酶基因的上游片段和下游片段；(2)将腈水合酶基因的上游片段和下游片段插入到自杀质粒中，获得重组自杀质粒，自杀质粒携带卡那霉素抗性基因和蔗糖果聚糖酶基因；(3)利用重组自杀质粒转化敲除了酰胺酶基因的重组红球菌的感受态细胞，获得双基因敲除的重组红球菌，其中包括，通过卡那霉素抗性进行第一轮筛选，获得第一重组菌落，通过蔗糖平板对第一重组菌落进行第二轮筛选。还公开一种高表达腈水解酶的重组红球菌及其构建方法、以及一种制备丙烯酸铵的方法。

Description

双基因敲除重组红球菌、构建方法及其应用
技术领域
本发明涉及微生物基因工程领域，具体的，本发明涉及双基因敲除重组红球菌及其构建方法，更具体的，本发明涉及一种构建双基因敲除的红球菌的构建方法、一种双基因敲除重组红球菌、一种构建高表达腈水解酶重组红球菌的方法、一种高表达腈水解酶重组红球菌、高表达腈水解酶重组红球菌在制备羧酸类化合物中的用途以及一种制备丙烯酸铵的方法。
背景技术
红球菌是一种好氧的革兰氏阳性放线菌，具有相对较快的生长速率。由于具有强大的酶和代谢物合成能力，以及对有机溶剂的良好耐受性，红球菌广泛应用于化学品、医药产品等的生物制备。尤其是高表达腈水合酶的红色(赤)红球菌(Rhodococcusruber)或紫红红球菌(Rhodococcusrhodochrous)游离细胞，已经成功用于丙烯酰胺、烟酰胺等化学品的工业生物催化生产。
腈水解酶(Nitrilase)、酰胺酶(Amidase)和腈水合酶(Nitrilehydratase)，是腈代谢酶系的三种典型工业酶，广泛用于合成各种重要化学品和医药中间体。例如，微生物腈水解酶可以直接催化一分子丙烯腈与两分子水发生水合反应，生成丙烯酸和氨(赵孝先等，山东大学学报，1994,29(2)：43～46)，在中性和弱酸、弱碱性溶液中都表现为丙烯酸铵。该催化反应在常温常压下进行，能耗低，操作简单、安全；丙烯腈转化率高，生成产物单一。此外，腈水解酶还用于利普妥药物中间体、苦杏仁酸、苯甲酸、羟基乙酸等产品的生物合成。因此，对于腈水解酶的结构、性能和应用研究也受到广泛重视(徐建妙等，微生物学通报，2005,32(5)：141～146)。第一个能产腈水解酶的微生物菌种是由Hook和Robinson利用天然腈化合物蓖麻碱作为唯一碳源筛选得到的假单胞菌(Pseudomonas)，此后有许多研究者利用特定的腈化合物作为唯一碳源或者唯一氮源筛选到一系列能产腈水解酶的细菌和真菌。日本利用紫红红球菌R.rhodochrousJ1产生的腈水解酶催化丙烯腈生产丙烯酸，在丙烯腈浓度较低的条件下，其腈水解酶酶活为18.4U/mL，经过连续24小时的补加丙烯腈进行催化，丙烯酸的浓度累积到392g/L(Nagasawa,etal.ArchMicrobiol,1988,150:89～94)。王铁钢等人则对菌株R.rhodochroustg1-A6进行了紫外诱变和培养基优化，腈水解酶活性达到26.77U/mL，经过10小时的补加丙烯腈连续催化，丙烯酸累积浓度达到414.2g/L(罗晖等，现代化工，2006，26(S2)：109～113；王铁钢等，生物加工过程，2007,5(1)：41～44)。
与腈水解酶相比，腈水合酶的研究更为广泛，且腈水合酶催化生产丙烯酰胺的生物路线已经成功实现产业化生产。在红色红球菌TH中，腈水合酶的表达量可高达总蛋白量的80％左右。
由于成本、原料价格、腈水解酶活性和催化工艺等因素的影响，采用腈水解酶催化的生物法生产丙烯酸(铵)尚未普遍应用。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种商业选择。
依据本发明的一方面，本发明提供一种构建双基因敲除的重组红球菌的方法，包括步骤：(1)根据所述红球菌的腈水合酶基因序列，设计引物以分别扩增所述腈水合酶基因的上游序列和所述腈水合酶基因的下游序列，获得所述腈水合酶基因的上游片段和所述腈水合酶基因的下游片段；(2)将(1)中的腈水合酶基因的上游片段和腈水合酶基因的下游片段插入到自杀质粒中，获得重组自杀质粒，所述自杀质粒携带卡那霉素抗性基因和蔗糖果聚糖酶基因；(3)利用(2)中的重组自杀质粒转化敲除了酰胺酶基因的重组红球菌的感受态细胞，获得所述双基因敲除的重组红球菌，其中包括，通过卡那霉素抗性进行第一轮筛选，获得第一重组菌落，通过蔗糖平板对所述第一重组菌落进行第二轮筛选，以获得所述双基因敲除的重组红球菌。
利用上述本发明的这一方面的方法，能够高效的构建出双基因敲除的重组红球菌，即高效的构建出同时敲除了酰胺酶基因和腈水合酶基因的重组红球菌。构建出的该双基因敲除的重组红球菌可以作为宿主细胞，用于插入目的基因片段使目的基因得以高效表达。
根据本发明的实施例，上述本发明一方面的构建双基因敲除的重组红球菌的方法还可以具有以下附加技术特征至少之一：
所称的红球菌可以选自目前已知的红球菌，本发明对此不作限制。根据本发明的一个实施例，所称的红球菌选自红色红球菌红色红球菌RhodococcusruberTH(R.ruberTH)和TH3中的一种。红色红球菌R.ruberTH和TH3的生长周期短、酶的表达效率高、工业化生产工艺成熟，具有很好的工业应用价值。此外，在红色红球菌TH和TH3中，天然的腈水解酶基因几乎不表达，腈水解酶活性几乎为零。
所称的自杀质粒(suicideplasmid)，通常为R质粒的衍生质粒，常有宿主范围广的特点，具有接合转移基因。它的复制需要一种特殊的蛋白，大多数细菌不产生这种蛋白质，因此，当进入寄主细胞时，要么不能复制、被消除，要么被整合入染色体上，和染色体一起复制。利用自杀质粒的这个特点，将基因工程技术构建的基因缺失的DNA片段，克隆入自杀质粒，利用缺失基因两端的同源片段，定位自杀质粒的整合位点。利用同源性DNA片段可发生重组的原理，构建精确基因缺失菌株。根据本发明的一个实施例，(2)中的自杀质粒选自pk18mob-sacB和其衍生质粒中的一种。
根据本发明的一个实施例，所称的敲除了酰胺酶基因的重组红球菌为敲除了酰胺酶基因的TH3红色红球菌，可表示为TH3(amdA－)。该工程菌株是清华大学为了减少红球菌TH腈水合酶催化丙烯腈生产丙烯酰胺过程中的副产物(丙烯酸)积累，采用同源单交换重组的方法，敲除了染色体上的酰胺酶基因获得的基因工程菌株(ZL200880000969.1；WO2009/117843；US12/933,725)。将TH3(amdA－)菌株用于催化生产丙烯酰胺，副产物丙烯酸的生成量降低了80％以上(Maetal.Bioresourcetechnology,2010,101(1):285-291)。
根据本发明的一个实施例，(1)中的腈水合酶基因的上游片段带有酶切位点EcoRI/XbaI，(1)中获得的腈水合酶基因的下游片段带有酶切位点XbaI/HindIII。使得在步骤(2)中，能够通过双酶切将腈水合酶基因的上游片段和下游片段插入到自杀质粒中。
根据本发明的一个较佳实施例，(1)中的扩增所述腈水合酶基因的上游片段的引物具有如SEQIDNO：1和2所示的序列，所述腈水合酶基因的上游片段具有如SEQIDNO：3所示的序列，和/或(1)中的扩增所述腈水合酶基因的下游片段的引物具有如SEQIDNO：4和5所示的序列，所述腈水合酶基因的下游片段具有如SEQIDNO：6所示的序列。通过上述设计的特定的引物引入酶切位点，使获得的上下游片段分别带有EcoRI/XbaI酶切位点和XbaI/HindIII酶切位点。
根据本发明的一个实施例，(3)为利用电穿孔进行所述重组自杀质粒转化。
根据本发明的一个较佳实施例，(3)中的通过卡那霉素抗性进行第一轮筛选，获得第一重组菌落，包括：利用含卡那霉素20微克/毫升的LB固体平板进行所述第一轮筛选，获得在所述卡那霉素20微克/毫升的LB固体平板上生长的红色菌落为所称第一重组菌落。含卡那霉素的平板上出现红色菌落，说明质粒上携带的腈水合酶基因上下游片段已经和染色体发生单交换同源重组，携带卡纳霉素抗性基因的自杀质粒基因插入了染色体。
根据本发明的一个较佳实施例，(3)中的通过蔗糖平板对所述第一重组菌落进行第二轮筛选，以获得所述双基因敲除的重组红球菌，包括：利用含蔗糖10％的LB固相平板对所述红色菌落进行所述第二轮筛选，获得在含蔗糖10％的LB固相平板上生长的菌落；分别通过含卡那霉素20微克/毫升的LB固体平板和不含卡那霉素的LB固相平板对所述在含蔗糖10％的LB固相平板上生长的菌落进行筛选，获得在所述含卡那霉素20微克/毫升的LB固体平板上不生长、在所述不含卡那霉素的LB固体平板上生长的菌落为所述双基因敲除的重组红球菌。随机挑选3个预计为双基因敲除的菌落进行PCR和测序验证，结果显示菌落染色体上没有酰胺酶和腈水合酶，证实为双基因敲除菌，说明酰胺酶-腈水合酶基因敲除型重组红色红球菌THdAdN构建以及筛选成功。
依据本发明的另一方面，提供一种双基因敲除的重组红球菌，其利用上述本发明一方面或者任一实施例中的构建双基因敲除的重组红球菌的方法构建获得。该双基因敲除的重组红球菌可以作为宿主细胞，用于插入目的基因片段使目的基因得以高效表达。
依据本发明的又一方面，提供一种构建高表达腈水解酶重组红球菌的方法，该方法包括：构建高表达腈水解酶的质粒，获得高表达腈水解酶质粒；利用所述高表达腈水解酶质粒转化双基因敲除的重组红球菌的感受态细胞，以获得所述高表达腈水解酶重组红球菌，所述双基因敲除的重组红球菌利用上述本发明一方面或者任一实施例中的构建双基因敲除的重组红球菌的方法构建获得。
本发明的这一方面的方法，利用上述本发明一方面或者任一实施例的方法构建的双基因敲除的重组红球菌可以作为宿主细胞，利用克隆高表达腈水解酶基因以及构建高表达腈水解酶的质粒，将高表达腈水解酶的质粒转化进宿主细胞中，使获得能够高表达腈水解酶的重组红球菌。
根据本发明的实施例，所述构建高表达腈水解酶的质粒包括：设计引物对以扩增紫红红球菌的腈水解酶基因，获得腈水解酶基因扩增产物；将所述腈水解酶基因扩增产物插入到大肠杆菌-红球菌穿梭质粒中，以获得所述高表达腈水解酶质粒。
所称穿梭质粒是指一类人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，因而可以在两种不同类群宿主中存活和复制的质粒载体。此概念不仅用于不同的微生物菌群之间，也可以推广到真核生物表达载体的构建，如用于枯草的pBE2、酵母的pPIC9K、哺乳动物表达载体pMT2和用于植物细胞的Ti质粒。这些穿梭质粒不仅可以在大肠杆菌中复制扩增，也可以在相应的枯草、酵母、动物或植物细胞中扩增和表达，这样利于对质粒的分子生物学操作和大量制备。
所称的大肠杆菌-红球菌穿梭质粒，能够在大肠杆菌和红球菌中存活和复制。根据本发明的实施例，穿梭质粒为大肠杆菌-诺卡氏菌/红球菌穿梭质粒，选自pNV18、pNV18.1、pNV19和其衍生质粒中的一种。
根据本发明的实施例，所述大肠杆菌-红球菌穿梭质粒的启动子选自红球菌的酰胺酶启动子和红球菌的酰胺酶启动子的突变体中的一种。
根据本发明的一个实施例，所称的紫红红球菌为R.rhodochrousATCC33278。利用克隆该菌的腈水解酶基因，以及将该基因插入穿梭质粒载体中，来获得高表达腈水解酶质粒。
根据本发明的一个较佳实施例，所述引物对具有如SEQIDNO：7和8所示的序列，以高效克隆目的片段以及引入PstI/HindIII酶切位点。
根据本发明的一个实施例，所述腈水解酶基因扩增产物带有酶切位点PstI/HindIII；其具有如SEQIDNO：9所示的序列。
依据本发明的又一方面，提供一种高表达腈水解酶重组红球菌，其利用上述本发明一方面或者任一实施例中的构建高表达腈水解酶的重组红球菌的方法构建获得。
该高表达腈水解酶重组红球菌可表示为R.ruberTHdAdN(Nit)，根据本发明的实施例，该菌表达腈水解酶的酶活高达187U/ml，而目前国内外文献公开报道的最高水平低于40U/ml，并且生长周期比改造前的紫红红球菌缩短近一倍。
本发明这一方面的高表达腈水解酶重组红球菌可以用于制备羧酸类化合物。依据本发明的一方面，提供上述本发明一方面的高表达腈水解酶重组红球菌在制备羧酸类化合物中的用途。该重组菌株，能够用于羧酸类化学品，包括丙烯酸铵的高效清洁生产制备。
依据本发明的再一方面，提供一种制备丙烯酸铵的方法，该方法利用上述本发明一方面或者任一实施例中的高表达腈水解酶重组红球菌进行所述丙烯酸铵的制备。
本发明的这一方面的方法，利用上述本发明一方面或者任一实施例中的高表达腈水解酶重组红球菌游离细胞作为生物催化剂，用于丙烯腈水合高效制备丙烯酸铵，水合反应3小时，丙烯酸铵浓度能够达到630g/L，远高于目前报道的水平。
根据本发明的实施例，所述方法包括：(a)将所述双基因敲除的重组红球菌接入活化培养基中，在28～30℃、摇床转速为150～250转/min的条件下培养32～56小时，得到活化的基因工程菌菌液，其中所述活化培养基的组成比例为：葡萄糖20～30g/L，酵母膏1～5g/L，蛋白胨7～10g/L，KH2PO40.5～0.75g/L，K2HPO40.5～0.75g/L，MgSO4·7H2O0.5～1.0g/L,pH7.5，其余为水；(b)按照0.5～1.0％的体积百分比将步骤(a)的活化的基因工程菌菌液接种到装有种子培养基的种瓶或种子罐，在28～30℃、摇床转速为200～300转/min的条件下培养32～48小时，得到基因工程菌的种子液，所述种子培养基的组成比例为：葡萄糖20～30g/L，酵母膏1～5g/L，蛋白胨7～10g/L，KH2PO40.5～0.75g/L，KH2PO40.5～0.75g/L，MgSO4·7H2O0.5～1.0g/L，泡敌0.2～0.3g/L,pH7.5，其余为水；(c)按照5.0～10.0％的体积百分比将步骤(b)所得种子液转接种到装有发酵培养基的摇瓶或发酵罐，在28～30℃、pH7.5～8.5条件下培养36～48小时，得发酵液，所述发酵培养基的组成比例为：葡萄糖20～40g/L，酵母膏5.0～10.0g/L，尿素7.5～10.0g/L，KH2PO40.5～1.0g/L，KH2PO40.5～1.0g/L，MgSO4·7H2O0.5～1.5g/L，味精0.5～1.5g/L,CoCl20.04～0.12mM，pH7.5～8.5，其余为水；(d)将(c)中的发酵液配制成10～40g/L(干重)的菌液，在三口烧瓶或水合反应釜中进行水合反应，通过调节丙烯腈流量使丙烯腈流加速度从高向低逐步调小，pH6.0～8.5、室温条件下进行水合反应2～5小时，得到高浓度的丙烯酸铵溶液；任选的进行(e)：采用中空纤维超滤膜分离方法，除去(d)中的高浓度的丙烯酸铵溶液中的细胞，获得高纯度的丙烯酸铵溶液。
本发明的各方面的方法或者工程菌的优点和有益效果还包括：(1)所构建的腈水解酶基因工程菌株THdAdN(Nit)，腈水解酶表达活性高达187U/ml；而国内外文献公开报道的水平低于40U/ml；(2)所构建的腈水解酶基因工程菌株，是重组红色红球菌，其发酵培养周期比紫红红球菌诱变菌株缩短1倍；(3)生产的丙烯酸铵质量高，杂质少，适于工业化的生产以及后续各种应用。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施方式的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是本发明的一个实施例中的腈水解酶基因的琼脂糖凝胶电泳图；左侧条带为DNA分子量Marker。右侧条带为腈水解酶基因。
图2是本发明的一个实施例中的腈水解酶基因高表达载体pNV-Nit的质粒示意图。
图3是本发明的一个实施例中的重组自杀质粒p18B-TH的示意谱图。
图4是本发明的一个实施例中的同源双交换敲除腈水合酶基因的过程的示意图。
图5是本发明的一个实施例中的紫红红球菌诱变株的细胞生长和酶活曲线。
图6是本发明的一个实施例中的重组红球菌THdA(Nit)的细胞生长和酶活曲线。
图7是本发明的一个实施例中的重组红球菌THdAdN(Nit)的细胞生长和酶活曲线。
图8是本发明的一个实施例中的重组红球菌THdAdN(Nit)、THdA(Nit)和紫红红球菌对照株进行水合反应生成丙烯酸铵的对比曲线。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的，本文中所使用的术语“第一”、“第二”等仅为方便描述，不能理解为指示或暗示相对重要性，也不能理解为之间有先后顺序关系。除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
下述实施例中的实验均设置三次重复，结果取平均值，例如实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
除另有交待，以下实施例中涉及的未特别交待技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《分子克隆实验指南》第三版或者相关产品说明书进行，未特别交待的试剂、序列、载体和细胞等也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公职的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
除另有交代，以下实施例采用的穿梭质粒为大肠杆菌-诺卡氏菌/红球菌穿梭质粒pNV18.1-Pa2，构建的腈水解酶基因高表达质粒载体表示为pNV-Nit。
采用的紫红红球菌为R.rhodochrousATCC33278。
自杀质粒选自pk18mob-sacB或其衍生质粒(NCBIaccessionNo.AF012346)。自杀质粒为携带卡那霉素抗性基因nptII和蔗糖果聚糖酶基因sacB的自杀质粒，构建的重组自杀质粒表示为p18B-TH。
双基因敲除的重组红球菌表示为THdAdN，将pNV-Nit转化进入THdAdN，获得的高表达腈水解酶重组红球菌表示为THdAdN(pNV-Nit)，简称为THdAdN(Nit)。
将高表达腈水解酶基因的质粒pNV-Nit转化进入酰胺酶基因单敲除的宿主菌TH3(amdA－)，获得的重组菌株称为THdA(pNV-Nit)，简称为THdA(Nit)，该菌株作为THdAdN(Nit)的一株对照菌株。
大肠杆菌-红球菌穿梭质粒载体选自pNV18、pNV18.1、pNV19或其衍生质粒(ChibaK.,HoshinoY.,IshinoK.etal.ConstructionofapairofpracticalNocardia-Escherichiacolishuttlevectors.Jpn.J.Infect.Dis.2007,60:45-47)以及其它可用的红球菌-大肠杆菌穿梭质粒中的至少一种。
穿梭质粒载体所使用的启动子是来源于红球菌TH的酰胺酶启动子(或其突变体)，或者其它组成型的红球菌强启动子(刘昌春等，红球菌启动子识别及β-半乳糖苷酶报告基因表达,生物工程学报，2009,25(9):1360～1365)。
所称的红球菌TH，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，CGMCCNo.2380(中国发明专利ZL200880000969.1)。所述的红球菌TH3，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，CGMCCNo.2381(中国发明专利ZL200880000969.1)。
实施例示例一种高表达腈水解酶的基因重组红球菌的构建方法。该方法采用同时敲除了酰胺酶基因和腈水合酶基因的红色红球菌作为宿主菌，采用大肠杆菌-诺卡氏菌/红球菌穿梭质粒pNV18.1-Pa2作为表达质粒；将来自紫红红球菌R.rhodochrousATCC33278(美国菌种保藏中心保藏)的腈水解酶基因插入质粒载体，即获得高表达腈水解酶的重组红球菌。
实施例示例一种高效表达腈水解酶的基因工程菌株。
实施例示例一种利用高表达腈水解酶的基因重组红球菌生产丙烯酸铵的方法。
实施例示例的一种高表达腈水解酶的基因重组红球菌的构建方法，由下述步骤构成：
1、腈水解酶基因的克隆和高表达质粒的构建
以紫红红球菌R.rhodochrousATCC33278的基因组为模板，扩增获得腈水解酶基因，如SEQIDNO：9所示。腈水解酶基因扩增的电泳图如图1所示。
SEQIDNO：9为：
将扩增获得的腈水解酶基因以PstI/HindIII双酶切插入大肠杆菌-红球菌穿梭质粒载体，获得腈水解酶基因高表达载体pNV-Nit。该质粒谱图如图2所示。
2、酰胺酶基因-腈水合酶酶基因双敲除的重组红球菌构建
根据红球菌TH或TH3的腈水合酶基因序列分别扩增获得腈水合酶基因的上游片段A(SEQIDNO：3)和下游片段B(SEQIDNO：6)。
SEQIDNO：3为：
SEQIDNO：6为：
将腈水合酶基因的上游片段A和下游片段B插入携带卡那霉素抗性基因nptII和蔗糖果聚糖酶基因sacB的自杀质粒载体，获得用于腈水合酶敲除的重组自杀质粒p18B-TH，其谱图如图3所示。
摇瓶培养敲除了酰胺酶基因的重组红球菌TH3，制备获得其感受态细胞。
将重组自杀质粒p18B-TH电转化进入红球菌TH3(amdA－)的感受态细胞，以发生双交换同源重组敲除腈水合酶基因。首先通过卡那霉素抗性(20mg/L)，进行第一轮单交换敲除筛选。进一步通过10％蔗糖平板进行第二轮双交换敲除筛选。挑取能够在蔗糖平板上生长的菌落，经菌落PCR扩增验证，即可获得所需要的腈水合酶基因敲除型重组红色红球菌，命名为THdAdN。上述腈水合酶基因双交换敲除过程如图4所示，具体过程参见实施例2。
3、高表达腈水解酶基因的重组红色红球菌构建
将高表达腈水解酶基因的质粒pNV-Nit电转化进入酰胺酶-腈水合酶基因双敲除的重组宿主菌THdAdN，获得重组菌株THdAdN(pNV-Nit)，简称为THdAdN(Nit)。
类似的，将高表达腈水解酶基因的质粒pNV-Nit电转化进入酰胺酶基因单敲除的宿主菌TH3(amdA－)，获得重组菌株THdA(pNV-Nit)，简称为THdA(Nit)，该菌株作为THdAdN(Nit)的一株对照菌株。
实施例示例的利用上述腈水解酶基因工程红球菌生产丙烯酸铵的方法，按照如下步骤进行：
(1)将在4℃保藏的腈水解酶基因工程红球菌接入活化培养基中，在28～30℃、摇床转速为150～250转/min的条件下培养32～56小时，得到活化的基因工程菌菌液；其中所述培养基的组成比例为：葡萄糖20～30g/L，酵母膏1～5g/L，蛋白胨7～10g/L，KH2PO40.5～0.75g/L，K2HPO40.5～0.75g/L，MgSO4·7H2O0.5～1.0g/L,pH7.5，其余为水；
(2)按照0.5～1.0％的体积百分比将步骤(1)的腈水解酶基因工程菌液接种到装有培养基的种瓶或种子罐，在28～30℃、摇床转速为200～300转/min的条件下培养32～48小时，得腈水合酶基因工程菌的种子液；所述的培养基的组成比例为：葡萄糖20～30g/L，酵母膏1～5g/L，蛋白胨7～10g/L，KH2PO40.5～0.75g/L，K2HPO40.5～0.75g/L，MgSO4·7H2O0.5～1.0g/L，泡敌0.2～0.3g/L,pH7.5，其余为水；
(3)按照5.0～10.0％的体积百分比将步骤(2)所得种子液转接种到装有摇瓶或发酵罐，在28～30℃、pH7.5～8.5条件下培养36～48小时，得发酵液；所述培养基的组成比例为：葡萄糖20～40g/L，酵母膏5.0～10.0g/L，尿素7.5～10.0g/L，KH2PO40.5～1.0g/L，K2HPO40.5～1.0g/L，MgSO4·7H2O0.5～1.5g/L，味精0.5～1.5g/L,CoCl20.04～0.12mM，pH7.5～8.5，其余为水；
(4)将发酵液配制为10～40g/L(干重)的菌液，在三口烧瓶或水合反应釜中进行水合反应，通过精密加料泵调节丙烯腈流量，流加速度从高向低逐步调小，pH6.0～8.5条件下进行室温水合反应2～5小时，得到高浓度的丙烯酸铵溶液。
(5)采用中空纤维超滤膜分离方法，分离水合液中的细胞，获得高纯度的丙烯酸铵溶液。
上述腈水解酶基因工程红球菌生产丙烯酸铵的方法，步骤(1)中所述的腈水解酶基因工程红球菌，是指酰胺酶-腈水合酶双敲除的基因工程红球菌THdAdN(Nit)和酰胺酶单敲除的THdA(Nit)，其中后者作为前者的对比菌株。同时，紫红红球菌诱变菌株R.rhodochroustg1-A6也作为原始对照株进行发酵培养和水合反应。三株菌的发酵培养和腈水解酶酶活结果如图5、图6和图7所示。丙烯腈水合反应生成丙稀酸铵的平行对照图如图8所示。
实施例1腈水解酶基因的克隆和高表达穿梭质粒pNV-Nit的构建
以紫红红球菌R.rhodochrousATCC33278的总DNA为模板，进行聚合酶链反应(PCR)扩增腈水解酶基因。上游引物为：5'-TGCACTGCAGATGGTCGAATACACAAACACATTCA-3'(SEQIDNO：7)，下游引物为：5'-CCCAAGCTTTCAGATGGAGGCTGTCGCC-3'(SEQIDNO：8)，引入的酶切位点为PstI/HindIII。引物设计后均委托北京赛百盛生物工程公司合成，用无菌水溶解至浓度为50μmol/L。PCR所用聚合酶及相应扩增缓冲液、四种脱氧核苷酸溶液均购自宝生物工程(大连)有限公司。
PCR反应体系为：
反应条件为：94℃，5min；94℃，1min、50℃，1.5min、72℃，1.5min，循环30次；最后72℃10min。扩增得到腈水解酶基因，其电泳图如图1所示。
将获得的腈水解酶基因片段，以本领域技术人员熟知的方法，在37℃下进行双酶切反应4h；将所得酶切产物用PCR产物回收试剂盒纯化(天根生化科技(北京)有限公司)后，用T4DNA连接酶(Promega公司)在4℃进行连接反应16h；将连接产物转化宿主菌E.coliJM109的感受态细胞(天根生化科技(北京)有限公司)，采用氨苄青霉素抗性(Amp)LB平板挑选阳性克隆，在LB培养基中37℃过夜培养后提取小量质粒进行酶切和电泳验证，得到含有腈水解酶基因片断的重组质粒pNV-Nit。测序验证表明质粒构建成功，其谱图如图2所示。
实施例2酰胺酶基因-腈水合酶基因双敲除的重组红球菌构建
根据红球菌TH的腈水合酶基因序列，首先设计引物扩增腈水合酶基因的上游片段A。所使用的上下游引物分别为：5'-GGAATTCCACCCTGCCGCCGTTGGACGACCAC-3'(SEQIDNO：1)，5'-GCTCTAGATCCTTTCATCGGAGCTGGGCTCAAA-3'(SEQIDNO：2)。引入的酶切位点为EcoRI/XbaI。引物均由北京赛百盛生物工程公司合成，用无菌水溶解至浓度为50μmol/L。PCR所用聚合酶及相应扩增缓冲液、四种脱氧核苷酸溶液均购自宝生物工程(大连)有限公司。PCR反应体系同实施例1。
类似的，根据红球菌TH的腈水合酶基因序列，首先设计引物扩增腈水合酶基因的下游片段B。所用的上游引物为：5'-GCTCTAGATGAAGACACACTCACTGATCGGCTC-3'(SEQIDNO：4)，下游引物为：5'-CCCAAGCTTAGTTGCGAGGTCGGTATCGGTTAGA-3'(SEQIDNO：5)。引入的酶切位点为XbaI/HindIII。
将腈水合酶基因的上游片段A和下游片段B通过双酶切插入携带卡那霉素抗性基因nptII和蔗糖果聚糖酶基因sacB的自杀质粒载体，酶切和连接条件同实施例1。获得用于腈水合酶敲除的重组自杀质粒p18B-TH，其谱图如图3所示。
采用300ml摇瓶，摇床转速200转/分钟，28℃培养敲除了酰胺酶基因的重组红球菌TH3(参见中国发明专利ZL200880000969.1)，制备获得其感受态细胞。感受态细胞的制备方法采用《分子克隆指南》(J.萨姆布鲁克，D.W.拉赛尔著)中革兰氏阳性菌感受态细胞的常规制备方法。
将重组自杀质粒p18B-TH电穿孔转化进入红球菌TH3(amdA－)的感受态细胞，以发生双交换同源重组敲除腈水合酶基因。电穿孔转化的方法参见中国发明专利ZL200880000969.1进行。电转后的细胞，培养复苏60分钟，用微量移液器吸取200微升菌液涂在含卡那霉素(20微克/毫升)的LB固体平板(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L，琼脂粉15g/L)上，28℃培养3天。平板上出现红色菌落，说明质粒上携带的腈水合酶基因上下游片段已经和染色体发生单交换同源重组，携带卡纳霉素抗性基因的质粒基因插入了染色体。
进一步配制10％蔗糖LB固体平板，将发生了单交换重组的菌落，摇瓶培养48h，然后稀释适当倍数涂布在蔗糖平板上，28℃培养3天。挑取20个单菌落，平行涂布在含卡那霉素(20微克/毫升)和不含卡那霉素的LB固体平板上，28℃培养3天。寻找在卡那霉素抗性平板上不生长、在无抗性平板上生长的红色菌落进行菌落PCR验证。其中3个菌落的PCR结果正确。进一步测序证实，腈水合酶基因敲除型重组红色红球菌THdAdN构建成功。上述腈水合酶基因双交换敲除过程如图4所示。
实施例3腈水解酶高表达重组红球菌的构建
将实施例1构建的腈水解酶高表达穿梭质粒pNV-Nit以电穿孔法转化实施例2中构建的双基因敲除宿主菌TH(dAm-dNH)的感受态细胞，可得重组红球菌THdAdN(Nit)。
类似的，将实施例1构建的腈水解酶高表达穿梭质粒pNV-Nit以电穿孔法转化单基因敲除的宿主菌TH(dAm)(参见中国发明专利ZL200880000969.1)的感受态细胞，可得对比重组红球菌THdA(Nit)。
实施例4基因工程红色红球菌和紫红红球菌诱变株的对比培养
采用500ml三角摇瓶，装培养基的量为10％，将实施例3所得重组红色红球菌THdAdN(Nit)和THdA(Nit)以及紫红红球菌诱变株在28℃摇床分批培养，摇床转速为200rpm。其中，紫红红球菌培养120小时，THdAdN(Nit)和THdA(Nit)培养72小时。所述重组红色红球菌的培养基的组成比例为：葡萄糖30g/L，酵母膏5g/L，尿素7.5g/L，KH2PO40.5g/L，K2HPO40.5g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，泡敌0.2g/L，pH值为7.5，二价钴离子40ppm，其余为水。紫红红球菌的培养基组成为：葡萄糖30g/L，谷氨酸钠10g/L，酵母膏3g/L，硫酸镁0.5g/L，诱导剂己内酰胺7g/L，磷酸盐1.5g/L，pH为7.5。
结果表明，紫红红球菌诱变株的腈水解酶活性，在80小时达到最高，约28U/ml，如图5所示。而对比重组红球菌THdA(Nit)，在42小时培养后达到最高，为70U/ml。重组菌株THdAdN(Nit)的腈水解酶活性，在48小时培养后达到最高，且高达187U/ml，如图6和图7所示。二者均优于紫红红球菌，且培养周期缩短接近一倍。重组菌株THdAdN(Nit)和THdA(Nit)的腈水解酶活性均远高于目前国内外文献报道的水平(低于40U/ml)。
其中，腈水合酶的酶活检测采用标准的气相色谱内标法。1mL反应体系中含有200μL菌液以及800μL50mMPBS缓冲液(pH8)，加入20μL丙烯腈于28℃水浴中反应10min后，立即用100μL3M的盐酸终止反应。酶活的国际单位定义为：每分钟催化生成1μmol丙烯酸铵所需的酶量；1μmol丙烯酸铵/(min·ml菌液)＝1U/ml。
实施例5利用基因工程菌THdAdN(Nit)水合制备丙烯酸铵
按照实施例4所描述的方法，挑取基因重组红球菌THdAdN(Nit)和THdA(Nit)以及紫红红球菌诱变株的单菌落，进行摇瓶培养。收获细胞，离心洗涤后重悬。对照的紫红红球菌细胞浓缩一倍使用。重组红球菌THdAdN(Nit)和THdA(Nit)则重悬为原发酵液浓度，用于催化水合丙烯腈生产丙烯酸铵。重悬液的酶活力约为60U/ml，70U/ml和100U/mL。在250ml三口烧瓶中进行水合反应，丙烯腈通过精密加料泵连续加入。调节初始丙烯腈流量40ml/h，每30min降低丙烯腈流量5ml/h。反应过程中监测产物浓度的变化，约3-4小时后，停止反应。丙烯酸铵生成浓度如图8所示。
由图可见，紫红红球菌游离细胞，反应4小时，产物浓度达到455g/L。对比重组红球菌THdA(Nit)，反应3.5小时，产物浓度达到491g/L。而本发明重组红球菌THdAdN(Nit)，反应2小时15分后，产物浓度达到609g/L，于3小时20分停止反应，产物终浓度高达633g/L。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (11)

1.一种构建双基因敲除的重组红球菌的方法，其特征在于，包括：
(1)根据所述红球菌的腈水合酶基因序列，设计引物以分别扩增所述腈水合酶基因的上游序列和所述腈水合酶基因的下游序列，获得所述腈水合酶基因的上游片段和所述腈水合酶基因的下游片段；
(2)将(1)中的腈水合酶基因的上游片段和腈水合酶基因的下游片段插入到自杀质粒中，获得重组自杀质粒，所述自杀质粒携带卡那霉素抗性基因和蔗糖果聚糖酶基因；
(3)利用(2)中的重组自杀质粒转化敲除了酰胺酶基因的重组红球菌的感受态细胞，获得所述双基因敲除的重组红球菌，其中包括，
通过卡那霉素抗性进行第一轮筛选，获得第一重组菌落，
通过蔗糖平板对所述第一重组菌落进行第二轮筛选，以获得所述双基因敲除的重组
红球菌。
2.权利要求1的方法，其特征在于，(1)中的腈水合酶基因的上游片段带有酶切位点EcoRI/XbaI，(1)中获得的腈水合酶基因的下游片段带有酶切位点XbaI/HindIII；
任选的，(1)中的扩增所述腈水合酶基因的上游片段的引物具有如SEQIDNO：1和2所示的序列，所述腈水合酶基因的上游片段具有如SEQIDNO：3所示的序列，和/或
(1)中的扩增所述腈水合酶基因的下游片段的引物具有如SEQIDNO：4和5所示的序列，所述腈水合酶基因的下游片段具有如SEQIDNO：6所示的序列。
3.权利要求1的方法，其特征在于，(2)中的自杀质粒选自pk18mob-sacB和其衍生质粒中的一种；
任选的，(3)为利用电穿孔进行所述重组自杀质粒转化。
4.权利要求1的方法，其特征在于，(3)中的通过卡那霉素抗性进行第一轮筛选，获得第一重组菌落，包括：
利用含卡那霉素20微克/毫升的LB固体平板进行所述第一轮筛选，获得在所述卡那霉素20微克/毫升的LB固体平板上生长的红色菌落。
5.权利要求4的方法，其特征在于，(3)中的通过蔗糖平板对所述第一重组菌落进行第二轮筛选，以获得所述双基因敲除的重组红球菌，包括：
利用含蔗糖10％的LB固相平板对所述红色菌落进行所述第二轮筛选，获得在含蔗糖10％的LB固相平板上生长的菌落，
分别通过含卡那霉素20微克/毫升的LB固体平板和不含卡那霉素的LB固相平板对所述在含蔗糖10％的LB固相平板上生长的菌落进行筛选，获得在所述含卡那霉素20微克/毫升的LB固体平板上不生长、在所述不含卡那霉素的LB固体平板上生长的菌落为所述双基因敲除的重组红球菌。
6.一种双基因敲除的重组红球菌，其利用权利要求1-5任一方法构建获得。
7.一种构建高表达腈水解酶重组红球菌的方法，其特征在于，包括：
构建高表达腈水解酶的质粒，获得高表达腈水解酶质粒；
利用所述高表达腈水解酶质粒转化权利要求6的双基因敲除的重组红球菌的感受态细胞，以获得所述高表达腈水解酶重组红球菌。
8.权利要求7的方法，其特征在于，所述构建高表达腈水解酶的质粒包括：
设计引物对以扩增紫红红球菌的腈水解酶基因，获得腈水解酶基因扩增产物，
将所述腈水解酶基因扩增产物插入到大肠杆菌-红球菌穿梭质粒中，以获得所述高表达腈水解酶质粒；
任选的，所述引物对具有如SEQIDNO：7和8所示的序列；
任选的，所述腈水解酶基因扩增产物带有酶切位点PstI/HindIII；
任选的，所述大肠杆菌-红球菌穿梭质粒选自pNV18、pNV18.1、pNV19和其衍生质粒中的一种；
任选的，所述大肠杆菌-红球菌穿梭质粒的启动子选自红球菌的酰胺酶启动子和红球菌的酰胺酶启动子的突变体中的一种。
9.一种高表达腈水解酶重组红球菌，其利用权利要求7或8的方法构建获得。
10.权利要求9的高表达腈水解酶重组红球菌在制备羧酸类化合物中的用途。
11.一种制备丙烯酸铵的方法，其特征在于，利用权利要求6的双基因敲除的重组红球菌表达腈水解酶进行所述丙烯酸铵的制备；
任选的，所述方法包括：
(a)将所述双基因敲除的重组红球菌接入活化培养基中，在28～30℃、摇床转速为150～250转/min的条件下培养32～56小时，得到活化的基因工程菌菌液，其中
所述活化培养基的组成比例为：葡萄糖20～30g/L，酵母膏1～5g/L，蛋白胨7～10g/L，KH2PO40.5～0.75g/L，K2HPO40.5～0.75g/L，MgSO4·7H2O0.5～1.0g/L,pH7.5，其余为水，
(b)按照0.5～1.0％的体积百分比将步骤(a)的活化的基因工程菌菌液接种到装有种子培养基的种瓶或种子罐，在28～30℃、摇床转速为200～300转/min的条件下培养32～48小时，得到基因工程菌的种子液，
所述种子培养基的组成比例为：葡萄糖20～30g/L，酵母膏1～5g/L，蛋白胨7～10g/L，KH2PO40.5～0.75g/L，K2HPO40.5～0.75g/L，MgSO4·7H2O0.5～1.0g/L，泡敌0.2～0.3g/L,pH7.5，其余为水，
(c)按照5.0～10.0％的体积百分比将步骤(b)所得种子液转接种到装有发酵培养基的摇瓶或发酵罐，在28～30℃、pH7.5～8.5条件下培养36～48小时，得发酵液，
所述发酵培养基的组成比例为：葡萄糖20～40g/L，酵母膏5.0～10.0g/L，尿素7.5～10.0g/L，KH2PO40.5～1.0g/L，K2HPO40.5～1.0g/L，MgSO4·7H2O0.5～1.5g/L，味精0.5～1.5g/L,CoCl20.04～0.12mM，pH7.5～8.5，其余为水，
(d)将(c)中的发酵液配制成10～40g/L(干重)的菌液，在三口烧瓶或水合反应釜中进行水合反应，通过调节丙烯腈流量使丙烯腈流加速度从高向低逐步调小，pH6.0～8.5、室温条件下进行水合反应2～5小时，得到高浓度的丙烯酸铵溶液，
(e)采用中空纤维超滤膜分离方法，除去(d)中的高浓度的丙烯酸铵溶液中的细胞，获得高纯度的丙烯酸铵溶液。
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