CN106399213A - 一种抗生素溶杆菌基因敲除系统及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗生素溶杆菌基因敲除系统及其构建方法和应用，属于微生物基因工程技术领域。本发明利用自杀质粒构建用于基因敲除的重组载体，将重组载体转入感受态细胞中，并在含庆大霉素抗性培养基上和含蔗糖培养基上分别进行一次交换子和二次交换子的筛选，再利用PCR进行突变体筛选获得基因敲除突变体。利用该敲除系统成功敲除抗生素溶杆菌OH13中的两个基因，证明该系统适用于抗生素溶杆菌的基因功能研究，为其小分子代谢产物生物合成、遗传调控和作用机制研究奠定了基础。

Description

一种抗生素溶杆菌基因敲除系统及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及一种基于同源重组的抗生素溶杆菌OH13基因敲除系统及其构建方法和应用，属于微生物基因工程领域。
背景技术
溶杆菌(Lysobacter spp)是属于黄单胞科、溶杆菌属的一类革兰氏阴性细菌。1978年Christensen和Cook建立了溶杆菌属，并命名了四个种，分别为：产酶溶杆菌(L.enzymogenes)，抗生素溶杆菌(L.antibioticus)，变棕溶杆菌(L.brunescens)和胶状溶杆菌(L.gummosus)。溶杆菌在环境中普遍存在，可存活于土壤中，新鲜的水中或腐烂的有机物中。溶杆菌的主要特征是无鞭毛但有滑行能力，基因组中G+C％含量达到65-70％，能产生大量裂解酶和小分子次生代谢产物，对许多微生物，如真菌、卵菌、酵母、细菌、单细胞藻类和线虫都有较好的拮抗活性，是一类具有重要生防和药用潜力的细菌。
抗生素溶杆菌OH13为本实验室分离于水稻根际土壤的一株革兰氏阴性细菌。OH13已于2013年05月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC No.7561。OH13能产生一类具有抗细菌活性的吩嗪类化合物，但其基因敲除系统还未见报道。由于溶杆菌对许多抗生素有抗性，且敏感的抗生素种类也不相同，导致溶杆菌的基因敲除系统不易构建，而且不同溶杆菌甚至同一个种的不同菌株其有效的基因敲除系统也不相同，不能共用。因此，针对抗生素溶杆菌OH13基因敲除系统的构建，有助于对OH13进行分子操作，特别是可为其小分子代谢产物生物合成、遗传调控和作用机制研究奠定基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗生素溶杆菌OH13基因敲除的方法。
本发明的另一目的在于提供采用上述方法获得的基因敲除突变体。通过该方法获得抗生素溶杆菌OH13的基因敲除系统(基因敲除突变体)可在相关基因功能的研究中进行应用。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种抗生素溶杆菌OH13基因敲除的方法，利用自杀质粒构建用于基因敲除的重组载体，将重组载体转入感受态细胞中，并在含庆大霉素抗性培养基上和含蔗糖培养基上分别进行一次交换子和二次交换子的筛选，再利用PCR进行突变体筛选获得基因敲除突变体。
上述的方法，具体包括以下步骤：
(1)构建重组载体：设计目的基因上游臂引物和下游臂引物，利用PCR扩增目的基因的上下游同源臂；将自杀质粒与上下游同源臂利用相应的内切酶进行酶切并连接得到用于基因敲除的重组载体；
(2)重组载体转入抗生素溶杆菌OH13感受态细胞：将重组载体以电转化方式转入抗生素溶杆菌OH13感受态细胞中，将细胞涂布于含庆大霉素抗性培养基上；挑取单菌落进行PCR筛选一次交换子；
(3)构建基因敲除突变体：挑取一次交换子单菌落于NBWS培养基中进行二次交换培养；取上述二次交换培养液涂布于含蔗糖培养基上，筛选二次交换子；挑取转化子进行PCR验证，获得基因敲除突变体。
所述的自杀质粒为质粒pJQ200SK，该自杀质粒携带庆大霉素抗性基因。
所述的含庆大霉素抗性培养基为含庆大霉素的NAWS平板；所述的含蔗糖培养基为NAWS+8％蔗糖培养基。优选的，所述的含庆大霉素抗性培养基为含50μg/ml庆大霉素的NAWS平板。
所述的NBWS培养基为不含蔗糖的NB培养基；所述的NAWS平板为不含蔗糖的NA固体培养基；所述的NA固体培养基为1L NB培养基+17g琼脂；
所述NB培养基的配方为：3g牛肉膏，1g酵母粉，5g蛋白胨，10g蔗糖，pH 7.0-7.2，1L灭菌水。
所述二次交换培养的条件为：30℃，200rpm培养7h。
上述方法获得的基因敲除突变体。
上述方法在制备基因敲除体变体中的应用。
本发明方法的最优选技术方案的详细过程为：
1、构建重组载体：
(1)设计目的基因上游臂引物和下游臂引物，利用PCR扩增目的基因上下游同源臂约1000-bp；(2)将质粒pJQ200SK(Quandt and Hynes 1993)与上下游同源臂利用相应的内切酶进行酶切；(3)酶切后的同源臂片段与质粒pJQ200SK利用连接酶连接后，热转入大肠杆菌感受态细胞进行克隆；(4)从正确转化菌株中提取质粒，PCR及酶切验证正确后，获得用于基因敲除的重组载体。
2、重组载体电转化进入OH13感受态细胞：
(1)制备OH13电转感受态细胞；(2)将重组质粒电击转入感受态细胞，电压为1.8kv；(3)将细胞涂布于含50μg/ml庆大霉素的NAWS平板；(4)挑取单菌落进行PCR筛选一次交换子。
3、构建基因敲除突变体：
(1)挑取一次交换子单菌落于含1ml NBWS培养基的2ml离心管，30℃，200rpm培养7h进行二次交换；(2)取上述培养液100μl涂布于含8％蔗糖的NAWS平板上，筛选二次交换子；(3)30℃培养3天挑取转化子进行PCR验证，获得基因敲除突变体。
培养基配方为：OH13及其突变体培养于NB培养基(3g牛肉膏，1g酵母粉，5g蛋白胨，10g蔗糖，pH7.0-7.2，1L灭菌水)；NBWS培养基(NB不含蔗糖)，或固体培养基NA(1L NB加17g琼脂)；或NAWS培养基(NA不含蔗糖)。
本发明的有益效果：
本发明针对抗生素溶杆菌OH13基因敲除系统的构建，有助于对OH13进行分子操作，特别是可为其小分子代谢产物生物合成、遗传调控和作用机制研究奠定基础。
附图说明
图1为抗生素溶杆菌中基因敲除过程示意图
图2为重组载体PCR验证
其中，M,Marker DL2000；+，抗生素溶杆菌OH13野生型基因组为模板；-,阴性对照。(A)1-4,基因LaPhzD重组载体的PCR检测，引物LaPhzD-F1/LaPhzD-R2，PCR产物预期为2040-bp。(B)1-4，基因LaPhzB重组载体的PCR检测，LaPhzB-F1/LaPhzB-R2，产物大小为2420-bp。
图3为LaPhzD与LaPhzB基因一次交换子的PCR筛选
其中，(A)LaPhzD基因一次交换子利用引物LaPhzD-deletion-MF/LaPhzD-deletion-MR的筛选。M,Marker DL2000；W,以OH13野生基因组DNA为模板，目的片段为626-bp；-，阴性对照；1，LaphzD基因的一次交换子，预期两个片段626-bp与286-bp。(B)LaPhzB基因一次交换子利用引物LaPhzB-deletion-MF/LaPhzB-deletion-MR的筛选。M,MarkerDL2000；W,以OH13野生基因组DNA为模板，目的片段为1000-bp；V，以重组载体pJQ200SK-phzB为PCR模板，预期片段大小为655-bp；-，阴性对照；1，LaphzD基因的一次交换子，预期两个片段1000-bp与655-bp。
图4为基因LaPhzD与LaPhzB敲除突变体的构建
其中，(A)LaPhzD敲除突变体利用引物LaPhzD-deletion-MF/LaPhzD-deletion-MR的PCR筛选。M,Marker DL2000；W,以OH13野生基因组DNA为模板，目的片段为626-bp；V,以重组载体pJQ200SK-phzD为PCR模板，预期片段大小为286-bp；-，阴性对照；1-4，LaphzD基因的敲除突变体，预期片段大小286-bp。(B)LaPhzB敲除突变体利用引物LaPhzB-deletion-MF/LaPhzB-deletion-MR的PCR筛选。M,Marker DL2000；W,以OH13野生基因组DNA为模板，目的片段为1000-bp；V，以重组载体pJQ200SK-LaphzB为PCR模板，预期片段大小为655-bp；-，阴性对照；1-4，LaphzB基因的敲除突变体，预期片段大小655-bp。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围不限于此。
需要的培养基为：OH13及其突变体培养于NB培养基(3g牛肉膏，1g酵母粉，5g蛋白胨，10g蔗糖，pH7.0-7.2，1L灭菌水)；
NBWS培养基(NB不含蔗糖)；
固体培养基NA(1L NB加17g琼脂)；
NAWS培养基(NA不含蔗糖)；
含50μg/ml庆大霉素的NAWS平板；
NAWS+8％蔗糖培养基(1L培养基中含80g蔗糖)。
实施例1抗生素溶杆菌OH13中LaPhzD基因的敲除
按以下步骤进行：
(1)根据抗生素溶杆菌OH13全基因组信息，设计目的基因LaPhzD上游臂引物LaPhzD-F1/LaPhzD-R1和下游臂引物LaPhzD-F2/LaPhzD-R2及突变体验证引物LaPhzD-deletion-MF/LaPhzD-deletion-MR。
LaPhzD-F1：CGGGATCCCGACGAAGCCCTGCTGCTACCC
LaPhzD-R1：CCCAAGCTTGGGCGAAGCGGCATTCTTGACC
LaPhzD-F2：CCCAAGCTTGGGACGCCGTCGCCGATTTCT
LaPhzD-R2：GCTCTAGAGCCGTGCGCCCTTCGATGAA
LaPhzD-deletion-MF：AAGATCCAGCCTTATGCG
LaPhzD-deletion-MR：CAGCAACGGGGTAGTCAT
(2)PCR扩增上游臂1100-bp，酶切位点为BamHI/HindIII；下游臂940-bp，酶切位点为HindIII/XbaI，质粒pJQ200SK利用BamHI/XbaI酶切。
(3)酶切后的上下臂与相应酶切位点的质粒pJQ200SK连接，转入大肠杆菌扩增后，获得重组载体pJQ200SK-LaPhzD，利用引物LaPhzD-F1/LaPhzD-R2进行PCR验证，获得2040-bp片段，1-4正确(图2A)。
(4)重组载体pJQ200SK-LaPhzD电转入抗生素溶杆菌OH13野生型后，将细胞涂布于含50μg/ml庆大霉素的NAWS平板上进行筛选，获得的转化子可能为一次交换子，利用引物LaPhzD-deletion-MF/LaPhzD-deletion-MR进行筛选。若基因LaPhzD的上游或下游片段发生一次交换，预期PCR获得两个片段，大小分别为626-bp和286-bp(图3A)。
(5)获得基因LaPhzD一次交换子后，挑取一次交换子单克隆于装有1ml NBWS的2ml离心管中，30℃，200rpm培养7h，取100μl培养液涂布于NAWS+8％蔗糖培养基，培养3天。
(6)挑取单菌落，PCR筛选LaPhzD基因敲除突变体。利用引物LaPhzD-deletion-MF/LaPhzD-deletion-MR进行PCR，预期片段大小为286-bp，获得1、2、3三个LaPhzD基因突变体(图4A)。
实施例2抗生素溶杆菌OH13中LaPhzB基因的敲除
按以下步骤进行：
(1)根据抗生素溶杆菌OH13全基因组信息，设计目的基因LaPhzB上游臂引物LaPhzB-F1/LaPhzB-R1和下游臂引物LaPhzB-F2/LaPhzB-R2及突变体验证引物LaPhzB-deletion-MF/LaPhzB-deletion-MR。
LaPhzB-F1：CGGGATCCCGCGGAGTCGGACTTGCTGTGG
LaPhzB-R1：CCCAAGCTTGGGCGCCCTTGCGGCTCATAT
LaPhzB-F2：CCCAAGCTTGGGGATTCCGGCGATCAAGCG
LaPhzB-R2：GCTCTAGAGCCAGCAATCCAACCAGGTCTCG
LaPhzB-deletion-MF：CGGTGAAACCCGACCTGC
LaPhzB-deletion-MR：GGCGTCTGCCCACTTCTT
(2)PCR扩增上游臂1318-bp，酶切位点为BamHI/HindIII；下游臂1102-bp，酶切位点为HindIII/XbaI，质粒pJQ200SK利用BamHI/XbaI酶切。
(3)酶切后的上下臂与相应酶切位点的质粒pJQ200SK连接，转入大肠杆菌扩增后，获得重组载体pJQ200SK-LaPhzB，利用引物LaPhzB-F1/LaPhzB-R2进行PCR验证，获得2420-bp片段，1-4正确(图2B)。
(4)重组载体pJQ200SK-LaPhzB电转入抗生素溶杆菌OH13野生型后，将细胞涂布于含50μg/ml庆大霉素的NAWS平板上进行筛选，获得的转化子利用引物LaPhzB-deletion-MF/LaPhzB-deletion-MR进行筛选。若基因LaPhzB的上游或下游片段发生一次交换，预期PCR获得两个片段，大小分别为1000-bp和655-bp(图3B)。
(5)获得基因LaPhzB一次交换子后，挑取一次交换子单克隆于装有1ml NBWS的2ml离心管中，30℃，200rpm培养7h，取100μl培养液涂布于NAWS+8％蔗糖培养基，培养3天。
(6)PCR筛选LaPhzB基因敲除突变体。利用引物LaPhzB-deletion-MF/LaPhzB-deletion-MR进行PCR，预期片段大小为655-bp，获得1、2、3、4四个LaPhzB基因敲除突变体(图4B)。

Claims (9)

1.一种抗生素溶杆菌OH13基因敲除的方法，其特征在于：利用自杀质粒构建用于基因敲除的重组载体，将重组载体转入感受态细胞中，并在含庆大霉素抗性培养基上和含蔗糖培养基上分别进行一次交换子和二次交换子的筛选，再利用PCR进行突变体筛选获得基因敲除突变体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于具体包括以下步骤：
(1)构建重组载体：设计目的基因上游臂引物和下游臂引物，利用PCR扩增目的基因的上下游同源臂；将自杀质粒与上下游同源臂利用相应的内切酶进行酶切并连接得到用于基因敲除的重组载体；
(2)重组载体转入抗生素溶杆菌OH13感受态细胞：将重组载体以电转化方式转入抗生素溶杆菌OH13感受态细胞中，将细胞涂布于含庆大霉素抗性培养基上；挑取单菌落进行PCR筛选一次交换子；
(3)构建基因敲除突变体：挑取一次交换子单菌落于NBWS培养基中进行二次交换培养；取上述二次交换培养液涂布于含蔗糖培养基上，筛选二次交换子；挑取转化子进行PCR验证，获得基因敲除突变体。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的自杀质粒为质粒pJQ200SK，该自杀质粒携带庆大霉素抗性基因。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的含庆大霉素抗性培养基为含庆大霉素的NAWS平板；所述的含蔗糖培养基为NAWS+8％蔗糖培养基。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述的含庆大霉素抗性培养基为含50μg/ml庆大霉素的NAWS平板。
6.根据权利要求2、4或5所述的方法，其特征在于：
所述的NBWS培养基为不含蔗糖的NB培养基；所述的NAWS平板为不含蔗糖的NA固体培养基；所述的NA固体培养基为1L NB培养基+17g琼脂；
所述NB培养基的配方为：3g牛肉膏，1g酵母粉，5g蛋白胨，10g蔗糖，pH 7.0-7.2，1L灭菌水。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述二次交换的培养条件为：30℃，200rpm培养7h。
8.权利要求1～7中任一所述方法获得的基因敲除突变体。
9.权利要求1～7中任一所述方法在制备基因敲除体变体中的应用。
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