CN102559705A

CN102559705A - 一种EPS基因簇EpsA、EpsB、EpsC、EpsD

Info

Publication number: CN102559705A
Application number: CN2011102616118A
Authority: CN
Inventors: 生庆海; 康小红; 张兰威; 龄南; 孙国庆; 周琦
Original assignee: Inner Mongolia Mengniu Dairy Group Co Ltd
Current assignee: Inner Mongolia Mengniu Dairy Group Co Ltd
Priority date: 2010-10-28
Filing date: 2011-09-06
Publication date: 2012-07-11

Abstract

本发明涉及一种嗜热链球菌及其包含的胞外多糖(EPS)基因簇EpsA、EpsB、EpsC、EpsD。所述菌株是从甘肃省甘南县采集的传统发酵乳制品中分离得到的产EPS的嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)MN-ZLW-002，保藏号为CGMCCNo.3817。所述基因簇是从该嗜热链球菌中分离得到的，其分别由EpsA、EpsB、EpsC和EpsD基因组成；并且对上述基因进行了克隆和测序。本发明的EPS基因簇可用于乳酸菌产粘菌株的筛选、益生菌株(拥有EPS相关益生功能)筛选以及用于菌株的基因改造。

Description

一种EPS基因簇EpsA、EpsB、EpsC、EpsD

技术领域

本发明涉及一种EPS基因簇EpsA、EpsB、EpsC、EpsD和包括该基因簇的嗜热链球菌。

背景技术

嗜热链球菌是发酵乳生产中必不可少的乳酸菌菌株，其常常与保加利亚乳杆菌配比使用，某些嗜热链球菌在发酵乳制品生产中不仅起到前期的产酸作用，而且还有发挥一个非常重要的生物功能，就是产生胞外多糖，嗜热链球菌产生的胞外多糖具有增加黏度、改善发酵乳质构、流变特性及口感等作用，近年人们通过大量动物实验证明嗜热链球菌产生的胞外多糖除了上述作用外还拥有一定的益生功能，如：降胆固醇、增强粘膜吸附、增加机体免疫力和抗肿瘤等作用。

嗜热链球菌产生的胞外多糖均为杂多糖，是由不同的单糖组合而成的，组成杂多糖的单糖包括葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、果糖等。杂多糖是通过聚合在细胞质中形成的前体物质即重复单元的聚合反应而形成的，其生物合成和分泌过程需要一系列的酶和蛋白质，该过程可以分为四个反应阶段：糖转运进入细胞质，合成糖-1-磷酸，糖的激活和耦合及多糖转运出细胞质。决定嗜热链球菌产胞外多糖的基因簇均存在于菌株的染色体上，相关研究表明嗜热链球菌有一个复杂的基因组织负责EPS的生物合成和分泌。例如，通过Tn916诱变和对比染色的平板分析方法鉴定出S. thermophilus Sfi6位于染色体上的eps基因簇，是一段长14.52kb的DNA，编码Eps A到EpsM十三个基因。EpsE, EpsF, EpsG和EpsI基因在大肠杆菌中表达和体外用薄层色谱分析¹⁴C标记核苷酸的糖基转移酶反应，鉴定出EpsE、EpsG和EpsI分别是β-半乳糖酶、α-1,3-N-乙酸半乳糖胺和β-1,3-葡萄糖转移酶。通过排除，α-1,6-半乳糖转移酶应该是EpsF，它是糖基转移酶基因留下的没有功能的片段。Eps K基因与多糖输出有关，EpsI基因与聚合作用有关，EpsA、EpsB基因与决定链长有关。总之不同菌株的EPS基因簇的基因组的构成、转录的方向和功能表现出高度的保守性。根据同源性调查这类基因簇由四个功能区域组成，一个中心区域带有表现糖基转移酶同源性，这些酶是EPS重复单元生物合成的专一酶，两个在中心区域侧翼的区域，表现参与聚合作用和运输的酶的同源性(链长的控制、转运、聚合)和一个位于基因簇开始端的调节区域。

了解和阐明EPS基因簇的功能有助于我们掌握嗜热链球菌生产胞外多糖的基因调控机制，弄清EPS基因簇与嗜热链球菌生产胞外多糖的关系，可为产粘乳酸菌筛选、益生菌株(拥有EPS相关益生功能)筛选以及用于菌株的基因改造提供基础性的研究材料。

发明内容

本发明人针对上述问题，以传统发酵乳制品中乳酸菌为目标菌群，采用特定的筛选方法，从甘肃省甘南县采集的传统发酵乳制品中筛选出产粘菌株，得到一种产胞外多糖嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus ，MN-ZLW-002)及其筛选方法，并进一步研究了该产粘菌株中EPS基因簇以及其与胞外多糖产生之间的关系。

本发明的目的之一是对产胞外多糖嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus )MN-ZLW-002中相关EPS基因进行克隆和测序。

本发明的目的之二是通过PCR确定EPS基因簇与胞外多糖产生之间的关系。

本发明的目的之三是提供胞外多糖(EPS)基因簇或EPS基因在筛选和改造乳酸菌中的应用。

本发明的嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus) MN-ZLW-002已于2010年5月7日，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址为北京市朝阳区北辰西路1号院，中科院微生物研究所)，保藏号：CGMCC No.3817。

本发明提供了从所述嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus) MN-ZLW-002中分离的EPS基因簇：EpsA、EpsB、EpsC、EpsD，并且对该基因进行了克隆和测序。

本发明还提供了一种产胞外多糖嗜热链球菌的筛选方法。包括：

a.以传统发酵乳制品为样品，从中分离鉴定得到30株乳酸球菌；

b.经进一步理化鉴定确定嗜热链球菌菌株，并制得嗜热链球菌菌悬液；

c.吸取所述嗜热链球菌菌悬液，以2%接菌量接种于200mL 12%脱脂乳中。置于43℃条件下进行18小时过夜培养，在4℃条件下打冷5-8小时，打冷后对各样品进行检测；

d.用流变仪测定各样品的流变特性以及黏度大小；利用苯酚硫酸法测定各样品的胞外多糖产量；

本发明还提供了相关EPS基因的克隆方法，包括：

a.查询GeneBank，找到己公布的相关序列进行EPS基因的引物设计;

b.对上述新鲜嗜热链球菌进行PCR扩增，从而得到目的片段;

c.对目的片段进行琼脂糖凝胶回收以及基因克隆，并将克隆片段送往基因公司进行测序。

本发明的嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus ，MN-ZLW-002)具有较好产粘性能，对其EPS基因簇进行克隆研究后表明EPS基因簇与嗜热链球菌生产胞外多糖具有一定的关系，可用于产粘乳酸菌筛选、益生菌株(拥有EPS相关益生功能)筛选以及用于菌株的基因改造。

附图说明

附图1为本发明的嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus ，MN-ZLW-002)的全基因组图。

具体实施方式

下列实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1：嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus )MN-ZLW-002的分离和鉴定

1、菌株的筛选

经无菌离心管采集回来的甘肃省甘南县传统发酵乳制品，及时移入超净工作台，以无菌枪头吸取25mL，溶解于225mL的生理盐水中，振荡均匀，得到10^-1的菌悬液。

用移液枪吸取1mL此菌悬液注入9mL的生理盐水管中，得到稀释度为10^-2，的菌悬液，厌氧条件下逐级稀释，直到10^-6。

每个稀释度分别取1mL，接种到M17琼脂培养基中， 37℃恒温厌氧培养。培养48h后取出观察。

待菌落形成后，用接种环或接种针挑取菌落，接种于M17液体中，置于37℃条件下，培养24h-48h。待菌株生长良好后，再次划线接种于M17琼脂培养基中，置于37℃条件下，培养24h-48h，仔细观察记录菌落形态和革兰氏染色细胞形态特征。将革兰氏阳性链球菌暂定为嗜热链球菌进一步纯化培养，并采用冷藏、-85℃冻结保存或

低温真空冷冻保存。

将从传统发酵乳制品中分离的链球菌菌株，经生理生化学试验、乳酸旋光性测定等一系列试验分析鉴定，并将鉴定后的菌株分别制成供试菌液。

吸取菌悬液，以2%接菌量接种于200mL 12%脱脂乳中。置于43℃条件下进行18小时过夜培养，在4℃条件下打冷5-8小时，打冷后对各样品进行检测。

用流变仪测定各样品的流变特性以及黏度大小；利用苯酚硫酸法测定各样品的胞外多糖产量。

嗜热链球菌的鉴定：分离纯化的嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)MN-ZLW-002经生理生化学特性分析和16SrDNA序列分析的方法鉴定，其微生物学特性及16SrDNA如表1及表2所示。

表1 Streptococcus thermophilus ,MN-ZLW-002的生物学特性

表2 Streptococcus thermophilus ,MN-ZLW-002的16SrDNA序列

实施例2 : 嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus, MN-ZLW-002)Eps基因簇EpsA、EpsB、EpsC、EpsD部分序列的克隆及测序

本发明测序得到的片段，经过同源性比较证实为Eps基因簇的编码片段。

1、实验方法

1.1 PCR引物设计与合成

PCR引物根据GeneBank提供的相关序列(GenBank: AF430847.1)采用Primer Primer 6.0自行设计，由invitrogen公司合成。

EpsA：F: 5‘-AGATGGCGGAGATAATGAC-3‘;

R: 5‘-TACCTGTTACTGCTTGAGAA-3‘

EpsB： F: 5‘-GCAGAAGCAGAAGCACTT-3‘

R: 5‘-ATGAGCAACAATAGGCGTTA-3‘

EpsC： F: 5‘-GAGTCACCATCTTCACCAA-3‘

R: 5‘-GGCATCTTCCACATCTTCT-3‘

EpsD： F: 5‘-AGTGGTTCTCAGTTCTTAGG-3‘

R: 5‘-TACGACGATGTGCTCTTG-3‘

1.2嗜热链球菌DNA的提取。

采用CTAB法提取菌株基因组DNA。

将冷冻保存的菌株MN-ZLW-002接种于M17液体培养基中，置37℃培养24小时，经M17培养液传代培养2-3次后，取1.5m1对数生长末期的菌体培养物，5000 rpm离心1分钟收集菌体，去尽培养液。在沉淀中加入500μL的TE缓冲液，用吸管反复吹打，使之重悬。然后加入50μL10% SDS (w/v)和10μL 10 mg/ml蛋白酶K，混匀，于55℃摇床过夜消化。再加入100μL 10 mol/L CTAB溶液(4.1g NaCl溶于80m1水中缓慢加入CTAB 10g)及100μL浓度为5mol/L NaCl溶液，混匀，65℃水浴保温10分钟，得到粗提取液。在此粗提取液中加入等体积(一般为700μL)的苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1，v/v )，颠倒混匀，12000 rpm离心5分钟；取上清，并加入等体积氯仿/异戊醇(24:1， v/v )，颠倒混匀，12000 rpm离心5分钟，弃下层。在所得到的上清液中，加入500μL预冷异丙醇，轻轻混合，直到DNA沉淀下来，室温下静止10分钟，12000 rpm离心5分钟，弃去上清，得到DNA沉淀。用lml 70%的乙醇(v/v)洗涤DNA沉淀1次。清除酒精，吸干DNA，加 100μL TE缓冲液溶解DNA，于55℃保温助溶，20分钟后取出冷却。加入5μL 4mg/ml RNase于37℃水浴30分钟。而后加入400μL TE缓冲液以及500μL 苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1，v/v)，颠倒混匀，12000 rpm离心5分钟；取上清，并加入等体积氯仿/异戊醇(24:1，v/v)，颠倒混匀，12000 rpm离心5分钟，弃下层。在所得到的上清液中，加入0.1倍体积3 M NaAC，轻轻混匀后加入500μL预冷异丙醇，轻轻混合，直到DNA沉淀下来，室温下静止10分钟，12000r pm离心5分钟，弃去上清，得到DNA沉淀。用1 ml 70%的乙醇(v/v)洗涤DNA沉淀1次。清除酒精，吸干DNA。最后用30-50μL灭菌去离子水溶解DNA，于55℃，保温20min，助溶后置于-20℃保存。

1.3目的片段的PCR扩增

PCR扩增体系：0.2μL Taq聚合酶(SU/μL，Takara Tokyo，Japan)，2.5μL 10×PCR缓冲液(不含Mg²⁺)，2 μL dNTP(各2.5 mM)，2μL MgCl₂(25mM)，0.2μL正向引物(50pM)，0.2μL反向引物(50pM)，1 μL DNA产物(100ng/μL)和17.4μL ddH20。

PCR扩增条件：97℃变性5分钟；95℃30秒→EpsA：50℃(EpsB：51℃、EpsC：50℃、EpsD：50℃)30秒→72℃1分钟，如此进行35次循环；72℃延伸10分钟，4℃保存。

1.4琼脂糖凝胶电泳检测

取PCR产物5μL，与1μL上样缓冲液混合均匀，点样于琼脂糖凝胶孔中，在另一孔中加入5μL DL2000 Marker，5V/cm电压下，电泳30分钟。电泳结束后，在凝胶成像系统上留取照片。

1.5目的基因片段回收与鉴定

片段回收按上海华舜小量胶回收试剂盒说明进行。在紫外灯下迅速将含目的片段条带的琼脂糖块割下，放入1.5m1的离心管中。按每100mg琼脂糖加入300-600μL S1液的比例加入S1液，置55℃水浴中10分钟，使琼脂糖块完全溶化，每2分钟颠倒混匀一次。加入1/3S1体积的异丙醇，混匀，55℃温浴1分钟。将溶化后的琼脂糖块移入吸附柱，离心1分钟。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集

管中。在吸附柱中加入450μL W1液，静置1分钟后，离心15秒。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。在吸附柱中加入450μL W1液，离心15秒后倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。离心1分钟。将吸附柱放入一个干净的1.5m1的离心管中，在吸附柱的中央加30μL T1液，静置1分钟后，离心1分钟。最后吸取2-4μL溶液，在紫外分光光度计上测定比值和浓度后，将1.5离心管中DNA贮存于-20℃下。

1.6目的基因片段的克隆与鉴定

1.6.1感受态细胞的制备

挑取JM109大肠杆菌原种，LB琼脂板上划线。过夜培养后挑取新鲜单菌落，接种到100m1 LB培养基中，37℃摇菌培养2-3小时(160转/分钟)，至OD₆₀₀达到0.4-0.5时将菌液移至灭菌预冷的100m1离心管中，冰浴10-15分钟。4000 rpm, 4℃离心10分钟，回收细菌沉淀。加入20m1经过过滤除菌并经预冷的0.1 M CaC1₂,悬浮细菌沉淀。冰浴10-15分钟后于4000 rpm，4℃离心10分钟，回收细菌沉淀。加入4m1 0.1 M CaC1₂悬浮细菌沉淀。该细胞可直接用于转化实验。加甘油至终浓度为15%-20%，混匀，每份分装成100μL于1.5m1 EP管中，冻存于-70 ℃冰箱中。

1.6.2回收片段与T载体的连接

连接用TaKaRa pMD 18-T Vector试剂盒。操作过程如下:

首先在EP管中制备下列连接反应液:

pMD 18-T Vector(50ng/μL) 0.5μL

DNA 20-40ng

溶液1 5μL

加dH₂O至 10μL

总计 10μL

将上述反应液在16℃反应过夜，产物用于转化感受态细胞。

1.6.3质粒的转化

从-70℃冰箱中取出保存的感受态细胞，冰浴助溶。将100μL感受态细胞加入10μL连接产物，冰浴30分钟后于42℃水浴热应激90秒钟，立即置入冰浴中2分钟。加入400μL液体LB培养基，37℃复活50分钟后取100μL铺于LB平板上，平板含0.1(V/V)的氨节青霉Amp(100mg/ml)，X-gal(100μg/ml)和IPTG(1mM)。最后于37℃恒温培养10-15小时。白色菌斑应含重组质粒。

1.6.4转化菌落的PCR鉴定与培养

用记号笔标记转化培养的单菌落，用灭菌的牙签蘸取白色单菌落。将牙签头放入在加有PCR反应液(不含模板)的EP管中晃动，进行PCR扩增。将PCR产物同标记物(Marker)一起进行琼脂糖凝胶电泳，鉴别T载体上是否含有目的片段。得到目的片段后，用灭菌枪头挑取在平板上的与之对应的单菌落，放入40m1含0.1 %(V/V)青霉素钠(100 mg/ml )的LB液体培养基中，37℃过夜摇菌培养，用于质粒回收和测序。

2、实验结果

经过测序得到以下Eps基因簇的部分序列。

EpsA

AGATGACGGAGATAATGACCGTGGTAAAAACCAGGAGAAAGTCATTTCTGCGATTGTAAACAAGTTGGCTTCTCTAAAGTCTGTATCAAACTTTACTTCAATCGTTAATAATCTCCAAGACTCTGTTCAGACAAATATTTCTTTGGATACCATTAATGCTTTGGCTAATACACAACTTGATTCAGGCTCTAAATTTACAGTAACGTCTCAAGCAGTAACTGGTA

EpsB

GCAGAAGCAGAAGCACTTTATCCAGACTTAACTATTTATTATGGAGGTGAACTTTATTACACCTTAGACATTGTGGAGAAACTTGAAAAGAATCTCATTCCGCGCATGCACAACACTCAATTTGCTTTGATTGAGTTTAGTGCTCGCACATCTTGGAAAGAAATTCATAGTGGGCTTAGTAATGTTTTGAGAGCGGGGGTAACGCCTATTGTTGCTCAT

EpsC

GAGTCACCATCTTCACCAAATATCAAACTTAATGTGCTTCTTGGGGCAGTGCTTGGAGGATTCCTTGCAGTGGTTGGTGTATTGGTACGTGAAATCCTAGATGATCGTGTTCGCCGTCCAGAAGATGTGGAAGATGCC

EpsD

AGTGGTTCTCAGTTCTTAGGGGTCGTCCTTAATAAAGTTGACATGACAGTTGATAAATATGGATCATATGGTTCTTACGGATCATATGGCGAGTATGGAAAAAAATCTAACCAAAAAGAAGGTCATTCAAGAGCACATCGTCGTA

3、结论

克隆得到的基因片段为Eps基因簇EpsA、EpsB、EpsC、EpsD的部分序列。其与GeneBank中登载的基因序列的同源性分别为92.9%、99.1%、100%和97.9%。

实施例3 : 嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus, MN-ZLW-002)Eps基因簇EpsA、EpsB、EpsC、EpsD的功能鉴定

1、实验方法

1.1 PCR引物设计与合成

EpsA：F: 5‘-ATGAGTTCGCGTACGAATC-3‘;

R: 5‘-AATCTGATGGAGGAAAAATAA-3‘

EpsB： F: 5‘-GTGATTGACGTTCACTCACA-3‘

R: 5‘-AGAAAATCAATATTTATAG-3‘

EpsC： F: 5‘-ATGAATCAAGATAACACTAAAA-3‘

R: 5‘-CCTGATACAGATAAAATTTAA-3‘

EpsD： F: 5‘-ATGCCTCTATTAAAGTTA-3‘

R: 5‘-CACATCGTCGTAGAAAAG-3‘

1.2嗜热链球菌DNA的提取。

采用CTAB法提取菌株基因组DNA。

1.3EpsA、EpsB、EpsC、EpsD全序列的PCR扩增

PCR扩增条件:97℃变性5分钟；95℃30秒→EpsA：49℃(EpsB：50℃、EpsC：50℃、EpsD：49℃)30秒→72℃1分钟，如此进行40次循环；72℃延伸15分钟，4℃保存。

1.4琼脂糖凝胶电泳检测

目的基因片段回收与鉴定、目的基因片段的克隆与鉴定方法同实施例2中的1.5和1.6

1. 5EpsA、EpsB、EpsC、EpsD基因敲除载体的构建

分析PLAFR3 ( GenBank Accession No.AY532632) 载体，tetR 和tetA 基因序列( Tc 基因) 没有AsuⅡ和BstEⅡ位点；分析获得的pGEM-T-EpsA(EpsB、EpsC、EpsD)内部含有1 个AsuⅡ和BstEⅡ位点，pGEM-T-easy 上没有AsuⅡ和BstEⅡ位点：设计含AsuⅡ和BstEⅡ酶切位点的引物( Tc1 和Tc2 ) 从PLAFR3载体扩增Tc 基因。分别用AsuⅡ和BstEⅡ完全酶切pGEM-T-EpsA(EpsB、EpsC、EpsD)和Tc 基因扩增产物，酶切片段连接，连接产物转化，重组质粒鉴定，获得质粒pGEM-T-EpsA(EpsB、EpsC、EpsD)-Tc、自杀载体pJQ200SK 多克隆位点含有1 个BamHⅠ位点，pGEM-T-EpsA(EpsB、EpsC、EpsD)-Tc 的内部没有BamHⅠ位点；设计含有BamHⅠ位点的引物Eps1 和Eps2从pGEM-T-EpsA(EpsB、EpsC、EpsD)-Tc扩增EpsA(EpsB、EpsC、EpsD)

-Tc。分别用BamHⅠ完全酶切pJQ200SK 和EpsA(EpsB、EpsC、EpsD)-Tc 扩增产物，酶切片段连接，连接产物转化，重组质粒鉴定，获得敲除质粒pJQ200SK- EpsA(EpsB、EpsC、EpsD)-Tc。

1. 6EpsA、EpsB、EpsC、EpsD基因敲除菌株的筛选

通过三亲本杂交的方法将敲除质粒pJQ200SK- EpsA(EpsB、EpsC、EpsD)-Tc 转入嗜热链球菌MN-ZLW-002中，敲除质粒上的EpsA(EpsB、EpsC、EpsD)-Tc与MN-ZLW-002 基因组中的EpsA(EpsB、EpsC、EpsD)发生同源重组，对MN-ZLW-002 EpsA(EpsB、EpsC、EpsD)进行敲除. 质粒pJQ200SK- EpsA(EpsB、EpsC、EpsD)-Tc 的复制子不能在嗜热链球菌菌中复制，因此在Gm 和Tc 选择压力下可以筛选到发生单交换的重组子；pJQ200SK- EpsA(EpsB、EpsC、EpsD)-Tc上有蔗糖敏感基因sacB，进而在7% 蔗糖平板上可筛选到发生双交换的重组子。

1.7基因敲除菌株胞外多糖产生量测定

分别吸取基因敲除菌株菌悬液，以2%接菌量接种于200mL 12%脱脂乳中。置于43℃条件下进行18小时过夜培养，在4℃条件下打冷5-8小时，打冷后利用苯酚硫酸法测定各样品的胞外多糖产量。

2、实验结果

2.1经过测序得到以下Eps基因簇的全序列及其编码的多肽序列

EpsA

ATGAGTTCGCGTACGAATCGTAAGCAAAAGCATACGAGTAATGGATCGTGGGGGATGGTCAACGTTGGGTTGACCATCCT

GTATGCTATTTTAGCATTGGTCTTATTATTCACCATGTTCAATTATAATTTCCTATCCTTTAGGTTTTTGAACATCATTA

TCACCATTGGTTTGTTGGTAGTTCTTGCTATTAGCATCTTCCTTCAGAAGACTAAGAAATCACCACTAGTGACAACGGTT

GTACTGGTTATCTTCTCGCTAGTTTCTCTGGTTGGTATTTTTGGTTTTAAACAAATGATTGACATTACTAACCGTATGAA

TCAGACGGCAGGATTTTCTGAAGTAGAAATGAGCATCGTGGTTCCTAAGGAAAGTGACATCAAAGATGTGAGCCAGCTTA

CTAGCGTACAGGCACCTACTAAGGTTGATAAGAACAATATCGAGATCTTGATGTCAGCTCTCAAAAAAGATAAAAAAGTT

GATGTTAAAGTTGATGATGTTGCCTCATATCAAGAAGCTTATGATAATCTTAAGTCTGGCAAATCTAAAGCTATGGTCTT

GAGTGGCTCTTATGCTAGCCTATTAGAGTCTGTCGATAGTAACTATGCTTCAAATCTAAAAACAATCTATACTTATAAAA

TTAAAAAGAAGAATAACAATTCTGCAAAACAAGTAGATTCAAAAGTCTTCAATATTTATATTAGTGGTATTGACACCTAC

GGTTCAATTTCAACAGTGTCACGTTCAGATGTCAATATCATTATGACCGTTAACATGAACACACATAAGATTCTCTTGAC

GACTACTTCACGTGATGCATACGTTAAGATTCCTGGTGGTGGGGCAAACCAGTATGATAAATTAACCCACGCAGGTATTT

ATGGCGTTGAAACATCTGAACAAACTCTGGAAAATCTTTATGGTATTAAGATTGATTACTATGCCCGAATTAACTTCACA

TCTTTCCTTAAGTTGATTGACCAACTTGGTGGTGTGACAGTCCATAATGATCAAGCTTTCACAAGTCTTCATGGGAAGTT

TGATTTCCCAGTTGGAGATATCCAAATGAATTCAGAGCAAGCACTTGGATTTGTTCGTGAACGCTATAGTTTAGATGACG

GAGATAATGACCGTGGTAAAAACCAGGAGAAAGTCATTTCTGCGATTGTAAACAAGTTGGCTTCTCTAAAGTCTGTATCA

AACTTTACTTCAATCGTTAATAATCTCCAAGACTCTGTTCAGACAAATATTTCTTTGGATACCATTAATGCTTTGGCTAA

TACACAACTTGATTCAGGCTCTAAATTTACAGTAACGTCTCAAGCAGTAACTGGTACAGGTTCAACCGGACAATTGACCT

CTTATGCTATGCCAAATTCTAGTCTTTACATGATGAAACTAGATAATTCGAGTGTGGCAAGAGCCTCTCAAGCTATCAAA

AATCTGATGGAGGAAAAATAA

EpsB

GTGATTGACGTTCACTCACATATTGTTTTTGATGTTGATGATGGTCCTAAAACTTTAGAAGAAAGTTTAGACCTCATTGG

TGAAAGTTACGCCCAGGGGGTACGTAAGATTGTTTCAACATCCCATCGTCGTAAGGGAATGTTTGAGACTCCAGAGGATA

AAATTTTTGCCAACTTTTCTAAGGTAAAAGCAGAAGCAGAAGCACTTTATCCAGACTTAACTATTTATTATGGAGGTGAA

CTTTATTACACCTTAGACATTGTGGAGAAACTTGAAAAGAATCTCATTCCGCGCATGCACAACACTCAATTTGCTTTGAT

TGAGTTTAGTGCTCGCACATCTTGGAAAGAAATTCATAGTGGGCTTAGTAATGTTTTGAGAGCGGGGGTAACGCCTATTG

TTGCTCATATTGAGCGCTATGATGCCCTCGAAGAAAATGCTGATCGTGTTAGAGAAATCATCAATATGGGCTGCTATACT

CAAGTCAATAGCTCACATGTCCTCAAACCAAAGCTCTTTGGAGATAAAGATAAAGTAGGAAAAAAACGTGTTCGTTATTT

CTTGGAGAAAAATTTGGTTCATATGGTTGCTAGTGACATGCATAATCTTGGTCCAAGACCACCATTTATGAAAGATGCTT

ATGAAATTGTTAAAAAGAACTACGGCTCCAAACGTGCTAAGAATCTTTTTATTGAAAATCCCAAAACATTACTAGAAAAT

CAATATTTATAG

EpsC

ATGAATCAAGATAACACTAAAAGTGATGAAATCGACGTACTAGCATTGCTACATAAACTTTGGACGAAGAAGCTTTTGAT

TCTTTTCACAGTTTTTTATTTCGCTGCTTTCAGTTTCTTAGGTACTTATTTCTTTATCCAACCAACATATACATCAACAA

CGCGTATCTATGTGGTTAATCAGGCAACAGATAATAAGAATCTTTCTGCTGAAGCTTTGCAGGCCGGTACATTTTTGACA

AAAGACTACAAAGAAATTATTACATTAAACGATGTCTTGTCAGAAGTTATCAAAGATGAAAAATTGAATATGACAGTAGC

AGAACTTGCTAAAATGATTTTAGTTGATAATCCTACTGATACTCGTCTTATTTCAATTTCTGTTAATGCTAAAACTGGTC

AAGATGCGCAAACACTTGCCAATAAGGTTCGTGAAGTTGCTTCAGAAAAAATCAAGAACGTGACAAAAGTTGAAGATGTT

ACAACGCTCGAAGAAGCTAAATTGCCAGAGTCACCATCTTCACCAAATATCAAACTTAATGTGCTTCTTGGGGCAGTGCT

TGGAGGATTCCTTGCAGTGGTTGGTGTATTGGTACGTGAAATCCTAGATGATCGTGTTCGCCGTCCAGAAGATGTGGAAG

ATGCCCTTGGAATGACACTTCTTGGAATTGTCCCTGATACAGATAAAATTTAA

EpsD

ATGCCTCTATTAAAGTTAGTAAAATCTAAAGTAAACTTTGCCAAACAAACAGAAGAGAATTACAATGCCATTCGCACAAA

TATTCAATTTTCTGGTGCTCAGATTAAAGTGATTGCGATTAGCTCTGTTGAAGCTGGTGAAGGAAAATCAACGACATCTG

TTAACTTGGCGATTTCATTTGCTAGTGTTGGGCTCCGAACACTTCTGATTGATGCTGATACGCGTAATTCTGTTTTGTCG

GGTACATTTAAATCAAATGAGCCTTATAAAGGTCTTTCAAATTTCCTTTCAGGAAATGCCGATCTAAATGAAACGATTTG

CCAAACTGATATTTCTGGTTTGGATGTTATTGCATCTGGTCCTGTTCCACCTAATCCAACAAGTCTTTTGCAAAATGACA

ATTTTAGACATTTGATGGAAGTTGCTCGTAGTCGTTATGATTATGTCATCATCGATACACCACCAATTGGTATGGTTATT

GATGCAGTTATTATTGCCCATCAGGCTGATGCCAGTCTTTTGGTTACAGAAGGTGGGAAAATCAAACGTCGTTTCGTAAC

TAAGGCCGTTGAACAATTGGAACAAAGTGGTTCTCAGTTCTTAGGGGTCGTCCTTAATAAAGTTGACATGACAGTTGATA

AATATGGATCATATGGTTCTTACGGATCATATGGCGAGTATGGAAAAAAATCTAACCAAAAAGAAGGTCATTCAAGAGCA

CATCGTCGTAGAAAAG

EpsA基因序列及氨基酸序列

ATGAGTTCGCGTACGAATCGTAAGCAAAAGCATACGAGTAATGGATCGTGGGGGATGGTCAACGTTGGGTTGACCATC

M S S R T N R K Q K H T S N G S W G M V N V G L T I

CTGTATGCTATTTTAGCATTGGTCTTATTATTCACCATGTTCAATTATAATTTCCTATCCTTTAGGTTTTTGAACATC

L Y A I L A L V L L F T M F N Y N F L S F R F L N I

ATTATCACCATTGGTTTGTTGGTAGTTCTTGCTATTAGCATCTTCCTTCAGAAGACTAAGAAATCACCACTAGTGACA

I I T I G L L V V L A I S I F L Q K T K K S P L V T

ACGGTTGTACTGGTTATCTTCTCGCTAGTTTCTCTGGTTGGTATTTTTGGTTTTAAACAAATGATTGACATTACTAAC

T V V L V I F S L V S L V G I F G F K Q M I D I T N

CGTATGAATCAGACGGCAGGATTTTCTGAAGTAGAAATGAGCATCGTGGTTCCTAAGGAAAGTGACATCAAAGATGTG

R M N Q T A G F S E V E M S I V V P K E S D I K D V

AGCCAGCTTACTAGCGTACAGGCACCTACTAAGGTTGATAAGAACAATATCGAGATCTTGATGTCAGCTCTCAAAAAA

S Q L T S V Q A P T K V D K N N I E I L M S A L K K

GATAAAAAAGTTGATGTTAAAGTTGATGATGTTGCCTCATATCAAGAAGCTTATGATAATCTTAAGTCTGGCAAATCT

D K K V D V K V D D V A S Y Q E A Y D N L K S G K S

AAAGCTATGGTCTTGAGTGGCTCTTATGCTAGCCTATTAGAGTCTGTCGATAGTAACTATGCTTCAAATCTAAAAACA

K A M V L S G S Y A S L L E S V D S N Y A S N L K T

ATCTATACTTATAAAATTAAAAAGAAGAATAACAATTCTGCAAAACAAGTAGATTCAAAAGTCTTCAATATTTATATT

I Y T Y K I K K K N N N S A K Q V D S K V F N I Y I

AGTGGTATTGACACCTACGGTTCAATTTCAACAGTGTCACGTTCAGATGTCAATATCATTATGACCGTTAACATGAAC

S G I D T Y G S I S T V S R S D V N I I M T V N M N

ACACATAAGATTCTCTTGACGACTACTTCACGTGATGCATACGTTAAGATTCCTGGTGGTGGGGCAAACCAGTATGAT

T H K I L L T T T S R D A Y V K I P G G G A N Q Y D

AAATTAACCCACGCAGGTATTTATGGCGTTGAAACATCTGAACAAACTCTGGAAAATCTTTATGGTATTAAGATTGAT

K L T H A G I Y G V E T S E Q T L E N L Y G I K I D

TACTATGCCCGAATTAACTTCACATCTTTCCTTAAGTTGATTGACCAACTTGGTGGTGTGACAGTCCATAATGATCAA

Y Y A R I N F T S F L K L I D Q L G G V T V H N D Q

GCTTTCACAAGTCTTCATGGGAAGTTTGATTTCCCAGTTGGAGATATCCAAATGAATTCAGAGCAAGCACTTGGATTT

A F T S L H G K F D F P V G D I Q M N S E Q A L G F

GTTCGTGAACGCTATAGTTTAGATGACGGAGATAATGACCGTGGTAAAAACCAGGAGAAAGTCATTTCTGCGATTGTA

V R E R Y S L D D G D N D R G K N Q E K V I S A I V

AACAAGTTGGCTTCTCTAAAGTCTGTATCAAACTTTACTTCAATCGTTAATAATCTCCAAGACTCTGTTCAGACAAAT

N K L A S L K S V S N F T S I V N N L Q D S V Q T N

ATTTCTTTGGATACCATTAATGCTTTGGCTAATACACAACTTGATTCAGGCTCTAAATTTACAGTAACGTCTCAAGCA

I S L D T I N A L A N T Q L D S G S K F T V T S Q A

GTAACTGGTACAGGTTCAACCGGACAATTGACCTCTTATGCTATGCCAAATTCTAGTCTTTACATGATGAAACTAGAT

V T G T G S T G Q L T S Y A M P N S S L Y M M K L D

AATTCGAGTGTGGCAAGAGCCTCTCAAGCTATCAAAAATCTGATGGAGGAAAAATAA

N S S V A R A S Q A I K N L M E E K *

EpsB基因序列及氨基酸序列

GTGATTGACGTTCACTCACATATTGTTTTTGATGTTGATGATGGTCCTAAAACTTTAGAAGAAAGTTTAGACCTCATT

V I D V H S H I V F D V D D G P K T L E E S L D L I

GGTGAAAGTTACGCCCAGGGGGTACGTAAGATTGTTTCAACATCCCATCGTCGTAAGGGAATGTTTGAGACTCCAGAG

G E S Y A Q G V R K I V S T S H R R K G M F E T P E

GATAAAATTTTTGCCAACTTTTCTAAGGTAAAAGCAGAAGCAGAAGCACTTTATCCAGACTTAACTATTTATTATGGA

D K I F A N F S K V K A E A E A L Y P D L T I Y Y G

GGTGAACTTTATTACACCTTAGACATTGTGGAGAAACTTGAAAAGAATCTCATTCCGCGCATGCACAACACTCAATTT

G E L Y Y T L D I V E K L E K N L I P R M H N T Q F

GCTTTGATTGAGTTTAGTGCTCGCACATCTTGGAAAGAAATTCATAGTGGGCTTAGTAATGTTTTGAGAGCGGGGGTA

A L I E F S A R T S W K E I H S G L S N V L R A G V

ACGCCTATTGTTGCTCATATTGAGCGCTATGATGCCCTCGAAGAAAATGCTGATCGTGTTAGAGAAATCATCAATATG

T P I V A H I E R Y D A L E E N A D R V R E I I N M

GGCTGCTATACTCAAGTCAATAGCTCACATGTCCTCAAACCAAAGCTCTTTGGAGATAAAGATAAAGTAGGAAAAAAA

G C Y T Q V N S S H V L K P K L F G D K D K V G K K

CGTGTTCGTTATTTCTTGGAGAAAAATTTGGTTCATATGGTTGCTAGTGACATGCATAATCTTGGTCCAAGACCACCA

R V R Y F L E K N L V H M V A S D M H N L G P R P P

TTTATGAAAGATGCTTATGAAATTGTTAAAAAGAACTACGGCTCCAAACGTGCTAAGAATCTTTTTATTGAAAATCCC

F M K D A Y E I V K K N Y G S K R A K N L F I E N P

AAAACATTACTAGAAAATCAATATTTATAG

K T L L E N Q Y L *

EpsC基因序列及氨基酸序列

ATGAATCAAGATAACACTAAAAGTGATGAAATCGACGTACTAGCATTGCTACATAAACTTTGGACGAAGAAGCTTTTG

M N Q D N T K S D E I D V L A L L H K L W T K K L L

ATTCTTTTCACAGTTTTTTATTTCGCTGCTTTCAGTTTCTTAGGTACTTATTTCTTTATCCAACCAACATATACATCA

I L F T V F Y F A A F S F L G T Y F F I Q P T Y T S

ACAACGCGTATCTATGTGGTTAATCAGGCAACAGATAATAAGAATCTTTCTGCTGAAGCTTTGCAGGCCGGTACATTT

T T R I Y V V N Q A T D N K N L S A E A L Q A G T F

TTGACAAAAGACTACAAAGAAATTATTACATTAAACGATGTCTTGTCAGAAGTTATCAAAGATGAAAAATTGAATATG

L T K D Y K E I I T L N D V L S E V I K D E K L N M

ACAGTAGCAGAACTTGCTAAAATGATTTTAGTTGATAATCCTACTGATACTCGTCTTATTTCAATTTCTGTTAATGCT

T V A E L A K M I L V D N P T D T R L I S I S V N A

AAAACTGGTCAAGATGCGCAAACACTTGCCAATAAGGTTCGTGAAGTTGCTTCAGAAAAAATCAAGAACGTGACAAAA

K T G Q D A Q T L A N K V R E V A S E K I K N V T K

GTTGAAGATGTTACAACGCTCGAAGAAGCTAAATTGCCAGAGTCACCATCTTCACCAAATATCAAACTTAATGTGCTT

V E D V T T L E E A K L P E S P S S P N I K L N V L

CTTGGGGCAGTGCTTGGAGGATTCCTTGCAGTGGTTGGTGTATTGGTACGTGAAATCCTAGATGATCGTGTTCGCCGT

L G A V L G G F L A V V G V L V R E I L D D R V R R

CCAGAAGATGTGGAAGATGCCCTTGGAATGACACTTCTTGGAATTGTCCCTGATACAGATAAAATTTAA

P E D V E D A L G M T L L G I V P D T D K I *

EpsD基因序列及氨基酸序列

ATGCCTCTATTAAAGTTAGTAAAATCTAAAGTAAACTTTGCCAAACAAACAGAAGAGAATTACAATGCCATTCGCACA

M P L L K L V K S K V N F A K Q T E E N Y N A I R T

AATATTCAATTTTCTGGTGCTCAGATTAAAGTGATTGCGATTAGCTCTGTTGAAGCTGGTGAAGGAAAATCAACGACA

N I Q F S G A Q I K V I A I S S V E A G E G K S T T

TCTGTTAACTTGGCGATTTCATTTGCTAGTGTTGGGCTCCGAACACTTCTGATTGATGCTGATACGCGTAATTCTGTT

S V N L A I S F A S V G L R T L L I D A D T R N S V

TTGTCGGGTACATTTAAATCAAATGAGCCTTATAAAGGTCTTTCAAATTTCCTTTCAGGAAATGCCGATCTAAATGAA

L S G T F K S N E P Y K G L S N F L S G N A D L N E

ACGATTTGCCAAACTGATATTTCTGGTTTGGATGTTATTGCATCTGGTCCTGTTCCACCTAATCCAACAAGTCTTTTG

T I C Q T D I S G L D V I A S G P V P P N P T S L L

CAAAATGACAATTTTAGACATTTGATGGAAGTTGCTCGTAGTCGTTATGATTATGTCATCATCGATACACCACCAATT

Q N D N F R H L M E V A R S R Y D Y V I I D T P P I

GGTATGGTTATTGATGCAGTTATTATTGCCCATCAGGCTGATGCCAGTCTTTTGGTTACAGAAGGTGGGAAAATCAAA

G M V I D A V I I A H Q A D A S L L V T E G G K I K

CGTCGTTTCGTAACTAAGGCCGTTGAACAATTGGAACAAAGTGGTTCTCAGTTCTTAGGGGTCGTCCTTAATAAAGTT

R R F V T K A V E Q L E Q S G S Q F L G V V L N K V

GACATGACAGTTGATAAATATGGATCATATGGTTCTTACGGATCATATGGCGAGTATGGAAAAAAATCTAACCAAAAA

D M T V D K Y G S Y G S Y G S Y G E Y G K K S N Q K

GAAGGTCATTCAAGAGCACATCGTCGTAGAAAAG

E G H S R A H R R R K

2.2 EpsA、EpsB、EpsC、EpsD敲除菌株Eps产量测定

表1 各基因敲除菌株Eps产量(mg/L)

	1	2	3	平均值±sd
					MN-ZLW-002	322	313	319	318.00±4.58
EpsA敲除菌株	45	49	47	47.00±2.00**
					EpsB敲除菌株	78	69	71	72.67±4.73**
EpsC敲除菌株	99	89	92	93.33±5.13**
					EpsD敲除菌株	100	104	98	100.67±3.06**

注：**代表相应菌株Eps产量与MN-ZLW-002比较差异极显著

3、结论

克隆得到的EpsA、EpsB、EpsC、EpsD的全序列，与GeneBank中登载的基因序列的同源性分别为95.1%、97.7%、95.4%和95.9%。

敲除EpsA、EpsB、EpsC、EpsD基因的菌株发酵12%脱脂乳所产生的胞外多糖含量均极显著低于MN-ZLW-002(未敲除基因)的胞外多糖产量，故克隆得到的EpsA、EpsB、EpsC、EpsD具有调控嗜热链球菌产生胞外多糖的能力。

<110> 申请人内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司

<120> 一种EPS基因簇EpsA、EpsB、EpsC、EpsD

<160> 6

<210> 1

<211> 3622

<212> DNA

<213> 嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus )

<400> 1

atgagttcgc gtacgaatcg taagcaaaag catacgagta atggatcgtg ggggatggtc 60

aacgttgggt tgaccatcct gtatgctatt ttagcattgg tcttattatt caccatgttc 120

aattataatt tcctatcctt taggtttttg aacatcatta tcaccattgg tttgttggta 180

gttcttgcta ttagcatctt ccttcagaag actaagaaat caccactagt gacaacggtt 240

gtactggtta tcttctcgct agtttctctg gttggtattt ttggttttaa acaaatgatt 300

gacattacta accgtatgaa tcagacggca ggattttctg aagtagaaat gagcatcgtg 360

gttcctaagg aaagtgacat caaagatgtg agccagctta ctagcgtaca ggcacctact 420

aaggttgata agaacaatat cgagatcttg atgtcagctc tcaaaaaaga taaaaaagtt 480

gatgttaaag ttgatgatgt tgcctcatat caagaagctt atgataatct taagtctggc 540

aaatctaaag ctatggtctt gagtggctct tatgctagcc tattagagtc tgtcgatagt 600

aactatgctt caaatctaaa aacaatctat acttataaaa ttaaaaagaa gaataacaat 660

tctgcaaaac aagtagattc aaaagtcttc aatatttata ttagtggtat tgacacctac 720

ggttcaattt caacagtgtc acgttcagat gtcaatatca ttatgaccgt taacatgaac 780

acacataaga ttctcttgac gactacttca cgtgatgcat acgttaagat tcctggtggt 840

ggggcaaacc agtatgataa attaacccac gcaggtattt atggcgttga aacatctgaa 900

caaactctgg aaaatcttta tggtattaag attgattact atgcccgaat taacttcaca 960

tctttcctta agttgattga ccaacttggt ggtgtgacag tccataatga tcaagctttc 1020

acaagtcttc atgggaagtt tgatttccca gttggagata tccaaatgaa ttcagagcaa 1080

gcacttggat ttgttcgtga acgctatagt ttagatgacg gagataatga ccgtggtaaa 1140

aaccaggaga aagtcatttc tgcgattgta aacaagttgg cttctctaaa gtctgtatca 1200

aactttactt caatcgttaa taatctccaa gactctgttc agacaaatat ttctttggat 1260

accattaatg ctttggctaa tacacaactt gattcaggct ctaaatttac agtaacgtct 1320

caagcagtaa ctggtacagg ttcaaccgga caattgacct cttatgctat gccaaattct 1380

agtctttaca tgatgaaact agataattcg agtgtggcaa gagcctctca agctatcaaa 1440

aatctgatgg aggaaaaata agtgattgac gttcactcac atattgtttt tgatgttgat 1500

gatggtccta aaactttaga agaaagttta gacctcattg gtgaaagtta cgcccagggg 1560

gtacgtaaga ttgtttcaac atcccatcgt cgtaagggaa tgtttgagac tccagaggat 1620

aaaatttttg ccaacttttc taaggtaaaa gcagaagcag aagcacttta tccagactta 1680

actatttatt atggaggtga actttattac accttagaca ttgtggagaa acttgaaaag 1740

aatctcattc cgcgcatgca caacactcaa tttgctttga ttgagtttag tgctcgcaca 1800

tcttggaaag aaattcatag tgggcttagt aatgttttga gagcgggggt aacgcctatt 1860

gttgctcata ttgagcgcta tgatgccctc gaagaaaatg ctgatcgtgt tagagaaatc 1920

atcaatatgg gctgctatac tcaagtcaat agctcacatg tcctcaaacc aaagctcttt 1980

ggagataaag ataaagtagg aaaaaaacgt gttcgttatt tcttggagaa aaatttggtt 2040

catatggttg ctagtgacat gcataatctt ggtccaagac caccatttat gaaagatgct 2100

tatgaaattg ttaaaaagaa ctacggctcc aaacgtgcta agaatctttt tattgaaaat 2160

cccaaaacat tactagaaaa tcaatattta tagatgaatc aagataacac taaaagtgat 2220

gaaatcgacg tactagcatt gctacataaa ctttggacga agaagctttt gattcttttc 2280

acagtttttt atttcgctgc tttcagtttc ttaggtactt atttctttat ccaaccaaca 2340

tatacatcaa caacgcgtat ctatgtggtt aatcaggcaa cagataataa gaatctttct 2400

gctgaagctt tgcaggccgg tacatttttg acaaaagact acaaagaaat tattacatta 2460

aacgatgtct tgtcagaagt tatcaaagat gaaaaattga atatgacagt agcagaactt 2520

gctaaaatga ttttagttga taatcctact gatactcgtc ttatttcaat ttctgttaat 2580

gctaaaactg gtcaagatgc gcaaacactt gccaataagg ttcgtgaagt tgcttcagaa 2640

aaaatcaaga acgtgacaaa agttgaagat gttacaacgc tcgaagaagc taaattgcca 2700

gagtcaccat cttcaccaaa tatcaaactt aatgtgcttc ttggggcagt gcttggagga 2760

ttccttgcag tggttggtgt attggtacgt gaaatcctag atgatcgtgt tcgccgtcca 2820

gaagatgtgg aagatgccct tggaatgaca cttcttggaa ttgtccctga tacagataaa 2880

atttaaatgc ctctattaaa gttagtaaaa tctaaagtaa actttgccaa acaaacagaa 2940

gagaattaca atgccattcg cacaaatatt caattttctg gtgctcagat taaagtgatt 3000

gcgattagct ctgttgaagc tggtgaagga aaatcaacga catctgttaa cttggcgatt 3060

tcatttgcta gtgttgggct ccgaacactt ctgattgatg ctgatacgcg taattctgtt 3120

ttgtcgggta catttaaatc aaatgagcct tataaaggtc tttcaaattt cctttcagga 3180

aatgccgatc taaatgaaac gatttgccaa actgatattt ctggtttgga tgttattgca 3240

tctggtcctg ttccacctaa tccaacaagt cttttgcaaa atgacaattt tagacatttg 3300

atggaagttg ctcgtagtcg ttatgattat gtcatcatcg atacaccacc aattggtatg 3360

gttattgatg cagttattat tgcccatcag gctgatgcca gtcttttggt tacagaaggt 3420

gggaaaatca aacgtcgttt cgtaactaag gccgttgaac aattggaaca aagtggttct 3480

cagttcttag gggtcgtcct taataaagtt gacatgacag ttgataaata tggatcatat 3540

ggttcttacg gatcatatgg cgagtatgga aaaaaatcta accaaaaaga aggtcattca 3600

agagcacatc gtcgtagaaa ag 3622

<210> 2

<211> 1204

<212> PROTEIN

<213> 嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus )

<400> 2

MSSRTNRKQK HTSNGSWGMV NVGLTILYAI LALVLLFTMF NYNFLSFRFL NIIITIGLLV 60

VLAISIFLQK TKKSPLVTTV VLVIFSLVSL VGIFGFKQMI DITNRMNQTA GFSEVEMSIV 120

VPKESDIKDV SQLTSVQAPT KVDKNNIEIL MSALKKDKKV DVKVDDVASY QEAYDNLKSG 180

KSKAMVLSGS YASLLESVDS NYASNLKTIY TYKIKKKNNN SAKQVDSKVF NIYISGIDTY 240

GSISTVSRSD VNIIMTVNMN THKILLTTTS RDAYVKIPGG GANQYDKLTH AGIYGVETSE 300

QTLENLYGIK IDYYARINFT SFLKLIDQLG GVTVHNDQAF TSLHGKFDFP VGDIQMNSEQ 360

ALGFVRERYS LDDGDNDRGK NQEKVISAIV NKLASLKSVS NFTSIVNNLQ DSVQTNISLD 420

TINALANTQL DSGSKFTVTS QAVTGTGSTG QLTSYAMPNS SLYMMKLDNS SVARASQAIK 480

NLMEEKVIDV HSHIVFDVDD GPKTLEESLD LIGESYAQGV RKIVSTSHRR KGMFETPEDK 540

IFANFSKVKA EAEALYPDLT IYYGGELYYT LDIVEKLEKN LIPRMHNTQF ALIEFSARTS 600

WKEIHSGLSN VLRAGVTPIV AHIERYDALE ENADRVREII NMGCYTQVNS SHVLKPKLFG 660

DKDKVGKKRV RYFLEKNLVH MVASDMHNLG PRPPFMKDAY EIVKKNYGSK RAKNLFIENP 720

KTLLENQYLM NQDNTKSDEI DVLALLHKLW TKKLLILFTV FYFAAFSFLG TYFFIQPTYT 780

STTRIYVVNQ ATDNKNLSAE ALQAGTFLTK DYKEIITLND VLSEVIKDEK LNMTVAELAK 840

MILVDNPTDT RLISISVNAK TGQDAQTLAN KVREVASEKI KNVTKVEDVT TLEEAKLPES 900

PSSPNIKLNV LLGAVLGGFL AVVGVLVREI LDDRVRRPED VEDALGMTLL GIVPDTDKIM 960

PLLKLVKSKV NFAKQTEENY NAIRTNIQFS GAQIKVIAIS SVEAGEGKST TSVNLAISFA 1020

SVGLRTLLID ADTRNSVLSG TFKSNEPYKG LSNFLSGNAD LNETICQTDI SGLDVIASGP 1080

VPPNPTSLLQ NDNFRHLMEV ARSRYDYVII DTPPIGMVID AVIIAHQADA SLLVTEGGKI 1140

KRRFVTKAVE QLEQSGSQFL GVVLNKVDMT VDKYGSYGSY GSYGEYGKKS NQKEGHSRAH 1200

RRRK 1204

<210> 3

<211> 1461

<212> DNA

<213> 嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus )

<400> 3

atgagttcgc gtacgaatcg taagcaaaag catacgagta atggatcgtg ggggatggtc 60

aacgttgggt tgaccatcct gtatgctatt ttagcattgg tcttattatt caccatgttc 120

aattataatt tcctatcctt taggtttttg aacatcatta tcaccattgg tttgttggta 180

gttcttgcta ttagcatctt ccttcagaag actaagaaat caccactagt gacaacggtt 240

gtactggtta tcttctcgct agtttctctg gttggtattt ttggttttaa acaaatgatt 300

gacattacta accgtatgaa tcagacggca ggattttctg aagtagaaat gagcatcgtg 360

gttcctaagg aaagtgacat caaagatgtg agccagctta ctagcgtaca ggcacctact 420

aaggttgata agaacaatat cgagatcttg atgtcagctc tcaaaaaaga taaaaaagtt 480

gatgttaaag ttgatgatgt tgcctcatat caagaagctt atgataatct taagtctggc 540

aaatctaaag ctatggtctt gagtggctct tatgctagcc tattagagtc tgtcgatagt 600

aactatgctt caaatctaaa aacaatctat acttataaaa ttaaaaagaa gaataacaat 660

tctgcaaaac aagtagattc aaaagtcttc aatatttata ttagtggtat tgacacctac 720

ggttcaattt caacagtgtc acgttcagat gtcaatatca ttatgaccgt taacatgaac 780

acacataaga ttctcttgac gactacttca cgtgatgcat acgttaagat tcctggtggt 840

ggggcaaacc agtatgataa attaacccac gcaggtattt atggcgttga aacatctgaa 900

caaactctgg aaaatcttta tggtattaag attgattact atgcccgaat taacttcaca 960

tctttcctta agttgattga ccaacttggt ggtgtgacag tccataatga tcaagctttc 1020

acaagtcttc atgggaagtt tgatttccca gttggagata tccaaatgaa ttcagagcaa 1080

gcacttggat ttgttcgtga acgctatagt ttagatgacg gagataatga ccgtggtaaa 1140

aaccaggaga aagtcatttc tgcgattgta aacaagttgg cttctctaaa gtctgtatca 1200

aactttactt caatcgttaa taatctccaa gactctgttc agacaaatat ttctttggat 1260

accattaatg ctttggctaa tacacaactt gattcaggct ctaaatttac agtaacgtct 1320

caagcagtaa ctggtacagg ttcaaccgga caattgacct cttatgctat gccaaattct 1380

agtctttaca tgatgaaact agataattcg agtgtggcaa gagcctctca agctatcaaa 1440

aatctgatgg aggaaaaata a 1461

<210> 4

<211> 732

<212> DNA

<213> 嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus )

<400> 4

gtgattgacg ttcactcaca tattgttttt gatgttgatg atggtcctaa aactttagaa 60

gaaagtttag acctcattgg tgaaagttac gcccaggggg tacgtaagat tgtttcaaca 120

tcccatcgtc gtaagggaat gtttgagact ccagaggata aaatttttgc caacttttct 180

aaggtaaaag cagaagcaga agcactttat ccagacttaa ctatttatta tggaggtgaa 240

ctttattaca ccttagacat tgtggagaaa cttgaaaaga atctcattcc gcgcatgcac 300

aacactcaat ttgctttgat tgagtttagt gctcgcacat cttggaaaga aattcatagt 360

gggcttagta atgttttgag agcgggggta acgcctattg ttgctcatat tgagcgctat 420

gatgccctcg aagaaaatgc tgatcgtgtt agagaaatca tcaatatggg ctgctatact 480

caagtcaata gctcacatgt cctcaaacca aagctctttg gagataaaga taaagtagga 540

aaaaaacgtg ttcgttattt cttggagaaa aatttggttc atatggttgc tagtgacatg 600

cataatcttg gtccaagacc accatttatg aaagatgctt atgaaattgt taaaaagaac 660

tacggctcca aacgtgctaa gaatcttttt attgaaaatc ccaaaacatt actagaaaat 720

caatatttat ag 732

<210> 5

<211> 693

<212> DNA

<213> 嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus )

<400> 5

atgaatcaag ataacactaa aagtgatgaa atcgacgtac tagcattgct acataaactt 60

tggacgaaga agcttttgat tcttttcaca gttttttatt tcgctgcttt cagtttctta 120

ggtacttatt tctttatcca accaacatat acatcaacaa cgcgtatcta tgtggttaat 180

caggcaacag ataataagaa tctttctgct gaagctttgc aggccggtac atttttgaca 240

aaagactaca aagaaattat tacattaaac gatgtcttgt cagaagttat caaagatgaa 300

aaattgaata tgacagtagc agaacttgct aaaatgattt tagttgataa tcctactgat 360

actcgtctta tttcaatttc tgttaatgct aaaactggtc aagatgcgca aacacttgcc 420

aataaggttc gtgaagttgc ttcagaaaaa atcaagaacg tgacaaaagt tgaagatgtt 480

acaacgctcg aagaagctaa attgccagag tcaccatctt caccaaatat caaacttaat 540

gtgcttcttg gggcagtgct tggaggattc cttgcagtgg ttggtgtatt ggtacgtgaa 600

atcctagatg atcgtgttcg ccgtccagaa gatgtggaag atgcccttgg aatgacactt 660

cttggaattg tccctgatac agataaaatt taa 693

<210> 6

<211> 736

<212> DNA

<213> 嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus )

<400> 6

atgcctctat taaagttagt aaaatctaaa gtaaactttg ccaaacaaac agaagagaat 60

tacaatgcca ttcgcacaaa tattcaattt tctggtgctc agattaaagt gattgcgatt 120

agctctgttg aagctggtga aggaaaatca acgacatctg ttaacttggc gatttcattt 180

gctagtgttg ggctccgaac acttctgatt gatgctgata cgcgtaattc tgttttgtcg 240

ggtacattta aatcaaatga gccttataaa ggtctttcaa atttcctttc aggaaatgcc 300

gatctaaatg aaacgatttg ccaaactgat atttctggtt tggatgttat tgcatctggt 360

cctgttccac ctaatccaac aagtcttttg caaaatgaca attttagaca tttgatggaa 420

gttgctcgta gtcgttatga ttatgtcatc atcgatacac caccaattgg tatggttatt 480

gatgcagtta ttattgccca tcaggctgat gccagtcttt tggttacaga aggtgggaaa 540

atcaaacgtc gtttcgtaac taaggccgtt gaacaattgg aacaaagtgg ttctcagttc 600

ttaggggtcg tccttaataa agttgacatg acagttgata aatatggatc atatggttct 660

tacggatcat atggcgagta tggaaaaaaa tctaaccaaa aagaaggtca ttcaagagca 720

catcgtcgta gaaaag 736

Claims

1.一种胞外多糖(EPS)基因簇EpsA、EpsB、EpsC、EpsD,

其特征在于所述基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种如SEQ ID NO:1所示核苷酸编码的多肽，其序列如SEQ ID NO：2所示。

3.EpsA基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

4.EpsB基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

5.EpsC基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

6.EpsD基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

7.权利要求1的胞外多糖(EPS)基因簇、权利要求3的EpsA基因、权利要求4的EpsB基因、权利要求5的EpsC基因或权利要求6的EpsD基因在筛选和改造乳酸菌中的应用。