CN101120013A - 通过在非病原性、非侵入性革兰氏阳性菌中异源表达和分泌复合多糖而有效产生病原性革兰氏阳性菌荚膜多糖的新方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了在非病原性、非侵入性革兰氏阳性细菌中异源表达、产生和/或分泌复合荚膜多糖的方法和手段。特别地，本发明提供了能够表达和/或分泌来自病原性菌种的异源复合多糖的非病原性、非侵入性革兰氏阳性细菌。这样的细菌和其中产生的多糖可用于本发明以提供用于接种疫苗的组合物，以治疗和预防感染性细菌疾病。

Description

通过在非病原性、非侵入性革兰氏阳性菌中异源表达和分泌复合多糖而有效产生病原性革兰氏阳性菌荚膜多糖的新方法

技术领域

本发明涉及生物学、特别是微生物学领域，以及细菌细胞中蛋白质和多糖的异源表达。本发明也涉及医学领域、特别是感染性疾病的治疗和预防、更特别地涉及疫苗接种领域。

背景技术

微生物多糖(PS)可以与细胞表面共价结合的荚膜多糖(CPS)、脂多糖(LPS)中的O-抗原的形式存在或者分泌为胞外多糖(EPS)，并且是可引起侵入性疾病的革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌病原体中的重要的毒力因子。许多侵入性细菌产生荚膜多糖，荚膜多糖是病原体侵入人体的重要的毒力因子。荚膜多糖是细胞表面发现的主要抗原，并频繁地用于制备疫苗。利用经常与蛋白质载体偶联和/或与激发免疫反应的佐剂结合的CPS进行疫苗接种，是一种保护人类抵抗由细菌性病原体(如肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)和流感嗜血杆菌b型(Haemophilusinfluenzae type b)(Hib))引起的感染性疾病的有力方法。

足量的安全、纯净和明确的多糖(这样的多糖不容易通过纯化或纯粹的有机合成而获得)，对于制备安全和具有成本效率的疫苗是重要的。因此，在非病原性、非侵入性细菌宿主细胞中异源制备荚膜多糖是纯化天然来源的CPS的替代性的、有效的、简单的、安全的和具有成本效率的方案。

已经对肺炎链球菌(也称为肺炎球菌)进行了相当多的有关CPS的研究。肺炎球菌是呼吸道感染、中耳炎和肺炎的常见起因。肺炎球菌性疾病的最严重的形式是肺炎、脑膜炎和败血症。肺炎链球菌引起疾病的能力明显与其多糖荚膜的表达相关，因为所有临床分离物均被有荚膜(Whatmore et al.，2000)，而自发性无被膜变体是无毒的(Velasco et al.，1995)。当前有至少九十种已知的肺炎链球菌的血清学上不同的荚膜类型(Henrichsen，1999)，各种的不同在于糖苷键中的糖组成(参见Weintraub(2003)综述)。

由于肺炎链球菌的抗药性菌株的播散，肺炎球菌感染的治疗已经变得更加复杂和昂贵。这已经推动了增进我们对荚膜生物合成的调节中涉及的机制的理解并开发预防肺炎球菌感染的有效疫苗的需要。荚膜多糖是免疫原性的并用作疫苗抗原。现在，市场上有基于纯化的多糖或其糖缀合物的几种疫苗(Weintraub，2003)。肺炎链球菌的抗原多样性使有效的肺炎球菌疫苗的开发复杂化。90多种迄今已知的肺炎球菌性血清型在其CPS产生和结构上差异很大。并且，荚膜多糖在幼儿中并不能可靠地引起保护性的和长久的免疫防护。因此，目前的肺炎球菌疫苗联合来自几种血清型的荚膜多糖，包括来自高达20种以上血清型的CPS。这样的多血清型疫苗是昂贵的并难以制备。这需要培养许多不同的病原性的和危险的肺炎链球菌血清型、分离并广泛纯化CPS、质量控制菌株和CPS分离物、以适当的或者需要的数量将其混合，并制成用于接种疫苗的组合物。

已经描述了通过含有至少一些血清型特异性cps基因的cps基因簇的DNA片段的同源重组，在另一血清型的肺炎球菌性细胞中制备特定血清型的肺炎球菌CPS(US 5,948,900)。

人们期望通过如在革兰氏阴性细菌中生物合成O-抗原多糖所述的相似路径来进行大多数肺炎球菌荚膜多糖的制备(Whitfield，1995)。通过糖基转移酶在细胞膜的细胞质侧的连续作用，将多糖重复单元组装在脂质载体上。一旦完成，重复单元通过重复单元转运蛋白穿过细胞膜转运，并聚合在生长的多糖链的还原端(Whitfield and Roberts，1999)，并共价连接到细胞壁(Srensen et al.，1990)。

编码荚膜生物合成的基因座具有盒式结构，所有血清型通用的调节基因位于编码产生特定荚膜结构所需的功能的基因的两侧。通用区域位于该簇中血清型特异性基因的上游，并编码CpsA、CpsB、CpsC和CpsD(Guidolin et al.，1994；Morona et al.，1997)。cpsA的准确功能仍是未知的，但在无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)中显示了CpsA作为转录激活子的功能(Cieslewicz et al.，2001)，并且肺炎链球菌中cpsA的突变导致荚膜量降低，但没有改变荚膜的尺寸分布(Bender et al.，2003)。近来表明，CpsB、CpsC和CpsD通过存在于CpsD中的酪氨酸残基上的可逆磷酸化事件参与了荚膜制备的调节(Bender and Yother，2001；Bender etal.，2003；Morona et al.，2003)。存在于非病原性乳酸乳球菌(Lactococcuslactis bacterium)(Van Kranenburg et al.，1997)以及其它非病原性革兰氏阳性细菌(例如保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)(Lamothe etal.，2002)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)(Stingele et al.，1996)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)(Kleerebezem et al.，2003)、马其顿链球菌(Streptococcus macedonicus)(Jolly et al.，2001)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)(Jolly et al.，2002)的编码多糖生物合成的位点也以相似方式组织。

病原性和侵入性肺炎球菌和非病原性、非侵入性乳球菌在由CPS或EPS基因簇生物合成多糖的机制方面分别具有共同的特征。先前表明，乳酸乳球菌通过引入仅三种血清型3生物合成基因(包括一种单一加工糖基转移酶)，能够产生含有二糖重复单元的相对简单的肺炎球菌血清型3多糖(WO98/31786，Gilbert et al.，2000)。简单的血清型3多糖的生物合成仅包括通过加工机制在UDP-葡萄糖和UDP-葡糖醛酸之间形成糖苷键的单一的糖基转移酶(Cartee et al.，2000)。在乳酸乳球菌中表达时，肺炎球菌血清型3的CPS仍然与乳酸乳球菌细胞结合。细胞结合妨碍了CPS从细菌细胞和细胞碎片快速分离。需要广泛的纯化，使得从细菌细胞或细菌物质纯化CPS变得更加困难和昂贵。

对迄今为止已表征的肺炎球菌cps位点的研究表明，除了肺炎球菌血清型3和37，CPS的生物合成是通过在荚膜多糖的聚合前形成脂质连接的前体单元进行的。这是由所谓的引导糖基转移酶的作用调节的(Kranenburg et al 1999)。与血清型3CPS形成对比，迄今为止，在非病原性和非侵入性细菌(例如乳球菌)中，通过任何方法都不能制备这些更加复杂的荚膜多糖。不能在非病原性和非侵入性革兰氏阳性宿主菌(例如乳球菌)中产生足量的复合肺炎球菌CPS，妨碍了用于制备抗病原性和/或侵入性革兰氏阳性细菌的肺炎球菌疫苗和其他疫苗的更好、更安全和更廉价的方法的开发。在重组非病原性和非侵入性革兰氏阳性细菌中异源表达革兰氏阳性CPS(例如肺炎球菌CPS)，将克服该问题。基于乳酸菌的制备方法具有易于升级、耐用、成本低、和由于不需通气因此很便利的优点。

因此，本发明的目的是在非病原性、非侵入性革兰氏阳性宿主菌中异源表达来自所有革兰氏阳性病原性和/或侵入性菌(例如肺炎链球菌)的复合CPS。本发明包括CPS的复合形式，其包括通过由脂质连接的中间体或脂质连接的前体单元合成的重复寡糖单元的聚合。

发明内容

本发明提供了一种能够表达异源的、复合的细菌CPS的革兰氏阳性细菌。本发明还涉及一种在这些非病原性和非侵入性革兰氏阳性宿主菌中表达编码复合CPS的基因簇的方法。本发明公开了适用于根据本发明的方法和用途的重组DNA载体。另一方面，本发明涉及一种异源制备和分离复杂的革兰氏阳性CPS、特别是肺炎球菌CPS的方法。在该方法中，由根据本发明的非病原性、非侵入性革兰氏阳性宿主菌通过使用根据本发明的DNA载体进行异源表达和合成而制备CPS，革兰氏阳性CPS、特别是肺炎球菌CPS便利地分泌到胞外空间和细菌培养基，使得CPS从宿主菌或培养基容易和便利地分离。又一方面，本发明提供了肺炎球菌CPS组合物、CPS的修饰形式、以及含有CPS或其修饰形式的疫苗的制备方法。这些组合物将证明特别适用于疫苗，能够在宿主中引起抵抗病原性、侵入性革兰氏阳性细菌的免疫反应。仅作为非限制性实施例，通过使用本发明的DNA载体和方法在乳酸乳球菌中表达复合肺炎球菌血清型14CPS来说明本发明。

本发明的详细描述

定义

基因簇是包括一组密切相关的基因的一段DNA，这些基因编码相同或相似的蛋白质，通常在同一染色体或质粒上聚集在一起，并且该族通常作为整体调节其表达和翻译。在细菌中，基因簇也称为操纵子：主要在原核生物中发现的包括启动子、操纵基因和几个结构基因的功能单元。所述结构基因通常编码几个功能上相关的酶，并且，尽管它们是作为一个(多顺反子)mRNA转录的，每一个均是独立地翻译的。在典型的操纵子中，操纵基因区起到开启或关闭mRNA合成的控制元件的作用。基因单元包括在操纵基因控制下的反馈系统，其中，当调节基因产生的阻遏物被封闭时，结构基因以mRNA的形式转录其信息。这里包括的通常是细菌操纵子的衰减子位点，在此调节转录终止。

本申请中定义的DNA载体可以是分子克隆领域已知的任何DNA载体，任何病毒、噬菌体、噬菌粒、粘粒、BAC、游离体或质粒。

本申请中序列相同性定义为通过序列比对确定的两个或多个氨基酸(多肽或蛋白质)序列、两个或多个核酸(多核苷酸)序列之间的关系。在本领域中，“相同性”也表示可能通过序列之间的匹配确定的氨基酸或核酸序列之间的序列相关度。两个氨基酸序列之间的“相似性”是通过比较一个多肽的氨基酸序列及其保守氨基酸取代基与第二个多肽序列确定的。“相同性”和“相似性”可以通过已知的方法容易地算出，包括但不限于Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，Oxford University Press，New York，1988；Biocomputing：Informatics andGenome Projects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis of Sequence Data，Part I，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis in MolecularBiology，von Heine，G.，Academic Press，1987；and Sequence AnalysisPrimer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，M Stockton Press，New York，1991；and Carillo，H.，and Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，48：1073(1988)中所述的那些方法。

确定相同性的优选方法设计为给出所测试的序列之间的最大匹配。在公众可获得的计算机程序中编码了确定相同性和相似性的方法。确定两序列之间的相同性和相似性的优选计算机程序方法包括例如GCG程序包(Devereux，J.，et al.，Nucleic Acids Research 12(1)：387(1984))、BestFit、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S.F.et al.，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)。BLAST X程序是由NCBI和其他来源(BLASTManual，Altschul，S.，et al.，NCBI NLM NIH Bethesda，MD 20894；Altschul，S.，et al.，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)可公开获得的。众所周知的Smith Waterman算法也可用来确定相同性。

用于多肽序列比对的优选参数包括以下各项：算法：Needleman andWunsch，J.Mol.Biol.48：443-453(1970)；比对矩阵：来自Hentikoff和Hentikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89：10915-10919(1992)的BLOSSUM62；空隙罚分：12；以及空隙长度罚分：4。可公开获得的使用这些参数的程序为来自位于威斯康星州麦迪逊的遗传学计算机小组的″Ogap″程序。前述参数为用于氨基酸比对的默认参数(末端空隙没有罚分)。用于核酸比对的优选参数包括以下各项：算法：Needleman andWunsch，J.Mol.Biol.48：443-453(1970)；比对矩阵：匹配＝+10，错配＝0；空隙罚分：50；空隙长度罚分：3。可获得的为来自位于威斯康星州麦迪逊的遗传学计算机小组的Gap程序。以上给出的为核酸比对的默认参数。

当用于表示给定的(重组)核酸或多肽分子和给定的宿主生物体或宿主细胞之间的关系时，术语“同源的”理解为表示自然界中该核酸或多肽分子是由相同物种、优选相同品种或株系的宿主细胞或生物体产生的。如果与宿主细胞同源，那么编码多肽的核酸序列可与不同于其天然环境中的另一启动子序列或者(如果可行的话)另一分泌信号序列和/或终止子序列可操作地连接。

当用于表示核酸序列之间的相关性时，术语“同源的”表示一个单链核酸序列可以与互补的单链核酸序列杂交。杂交度可取决于多个因素，包括本领域技术人员公知的序列之间相同性的量以及如温度和盐浓度的杂交条件。优选地，相同性的区域大于约5bp、更优选大于10bp。

如本申请中所用的，术语“启动子”是指位于相对于基因转录方向的上游起到调节一个或多个基因的转录的作用，并且结构上被依赖DNA的RNA聚合酶的结合位点、转录起始位点和任何其他的DNA序列的结合位点的存在所识别，所述结合位点包括但不限于转录因子结合位点、阻遏物和活化物蛋白结合位点以及本领域技术人员已知的直接或间接地调节来自启动子的转录的量的任何其他核苷酸序列。“组成型”启动子是在大多数环境和生理条件下有活性的启动子。“诱导型”启动子是仅在特殊环境条件或生理条件下有活性的启动子。

本申请中所用的术语“可操作地连接”是指在功能关系中多核苷酸元件的连接。当一个核酸置于与另一核酸序列的功能关系中时，该核酸是“可操作地连接”的。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么其是可操作地连接于编码序列。可操作地连接表示，被连接的DNA序列通常是邻接的，并且在有必要连接两个蛋白编码区的情况中是邻接的并位于读码框中。

疫苗：引起免疫系统对肿瘤或微生物(例如细菌或病毒)产生反应的一种或一组物质。疫苗可辅助对象的免疫系统识别和对抗感染，并破坏癌细胞或微生物或感染了病毒的细胞。一种疫苗(该词源于牛痘(vaccinia)，后者引起牛痘(cowpox)，接种后提供对天花的保护)用于使人类或动物的免疫系统准备好保护机体对抗特定病原体(通常是细菌、病毒或毒素)。根据准备对抗的感染体，疫苗可以是弱化的细菌或失去毒力的病毒，或类毒素(来自感染体的修饰的、弱化的毒素或颗粒)。免疫系统识别疫苗颗粒为外来的，破坏它们并“记忆”它们。当感染体的有毒版本出现时，免疫系统准备快速攻击，在感染体可以播散并增殖到大量之前中和感染体。弱化(弱化)的活疫苗用于抵抗结核病、狂犬病和天花，杀灭的感染体用于抵抗霍乱和伤寒；类毒素用于抵抗白喉和破伤风。

具体实施方式

在第一个实施方式中，本发明提供了一种非病原性、非侵入性的革兰氏阳性细菌，该菌包括：

a)第一异源DNA片段，其包含革兰氏阳性细菌菌种的荚膜多糖(CPS)血清型特异性基因，

b)第二DNA片段，其包含来自不同于a)中所述细菌的革兰氏阳性细菌的通用的调节基因以及引导糖基转移酶，

c)以及通过表达所述片段产生a)中所述菌种的异源多糖。特别地，本发明提供了表达产生复合型CPS的病原性和/或侵入性革兰氏阳性细菌菌种的异源血清型特异性cps基因的非病原性和/或非侵入性革兰氏阳性细菌。本说明书中所定义的复合CPS包括作为通过脂质连接的中间体合成的重复寡糖单元的聚合物在体内产生的CPS。更具体而言，复合荚膜多糖包括至少四个糖的重复多组分单元的聚合物。通过糖基转移酶的将单糖单元连接到脂质连接的中间体上的连续作用，重复单元在细胞内组装到脂质载体上。一旦完成，脂质连接的重复单元被跨膜转运，并通过聚合酶聚合。相反，简单型CPS(例如肺炎链球菌3和37血清型的CPS)包括单一的糖基转移酶(Arrecubieta et al.，1996；Llull et al.，2001)，该酶直接将单糖转移到生长的多糖链(Cartee et al.，2000)，而没有脂质连接的中间体的干预。另外，该糖基转移酶似乎跨膜转运生长的多糖链。

在优选的实施方式中，本发明提供了一种革兰氏阳性细菌，其将(至少部分)复合型多糖分泌到胞外空间、更优选分泌到培养基中。因此，一部分CPS可保留在宿主细胞的细胞膜中，然而，优选地，将大部分CPS分泌到培养基中，这对于(连续)制备或纯化目的特别有利。

优选地，表达异源复合型CPS的宿主菌选自非病原性和/或非侵入性革兰氏阳性细菌，包括乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、片球菌属(Pediococcus)、肉杆菌属(Carnobacterium)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、酒球菌属(Oenococcus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、嗜热链球菌(和其他本领域中已知的非病原性和/或非侵入性革兰氏阳性细菌。宿主菌细胞优选为革兰氏阳性细菌、更优选为属于以下各属的革兰氏阳性细菌：乳杆菌属、乳球菌属、明串珠菌属(Leuconostoc)、肉杆菌属、双歧杆菌属、芽孢杆菌属、链球菌属、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、酒球菌属、片球菌属、肠球菌属(Enterococcus)。最优选地，宿主菌细胞为属于以下菌种的细菌：嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、食淀粉乳杆菌(L.amylovorus)、巴伐利亚乳杆菌(L.bavaricus)、短乳杆菌(L.brevis)、干酪乳杆菌(L.caseii)、卷曲乳杆菌(L.crispatus)、卷曲乳杆菌(L.curvatus)、德氏乳杆菌(L.delbrueckii)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(L.delbrueckii subsp.Bulgaricus)、发酵乳杆菌(L.fermentum)、鸡乳杆菌(L.gallinarum)、加氏乳杆菌(L.gasseri)、瑞士乳杆菌(L.helveticus)、詹氏乳杆菌(L.jensenii)、约氏乳杆菌(L.johnsonii)、L.minutis、鼠乳杆菌(L.murinus)、类干酪乳杆菌(L.paracasei)、植物乳杆菌、桥乳杆菌(L.pontis)、路氏乳杆菌(L.reuteri)、L.sacei、唾液乳杆菌(L.salivarius)、旧金山乳杆菌(L.sanfrancisco)、乳杆菌亚种(Lactobacillus ssp.)、栖鱼肉杆菌(C.piscicola)、枯草芽孢杆菌、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、乳明串珠菌(Leuconoctoclactis)、明串珠菌亚种(Leuconostoc ssp)、乳酸乳球菌乳亚种(L.lactissubsp.Lactis)、乳酸乳球菌乳脂亚种(L.lactis subsp.Cremoris)、嗜热链球菌、双歧双歧杆菌(B.bifidum)、长双歧杆菌(B.longum)、婴儿双歧杆菌(B.infantis)、短双歧杆菌(B.breve)、青春双歧杆菌(B.adolescente)、动物(B.animalis)、鸡胚双歧杆菌(B.gallinarum)、大双歧杆菌(B.magnum)、嗜热双歧杆菌(B.thermophilus)。

血清型特异性序列优选来自产生如本申请中所定义的复合型CPS的革兰氏阳性细菌。优选地，血清型特异性基因来自下列属的病原性和/或侵入性革兰氏阳性CPS产生菌：链球菌属、葡萄球菌属、肠球菌属、芽孢杆菌属、利斯特氏菌属(Listeria)、棒状菌属(Corynebacterium)、梭菌属(Clostridium)、或者可以是革兰氏阳性病原体，例如与兽医领域(例如牲畜、宠物)相关的链球菌种。更具体而言，血清型特异性基因来自公知的革兰氏阳性病原体，例如，但不限于肺炎链球菌、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、变异链球菌(Streptococcus mutans)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、表皮链球菌(Streptococcus epidermidis)、格氏链球菌(Streptococcus gordonii)、缓症链球菌(Streptococcus mitis)、口腔链球菌(Streptococcusoralis)、马链球菌(Streptococcus equi)、炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)和金黄色葡萄球菌。

在本发明最优选的实施方式中，以及如实施例部分所示，本发明提供了产生来自异源血清型特异性基因的复合型CPS的非病原性和/或非侵入性革兰氏阳性细菌，所述基因来自产生复合型荚膜多糖的肺炎链球菌血清型。这些血清型包括迄今为止已知的所有肺炎链球菌血清型，除了血清型3、37和潜在的产生具有更简单的结构且生物合成不需要脂质连接的前体单元的连接的不同类型的CPS的其它肺炎球菌血清型。在本发明的实施方式中特别优选使用来自肺炎球菌血清型(丹麦命名法)1、2、4、5、6A、6B、7A、7B、7C、7F、8、9A、9L、9N、9V、10A、10B、10C、11A、11B、11C、11F、12B、12F、13、14、15F、15A、15B、15C、16F、16A、17F、17A、18A、18B、18C、19F、19A、19B、19C、20、21、22F、22A、23A、23B、24F、24A、24B、25F、25A、27、28F、28A、29、33F、33A、33B、33C、10F、11D、12A、18F、23F、31、32F、32A、33D、34、35F、35A、35B、35C、36、38、39、40、41F、41A、42、43、44、45、46、47F、47A、48的血清型特异性基因。

本发明的非病原性和/或非侵入性革兰氏阳性宿主菌包括并表达来自革兰氏阳性细菌的EPS或CPS基因簇的通用的调节EPS或CPS基因。优选地，所述通用的调节EPS或CPS基因至少包括通用的调节基因epsA(或cpsC)、epsB(或cpsD)以及任选的epsC(或cpsB)。优选地，通用的调节EPS或CPS基因也包括epsD或cpsE基因编码的、革兰氏阳性EPS或CPS基因簇的引导糖基转移酶(GTF)。

EpsA、EpsB、EpsC和EpsD同系物有几种特征。EpsC同系物通常含有保守的PHP(聚合酶和组氨醇磷酸酶)基序(Aravind和Koonin，1998)。EpsA同系物含有两个保守的跨膜片段，而EpsB含有保守的核苷酸结合基序(Fath和Kolter，1993)。磷酸糖基转移酶例如EpsD可以因存在先前(Wang et al.，1996；Van Kranenburg et al.1999)所述的保守的A、B和C构件而得以识别。该糖基转移酶(GTF)将第一个糖连接到脂质载体(最可能为十一异戊烯磷酸酯)上，并且在革兰氏阳性细菌中保守(至少30％的相同性)，因此命名为引导糖基转移酶。

优选地，根据本发明的革兰氏阳性宿主细胞表达的epsA基因编码的蛋白质与乳酸乳球菌EpsA至少具有20、30、40、50、60、70、80或90％的氨基酸相同性，epsB或epsC编码的蛋白质与乳酸乳球菌EpsB至少具有20、30、40、50、60、70、80或90％的氨基酸相同性，而epsD编码的蛋白质与乳酸乳球菌EpsD至少具有30、40、50、60、70、80或90％的氨基酸相同性。在序列表中SEQ ID No 1-4分别提供了乳酸乳球菌EpsA、EpsB、EpsC和EpsD的氨基酸序列，并由Van Kranenburg etal.(1997)等公开。EpsA、EpsB、EpsC和EpsD的Swiss-Prot数据库编号分别为O06029、O06030、O06031、O06032。

在另一方面，本发明提供了一种能够在非病原性和/或非侵入性革兰氏阳性细菌宿主细胞中使得革兰氏阳性复合CPS血清型特异性基因发生异源表达的DNA载体。该DNA载体包括编码革兰氏阳性复合CPS血清型特异性cps基因的DNA片段，其中，一个或多个cps基因选自来自荚膜多糖基因簇的血清型特异性基因。

所述血清型特异性基因位于多糖生物合成基因簇中的通用调节基因下游紧邻的20kb区域内。血清型特异性区域通常编码糖基转移酶，该酶是具有9-14个推定的跨膜节段的高度疏水性聚合酶，以及一种参与重复单元的转运的、通常含有12-14个跨膜结构域的蛋白质。由血清型特异性区域编码的糖基转移酶可为核苷酸二磷酸糖、核苷酸单磷酸糖和糖磷酸酯(EC 2.4.1.x)，并且可分入如Campbell et al.，(1997)最早所述的不同的基于序列的家族中。

任选地并优选地包含血清型特异性cps基因的DNA序列的血清型特异性片段不含有引导糖基转移酶编码基因。根据本发明的载体可含有或不含有或提供表达通用的调节eps/cps基因。优选地，含有革兰氏阳性血清型特异性cps基因的本发明的DNA载体不包括功能性通用调节eps/cps基因，且不提供epsA/cpsC、epsB/cpsD、epsC/cpsB和/或epsD/cpsE的基因表达。

在根据本发明的载体中表达的血清型特异性基因可选自cpsE、cpsF、cpsG、cpsH、cpsI、cpsJ、cpsK、cpsL或其同系物。优选地，在根据本发明的DNA载体中克隆所有产生CPS的基因簇的血清型特异性基因，并表达所有对于产生CPS至关重要的血清型特异性基因。所述载体可以是本领域中已知的任何DNA载体，例如噬菌体或病毒、噬菌粒、粘粒或BAC(细菌人工染色体)载体，并优选为质粒。适于同源重组、基因置换和/或基因组整合的载体也包含在本发明的范围内。血清型特异性基因也可表达自一种宿主细胞内的几种不同的载体，例如，以克服所选DNA载体的克隆大小限制。载体元件(例如转录调节序列、载体骨架、可选择标记编码序列、复制起始子、增强子元件等)的选择取决于待实行转录和翻译的宿主细胞，并且易于被技术人员确认。原则上，可以使用任何在宿主细胞中有活性的转录调节元件，并且其可与宿主细胞同源或异源。为了在原核细胞(例如革兰氏阳性细菌)中有效地转录，优选应使用原核转录调节序列，而为了在真核宿主细胞中转录和翻译，优选使用宿主细胞来源的启动子。特别优选强的组成型启动子和在诱导下的强诱导型启动子。

在本发明高度优选的实施方式中，血清型特异性cps基因通过聚合重复的脂质连接的前体寡糖单元由产生如本文中先前定义而合成的复合CPS的产生CPS的肺炎链球菌血清型得到。此类血清型特异性基因可由肺炎球菌血清型(丹麦命名法))1、2、4、5、6A、6B、7A、7B、7C、7F、8、9A、9L、9N、9V、10A、10B、10C、11A、11B、11C、11F、12B、12F、13、14、15F、15A、15B、15C、16F、16A、17F、17A、18A、18B、18C、19F、19A、19B、19C、20、21、22F、22A、23A、23B、24F、24A、24B、25F、25A、27、28F、28A、29、33F、33A、33B、33C、10F、11D、12A、18F、23F、31、32F、32A、33D、34、35F、35A、35B、35C、36、38、39、40、41F、41A、42、43、44、45、46、47F、47A、48得到，并且是特别优选的。

在本发明的优选实施方式中，DNA载体中的血清型特异性cps基因是在EPS或CPS基因簇调节序列的转录调节下。所述EPS或CPS基因簇调节序列可以来自不同于得到血清型特异性基因的基因簇，并且优选为来自所用的非病原性和/或非侵入性革兰氏阳性细菌宿主细胞的EPS或CPS基因簇调节序列，和/或自其得到通用的调节eps或cps基因的基因簇。

在另一优选实施方式中，血清型特异性cps基因包含于革兰氏阳性EPS或CPS基因簇调节序列调节下的多顺反子转录单元，所述调节序列任选地置换或部分置换该簇中的血清型特异性cps或eps基因。然而，除了EPS或CPS基因簇调节序列，也可以有利地应用本领域中已知的其它细菌、病毒、人工或甚至哺乳动物的调节序列，例如启动子、增强子、衰减子、绝缘子(insulators)、终止子。克隆和细菌转化法、DNA载体和调节序列的使用是本领域技术人员公知的，并且例如可见于Current Protocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel et al，WileyInterscience，2004，以引用的方式并入本文。

优选地，通过本领域已知的方法(例如转化或转导)，将包含革兰氏阳性血清型特异性基因的DNA载体转入与DNA载体中的血清型特异性cps基因属于不同菌种或血清型的非病原性、非侵入性革兰氏阳性宿主菌。

在另一方面，本发明提供了一种在非病原性、非侵入性革兰氏阳性细菌中异源制备复合荚膜多糖(CPS)的方法，该方法包括步骤：

a)在有助于产生CPS的条件下，培养包含本发明的载体和/或DNA片段的本发明的细菌，

b)从细菌细胞回收产生的复合型CPS。

在优选的实施方式中，由非病原性和/或非侵入性革兰氏阳性细菌宿主细胞制备的CPS分泌到胞外环境中，而不是或仅部分保留在细胞膜中，使得制得的胞外多糖从细菌培养基被回收。纯化EPS/CPS的方法是本领域已知的，并且例如可见于Looijesteijn and Hugenholtz(1999)或

et al.(2003)。

在又一实施方式中，本发明提供了包含荚膜多糖、优选来自病原性和/或侵入性革兰氏阳性细菌的荚膜多糖的药物组合物，所述荚膜多糖由根据本发明的非病原性和/或侵入性革兰氏阳性细菌宿主细胞产生并获得。

在第一实施方式中，根据本发明的药物组合物或营养组合物可包含有活力形式(例如生命衰减的)或无活力形式(例如福尔马林处理的热处理)的根据本发明的非病原性和/或非侵入性细菌细胞。包含所述细菌的药物学上可接受的组合物可包含一种或多种本领域已知的赋形剂或免疫原性佐剂。药物学上可接受的佐剂对于技术人员是已知的，并且可见于如Remmington′s Pharmaceutical Sciences，18 th ed.Mack PublishingCompany，1990和Current Protocols in Immunology，Edited by：John E.Coligan.Wiley Interscience，2004的教科书。

在另一实施方式中，根据本发明的药物学上可接受的组合物可包含分离的和/或纯化的复合多糖、优选病原性和/或侵入性革兰氏阳性细菌的荚膜多糖(例如如本文中所述的由非病原性、非侵入性革兰氏阳性细菌宿主细胞中产生并获得的肺炎球菌CPS)。根据本发明的药物组合物可进一步包含一种或多种接种疫苗或免疫领域已知的赋形剂和/或免疫原性佐剂。

优选地，根据本发明的药物组合物为适于用作接种疫苗或免疫目的的组合物。在一种实施方式中，在这样的组合物或疫苗中，CPS分子共价连接于免疫学分子(例如抗原蛋白质，包括例如破伤风类毒素、白喉类毒素、脑膜炎球菌外膜蛋白、白喉蛋白CRM₁₉₇和其他本领域中已知的免疫学分子)。适于应用于根据本发明的组合物中的免疫原性蛋白质和佐剂分子为polyIC、LPS、Lipid A、Poly-A-poly-U、GERBU、RIBI、Pam3、Specol、Freunds、Titermax和其它本领域中已知并使用的分子。

包含由根据本发明的非病原性和/或非侵入性革兰氏阳性细菌的组合物和疫苗可以根据接种疫苗领域已知的方法经口或鼻内或静脉内给药。根据本发明的肺炎球菌疫苗例如可如US 6,224,880所述给药，并在此作为参考。

附图说明

图1：用于在乳酸乳球菌中产生多糖的质粒的示意图。板A：pNZ4030质粒的B40eps基因簇；Peps，eps基因簇的启动子。板B：从pNZ4030框内缺失epsABCD，通过NcoI消化切除所得的基因簇，连接到NcoI-消化的pIL253中，得到pNZ4220。板C：通过BamHI消化切除epsEFGHIJKLorfY基因，并以包含cps14FGHIJKL的6.8kb片段置换，得到pNZ4230。指示了用于克隆PCR扩增的cps14基因的HindIII限制酶切位点(“材料和方法”中描述)。板D：含有B40eps(pNZ4206)和cps14(pNZ4237)调节基因并在乳链菌肽诱导型的启动子的调节下的质粒，以及本研究中所用的几种衍生构建体(详见“材料和方法”部分)。

图2：乳酸乳球菌中制备的血清型14PS的免疫检测。将10μl诱导的或非诱导的细胞的培养物上清和10μl诱导的细胞悬液点到硝酸纤维素膜上，并用血清型14特异性抗血清检测。乳酸乳球菌具有pNZ4220和pNZ4206(1道)；pNZ4230(2道)；pNZ4230+pNZ4206(3道)；pNZ4230+pNZ4209(4道)；pNZ4230+pNZ4208(5道)；pNZ4230+pNZ4235(6道)；pNZ4230+pNZ4237(7道)；pNZ4230+pNZ4238(8道)；pNZ4230+pNZ4221(9道)。

图3：板A.由肺炎链球菌血清型14纯化的多糖的NMR谱。板B.由表达pNZ4230和pNZ4206的乳酸乳球菌纯化的多糖的NMR谱。

图4：在产生B40多糖和肺炎球菌血清型14多糖的乳酸乳球菌中的EpsB或Cps14D蛋白的酪氨酸磷酸化。板A.具有与pNZ4206(1道)、pNZ4209(2道)、pNZ4208(3道)、pNZ4237(4、5道)、pNZ4235(6、7道)、pNZ4238(8道)、pNZ4221(9道)结合的pNZ4230的乳酸乳球菌的细胞提取物。细胞或者以1ng/ml乳链菌肽诱导(1、2、3、4、6、8、9道)，或者未诱导(5、7道)。板B.具有与pNZ4206(1道)、pNZ4209(2道)、pNZ4208(3道)、pNZ4237(4、5道)、pNZ4235(6、7道)、pNZ4238(8道)、pNZ4221(9道)结合的pNZ4220的乳酸乳球菌的细胞提取物。细胞或者以1ng/ml乳链菌肽诱导(1、2、3、4、6、8、9道)，或者未诱导(5、7道)。通过以抗磷酸酪氨酸的小鼠单克隆抗体使用Western免疫印迹法检测酪氨酸磷酸化的蛋白质。

实施例

实施例1：乳酸乳球菌中肺炎链球菌血清型14CPS的合成和分泌材料和方法

菌株和培养条件

本研究中所用的所有菌株和质粒列于表1中。乳酸乳球菌于30℃下不通气培养于添加了0.5％(wt/vol)葡萄糖的M17肉汤(Merck，Darmstadt，Germany)中，或培养于添加了2％(wt/vol)葡萄糖的化学定义培养基(Looijesteijn and Hugenholtz，1999)中。用作克隆宿主的大肠杆菌(Escherichia coli)于37℃下不通气培养于Trypton-Yeast(TY)肉汤(Sambrook et al.，1989)。适宜时，培养基加入红霉素(5μg/ml)、氯霉素(5μg/ml)、或四环素(2.5μg/ml)。

表1：所用菌株和质粒

菌主或质粒	相关性质	参考文献
			菌株
L.lactisNZ9000E.coli E10	MG1363 pepN::nisRK	Kuipers et al.，1998
			质粒
pNZ4130pNZ84pIL253_NcolpNZ124pUC18erypNZ8148pNZ8020pNZ4222pNZ4200pNZ4220pNZ4206pNZ4231pNZ4209pNZ4208pNZ4090pNZ4233pNZ4235pNZ4237pNZ4221pNZ4238pMK104pNZ84cpsF-JpNZ84cpsJ-LpNZ84cpsF-LpNZ4230	TetR，具有B40 eps基因簇的pNZ4000衍生物CmR，pACYC184衍生物，E.coli的克隆载体EryR，乳球菌克隆和表达载体CmR，乳球菌克隆载体AmpR，EryRCmR，乳球菌克隆和表达载体CmR乳球菌克隆和表达载体EryR，在B40 eps基因簇中缺失epsABCD的载体携带框内缺失epsABCD的pNZ4130衍生物携带来自pNZ4200的ΔepsABCD eps基因簇的pIL253_Ncol衍生物携带epsABCD的pNZ8148衍生物携带cps14B的pNZ8020衍生物具有EpsBΔYYYY的pNZ4206衍生物pNZ4206ΔepsCCmR，携带cps14′EF′的pNZ8020衍生物CmR，具有cps14CD的pNZ8020衍生物含有cp14CDE的pNZ4233衍生物含有cp14BCDE的pNZ4235衍生物含有epsABC和cps14E的pNZ8148衍生物含有5′-端平截cps14E的pNZ4237衍生物具有cps14CD的pBlueScript II KS衍生物CmR，具有cps14FGHIJ′的pNZ84衍生物CmR，具有cps14J′KL的pNZ84衍生物CmR，具有cps14FGHIJKL的pNZ84衍生物EryR，具有B40 eps启动子调控下的cps14FGHIJKL基因的pNZ4220衍生物	Boels et al.，2001Van Alen-Boerrigter et al.，1991Boels et al.，2003Platteeuw et al.，1993Van Kranenburg et al.，1997参考文献De Ruyter et al.，1996本研究本研究本研究Nierop Groot et al.，2004本研究Nierop Groot et al.，2004Nierop Groot et al.，2004Van Kranenburg et al.，1999本研究本研究本研究本研究本研究Kolkman et al.，1997本研究本研究本研究本研究

DNA操作和序列分析

如Sambrook et al.，(1989)所述进行大肠杆菌质粒DNA的小规模分离和标准重组DNA技术。

对于大肠杆菌的大规模质粒分离，按照制造商的说明书使用JetStar柱(Genorned GmbH，Bad Oberhausen，Germany)。如前所述(de Vos et al.，1989)进行乳酸乳球菌质粒DNA的分离和转化。

质粒的构建

构建了含有epsABCD基因的框内缺失的B40 eps质粒pNZ4130的衍生物。使用引物组合EPSRF1/EPSAR1和EPSDF2/EPSFR2、pNZ4030作为模板以及Pwo聚合酶(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany)，通过PCR得到1kb扩增子。用XbaI/BamHI(片段1)或KpnI/BamHI(片段2)消化两个得到的PCR产物，并在单个连接步骤中克隆于用XbaI/KpnI消化的pUC18中，得到pNZ4222。将质粒pNZ4222转化到乳酸乳球菌NZ9000(pNZ4130)，并在含有红霉素和四环素的平板上筛选单一的交换质粒整合体。由epsRA位点上的整合得到一个单一的Ery^R/Tet^R集落。在仅含有四环素的培养基中培养该整合体，并在通过在含有四环素或红霉素和四环素的GM17平板上复制40代后筛选Tet^R集落。得到了对红霉素敏感(Ery^S)并失去粘性表型的单一集落。通过PCR和Southern印迹证实了缺失了正确的区域，并将质粒命名为pNZ4200。另外，使用引物EPSANCOI和EPSFR2由pNZ4200扩增了0.9kb的片段，测序该片段，以证实缺失是在框内的。

通过增加编码多糖生物合成基因的拷贝数可以提高乳酸乳球菌中多糖产生(Boels et al.，2003)。因此，来自含有eps启动子的质粒pNZ4200的整个ΔepsABCD基因簇克隆到高拷贝载体pIL253上。这是通过从pNZ4200切除14kb ΔepsABCD基因簇作为NcoI片段，然后在携带NcoI位点的pIL253中克隆该片段实现的(Boels et al.，2003)。所得质粒命名为pNZ4220。

在两个单独的PCR反应中由肺炎链球菌血清型14的基因组DNA扩增编码cps14FGHIJKL基因的6.8kb片段。在以下PCR条件下使用引物cps14Jf和rev-cps14L以及Platinum聚合酶(Invitrogen)扩增编码cps14JKL的PfxA 3.1kb片段：94℃下15s，46℃下30s，68℃下4.5min。使用引物FWD-CPS14F和CPS14Jr以及以下PCR程序得到编码cps14FGHIJ的3.9kb扩增子：94℃下15s、40℃下1min、68℃下4.5min。用BamHI(在引物FWD-CPS14F和REV-CPS14L中引入位点)和HindIII(位点存在于cps14J基因)进行消化，在pNZ84中亚克隆两个PCR片段，分别得到pNZ84cpsF-J和pNZ84cpsJ-L，并通过测序证实了插入物。两个片段再分离为BamHI/HindIII片段，并且在一个连接反应中克隆入BamHI-消化的pNZ84，得到了pNZ84cpsF-L。通过用BamHI消化从pNZ84cpsF-L重分离编码cps14FGHIJKL基因的6.8kb片段，并通过在相似地消化的pNZ4220中克隆引入乳酸乳球菌，得到pNZ4230。通过PCR和pNZ4230的消化证实了cps14基因的正确方向。

在不同的质粒上克隆cps14基因簇的cps14BCDE基因。因此，通过用SphI和XbaI消化，从pMK104切除了含有cps14CD基因和平截cps14B(5′端平截)基因和cps14E(3′端平截)基因的1kb片段，并克隆入pNZ8020，得到pNZ4233。通过用XbaI(位点存在于cps14E基因和pNZ4090的多克隆位点)消化从pNZ4090切除cps14E的3′端，并克隆入pNZ4233。所得质粒命名为pNZ4235。使用引物CPS14Bf和CPS14Br从染色体肺炎链球菌DNA扩增cps14B基因。用EcoRI/KpnI消化该PCR产物，并克隆入相似地消化的pNZ8020，得到pNZ4231。使用存在于cps14B基因中的内部SacI限制酶切位点和来自pNZ4231的多克隆位点的BamHI位点，将cps14B的5′端引入pNZ4235作为0.6kb的片段，得到pNZ4237。为了构建pNZ4238，使用引物CPS14Deco和PEPS054f以及Pwo聚合酶从pNZ4237扩增了含有cps14BCD的2.2kb PCR片段。然后，将该扩增子克隆入携带平截cps14E基因的SmaI位点pNZ4090，并通过PCR证实插入物的正确方向。通过Ecl136II消化和随后从pNZ4206除去415bp epsD片段，以及在Ecl136II-消化的质粒中插入cps14EPCR片段(引物CPS14EF/CPS14ER)，构建了质粒pNZ4221。

表2：本研究中所用的寡核苷酸

	寡核苷酸序列(5′→3′)
		EPSRF1EPSAR1EPSFR2EPSDF2EPSANcoICPS14DecoPEPS054FCPS14BfCPS14BrFWD-CPS14FREV-CPS14LCPS14JfCPS14JrCPS14EFCPS14ER	ATTCTAGATTGAATCAAGTGGTAAATCTGCCCATCTGGATCCATACTTTGACGCGAATAATTTTAAAAATCCCTCATGGTACCTGACATAGTGTATTGGCTCGGTCAAAGTATGGATCCAGATGGAGCTCTATTATCTCCAGTACCCGGAATTCAAGGAGGCACTCACCATGGAGGAAACACAGGAACAGGTTTGAATTCCTTTCCTAAGTTATTTTTTACCAAGTATTTCGCTATGTACACCACGGTACCGTAGTTAAAGCAGCTATACAGGCCGAATTCATAGTTGCAATACATCGATTTCCCAATGGATCCGCGGCCGTAGTAAAATAACCAGCCGGATCCTCTCCATATCCTCTACCACCCTAGATTCTGGGGAAGTATCCATTGATACCCTTTTACAGTCCCCGCTTCCTATGGAAATTATGGCGCTTCCTATGGAAATTATGG

在寡核苷酸序列中加下划线的碱基对表示引入的限制酶切位点。

免疫印迹分析

在细胞沉淀中分析血清型14多糖产生，在M17培养基(2％葡萄糖)中通过使用免疫检测将乳酸乳球菌培养物的上清培养至OD₆₀₀为0.15，等分试样为两份培养物，其中一份以1ng/ml乳链菌肽诱导。诱导和未诱导的培养物均培养过夜，通过离心沉淀细胞。用滴管吸取10μl上清液至硝酸纤维素滤膜上。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞粒一次，并重悬浮至OD₆₀₀＝1，用滴管吸取10μl重悬浮的细胞至硝酸纤维素滤膜上。在含有0.05％Tween 20(PBS-T)的1％的牛血清白蛋白PBS溶液中室温下封闭滤膜1小时。为了检测PS14，室温下以1∶1000稀释的抗血清型14荚膜多糖的抗血清(Statens Serum Institute，Copenhagen，Denmark)作为初级抗血清温育滤膜过夜。用PBS-T洗涤滤膜三次，然后以1∶2000稀释的与辣根过氧化物酶(Pierce，Rockford，USA)偶联的山羊抗兔免疫球蛋白进行温育。用PBS-T洗涤滤膜两次，然后使用PBS洗涤一次。根据制造商的说明书，使用Supersignal底物(Pierce)显现偶联物。

为了分析酪氨酸磷酸化的Cps14D和EpsB，在添加了1％的葡萄糖的M17培养基中培养细胞。通过加入乳链菌肽Z在OD600＝0.15-0.20诱导细胞。诱导3-4小时后通过离心收集细胞，并将团粒重悬浮于10mM Tris[pH 8.0]，0.1mM EDTA。在锆玻璃珠的存在下机械破坏细胞(van der Meer et al.，1993)。通过离心出去细胞碎片，在2倍浓缩的Laemmli缓冲液(Laemmli，1970)中煮沸细胞提取物(CE)中的蛋白质10分钟。通过SDS-PAGE(12.5％凝胶)分离蛋白质，并通过电印迹转移到硝酸纤维素膜上。使用含有0.05％Tween 20(TBS-T)和2％BSA的Tris-缓冲盐水(100mM Tris[pH7.4]，0.9％NaCl)在室温下封闭膜1小时。使用含有0.05％Tween 20和0.5％BSA的TBS以1∶1000稀释的单克隆抗磷酸酪氨酸抗血清(PT-66，Sigma)，温育过夜。如上所述洗涤膜，并以1∶2000稀释的与辣根过氧化物酶(Pierce)偶联的山羊抗兔免疫球蛋白进行温育。使用氯萘酚和H₂O₂显现二抗的结合。

多糖的分离和分析

在含有2％葡萄糖的CDM中培养细胞至OD600＝0.15-0.20。然后将培养物分为两管，一管通过加入1ng/ml乳链菌肽进行诱导，而另一管未诱导。诱导和未诱导的细胞均温育过夜。如Looijesteijn和Hugenholtz(1999)所述从培养物分离多糖。对于血清型14多糖产生菌，使用了上述方法和Karlsson et al.(1998)所述的用于分离荚膜多糖的方案。

NMR分析

从1L具有pNZ4206和pNZ4230的乳酸乳球菌NZ9000分离多糖。如上所述诱导细胞，并通过离心(10min，15,000xg)从上清液收集多糖。通过加入10M NaOH将上清液调节到pH7，并通过超滤(MWCO 20,000Da)浓缩。浓缩的多糖对自来水渗析，并通过加入40mM Tris[pH8.0]、10mM MgCl₂和10mM CaCl₂中的600μg蛋白酶K和55℃下过夜温育的步骤，除去蛋白质。蛋白酶处理的多糖溶液对自来水渗析过夜，冻干，并溶于0.1M NaNO₃。使用TSK-凝胶6000PW柱(Phenomenex)和0.1M NaNO₃作为洗脱液通过大小排阻色谱法(SEC)对溶液进行分馏。通过折射率(RI)和280nm的UV检测在线分析来自柱的洗脱液。收集含有EPS的馏分，对Millipore水渗析，并冻干。将冻干样品溶于99.9原子％D₂O，并获得400MHz的乳酸乳球菌中制备的血清型14多糖和从肺炎链球菌(American Type Culture Collection，Manassas，USA)纯化的血清型14多糖的NMR谱。

结果

为了说明本发明，在非病原性、非侵入性革兰氏阳性宿主细胞(例如在本例中为乳酸乳球菌)中制备来自肺炎链球菌血清型14的CPS，肺炎链球菌血清型14指导其生物合成的完整基因簇是已知的(Kolkmanet al.，1997)。

血清型14多糖由具有连接到各N-乙酰葡糖胺残基上的β(1→4)-Galp残基的→6)-β-D-GlcpNAc-(1→3)-β-D-Galp-(1→4)-β-D-Glcp-(1→重复单元的线性骨架组成。完整的基因簇包含12个基因(cps14A to cps14L)，这些基因转录为单一的转录单元(Kolkman et al.，1997)。cps14组织为典型的盒式结构，包括聚合酶和重复单元转运蛋白的血清型特异性基因位于通用区域的两侧。

通过在一个质粒上克隆三个通用的乳球菌基因(epsABC)加上糖基转移酶编码基因epsD，以及在第二个质粒上克隆其余的血清型特异性基因，实现了在本发明的乳酸乳球菌中产生复合型肺炎球菌CPS。有趣的是，仅血清型14特异性基因与eps B40通用基因相组合的表达导致产生了血清型14多糖。

乳酸乳球菌中肺炎球菌血清型14多糖表达系统的克隆

为了合成血清型14多糖，使用糖核苷酸UDP-Gal、UDP-GlcNAc和UDP-Glc作为结构单元(Kolkman et al.，1997)。在乳酸乳球菌中由核心碳代谢的中间产物形成这些活化的糖(www.kegg.genome.ad.jp)。为了在乳酸乳球菌中表达血清型14多糖，我们修饰了在我们实验室已证明在乳酸乳球菌中成功地表达同源和异源eps基因的表达系统(Nierop Groot etal.，2004)。图1显示了用于在乳酸乳球菌中产生乳球菌多糖和肺炎球菌多糖的质粒的示意图。在该表达系统中，使用了细菌中多糖生物合成基因簇的保守的盒式结构。将cps14基因簇分在两个单独的质粒上。编码糖基转移酶和聚合酶以及输出蛋白的cps14血清型特异性基因克隆在pNZ4220衍生的质粒上。因此，使用两侧的BamHI限制酶切位点从质粒pNZ4220切除来自乳球菌eps基因簇的epsEFGHIJKLorfY基因，留下eps启动子序列和epsRX。通过用BamHI消化从pNZ84F-L质粒(材料和方法)切除6.8kb的片段，并连接在类似地消化的pNZ4220中得到质粒pNZ4230。在pNZ4230中，cps14血清型特异性基因的表达在乳球菌eps基因簇的组成型启动子的控制之下。在乳链菌肽-诱导型启动子的控制下，克隆编码调节基因、引导糖基转移酶、乳球菌eps和肺炎球菌cps14基因簇的保守区，得到pNZ4206(epsABCD)和pNZ4237(cps14BCDE)。因此，预计参与cps基因簇的转录活化(Cieslewicz et al.(2001)的cps14A不存在于该系统。该系统中cps14基因的表达是由组成型B40 eps启动子和乳链菌肽-诱导型启动子驱动的。先前表明，由于糖基转移酶EpsD和Cps14E对葡萄糖菌具有特异性(van Kranenburg et al.，1999；Kolkman et al.，1997)，因此在乳酸乳球菌中引入epsD突变体可以恢复EPS的产生(Van Kranenburg et al.，1999)。将质粒pNZ4206和pNZ4237转入具有pNZ4230的乳酸乳球菌。

免疫检测乳酸乳球菌中血清型14多糖的产生

使用免疫检测法检测了具有pNZ4230和pNZ4206(epsABCD)或pNZ4237(cps14BCDE)的乳酸乳球菌的诱导的和未诱导的培养物。另外，结合pNZ4230检测了构建体pNZ4209(epsAB_ΔYYYYCD)、pNZ4208(epsABD)、pNZ4235(cps14CDE)、pNZ4238(cps14BCDE’)和pNZ4221(epsABC+cps14E)。

作为阴性对照，使用了具有pNZ4230的菌株NZ9000以及具有pNZ4220和pNZ4206的NZ9000。乳链菌肽-诱导的和未诱导的细胞均在添加了2％葡萄糖的M17培养基中培养过夜。离心细胞，将上清液和细胞均点到硝酸纤维素膜上，并使用血清型14特异性抗血清检测多糖的存在。在具有pNZ4230结合pNZ4206、pNZ4208和pNZ4209A的乳酸乳球菌株中检测到强信号，而在未诱导细胞中信号程度较低。由于在2道中仅具有pNZ4230的阴性对照菌株中没有检测道信号，因此未诱导细胞中的该信号是泄漏nisA启动子引起的。在1道中的B40-EPS产生菌中未检测到信号，表明该血清特异性地检测血清型14多糖。惊人地，具有pNZ4230和pNZ4237(7道)的乳酸乳球菌未检测到信号。由于质粒pNZ4237含有来自肺炎球菌cps14基因簇的调节基因，这是出乎意料的。5道中的构建体pNZ4208缺少epsC基因，但具有该构建体的乳酸乳球菌产生了血清型14多糖。这表明，在乳酸乳球菌中，多糖的产生不严格地取决于epsC功能基因的存在。在EpsB(4道中的构建体pNZ4209)的C末端缺失7个氨基酸看起来降低了产生的多糖的量。有趣的是，血清型14多糖主要释放在培养物上清液中。在具有pNZ4230/pNZ4206的乳酸乳球菌的细胞悬浮液中检测到弱信号，其极可能是洗涤步骤中未完全除去的松散结合的多糖。质粒pNZ4237含有完整的cps14E基因，而先前的报道表明cps14E中存在另外的核糖体结合位点，产生了缺少开始的98个氨基酸的平截但有活性的糖基转移酶(Kolkman et al.，1997)。已表明，引导糖基转移酶的N-末端一半可参与十一异戊烯基-连接的重复单元的释放(Wang et al.，1996)。乳球菌同系物EpsD缺少该结构域并且仅含有对于糖基转移酶活性必要的保守结构域。为了检测Cps14E中该另外的结构域是否影响乳酸乳球菌中多糖制备，pNZ4237中完整的cps14E置换为平截cps14E，得到pNZ4238。然而，具有pNZ4230和pNZ4238的菌株未检测到信号。构建体pNZ4206中epsD置换为cps14E基因也阻止了血清型14多糖的产生。VanKranenburg et al.(1999)的数据和表3中的数据表明，糖基转移酶在乳酸乳球菌B40多糖合成中是有功能的。这表明乳酸乳球菌中血清型14多糖的生物合成需要EpsA、EpsB和EpsD的存在，而EpsC是任选的。

表3.由乳酸乳球菌的培养物上清液分离的多糖(PS)

具有质粒的菌株NZ9000	PS(mg/l)a		PS(mg/L.OD600)c	产生的聚合物类型d
					未诱导	诱导b
	pNZ4230+pNZ4237pNZ4230+pNZ4235pNZ4230+pNZ4206pNZ4230+pNZ4209pNZ4230+pNZ4208pNZ4230+pNZ4221pNZ4220+pNZ4237pNZ4220+pNZ4235pNZ4220+pNZ4206pNZ4220+pNZ4238pNZ4220+pNZ4221	＜1＜1＜1＜1＜1＜1＜1＜1＜1＜1＜1					＜1＜1251221＜13161103792	--12611-133561523	血清型14血清型14血清型14B40B40B40B40

^a列出的值为至少两个独立的实验的平均值，并且该平均值的变差不超过7％。

^b如“材料和方法”中所述用1ng/ml乳链菌肽诱导细胞。

^c用于最终的光密度(OD₆₀₀)的校正的多糖产量。

^dB40表示乳球菌B40多糖；血清型14：与肺炎球菌血清型14特异性抗血清反应的多糖。

从乳酸乳球菌培养物分离多糖

通过大小排阻色谱法然后通过多角光扫描法(SEC-MALLS)分析由乳酸乳球菌产生的多糖。每升具有pNZ4230和pNZ4206的乳酸乳球菌产生了25mg的血清型14多糖(表3)。这是具有pNZ4220和pNZ4206的乳酸乳球菌产生的B40多糖的量的23％。具有pNZ4208和pNZ4209的菌株也产生了多糖，尽管其产量显著地更低。在未诱导细胞中或者没有产生多糖或者量低于1mg/L的检测极限值。免疫检测是更加灵敏的检测方法，并解释了图2中由未诱导的乳酸乳球菌(pNZ4230，pNZ4206)得到的信号。正如已经通过免疫检测实验所表明的，不能从具有pNZ4230和pNZ4237的乳酸乳球菌分离多糖。另外使用了开发用于分离肺炎球菌荚膜多糖(Karlsson et al.，1998)的不同的方法，并证实了没有产生多糖。有趣的是，具有pNZ4220和pNZ4237或pNZ4238的乳酸乳球菌分别产生了31mg/L或37mg/L的B40多糖。这证实了cps14BCDE基因在乳酸乳球菌中是有功能的，并且多糖的产生相当于完整的和平截的cps14E构建体。表3进一步表明cps14E在B40多糖产生菌株(pNZ4220+pNZ4221)中结合epsABC基因是有功能的，但在具有pNZ4230的菌株中是没有功能的。因此，肺炎球菌血清型14多糖仅在epsABCD基因(存在或不存在epsC的情况下)的调节下在乳酸乳球菌中产生。

磷酸化酪氨酸残基的免疫检测

已知CpsD中存在的酪氨酸残基的可逆磷酸化调节肺炎链球菌中荚膜产生(Bender and Yother，2001；Bender et al.，2003)。图4表明Cps14D在具有pNZ4230结合cps14BCDE基因(4道)、cps14CDE基因(6道)、cps14BCDE’基因(8道)和epsABCcps14E构建体(9道)的菌株中是磷酸化的。有趣的是，这些菌株不产生血清型14多糖。在具有pNZ4220的乳酸乳球菌中，仅当多糖产生在Cps14BCDE或Cps14CDE的调控下时检测到磷酸化的酪氨酸，并且多糖产生与EpsABCD调节蛋白相比大大降低。这表明，在乳酸乳球菌中，酪氨酸磷酸化对多糖生物合成有负面影响。EpsB蛋白在具有pNZ4221(epsABCcps14E)和pNZ4230的乳酸乳球菌中被磷酸化，而在具有pNZ4221(epsABCcps14E)和pNZ4200的乳酸乳球菌中没有被磷酸化。这表明肺炎球菌引导糖基转移酶能够阻断多糖生物合成，并因此优选换为乳球菌糖基转移酶。

NMR分析

因为乳酸乳球菌产生的多糖的化学结构与免疫原性肺炎链球菌相同，因此勿庸置疑地预期乳酸乳球菌产生的多糖将引起保护性免疫反应。这通过来自Gilbert et al(2000)的数据进一步得到支持，这些数据表明乳酸乳球菌产生的血清型3多糖引起的免疫反应和由肺炎球菌产生的多糖观察到的免疫反应相同。

取得了乳酸乳球菌中产生的血清型14多糖和肺炎链球菌中产生的血清型14多糖的质子NMR谱图，并显示了相同的谱图(图3)。从肺炎链球菌血清型14分离的CPS中的小杂质产生了乳球菌分离物中不存在的3.27ppm处的额外的峰。然而，谱图清楚地显示乳酸乳球菌中产生的多糖的结构与肺炎链球菌中产生的本身的血清型14多糖相同。

总而言之，本实施例首次证明了在非病原性和/或非侵入性革兰氏阳性宿主细胞中来自肺炎球菌的复合型革兰氏阳性多糖的异源表达和产生。

Gilbert et al.，2000，WO 98/31786在乳酸乳球菌中达到的血清型3肺炎球菌多糖产生水平为120mg/L。这是一种简单型多糖。在本实施例中复合型血清型14肺炎球菌多糖以25mg/l产生，并且可通过在不同条件下培养宿主菌进一步提高和优化。血清型14多糖更加复杂，并且多数其他的肺炎球菌多糖是通过高度相似的机制合成的。根据(Boels et al.，2003)，因为UDP-葡萄糖和UDP-半乳糖很可能是非限制性的，因此通过提高乳酸乳球菌中UDP-GlcNAc的水平可以实现产生水平的提高。本实施例也表明本发明的另一优点：肺炎链球菌中产生的血清型14多糖以荚膜形式产生，而在乳酸乳球菌中则分泌到培养基中。根据本发明的异源产生复合型多糖的方法不仅提供了从非病原性革兰氏阳性细菌安全便利的产生多糖的优点，也能够从异源产生的多糖类型被分泌于其中的培养基中便利的分离，并减少了蛋白质污染。

参考文献

Arrecubieta，C.，R.Lopez，and E.Garcia.1996.Type 3-specific synthase of Streptococcuspneumoniae(Cap3B)directs type 3 polysaccharide biosynthesis in Escherichia coli and inpneumococcal strains of different serotypes.J.Exp.Med.184：449-455.

Aravind，L.and E.V.Koonin.1998.Phosphoesterase domains associated with DNApolymerases of diverse origins.Nucleic Acids Res.15；26(16)：3746-52.

Boels，I.C.，R.van Kranenburg，M.W.Kanning，B.Fong Chong，W.M.de Vos，and M.Kleerebezem.2003.Increased exopolysaccharide production in Lactococcus lactis due toincreased levels of expression of the NIZO B40 eps gene cluster.Appl.Environ.Microbiol.69：5029-5031.

Boels，I.C.，A.Ramos，M.Kleerebezem，and W.M.de Vos.2001.Functional analysis ofthe Lactococcus lactis galU and galE genes and their impact on sugar nucleotide andexopolysaccharide biosynthesis.Appl.Environm.Microbiol.67：3033-3040.

Bender，M.H.，R.T.Cartee，and J.Yother.2003.Positive correlation between tyrosinephosphorylation of CpsD and capsular polysaccharide production in Streptococcuspenumoniae.J.Bacteriol.185：6057-6066.

Bender，M.H.，and Y.Yother.2001.CpsB is a modulator of capsule-associated tyrosinekinase activity in Streptococcus penumoniae.J.Biol.Chem.276：47966-47974.

Campbell，J.A.，G.J.Davies，V.Bulone，and B.Henrissat.1997.A classification ofnucleotide-diphospho-sugar glycosyltransferases based on amino acid sequence similarities.Biochem J.15：929-39.

Cartee，R.T.，W.Thomas Forsee，J.S.Schutzbach，and Y.Yother.2000.Mechanism oftype 3 capsular polysaccharide synthesis in Streptococcus pneumoniae.J.Biol.Chem.275：3907-3914.

Cieslewicz，M.J.，D.L.Kasper，Y.Wang，and M.R.Wessels.2001.Functioual analysis intype Ia group B Streptococcus of a cluster of genes involved in extracellularpolysaccharide production by diverse species of streptococci.J.Biol.Chem.276：139-146.

V.M.M.，M.Takagi，R.B.Lima，H.Massaldi，R.C.Giordano，and M.M.Tanizaki.2003.Purification of capsular polysaccharide from Streptococcus pneumoniaeserotype 23F by a procedure suitable for scale-up.Biotechnol.Appl.Biochem.37：283-287.

De Ruyter，P.G.G.A.，O.P.Kuipers，M.M.Beerthuyzen，I.J.Van Alen-Boerrigter，andW.M.De Vos.1996.Functional analysis of promoters in the nisin gene cluster ofLactococcus lactis.J.Bacteriol.178：3434-3439.

De Vos，W.M.P.，H.de Haard，and I.Boerrigter.1989.Cloning and expression of theLactococcus lactis subsp.cremoris SK11 gene encoding an extracellular serine proteinase.Gene 85：169-176.

Fath，M.J.，and R.Kolter.1993.ABC transporters：bacterial exporters.Microbiol.Rev.57：995-1017.

Gilbert，C.，Robinson，K.，Le Page，R.W.F.，and J.M.Wells.2000.Heterologousexpression of an immunogenic pneumococcal type 3 polysaccharide in Lactococcus lactis.Infection and Immunity 68：3251-3260.

Guidolin，A.，J.K.Morona，R.Morona，D.Hansman，and J.C.Paton.1994.Nnceotidesequence analysis of genes essential for capsular polysaccharide biosynthesis inStreptococcus pneumoniae type 19F.Infect.Immun.62：5384-5396.

Jolly，L.，J.Newell，I.Porcelli，S.J.F.Vincent，and F.Stingele.2002.Lactobacillushelveticus glycosyltransferases：from genes to carbohydrate synthesis.Glycobiology 12：319-327.

Jolly，L.，and F.Stingele.2001.Molecular organization and funtionality ofexopolysaccharide gene clusters in lactic acid bacteria.Int.Dairy J.11：733-745.Henrichsen，J.1999.Typing of Streptococcus pneumoniae：past present and future.Am.J.Med.26：50S-54S.

Karlsson，C.，P.E.Jansson，and U.B.Srensen.1998.The chemical structures of thecapsular polysaccharides from Streptococcus pneumoniae types 32F and 32A.Eur.J.Biochem.255：296-302.

Kleerebezem，M.，Boekhorst，J.& 17 other authors.2003.Complete genome sequence ofLactobacillus plantarum WCFS1.PNAS 100，1990-1995.

Kolkman，M.A.B.，B.A.M.van der Zeijst，and P.J.M.Nuijten.1997.Functional analysis ofglycosyltransferases encoded by the capsular polysaccharide biosynthesis locus ofStreptococcus pneumoniae serotype 14.J.Biol.Chem.272：19502-19508.

Kolkman，M.A.B.，Wakarchuk，W.，Nuijten，P.J.M.，and B.A.M.van der Zeijst.1997.Capsular polysaccharide synthesis in Streptococcus pneumoniae serotype 14：molecularanalysis of the complete cps locus and identification of genes encodingglycosyltransferases required for the biosynthesis of the tetrasaccharide subunit，Mol.Microbiol.26：197-208.

Laemmli，U.K.1970.Cleavage of the structural proteins during the assembly of the headof bacteriophage T4.nature(London)227：680-685.

Lamothe，G.T.，L.Jolly，B.Mollet，F.Stingele.2002.Genetic and biochemicalcharacterization of exopolysaccharide biosynthesis by Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus.Arch.Microbiol.178：218-228.

Looijesteijn，P.J.，and J.Hugenholtz.1999.Uncoupling of growth and exopolysaccharideprodnction by Lactococcus lactis subsp.cremoris NIZO B40 and optimisation of itssynthesis.J.Biosci.And Bioeng.88：178-182.

Llull，D.，E.Garcia，and R.Lopez.2001.Tts，a processive β-glucosyltransferase ofStreptococcus pneumonia，directs the synthesis of the branched type 37 capsularpolysaccharide in pneumococcus and other Gram-positive species.J.Biol.Chem.276：21053-21060.

Morona，J.K.，R.Morona，and J.C.Paton.1997.Molecular and genetic characterization ofthe capsule biosynthesis locus of Streptococcus pneumoniae type 19B.J.Bacteriol.179：4953-4958.

Morona，J.K.，R.Morona，D.C.Miller，and J.C.Paton.2003.Mutational ahalysis of thecarboxy-terminal(YGX)₄ repeat domain of CpsD，an autophosphorylating tyrosine kinaserequired for capsule biosynthesis in Streptococcus pneumoniae.J.Bacteriol.185：3009-3019.

Nierop Groot，M.N.，and M.Kleerebezem.2004.Manuscript in preparation.Platteeuw，C.，G.Simons，and W.M.de Vos.1993.Use of the Escherichia coli β-glucoronidase(gusA)gene as a reporter gene for analyzing promoters in lactic acidbacteria.Appl.Environ.Microbiol.60：587-593.

Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，& Maniatis，T.(1989).Molecular cloning：a laboratorymanual，2^nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York.Srensen，U.B.S.，Henrichsen，J.，Chen，H-C.，and S.C.Szu.1990.Covalent linkagebetween the capsular polysaccharide and the cell wall peptidoglycan of Streptococcuspneumoniae revealed by immunochemical methods.Microbial Pathogenesis 8：325-334.

Stingele，F.，J-R.Neeser，and B.Mollet.1996.Identification and characterization of theeps(exopolysaccharide)gene cluster from Streptococcus thermophilus Sfi6.J.bacteriol.178：1680-1690.

Stingele，F.，Vincent，S.J.，Faber，E.J.，Newell.，J.W.，Kamerling，J.P.，and J.R.Neeser.1999.Introduction of the exopolysaccharide gene cluster from Streptococcus thermophilusSfi6 into Lactococcus lactis MG1363：production and characterization of an alteredpolysaccharide.Mol.Microbiol.32：1287-1295.

Van der Meer，J.R.，J.Polman，M.M.Beerthuyzen，R.J.Siezen，O.P.Kuipers，and W.M.deVos.1993.Characterization of the Lactococcus lactis nisinA operon genes nisP，encodinga subtilisin-like protease involved in precursor processing，and nisR，encoding a regulatoryprotein invovled in nisin biosynthesis.J.Bacteriol.175：2578-2588.

Van Kranenburg，R.，J.D.Marugg，I.V.Swam，N.J.Norwin，J.Willem，and W.M.de Vos.1997.Molecular characterisation of the plasmid-encoded eps gene cluster essential forexopolysaccharide biosynthesis in Lactococcus lactis.Mol.Microbiol.24：387-397.

Van kranenburg，R.，H.R.Vos，I.Van Swam，M.Kleerebezem，and W.M.de Vos.1999.Functional analysis of glycosyltransferase genes from Lactococcus lactis and other gram-positive cooci：complementation，expression and diversity.J.Bacteriol.181：6347-6353.Velasco et al.，1995.Streptococcus pneumoniae：virulence factors，pathogenesis andvaccines.Microbiol.Rev.p.591-603.

Wang，L.，D.Liu，and P.R.Reeves.1996.C-terminal half of Salmonella enterica WbaP(RfbP)is the galactosyl-1-transferase domain catalyzing the first step of O-antigensynthesis.J.Bacteriol.178：2598-2604.

Weintraub，A.2003.Immunology of bacterial polysaccharides.Review.CarbohydrateResearch 338：2539-2547.

Whatmore，A.M.，A.Efstratiou，A.P.Pickerill，K.Broughton，G.Woodward，D.Sturgeon，R.George，and C.G.Dowson.2000.Genetic relationships between clinical isolates ofStreptococcus pneumoniae，Streptococcus oralis，and Streptococcus mitis：characterizationof“a typical”pneumococci and organisms allied to S.mitis harbouring S.pneumoniaevirulence factor-encoding genes.Infect.Immun.68：1374-1382.

Whitfiel.1995.Biosynthesis of lipopolysaccharide O-antigens.Trends Microbiol.3：178-185.

序列表

<110>食品和营养托浦研究所基金会

<120>通过在非病原性、非侵入性革兰氏阳性菌中异源表达和分泌复合多糖而有效产生病原性革兰氏阳

性菌荚膜多糖的新方法

<130>P216350 EP

<160>4

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>259

<212>PRT

<213>Lactococcus lactis

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(259)

<223>EpsA

<400>1

Met Gln Glu Thr Gln Glu Gln Thr Ile Asp Leu Arg Gly Ile Phe Lys

1               5                   10                  15

Ile Ile Arg Lys Arg Leu Gly Leu Ile Leu Phe Ser Ala Leu Ile Val

            20                  25                  30

Thr Ile Leu Gly Ser Ile Tyr Thr Phe Phe Ile Ala Ser Pro Val Tyr

        35                  40                  45

Thr Ala Ser Thr Gln Leu Val Val Lys Leu Pro Asn Ser Asp Ash Ser

    50                  55                  60

Ala Ala Tyr Ala Gly Glu Val Thr Gly Ash Ile Gln Met Ala Asn Thr

65                  70                  75                  80

Ile Ash Gln Val Ile Val Ser Pro Val Ile Leu Asp Lys Val Arg Ser

                85                  90                  95

Asn Leu Ash Leu Ser Asp Asp Ser Phe Gln Lys Gln Val Thr Ala Ala

            100                 105                 110

Asn Gln Thr Asn Ser Gln Val Ile Met Leu Thr Val Lys Tyr Ser Asn

        115                 120                 125

Pro Tyr Ile Ala Lys Lys Ile Ala Asp Glu Thr Ala Lys Ile Phe Ser

    130                 135                 140

Ser Asp Ala Ala Lys Leu Leu Asn Val Thr Asn Val Asn Ile Leu Ser

145                 150                 155                 160

Lys Ala Lys Ala Gln Thr Thr Pro Ile Ser Pro Lys Pro Lys Leu Tyr

                165                 170                 175

Leu Ala Ile Ser Val Ile Ala Gly Leu Val Leu Gly Leu Ala Ile Ala

            180                 185                 190

Leu Leu Lys Glu Leu Phe Asp Ash Lys Ile Asn Lys Glu Glu Asp Ile

        195                 200                 205

Glu Ala Leu Gly Leu Thr Val Leu Gly Val Thr Ser Tyr Asp Gln Met

    210                 215                 220

Ser Asp Phe Asn Lys Asn Thr Asn Lys Asn Gly Thr Gln Ser Gly Thr

225                 230                 235                 240

Lys Ser Ser Pro Pro Ser Asp His Glu Val Asn Arg Ser Ser Lys Arg

                245                 250                 255

Asn Lys Arg

<210>2

<211>231

<212>PRT

<213>Lactococcus lactis

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(231)

<223>EpsB

<400>2

Met Ala Lys Asn Lys Arg Ser Ile Asp Asn Asn His Tyr Ile Ile Thr

1               5                   10                  15

Ser Val Asn Pro Gln Ser Pro Ile Ser Glu Gln Tyr Arg Thr Ile Arg

            20                  25                  30

Thr Thr Ile Asp Phe Lys Met Ala Asp Gln Gly Ile Lys Ser Phe Leu

        35                  40                  45

Val Thr Ser Ser Glu Thr Asp Glu Gly Lys Thr Thr Val Ser Ala Asn

    50                  55                  60

Ile Ala Val Ala Phe Ala Gln Gln Gly Lys Lys Val Leu Leu Ile Asp

65                  70                  75                  80

Gly Asp Leu Arg Lys Pro Thr Val Asn Ile Thr Phe Lys Val Gln Asn

                85                  90                  95

Arg Val Gly Leu Thr Asn Ile Leu Met His Gln Ser Ser Ile Glu Asp

            100                 105                 110

Ala Ile Gln Gly Thr Arg Leu Ser Glu Asn Leu Thr Ile Ile Thr Ser

        115                 120                 125

Gly Pro Ile Pro Pro Asn Pro Ser Glu Leu Leu Ala Ser Ser Ala Met

    130                 135                 140

Lys Asn Leu Ile Asp Ser Val Ser Asp Phe Phe Asp Val Val Leu Ile

145                 150                 155                 160

Asp Ile Pro Pro Leu Ser Ala Val Thr Asp Ala Gln Ile Leu Ser Ser

                165                 170                 175

Tyr Val Gly Gly Val Val Leu Val Val Arg Ala Tyr Glu Thr Lys Lys

            180                 185                 190

Glu Ser Leu Ala Lys Thr Lys Lys Lys Leu Glu Gln Val Asn Ala Asn

        195                 200                 205

Ile Leu Gly Val Val Leu His Gly Val Asp Ser Ser Asp Ser Pro Ser

    210                 215                 220

Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Val Glu

225                 230

<210>3

<211>254

<212>PRT

<213>Lactococcus lactis

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(254)

<223>EpsC

<400>3

Met Ile Asp Ile His Cys His Ile Leu Pro Gly Ile Asp Asp Gly Ala

1               5                   10                  15

Lys Thr Ser Gly Asp Thr Leu Thr Met Leu Lys Ser Ala Ile Asp Glu

            20                  25                  30

Gly Ile Thr Thr Ile Thr Ala Thr Pro His His Asn Pro Gln Phe Asn

        35                  40                  45

Asn Glu Ser Pro Leu Ile Leu Lys Lys Val Lys Glu Val Gln Asn Ile

    50                  55                  60

Ile Asp Glu His Gln Leu Pro Ile Glu Val Leu Pro Gly Gln Glu Val

65                  70                  75                  80

Arg Ile Tyr Gly Asp Leu Leu Lys Glu Phe ser Glu Gly Lys Leu Leu

                85                  90                  95

Lys Ala Ala Gly Thr Ser Ser Tyr Ile Leu Ile Glu Phe Pro Ser Asn

            100                 105                 110

His Val Pro Ala Tyr Ala Lys Glu Leu Phe Tyr Asn Ile Lys Leu Glu

        115                 120                 125

Gly Leu Gln Pro Ile Leu Val His Pro Glu Arg Asn Ser Gly Ile Ile

    130                 135                 140

Glu Asn Pro Asp Ile Leu Phe Asp Phe Ile Glu Gln Gly Val Leu Ser

145                 150                 155                 160

Gln Ile Thr Ala Ser Ser Val Thr Gly His Phe Gly Lys Lys Ile Gln

                165                 170                 175

Lys Leu Ser Phe Lys Met Ile Glu Asp His Leu Thr His Phe Val Ala

            180                 185                 190

Ser Asp Ala His Asn Val Thr Ser Arg Ala Phe Lys Met Lys Glu Ala

        195                 200                 205

Phe Glu Ile Ile Glu Asp Ser Tyr Gly Ser Gly Val Ser Arg Met Leu

    210                 215                 220

Gln Asn Asn Ala Asp Ser Val Ile Leu Asn Glu Ser Phe Tyr Gln Glu

225                 230                 235                 240

Glu Pro Ile Lys Ile Lys Thr Lys Lys Phe Leu Gly Leu Phe

                245                 250

<210>4

<211>226

<212>PRT

<213>Lactococcus lactis

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(226)

<223>EpsD

<400>4

Met Glu Val Phe Glu Ala Ser Ser Glu Leu Glu Glu Pro Lys Leu Val

1               5                   10                  15

Glu Leu Lys Lys Phe Ser Arg Arg Glu Ile Ile Ile Lys Arg Gly Ile

            20                  25                  30

Asp Ile Leu Gly Gly Leu Ala Gly Ser Gly Leu Phe Leu Ile Ala Ala

        35                  40                  45

Ala Leu Leu Tyr Val Pro Tyr Lys Met Ser Ser Lys Lys Asp Gln Gly

    50                  55                  60

Pro Met Phe Tyr Lys Gln Lys Arg Tyr Gly Lys Asn Gly Lys Ile Phe

65                  70                  75                  80

Tyr Ile Leu Lys Phe Arg Thr Met Ile Ile Asn Ala Glu Gln Tyr Leu

                85                  90                  95

Glu Leu His Pro Glu Val Lys Ala Ala Tyr His Ala Asn Gly Asn Lys

            100                 105                 110

Leu Glu Ser Asp Pro Arg Val Thr Lys Ile Gly Ser Phe Ile Arg Gln

        115                 120                 125

His Ser Ile Asp Glu Leu Pro Gln Phe Ile Asn Val Leu Lys Gly Asp

    130                 135                 140

Met Ser Leu Val Gly Pro Arg Pro Ile Leu Leu Phe Glu Ala Lys Glu

145                 150                 155                 160

Tyr Gly Glu Arg Leu Ser Tyr Leu Leu Ile Cys Lys Pro Gly Ile Thr

                165                 170                 175

Gly Tyr Trp Thr Thr His Gly Arg Ser Lys Val Leu Phe Pro Gln Arg

            180                 185                 190

Ala Asp Leu Glu Leu Tyr Tyr Leu Gln Tyr His Ser Thr Lys Asn Asp

        195                 200                 205

Ile Lys Leu Ile Met Leu Thr Ile Lys Gln Ile Leu His Gly Ser Asp

    210                 215                 220

Ala Tyr

225

Claims (21)

1.一种非病原性、非侵入性的革兰氏阳性细菌，其包括：

a)第一异源DNA片段，其包含革兰氏阳性细菌菌种的荚膜多糖(CPS)血清型特异性基因，

b)第DNA片段，其包含来自不同于a)中所述细菌的革兰氏阳性细菌的通用的调节基因以及引导糖基转移酶，

c)以及通过表达所述片段产生a)中所述菌种的异源多糖。

2.权利要求1所述的细菌，其中所述病原性和/或侵入性革兰氏阳性细菌菌种的血清型特异性cps基因来自产生复合型CPS的菌种，其中，所述CPS包括通过脂质连接的中间体合成的重复寡糖单元的聚合物。

3.权利要求1所述的细菌，其中在c)中产生的多糖被分泌到胞外空间中。

4.权利要求1所述的细菌，其中所述细菌选自以下一组非病原性、非侵入性革兰氏阳性细菌，  所述的组由来自乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)  、片球菌属(Pediococcus)、肉杆菌属(Carnobacterium)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)和酒球菌属(Oenococcus)的菌种以及枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)组成。

5.权利要求1所述的细菌，其中所述血清型特异性序列来自以下一组病原性和/或侵入性革兰氏阳性复合CPS产生菌：肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、变异链球菌(Streptococcus mutans)、酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)、、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、表皮链球菌(Streptococcus epidermidis)、格氏链球菌(Streptococcus gordonii)、缓症链球菌(Streptococcus mitis)、口腔链球菌(Streptococcusoralis)、马链球菌(Streptococcus equi)、炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。

6.权利要求5所述的细菌，其中血清型特异性基因来自产生复合荚膜多糖血清型1、2、4、5、6A、6B、7A、7B、7C、7F、8、9A、9L、9N、9V、10A、10B、10C、11A、11B、11C、11F、12B、12F、13、14、15F、15A、15B、15C、16F、16A、17F、17A、18A、18B、18C、19F、19A、19B、19C、20、21、22F、22A、23A、23B、24F、24A、24B、25F、25A、27、28F、28A、29、33F、33A、33B、33C、10F、11D、12A、18F、23F、31、32F、32A、33D、34、35F、35A、35B、35C、36、38、39、40、41F、41A、42、43、44、45、46、47F、47A和48的肺炎链球菌菌株。

7.权利要求1所述的细菌，其中所述表达的通用或调节基因和引导糖基转移酶至少包含通用的调节基因epsA或cpsC、epsB或cpsD、和epsD或cpsE以及任选的epsC或cpsB。

8.权利要求7所述的细菌，其中epsA编码的蛋白质和乳酸乳球菌EpsA具有至少20％的氨基酸相同性，其中epsB编码的蛋白质和乳酸乳球菌EpsB具有至少20％的氨基酸相同性，以及其中epsD编码的蛋白质和乳酸乳球菌EpsD具有至少30％的氨基酸相同性。

9.一种DNA载体，包含编码革兰氏阳性复合CPS血清型特异性cps基因的DNA片段，其中所述血清型特异性基因选自荚膜多糖(CPS)基因簇中存在的血清型特异性基因。

10.权利要求9所述的载体，其中一种或多种血清型特异性基因选自由cpsE、cpsF、cpsG、cpsH、cpsI、cpsJ、cpsK、cpsL或其同系物组成的一组血清型特异性cps基因。

11.权利要求10所述的载体，其中，所述血清型特异性cps基因来自产生CPS的肺炎链球菌菌株，这些菌株产生血清型1、2、4、5、6A、6B、7A、7B、7C、7F、8、9A、9L、9N、9V、10A、10B、10C、11A、11B、11C、11F、12B、12F、13、14、15F、15A、15B、15C、16F、16A、17F、17A、18A、18B、18C、19F、19A、19B、19C、20、21、22F、22A、23A、23B、24F、24A、24B、25F、25A、27、28F、28A、29、33F、33A、33B、33C、10F、11D、12A、18F、23F、31、32F、32A、33D、34、35F、35A、35B、35C、36、38、39、40、41F、41A、42、43、44、45、46、47F、47A和48的复合CPS。

12.权利要求9-11任一项所述的DNA载体，其中，所述血清型特异性cps基因在来自革兰氏阳性细菌的EPS或CPS基因簇调节序列的转录调控下，所述细菌为不同于自其得到所述血清型特异性基因的革兰氏阳性细菌的菌种。

13.权利要求12所述的DNA载体，其中，所述血清型特异性基因包含于多顺反子转录单元内。

14.权利要求12所述的载体，其中所述载体不包含一种或多种功能性通用调节eps基因epsA或cpsC、epsB或cpsD、epsD或cpsD以及任选的epsC或cpsB。

15.权利要求1所述的细菌，其中所述细菌包含权利要求9-14任一项所述的载体。

16.在非病原性、非侵入性革兰氏阳性细菌中异源产生复合荚膜多糖(CPS)的方法，该方法包括步骤：

a)在有助于产生CPS的条件下，培养根据权利要求1-8任一项所述的细菌，

b)以及任选地，回收产生的复合CPS。

17.权利要求16所述的方法，其中将所述细菌细胞和培养基分开，并在培养基中回收CPS，或任选地从培养基分离CPS。

18.一种药物学可接受的组合物，其包含根据权利要求1-7中任一项所述的细菌和至少一种赋形剂或免疫原性佐剂。

19.一种药物学可接受的组合物，其包含从权利要求1-6中任一项所述的非病原性、非侵入性革兰氏阳性细菌中获得的复合CPS和至少一种赋形剂或免疫原性佐剂。

20.权利要求19所述的组合物，其中所述复合CPS物理连接于免疫原性分子。

21.权利要求19所述的组合物，其中所述免疫原性分子选自以下一组免疫原性蛋白质：破伤风类毒素、白喉类毒素、脑膜炎球菌外膜蛋白和白喉蛋白CRM₁₉₇。

Images