CN109182186A - 一种乳酸菌胞外多糖及免疫佐剂 - Google Patents

一种乳酸菌胞外多糖及免疫佐剂 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种乳酸菌胞外多糖及免疫佐剂。本发明保护的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)WXD030，其保藏编号为：CGMCC No.12415。其胞外多糖能显著增强小鼠骨髓来源树突状细胞分泌细胞因子。将胞外多糖与OVA抗原免疫小鼠，可以显著提高小鼠血清中OVA特异性IgG抗体以及IgG抗体亚类的滴度；胞外多糖还能显著促进脾脏T淋巴细胞增殖以及INF‑γ和IL‑4的分泌；显著提高脾脏IL‑4+CD4+T细胞、IFN‑γ+CD4+T细胞以及IFN‑γ+CD8+T细胞的比例；此外，胞外多糖还可以显著增强口蹄疫灭活疫苗在小鼠上诱发的特异性抗体滴度。

Description

一种乳酸菌胞外多糖及免疫佐剂
技术领域
本发明涉及一种乳酸菌胞外多糖及免疫佐剂。
背景技术
疫苗是防控传染病的核心制品,在预防和控制动物传染病,保障人类健康、畜牧业和农业的可持续发展中起着重要的作用。尽管在疫苗开发制备等方面做出了很多努力，但目前部分疫苗的免疫效果并不理想，要克服现有疫苗引起的免疫应答效应单一，免疫原性弱的缺点，需辅于更为有效的免疫佐剂来增强疫苗的免疫应答。佐剂应用于疫苗中，能够提高抗原的免疫原性，增强疫苗的效果，降低抗原的使用量，使疫苗在价格上具有明显优势。因此，研发新型安全、有效的疫苗佐剂来激发机体产生高效的天然和获得性免疫应答，提升体液和细胞免疫应答水平，丰富疫苗的免疫应答类型，充分发挥出疫苗的免疫保护作用，是未来新型免疫佐剂研发的重要发展方向。
铝佐剂自1926年发现以来，至今已有80多年的历史，是至今唯一通过FDA批准的能用于人的佐剂。但随着疫苗研发品种的增加，发现其使用存在一定的局限性，且会存在一定的副作用，远远不能满足新型疫苗佐剂的要求。理想的新型免疫佐剂应该是对动物机体的细胞或体液免疫均有有效的激发作用、作用持久稳定、免疫次数减少、副作用小,同时便于生产和易于注射。
多糖是细胞与细胞间相互作用中重要的信号分子，在激活和调节先天性和适应性免疫反应中起到重要的作用。越来越多的研究证明多糖是一种良好的免疫增强剂。。
乳酸菌胞外多糖(LAB EPS)是乳酸菌在其生长和代谢过程中所分泌到细胞外的一种多糖类化合物。乳酸菌通常被认为是食品安全级(GRAS)微生物，因此，它们所产的EPS同样也被认为是安全无毒的，备受广大研究者们的青睐。研究表明,乳酸菌胞外多糖对免疫系统发挥多方面的重要调节作用，而且安全无毒，成为安全高效新型疫苗佐剂的候选资源。
发明内容
本发明的目的是提供一种乳酸菌胞外多糖及免疫佐剂。
本发明提供的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)WXD030，已于2016年05月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编：100101)，保藏编号为CGMCCNo.12415。
本发明还保护干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)WXD030或其培养物在制备胞外多糖中的应用。
本发明还保护酪乳杆菌(Lactobacillus casei)WXD030的胞外多糖的制备方法，包括如下步骤：培养干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)WXD030，得到胞外多糖。
所述方法中，采用MRS液体培养基培养干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)WXD030。
所述方法中，所述培养的温度为37℃；所述培养的时间为30h；所述培养为静置培养。
所述方法还包括如下步骤：(1)采用三氯乙酸萃取所述培养得到的发酵液，收集上清液；(2)用乙醇沉淀步骤(1)得到的上清液，收集沉淀；(3)将步骤(2)得到的沉淀溶解后进行透析，收集分子量为8K～12KDa的物质，冷冻干燥。
所述方法还包括如下步骤：完成步骤(3)后，对冷冻干燥得到的粗多糖进行离子交换纯化和分子筛纯化，得到胞外多糖。
本发明还保护以上任一所述的方法制备得到的胞外多糖。
本发明还保护干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)WXD030或其发酵物在制备产品中的应用；所述产品的用途为如下(a1)-(a7)中的至少一种：
(a1)作为免疫佐剂；
(a2)提高疫苗的免疫效果；
(a3)提高疫苗诱发的特异性抗体含量；
(a4)促进TNF-α和/或IL-6和/或IL-10和/或IL-12和/或INF-γ和/或IL-4分泌；
(a5)促进淋巴细胞增殖；
(a6)提高脾脏IL-4+CD4+T细胞和/或IFN-γ+CD4+T细胞和/或IFN-γ+CD8+T细胞的数量；
(a7)作为免疫促进剂。
本发明还保护以上任一所述胞外多糖在制备产品中的应用；所述产品的用途为如下(a1)-(a7)中的至少一种：
(a1)作为免疫佐剂；
(a2)提高疫苗的免疫效果；
(a3)提高疫苗诱发的特异性抗体含量；
(a4)促进TNF-α和/或IL-6和/或IL-10和/或IL-12和/或INF-γ和/或IL-4分泌；
(a5)促进淋巴细胞增殖；
(a6)提高脾脏IL-4+CD4+T细胞和/或IFN-γ+CD4+T细胞和/或IFN-γ+CD8+T细胞的数量；
(a7)作为免疫促进剂。
本发明还保护一种产品，包括以上任一所述胞外多糖；所述产品的用途为如下(a1)-(a6)中的至少一种：
(a1)作为免疫佐剂；
(a2)提高疫苗的免疫效果；
(a3)提高疫苗诱发的特异性抗体含量；
(a4)促进TNF-α和/或IL-6和/或IL-10和/或IL-12和/或INF-γ和/或IL-4分泌；
(a5)促进淋巴细胞增殖；
(a6)提高脾脏IL-4+CD4+T细胞和/或IFN-γ+CD4+T细胞和/或IFN-γ+CD8+T细胞的数量。
以上任一所述(a5)中，所述淋巴细胞具体可为脾脏T淋巴细胞。
本发明还保护一种产品，包括所述的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)WXD030和疫苗。
以上任一所述疫苗为口蹄疫疫苗，具体可为口蹄疫疫苗146S。
本发明的发明人从实验室保存鉴定的110株乳酸杆菌所产EPS进行测定，筛选1株能够提高机体特异性免疫应答的乳酸菌胞外多糖(Lactobacillus casei WXD030 EPS)，该多糖能显著增强小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDCs)分泌细胞因子(TNF-α、IL-6、IL-10和IL-12)。将WXD030 EPS与OVA抗原免疫小鼠，发现WXD030 EPS可以显著提高小鼠血清中OVA特异性IgG抗体以及IgG抗体亚类IgG1、IgG2a和IgG2b的滴度，与铝盐(Alum)佐剂相比，差异显著；WXD030 EPS还能显著促进脾脏T淋巴细胞增殖以及INF-γ和IL-4的分泌；显著提高脾脏IL-4+CD4+T细胞、IFN-γ+CD4+T细胞以及IFN-γ+CD8+T细胞的比例；此外，WXD030 EPS还可以显著增强口蹄疫灭活疫苗在小鼠上诱发的特异性抗体滴度。
附图说明
图1为WXD030 EPS经过DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱得到的洗脱曲线。
图2为WXD030 EPS经Sepharose CL-6B色谱柱洗脱曲线。
图3为WXD030 EPS的紫外扫描结果。
图4为WXD030 EPS的红外光谱扫描结果。
图5为WXD030 EPS的相对分子质量分布图谱。
图6为WXD030 EPS的离子色谱图。
图7为WXD030 EPS对小鼠BMDCs分泌细胞因子的影响。A：WXD030 EPS刺激小鼠BMDCs后分泌TNF-α的结果；B：WXD030 EPS刺激小鼠BMDCs后分泌IL-6的结果；C：WXD030 EPS刺激小鼠BMDCs后分泌IL-10的结果；D：WXD030 EPS刺激小鼠BMDCs后分泌IL-12的结果。与PBS组比较，＊：p＜0.05，＊＊：p＜0.01，＊＊＊：p＜0.001。n＝3。
图8为WXD030 EPS对小鼠血清中OVA特异性IgG抗体及其亚类水平的影响。A:首免14天小鼠血清中OVA特异性IgG抗体及其亚类水平；B:二免14天后小鼠血清中OVA特异性IgG抗体及其亚类水平。与OVA组比较，＊：p＜0.05，＊＊：p＜0.01。
图9为WXD030 EPS对小鼠脾脏T淋巴细胞增殖的影响。与OVA组比较，＊：p＜0.05，＊：p＜0.01，＊＊＊：p＜0.001。与OVA+Alum组比较，ns：p＞0.05。n＝3。
图10为WXD030 EPS对小鼠脾脏T淋巴细胞细胞因子分泌的影响。左图为ELISA法检测细胞上清中IFN-γ的含量，右图为细胞上清中IL-4的含量。＊：p＜0.05，＊＊：p＜0.01，＊＊＊：p＜0.001。n＝3。
图11为WXD030 EPS对小鼠脾脏IL-4+CD4+T细胞和IFN-γ+CD4+T细胞的影响。A：IL-4+CD4+T细胞所占总T细胞百分比；B：IFN-γ+CD4+T细胞所占总T细胞百分比。ns：p>0.05，＊：p<0.05，＊＊：p<0.01，＊＊＊：p<0.001。n＝3。
图12为WXD030 EPS对小鼠血清中FMDV特异性IgG抗体水平的影响。与146S组比较，＊：p＜0.05，＊＊：p＜0.01。
图13为菌株WXD030菌落。
图14为菌株WXD030革兰氏染色镜检图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、WXD030的获得
一、菌株的分离和纯化
1、将奶制品用无菌水稀释，然后取少量液体将其涂布至MRS固体培养基，倒置放于厌氧罐，厌氧条件下，37℃培养48h。
2、完成步骤1后，将菌落形态一致的菌株进行分离并标记，将分离的菌株进行反复地三区划线使其纯化，从中筛选出一株菌株，将其命名为菌株WXD030。
二、菌株的鉴定
1、菌株WXD030在MRS固体培养基上呈圆形，菌落中等大小，凸起，微白色，湿润，边缘整齐，如图13所示。革兰氏染色阳性，如图14所示。
2、将菌株WXD030的16S rDNA序列进行扩增并测序，测序结果如序列表的序列1所示。
经过上述鉴定，确定菌株WXD030属于乳酸菌属干酪乳杆菌，因此重新将其命名为干酪乳杆菌WXD030。
三、WXD030的保藏
本发明提供的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)WXD030，已于2016年05月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编：100101)，保藏编号为CGMCCNo.12415。干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)WXD030简称为WXD030。
实施例2、WXD030的胞外多糖提取、纯化及鉴定
一、WXD030胞外粗多糖的提取
1、将WXD030接种于MRS液体培养基中，37℃、静置培养30h，得到发酵液(菌浓度为1×109CFU/mL)。
2、将步骤1得到的发酵液5000rpm、4℃离心15min，取上清液。
3、向步骤2中的上清液中缓慢加入三氯乙酸，直至三氯乙酸在上清液中的浓度为40mg/mL，4℃静置8h后10000rpm，4℃离心10min，收集上清。
4、向1体积份步骤3得到的上清液中加入4体积份的无水乙醇，4℃过夜醇沉，10000rpm，4℃离心10min，收集沉淀。
5、将步骤4得到的沉淀溶于60℃蒸馏水中，10000rpm离心10min，取上清液。
6、将步骤5得到的上清液装入截留分子量为8K～12K Da的透析袋内，然后将透析液置于去离子水中进行透析(先2-4h更换一次去离子水，之后每6-8h更换一次去离子水)，连续透析2天。
7、完成步骤6后，收集透析袋内溶液，真空冷冻干燥制得WXD030胞外粗多糖。
二、WXD030胞外粗多糖的DEAE-Sepharose FastFlow离子交换纯化
1、将DEAE-Sepharose Fast Flow填料装填于Column XK 26/40(内径：26mm，高度40cm)层析柱中，体积为150mL，用Tris-HCl溶液(55mM，pH 7.5-7.8)以1.5mL/min流速过夜平衡层析柱。
2、将步骤一得到的WXD030胞外粗多糖溶解于Tris-HCl溶液(浓度为55mM，pH 7.5-7.8)中，得到上样液(胞外粗多糖在上样液中的浓度为10mg/mL)，0.22μm滤膜过滤后上样。流动相使用Tris-HCl溶液(浓度为55mM，pH 7.5-7.8)和含1M NaCl的Tris-HCl溶液(浓度为55mM，pH 7.5-7.8)，0-27min，Tris-HCl浓度为55mM；27-160min，Tris-HCl浓度线性降为22.5mM，NaCl的浓度线性升至0.5M。将GE Healthcare Bio-Sciences AB的流速设置为2.0mL/min，每3min收集一次洗脱液至试管中。用硫酸-苯酚法测定洗脱液中多糖含量，并在490nm处检测吸光值，绘制洗脱曲线。
结果如图1所示。WXD030胞外粗多糖经Tris-HCl和NaCl洗脱后，得到了单一的组分，由图看出WXD030胞外多糖为酸性多糖。
将收集到的WXD030胞外多糖主峰用截留分子量为8K-12K Da的透析袋透析2天，经真空冷冻干燥后得到初步纯化的胞外多糖样品。
三、WXD030胞外多糖的Sepharose CL-6B分子筛纯化
1、将Sepharose CL-6B装填于Column XK 16/100(内径：16mm，高度100cm)层析柱中，体积为150mL，用Tris-HCl溶液(55mM，pH 7.5-7.8)以0.5mL/min流速过夜平衡层析柱。
2、将步骤二得到的初步纯化的多糖样品溶解于Tris-HCl溶液(浓度为55mM，pH7.5-7.8)中，得到上样液(多糖样品在上样液中的浓度为5mg/mL)，0.22μm滤膜过滤后上样。流动相使用Tris-HCl溶液(浓度为55mM，pH 7.5-7.8)，流速为0.5mL/min，每10min收集一次洗脱液至试管中。用硫酸-苯酚法测定洗脱液中多糖含量，并在490nm处检测吸光值，绘制洗脱曲线。
结果如图2所示。经过纯化后，WXD030胞外多糖的主峰出现在8-24管。收集WXD030胞外多糖的主峰部分，并用截留分子量为8K-12K Da的透析袋透析2天，经过真空冷冻干燥后得到最终纯化的胞外多糖样品(WXD030 EPS)。
四、WXD030胞外多糖的紫外光谱扫描
用去离子水将步骤三得到的WXD030 EPS溶解，得到检测液(胞外多糖在检测液中的浓度为0.5mg/mL)，用0.22μm滤膜过滤后在185～540nm波长范围内进行紫外扫描。样品流速为0.5mL/min。流动相为去离子水。
结果如图3所示。图3中，横坐标表示紫外波长(nm)，纵坐标为响应强度(μAu)。结果显示，WXD030 EPS只在206nm处均出现了多糖才具有的响应吸收峰；在260nm和280nm处无吸收峰，表明其不含有核酸和蛋白质这两类杂质。
五、WXD030胞外多糖的红外光谱分析
取步骤三得到的最终纯化的WXD030 EPS 1-2mg和100-200mg溴化钾粉末混匀后进行压片(厚度约0.1mm)，进行红外扫描。
结果如图4所示。WXD030 EPS在3408.32cm-1处有很强的吸收峰，是糖类化合物羟基的O-H键伸缩振动吸收峰；2939.41cm-1处出现的吸收峰是C-H键的伸缩振动吸收峰；出现在1652.93cm-1附近的是C＝O非对称伸缩振动峰；在1411.84cm-1处出现的是C-H键的变角振动峰；出现在1226.68cm-1处为C＝O的变角振动峰；在1053.10cm-1处出现的强吸收峰是吡喃糖的C-O-C特征吸收峰；出现在808.15cm-1处的是吡喃糖端基C-H变角振动。
六、WXD030胞外多糖的分子量测定
取步骤三得到的WXD030 EPS，溶解于0.1M NaCl水溶液中，得到检测液(WXD030EPS在检测液中的浓度为1mg/mL)，采用多角度激光光散射仪测定，使用Astra数据分析软件计算样品的分子量。
色谱柱：TSK Gel G4000PWxl；
流动相：0.1M NaCl水溶液；
流速：0.5mL/min；
进样量：200μL。
结果如图5所示。检测结果经数据处理后，WXD030 EPS的重均分子量为3.737Mw×104Da，数均分子量为2.554Mn×104Da。
七、乳酸菌WXD030胞外多糖的单糖组成测定
称取步骤三得到的WXD030 EPS 10mg于水解瓶中，加入4M三氟乙酸水溶液4mL，充N21min排出管内空气，旋紧螺旋盖，120℃水解2h，水解液0.22μm滤膜过滤后进样。根据对比保留时间确定单糖组成。
色谱柱：Carbo PacTMPA20 3×150mm Analytical；
淋洗液：250mM NaOH水溶液和1M NaAC水溶液；
流速：0.5mL/min；
进样体积：10μL；
柱温：35℃；
检测器：脉冲安培检测器，金电极。
梯度洗脱条件(A为水，B为250mM NaOH水溶液，C为1M NaAC水溶液)：
0-20min：A：94％，B：6％，C：0％；
20-20.1min：A：由94％线性降低为89％，B：6％，C：由0％线性上升为5％；
20.1-35min：A：由85％线性降低为74％，B：6％，C：由5％线性上升为20％；
35.1-45min：A：由74％线性降低为20％，B：由6％线性上升为80％，C：由20％线性下降为0％；
45.1-55min：A：由20％线性上升为94％，B：由80％线性下降为6％，C：0％。
结果如图6所示。图6中，横坐标表示保留时间(time)，纵坐标表示吸光强度单位(mAU)，所标数字表示不同的单糖。经分析可知，WXD030 EPS的单糖组成主要有：氨基葡萄糖(T＝5.68)峰面积占整体34.89％；葡萄糖(T＝9.53)峰面积占整体27.95％和甘露糖(T＝12.01)峰面积占整体17.97％。此外，还有少量的阿拉伯糖(T＝6.65)峰面积占整体0.98％；氨基半乳糖(T＝7.32)峰面积占整体8.05％；半乳糖(T＝8.33)峰面积占整体3.68％和葡萄糖醛酸(T＝27.73)峰面积占整体6.48％。各主要组分摩尔比葡萄糖：氨基葡萄糖：甘露糖约为1.4:1.1:1。
实施例3、WXD030胞外多糖在作为免疫佐剂中的应用研究
一、WXD030胞外多糖刺激小鼠骨髓来源细胞(BMDCs)后细胞因子的分泌
1、依次按照如下步骤制备小鼠骨髓来源细胞(BMDCs)：
(1)取6-8周龄BALB/c雌鼠(SPF级，北京维通利华实验动物技术有限公司)，断颈处死后置于75％酒精中浸泡5-10min；
(2)无菌取股骨、胫骨和肱骨，置于浸泡用PBS中；
(3)小心去除骨上附着的肌肉组织、结缔组织和软骨组织，置于浸泡用PBS中清洗，移入新鲜的浸泡用PBS中；
(4)用无菌镊子夹住骨头，剪掉两端骨骺后，用1mL无菌注射器吸取含双抗的RPMI1640基础培养基，从骨骺的一端反复冲洗至骨髓腔变白，将冲洗液收集在15mL离心管中，1000rpm离心6min，弃上清；
(5)用1mL含双抗的RPMI 1640基础培养基重悬细胞，加入10倍体积37℃预温的红细胞裂解液，混匀室温放置3-5min，1000rpm离心6min，弃上清；
(6)加入适量BMDCs完全培养基，血球计数板计数，配成1×106个/mL细胞悬液，分装到T75透气细胞培养瓶中。37℃，5％CO2条件下培养，第三天和第六天时半量换液，在第7天时得到小鼠骨髓来源细胞(BMDCs)。
BMDCs完全培养基：RPMI 1640培养基218.5mL，10％胎牛血清(Hyclone，货号:SH30070.03)，1％双抗(Gibco，货号:15140-122)，1％谷氨酰胺(Gibco，货号:35050-061)，GM-CSF 20ug/L(ebioscience，货号:BMS325)，IL-410ug/L(ebioscience，货号:14-8041-62)。
2、取步骤1得到的小鼠骨髓来源细胞，用新鲜的RPMI 1640细胞培养液调整细胞浓度为1×105个/mL，每孔100μL接入96孔板，37℃，5％CO2条件下培养，4h后进行分组操作(每组设三个重复)：
对照组(PBS)：弃掉培养液，替换为100μLPBS；
LPS组(LPS)：弃掉培养液，替换为含有1μg/mL脂多糖(LPS，Sigma公司)的RPMI1640细胞培养液；
WXD030 EPS组(EPS)：弃掉培养液，替换为含有500μg/mL实施例2步骤三得到的WXD030 EPS的RPMI 1640细胞培养液；
37℃，5％CO2培养箱中培养24h，吸取细胞上清。
3、完成步骤2后，采用TNF-α检测试剂盒(R&D Systems，货号：MTA00B)检测上清液中的TNF-α含量。
4、完成步骤2后，采用IL-6检测试剂盒(R&D Systems，货号：D6050)检测上清液中的IL-6含量。
5、完成步骤2后，采用IL-10检测试剂盒(R&D Systems，货号：M1000B)检测上清液中的IL-10含量。
6、完成步骤2后，采用IL-12检测试剂盒(R&D Systems，货号：M1270)检测上清液中的IL-12含量。
结果如图7所示。在24h时，WXD030 EPS组可以显著促进小鼠BMDCs分泌TNF-α，与对照组相比差异显著(图7A)。同样，与对照组相比，WXD030 EPS组刺激小鼠BMDCs 24h后，可以显著上调其分泌IL-6的量(图7B)。在24h时，WXD030 EPS组可以显著上调BMDCs IL-10的表达，比LPS组的值高出约2倍，与对照组相比差异极显著(图7C)。在刺激BMDCs 24h后，WXD030EPS组也能显著上调BMDCs IL-12的表达，与对照组相比差异极显著(图7D)。
二、小鼠免疫实验
1、取6-8周龄BALB/c雌性小鼠(SPF级，北京维通利华实验动物技术有限公司)56只，随机分为7组，每组8只。实验分组和免疫情况如表1所示。每只小鼠背部皮下多点注射免疫，间隔14天连续免疫两次。
表1实验动物分组与免疫
OVA：Sigma，货号：9006-59-1。
Alum：Thermo Fisher Scientific，货号：77161。
首次免疫后14天以及第二次免疫后14天眼眶取血，分离血清。间接ELISA法检测血清中OVA特异性IgG抗体水平：
(1)包被：用包被缓冲液将OVA配置成浓度为10μg/mL的OVA溶液，在酶标板反应孔中每孔加100μL，4℃过夜。甩去孔内液体，洗板机洗板3次，拍干。
(2)封闭：每孔加入200μL 5％BSA封闭液，37℃孵育2h。甩去孔内液体，洗板机洗板3次，拍干。
(3)加入待检血清：每孔加入100μL待检血清，开始1:100稀释，之后倍比稀释。置温箱中，37℃孵育2h。用洗涤缓冲液洗板5次，每次3min，拍干。
(4)加入HRP标记的IgG抗体或IgG抗体亚类(IgG1，IgG2a或IgG2b)：向个实验孔中加入新鲜稀释的酶标抗体(1:5000稀释)100μL。37℃孵育2h，甩去孔内液体，洗板机洗板3次，拍干。
(5)显色：向各反应孔中加入双组份TMB显色液100μL，37℃孵育15min。
(6)终止：每孔加入ELISA终止液50μL终止反应，轻轻震荡混匀。
(7)结果判定：将96孔板置于酶标仪上，450nm下读数，输出到Excel中，阳性滴度的终点为高于同等稀释度的阴性血清平均值的2.1倍(即待检血清OD值/本底血清OD值>2.1)，用被检血清最大稀释度以2为底的对数(log2)表示。
结果如图8所示。首次免疫14天后，与OVA组相比，OVA+Alum组、OVA+WXD030 EPS(200μg)组和OVA+WXD030 EPS(400μg)组均产生较高水平的IgG，且差异显著(p<0.05)，OVA+WXD030 EPS(100μg)组产生的IgG滴度与OVA组相当；与OVA+Alum组相比，OVA+WXD030 EPS(100μg)、OVA+WXD030 EPS(200μg)组和OVA+WXD030 EPS(400μg)组差异均不显著。首次免疫14天后，与OVA组相比，OVA+Alum组、OVA+WXD030 EPS(100μg)、OVA+WXD030 EPS(200μg)组和OVA+WXD030 EPS(400μg)组都产生了较高水平的IgG1(p<0.05)。与OVA+Alum组相比，OVA+WXD030 EPS(100μg)、OVA+WXD030 EPS(200μg)组和OVA+WXD030 EPS(400μg)组差异均不显著。各浓度WXD030 EPS对小鼠体内OVA特异性IgG抗体亚类IgG1的产生无浓度依赖性。首次免疫14天后，只有OVA+WXD030 EPS(400μg)组产生了较高水平的IgG2a和IgG2b，OVA组、OVA+Alum组、OVA+WXD030 EPS(100μg)和OVA+WXD030 EPS(200μg)组均没有产生OVA特异性IgG2a和IgG2b。
在二次免疫14天后，与OVA组相比，OVA+Alum组、OVA+WXD030 EPS(100μg)、OVA+WXD030 EPS(200μg)组和OVA+WXD030 EPS(400μg)组都产生了较高水平的IgG(p<0.05)。与OVA+Alum组相比，OVA+WXD030 EPS(400μg)组能显著提高小鼠体内OVA特异性IgG抗体水平，但OVA+WXD030 EPS(100μg)和OVA+WXD030 EPS(200μg)组则无显著性差异。对比WXD030 EPS不同浓度对OVA特异性IgG抗体产生的影响发现，各浓度之间无浓度依赖性，但在WXD030EPS浓度为400μg/mL时，产生的抗体滴度最高。与OVA组相比，OVA+Alum组、OVA+WXD030EPS(100μg)、OVA+WXD030 EPS(200μg)组和OVA+WXD030 EPS(400μg)组都产生了较高水平的IgG1(p<0.05)，且与OVA+Alum组相比，OVA+WXD030 EPS(400μg)组能显著提高小鼠体内OVA特异性IgG抗体亚类IgG1的水平。各浓度WXD030 EPS对小鼠体内OVA特异性IgG抗体亚类IgG1的产生具有一定的剂量依赖性，即WXD030 EPS的浓度越大，产生的抗体水平越高。第二次免疫14天后，只有OVA+Alum组和OVA+WXD030 EPS(400μg)组产生了较高水平的IgG2a，且与OVA+Alum组相比，OVA+WXD030 EPS(400μg)组能显著提高小鼠体内OVA特异性IgG抗体亚类IgG2a的水平。与OVA组相比，OVA+Alum组、OVA+WXD030 EPS(100μg)、OVA+WXD030 EPS(200μg)组和OVA+WXD030 EPS(400μg)组都产生了较高水平的IgG2b(p<0.05)。与OVA+Alum组相比，OVA+WXD030 EPS(400μg)组能显著提高小鼠体内OVA特异性IgG抗体亚类IgG2b的水平，但OVA+WXD030 EPS(100μg)和OVA+WXD030 EPS(200μg)组则无显著性差异。各浓度WXD030EPS对小鼠体内OVA特异性IgG抗体亚类IgG2b的产生无浓度依赖性，但在WXD030 EPS浓度为400μg/mL时，产生的抗体滴度最高。
2、取6-8周龄BALB/c雌性小鼠56只，随机分为7组，每组8只。实验分组和免疫情况如表1所示。每只小鼠背部皮下多点注射免疫，间隔14天连续免疫两次。第二次免疫7天后，断颈处死小鼠，检测小鼠脾脏T淋巴细胞增殖能力：
(1)将小鼠酒精浸泡5-10min，置于超净台内，用手术剪小心剪开小鼠左侧腹部皮肤，分离皮下组织以及小鼠腹部肌肉使脾脏暴露。用干净手术剪小心剪去脾脏周围的结缔组织，立即放入盛有RPMI 1640培养基的培养皿中。用注射器塞在200目滤网上小心挤压脾脏，将获得的细胞悬液用200目滤网过滤后移入15mL离心管中，1000rpm离心8min，弃上清。
(2)加入5mL RPMI 1640细胞完全培养基，移液器反复吹打重悬细胞。吸取细胞悬液，使其缓慢通过玻璃棉柱，收集滤液。1000rpm离心8min，弃上清。
(3)加入2mL 37℃预温的红细胞裂解液，室温裂解2-3min。加入等体积含4％FBS的RPMI 1640终止反应，1000rpm离心8min，弃上清。
(4)加入2mL PBS并用移液器反复吹打重悬细胞重悬细胞，血球计数板计数，调整细胞至1×106个/mL。
(5)加入CFSE染色，每1mL细胞悬液加1μL CFSE，37℃孵育20min，避光。
(6)加入5倍体积含1％FBS的RPMI 1640完全培养基，37℃孵育5min，避光。
(7)加入2mL RPMI 1640完全培养基重悬细胞，100μL/孔加入96孔板各孔中，分别用浓度为5μg/mL的ConA和10μg/mL的OVA刺激，每个样品设三个重复。37℃，5％CO2条件下培养72h。
(8)反复吹打每孔细胞使细胞悬浮，转移到1.5mL离心管中，1000rpm离心8min，弃上清。
(9)流式细胞仪检测。
结果如图9所示。结果表明，与OVA组相比，OVA+WXD030 EPS(200μg)组和OVA+WXD030 EPS(400μg)组能显著提高小鼠脾脏T淋巴细胞的增殖能力。
3、取6-8周龄BALB/c雌性小鼠56只，随机分为7组，每组8只。实验分组和免疫情况如表1所示。每只小鼠背部皮下多点注射免疫，间隔14天连续免疫两次。第二次免疫7天后，断颈处死小鼠，利用ELISA法检测小鼠脾脏T淋巴细胞上清中细胞因子INF-γ(R&DSystems，货号：DIF50)和IL-4(R&D Systems，货号：M4000B)的含量。
(1)将小鼠酒精浸泡5-10min，置于超净台内，用手术剪小心剪开小鼠左侧腹部皮肤，分离皮下组织以及小鼠腹部肌肉使脾脏暴露。用干净手术剪小心剪去脾脏周围的结缔组织，立即放入盛有RPMI 1640培养基的培养皿中。用注射器塞在200目滤网上小心挤压脾脏，将获得的细胞悬液用200目滤网过滤后移入15mL离心管中，1000rpm离心8min，弃上清。
(2)加入5mL RPMI 1640细胞完全培养基，移液器反复吹打重悬细胞。吸取细胞悬液，使其缓慢通过玻璃棉柱，收集滤液。1000rpm离心8min，弃上清。
(3)加入2mL 37℃预温的红细胞裂解液，室温裂解2-3min。加入等体积含4％FBS的RPMI 1640终止反应，1000rpm离心8min，弃上清。
(4)加入2mL PBS并用移液器反复吹打重悬细胞重悬细胞，血球计数板计数，调整细胞至1×106个/mL。
(5)每孔200μL加入96孔板中，37℃，5％CO2条件下培养72h，6000rpm离心收集细胞上清，利用ELISA法检测小鼠脾脏T淋巴细胞上清中细胞因子INF-γ(R&D Systems，货号：DIF50)和IL-4(R&D Systems，货号：M4000B)的含量。。
结果如图10所示。与OVA组相比，OVA+Alum组和OVA+WXD030 EPS(400)组均能显著提高小鼠脾脏T淋巴细胞INF-γ和IL-4的分泌量。与OVA+Alum组相比，OVA+WXD030 EPS组刺激小鼠脾脏T淋巴细胞分泌细胞因子INF-γ和IL-4的量显著增加。
结果如图11所示。图11A所示为IL-4+CD4+T细胞所占总T细胞比例，从图中可以看出，PBS组、OVA组、OVA+Alum组、OVA+WXD030 EPS组以及EPS组IL-4+CD4+T细胞所占百分比分别为8.44％、19.92％、23.02％、30.42％和11.62％。与OVA组相比，OVA+Alum组和OVA+WXD030 EPS组IL-4+CD4+T细胞所占比例显著提高；且与OVA+Alum组相比，OVA+WXD030 EPS组IL-4+CD4+T细胞所占比例同样也显著提高。
图11B所示为IFN-γ+CD4+T细胞所占总T细胞比例，从图中可以看出，PBS组、OVA组、OVA+Alum组、OVA+WXD030 EPS组以及EPS组IFN-γ+CD4+T细胞所占百分比分别为6.10％、8.27％、9.16％、10.34％、7.74％。与OVA组相比，OVA+Alum组和OVA+WXD030 EPS组IFN-γ+CD4+T细胞所占比例显著提高；且与OVA+Alum组相比，OVA+WXD030 EPS组IFN-γ+CD4+T细胞所占总T细胞比例显著提高。
4、取6-8周龄BALB/c雌性小鼠56只，随机分为7组，每组8只。实验分组如表3所示。每只小鼠背部皮下多点注射免疫，间隔14天连续免疫两次，首次免疫后2周、4周、6周和8周眼眶取血，分离血清。
口蹄疫疫苗146S：内蒙古金宇保灵生物药品有限公司。
ISA206佐剂：内蒙古金宇保灵生物药品有限公司。
表3实验动物分组与免疫
间接ELISA法检测血清中FMDV特异性IgG抗体水平：
(1)包被：用包被缓冲液将OVA配置成浓度为10μg/mL的FMDV溶液，在酶标板反应孔中每孔加100μL，4℃过夜。甩去孔内液体，洗板机洗板3次，拍干。
(2)封闭：每孔加入200μL 5％BSA封闭液，37℃孵育2h。甩去孔内液体，洗板机洗板3次，拍干。
(3)加入待检血清：每孔加入100μL待检血清，开始1:100稀释，之后倍比稀释。置温箱中，37℃孵育2h。用洗涤缓冲液洗板5次，每次3min，拍干。
(4)加入HRP标记的IgG抗体或IgG抗体亚类(IgG1，IgG2a或IgG2b)：向个实验孔中加入新鲜稀释的酶标抗体(1:5000稀释)100μL。37℃孵育2h，甩去孔内液体，洗板机洗板3次，拍干。
(5)显色：向各反应孔中加入双组份TMB显色液100μL，37℃孵育15min。
(6)终止：每孔加入ELISA终止液50μL终止反应，轻轻震荡混匀。
(7)结果判定：将96孔板置于酶标仪上，450nm下读数，输出到Excel中，阳性滴度的终点为高于同等稀释度的阴性血清平均值的2.1倍(即待检血清OD值/本底血清OD值>2.1)，用被检血清最大稀释度以2为底的对数(log2)表示。
结果如图12所示。首免后第二周，免疫146S+ISA206+WXD030 EPS组抗体滴度与单独免疫146S组相比差异显著；而到第4、第6和第8周时，除免疫146S+ISA206+WXD030 EPS组外，免疫146S+ISA206组和免疫146S+WXD030 EPS组与单独免疫146S组相比，血清中抗体滴度与显著提高，表明WXD030 EPS在400μg剂量下，能辅助ISA206提高146S的抗体滴度。
序列表
<110> 内蒙古大学
<120> 一种乳酸菌胞外多糖及免疫佐剂
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1428
<212> DNA
<213> 干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)
<400> 1
gtcgacgagt tctcgttgat gatcggtgct tgcaccgaga ttcaacatgg aacgagtggc 60
ggacgggtga gtaacacgtg ggtaacctgc ccttaagtgg gggataacat ttggaaacag 120
atgctaatac cgcatagatc caagaaccgc atggttcttg gctgaaagat ggcgtaagct 180
atcgcttttg gatggacccg cggcgtatta gctagttggt gaggtaatgg ctcaccaagg 240
cgatgatacg tagccgaact gagaggttga tcggccacat tgggactgag acacggccca 300
aactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccacaatg gacgcaagtc tgatggagca 360
acgccgcgtg agtgaagaag gctttcgggt cgtaaaactc tgttgttgga gaagaatggt 420
cggcagagta actgttgtcg gcgtgacggt atccaaccag aaagccacgg ctaactacgt 480
gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca agcgttatcc ggatttattg ggcgtaaagc 540
gagcgcaggc ggttttttaa gtctgatgtg aaagccctcg gcttaaccga ggaagcgcat 600
cggaaactgg gaaacttgag tgcagaagag gacagtggaa ctccatgtgt agcggtgaaa 660
tgcgtagata tatggaagaa caccagtggc gaaggcggct gtctggtctg taactgacgc 720
tgaggctcga aagcatgggt agcgaacagg attagatacc ctggtagtcc atgccgtaaa 780
cgatgaatgc taggtgttgg agggtttccg cccttcagtg ccgcagctaa cgcattaagc 840
attccgcctg gggagtacga ccgcaaggtt gaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca 900
caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc aggtcttgac 960
atcttttgat cacctgagag atcaggtttc cccttcgggg gcaaaatgac aggtggtgca 1020
tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct 1080
tatgactagt tgccagcatt tagttgggca ctctagtaag actgccggtg acaaaccgga 1140
ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga cctgggctac acacgtgcta 1200
caatggatgg tacaacgagt tgcgagaccg cgaggtcaag ctaatctctt aaagccattc 1260
tcagttcgga ctgtaggctg caactcgcct acacgaagtc ggaatcgcta gtaatcgcgg 1320
atcagcacgc cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccatga 1380
gagtttgtaa cacccgaagc cggtggcgta acccttttag ggagcgag 1428

Claims (10)

1.干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)WXD030，其保藏编号为：CGMCC No.12415。
2.权利要求1所述的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)WXD030或其培养物在制备胞外多糖中的应用。
3.干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)WXD030的胞外多糖的制备方法，包括如下步骤：培养权利要求1所述的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)WXD030，得到胞外多糖。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：采用MRS液体培养基培养干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)WXD030。
5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述培养的温度为37℃；所述培养的时间为30h；所述培养为静置培养。
6.权利要求3至5任一所述的方法制备得到的胞外多糖。
7.权利要求1所述的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)WXD030或其发酵物在制备产品中的应用；所述产品的用途为如下(a1)-(a7)中的至少一种：
(a1)作为免疫佐剂；
(a2)提高疫苗的免疫效果；
(a3)提高疫苗诱发的特异性抗体含量；
(a4)促进TNF-α和/或IL-6和/或IL-10和/或IL-12和/或INF-γ和/或IL-4分泌；
(a5)促进淋巴细胞增殖；
(a6)提高脾脏IL-4+CD4+T细胞和/或IFN-γ+CD4+T细胞和/或IFN-γ+CD8+T细胞的数量；
(a7)作为免疫促进剂。
8.权利要求6所述的胞外多糖在制备产品中的应用；所述产品的用途为如下(a1)-(a7)中的至少一种：
(a1)作为免疫佐剂；
(a2)提高疫苗的免疫效果；
(a3)提高疫苗诱发的特异性抗体含量；
(a4)促进TNF-α和/或IL-6和/或IL-10和/或IL-12和/或INF-γ和/或IL-4分泌；
(a5)促进淋巴细胞增殖；
(a6)提高脾脏IL-4+CD4+T细胞和/或IFN-γ+CD4+T细胞和/或IFN-γ+CD8+T细胞的数量；
(a7)作为免疫促进剂。
9.一种产品，包括权利要求6所述的胞外多糖；所述产品的用途为如下(a1)-(a6)中的至少一种：
(a1)作为免疫佐剂；
(a2)提高疫苗的免疫效果；
(a3)提高疫苗诱发的特异性抗体含量；
(a4)促进TNF-α和/或IL-6和/或IL-10和/或IL-12和/或INF-γ和/或IL-4分泌；
(a5)促进淋巴细胞增殖；
(a6)提高脾脏IL-4+CD4+T细胞和/或IFN-γ+CD4+T细胞和/或IFN-γ+CD8+T细胞的数量。
10.一种产品，包括权利要求1所述的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)WXD030和疫苗。
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