CN111961696A - 一种植物乳杆菌589产的胞外多糖及制备方法、应用和含植物乳杆菌或胞外多糖的组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物食品技术领域，为进一步对植物乳杆菌589的性能进行保护，本发明提供了一种植物乳杆菌589产的胞外多糖，具有促进脾淋巴细胞增殖的作用。胞外多糖由活化后MRS液体培养基中培养得到。本发明对植物乳杆菌589的性能进行了深入的拓展，提供了植物乳杆菌589产的胞外多糖以及高产胞外多糖的方法，胞外多糖的产量达到580mg/L左右；并且植物乳杆菌589及其衍生物均可以促进脾淋巴细胞增殖的作用，其中植物乳杆菌589产的胞外多糖具有促进脾淋巴细胞增殖的低剂量浓度，仅1μg/mL，而植物乳杆菌589也具有低用量促进脾淋巴细胞增殖的低剂量浓度，仅为1×10⁷CFU。

Description

一种植物乳杆菌589产的胞外多糖及制备方法、应用和含植物 乳杆菌或胞外多糖的组合物

本发明涉及生物食品技术领域，具体涉及一种植物乳杆菌产的胞外多糖及制备方法、应用和含植物乳杆菌或胞外多糖的组合物。

背景技术

乳酸菌产生的胞外多糖是在其生长、代谢过程中分泌到细胞外的粘液或荚膜多糖。自然界中产胞外多糖的乳酸菌很多，主要是从传统的发酵食品(如乳制品、泡菜、酸面团等) 中分离获得。影响乳酸菌胞外多糖合成的因素有很多，不同种属的乳酸菌产胞外多糖的能力明显不同L.rhamnosus的胞外多糖产量为12-400mg/L，S.thermophilus的胞外多糖产量为 50-350mg/L，L.plantarum的胞外多糖产量为30-200mg/L，L.delbrueckiisubsp.bulgaricus的胞外多糖产量为60-150mg/L，L.casei的胞外多糖产量为50-60mg/L。研究表明，鼠李糖乳杆菌GG(L.rhamnosus GG，LGG)菌株能够产生胞外多糖，但因受到研究条件(培养基组成、培养条件、提取纯化方法等)的影响，不同的文献报道LGG菌株胞外多糖产量不同。同时研究发现，乳酸菌胞外多糖还具有多种生理活性，如抗氧化、抗病毒、降血压、降胆固醇、抗肿瘤等。

乳酸菌被认为是绿色安全的益生菌。因此，产胞外多糖的乳酸菌可以直接应用到发酵生产中，能够改善乳制品的质构、粘度和口感，使其发酵乳产品增稠、质地细腻均匀、稳定、口感润滑。同时，乳酸菌胞外多糖还可作为益生元促进肠道内其他益生菌的生长，改善肠道微生态环境，促进机体健康。乳酸菌胞外多糖的产量普遍不高，因此，从自然生境中筛选具有高产胞外多糖，且又具有一定生理活性的乳酸菌菌株对功能性发酵剂开发意义重大。

申请人在前期的研究中从四川泡菜样品中分离得到一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)新菌株589，并就其在腹泻预防中的应用进行了研究，但是对于该菌株是否具有产胞外多糖的能力以及能否具有更多的生理活性，则有待进一步研究。

发明内容

为进一步对植物乳杆菌589的性能进行保护，本发明提供了一种植物乳杆菌589产的胞外多糖，具有促进脾淋巴细胞增殖的作用。

本发明的另一目的在于提供该植物乳杆菌589产的胞外多糖的制备方法，具有非常高的胞外多糖产量。

本发明的另一目的还在于提供该植物乳杆菌589或植物乳杆菌589的胞外多糖在促进脾淋巴细胞增殖上的应用。

同时本发明的另一目的还在于提供一种可促进脾淋巴细胞增殖的组合物。

本发明提供如下的技术方案：

一种植物乳杆菌589产的胞外多糖，所述植物乳杆菌589保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏时间2018年5月25日，微生物保藏编号为CGMCCNo.15811。申请人就植物乳杆菌589菌株及其在腹泻预防方面的应用提出专利申请，目前已经公开，公开号为：CN109666601A；专利名称为：一株具有抑菌特性的植物乳杆菌及其在腹泻预防中的应用。本申请的发明人团队在前期研究基础上对植物乳杆菌589进行继续挖掘研究，发现该菌株具有产胞外多糖即EPS的能力，并且所产胞外多糖具有促进脾淋巴细胞增殖的作用。

上述植物乳杆菌589产的胞外多糖的制备方法，其特征在于，步骤如下：

1)对植物乳杆菌589进行活化；

2)将活化后的植物乳杆菌589接种于液体培养基中发酵培养；

3)收集发酵培养后的植物乳杆菌589的菌液，灭菌后离心收集上清液，向上清液中加入三氯乙酸溶液并静置；

4)离心分离步骤3)静置后的溶液体系，收集上清液并加冰乙醇沉降，离心分离并收集沉淀；蒸馏水透析沉淀，冷冻干燥透析液得到胞外多糖。

作为本发明方法的优选，步骤1)中的活化包括一代活化和二代活化；所述一代活化为：将植物乳杆菌589的菌株以0.8～2％的接种量接种于80～150mL液体培养基中，在35～ 38℃恒温培养箱中培养12～20h完成一代活化；重复一代活化过程完成二代活化；

步骤2)的发酵培养为：将植物乳杆菌589通过全部活化过程后得到的活化菌液按接种量0.8～ 2％接种于0.8～1.5L的液体培养基中，在35～38℃恒温培养箱中发酵培养20～30h；

步骤3)中三氯乙酸的加入方法为：加入质量体积百分比为75～90％的三氯乙酸溶液至质量体积百分比为4～5％，然后2～4℃静置过夜；

步骤4)的乙醇沉降和透析为：向上清液中加入2～3倍体积的95％冰乙醇2～4℃过夜，离心收集沉淀；蒸馏水溶解沉淀，装入透析袋中蒸馏水透析42～60h，每6～8h更换一次蒸馏水。

作为本发明方法的优选，所述液体培养基为MRS液体培养基或质量浓度8～10％的脱脂乳溶液培养基。

作为本发明方法的优选，所述步骤1)的活化还包括在二代活化后的两级短时活化：将二代活化后的菌株按接种量0.8～2％接种于80～150mL的质量浓度8～10％的脱脂乳溶液培养基37～38℃培养0.5～1h完成一级短时活化；然后重复一级短时活化过程完成二级短时活化；其中一代活化和二代活化所用液体培养基为MRS液体培养基；

所述步骤2)的发酵培养为：将经过二级短时活化后的活化菌液按接种量0.8～2％接种于0.8～ 1.5L的质量浓度10％的脱脂乳溶液培养基中，在35～38℃恒温培养箱中发酵培养20～30h。

本申请的发明人针对植物乳杆菌589特性，建立胞外多糖的发酵制备方法，将植物乳杆菌经两次活化后再置于液体培养基中发酵培养，获得了高产量的胞外多糖，采用MRS液体培养基下发酵培养，胞外多糖含量达到580mg/L，是商业菌株LGG的2倍，具有非常重要的应用价值。同时发明人经过进一步的研究发现，在现有活化基础上引入短时活化过程，并且将一代、二代活化的液体培养基由MRS液体培养基在短时活化中更改为10％脱脂乳溶液培养基，然后采用10％脱脂乳溶液发酵培养可以有效提升胞外多糖的产量。发明人推测，这可能与脱脂溶液培养基与MRS液体培养基的组分不同，对植物乳杆菌589具有更好的相适应性相关，经过两代活化后的植物乳杆菌589置于10％脱脂乳液中短时活化激发了更高的活性，并且在脱脂乳液中得到充分的培养发酵，从而提升了胞外多糖的产量。

上述植物乳杆菌589产的胞外多糖或植物乳杆菌589在促进脾淋巴细胞增殖上的应用。本申请的技术人员经过研究发现，植物乳杆菌589以及所产的胞外多糖具有促进脾淋巴细胞增强的作用，对于将植物乳杆菌589或其胞外多糖在制备具有保健效果的食品上的应用具有积极意义。其中植物乳杆菌589产的胞外多糖具有促进脾淋巴细胞增殖的低剂量浓度，仅1μg/mL，而植物乳杆菌589也具有低剂量浓度促进脾淋巴细胞增殖的效果，施加浓度仅为1×10⁷CFU。

一种可促进脾淋巴细胞增殖的组合物，所述组合物为含有如权利要求1所述的胞外多糖、或者含有植物乳杆菌589、或者含有植物乳杆菌589的衍生物的生理上可接受的赋形剂或稀释剂。

作为本发明的优选，所述植物乳杆菌589的衍生物为植物乳杆菌589经诱变、驯化、基因重组或者自然突变而获得的突变体；或者所述植物乳杆菌589的衍生物为含有植物乳杆菌589和/或植物乳杆菌589的突变体的菌体培养物；或者所述植物乳杆菌589的衍生物为含有植物乳杆菌589产胞外多糖和/或植物乳杆菌589的突变体产胞外多糖的菌体培养物；所述菌体培养物为培养的菌液或菌剂。

作为本发明的优选，所述赋形剂和稀释剂为口服形式的食品、药品或保健品；

所述食品为发酵乳、乳酪、含乳饮料、乳粉、固体饮料或发酵果蔬；

所述药品或保健品为胶囊、粉剂或片剂。

本发明的有益效果如下：

本发明对植物乳杆菌589的性能进行了深入的拓展，提供了植物乳杆菌589产的胞外多糖以及高产胞外多糖的方法，胞外多糖的产量达到580mg/L左右；并且植物乳杆菌589及其衍生物均可以促进脾淋巴细胞增殖的作用，其中植物乳杆菌589产的胞外多糖具有促进脾淋巴细胞增殖的低剂量浓度，仅1μg/mL，而植物乳杆菌589也具有促进脾淋巴细胞增殖的低剂量浓度，仅为1×10⁷CFU。

附图说明

图1为植物乳杆菌589菌株的生长曲线和产酸曲线。

图2为植物乳杆菌589菌株的单菌落拉丝图。

图3为植物乳杆菌589菌株的菌液拉丝图。

图4为实施例2中植物乳杆菌589与对比例中商业LGG菌株的胞外多糖产量对照图。

图5为植物乳杆菌589菌株与商业LGG菌株、空白对照组的促脾淋巴细胞增殖效果的对照图。

图6为植物乳杆菌589菌株的发酵乳产酸三次重复试验的速率曲线；

其中，图1中，图1A表示生长曲线图，图1B表示产酸曲线图；

图4中，*：p<0.05；**：p<0.01；

图5中，*：p<0.05；**：p<0.01；CK表示空白对照组。

具体实施方式

下面就本发明的具体实施方式作进一步说明。

如无特别说明，本发明中所采用的原料均可从市场上购得或是本领域常用的，如无特别说明，下述实施例中的方法均为本领域的常规方法。

实施例1

一种植物乳杆菌589产的胞外多糖，该植物乳杆菌589由发明人从四川泡菜样品中分离得到，鉴定属于植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，命名植物乳杆菌589，于2018年5月25 日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏，微生物保藏编号为 CGMCC No.15811，由发明人从我国四川泡菜样品中分离得到。

实施例2

植物乳杆菌589产的胞外多糖的制备方法，包括以下步骤：

1)将植物乳杆菌589的菌株按1％的接种量接种于100mL的MRS液体培养基中，在37℃恒温培养箱中培养14h进行一代活化；将一代活化得到的菌液以1％的接种量接种于100mL的MRS液体培养基中，在37℃恒温培养箱中培养14h进行二代活化，得到活化菌液；

2)将植物乳杆菌589的活化菌液按接种量1％接种于1L的MRS液体培养基中，在37℃恒温培养箱中发酵培养24h；

3)收集发酵培养后的植物乳杆菌589的菌液，煮沸10min灭菌，然后离心收集上清液，向上清液中加入质量体积百分比为80％(m/v)的三氯乙酸溶液至质量体积百分比为4％(m/v)，然后4℃静置过夜；

4)离心分离步骤3)静置后的溶液体系，收集上清液，向上清液中加入2.5倍体积的95％冰乙醇4℃过夜，离心收集沉淀；蒸馏水溶解沉淀，装入透析袋中蒸馏水透析48h，每8h更换一次蒸馏水，冷冻干燥透析液得到胞外多糖。

实施例3

植物乳杆菌589产的胞外多糖的制备方法，包括以下步骤：

1)将植物乳杆菌589的菌株在35℃恒温培养箱中培养20h进行一代活化；然后将一代活化得到的菌液以0.8％的接种量接种于80mL的MRS液体培养基中，在35℃恒温培养箱中培养20h进行二代活化，得到活化菌液；

2)将植物乳杆菌589的活化菌液按接种量0.8％接种于0.8L的MRS液体培养基中，在35℃恒温培养箱中发酵培养30h；

3)收集发酵培养后的植物乳杆菌589的菌液，煮沸10min灭菌，然后离心收集上清液，向上清液中加入质量体积百分比为75％的三氯乙酸溶液至质量体积百分比为5％(m/v)，然后4℃静置过夜；

4)离心分离步骤3)静置后的溶液体系，收集上清液，向上清液中加入2倍体积的95％冰乙醇2℃过夜，离心收集沉淀；蒸馏水溶解沉淀，装入透析袋中蒸馏水透析42h，每7h更换一次蒸馏水，冷冻干燥透析液得到胞外多糖。

实施例4

植物乳杆菌589产的胞外多糖的制备方法，包括以下步骤：

1)将植物乳杆菌589的菌株在38℃恒温培养箱中培养12h进行一代活化得到一代菌液；然后将一代活化得到的菌液以2％的接种量接种于150mL的MRS液体培养基中，在38℃恒温培养箱中培养12h进行二代活化，得到活化菌液；

2)将植物乳杆菌589的活化菌液按接种量2％接种于1.5L的MRS液体培养基中，在38℃恒温培养箱中发酵培养20h；

3)收集培养后的植物乳杆菌589的菌液，煮沸10min灭菌，然后离心收集上清液，向上清液中加入质量体积百分比为90％的三氯乙酸溶液至质量体积百分比为4％(m/v)，然后4℃静置过夜；

4)离心分离步骤3)静置后的溶液体系，收集上清液，向上清液中加入3倍体积的95％冰乙醇4℃过夜，离心收集沉淀；蒸馏水溶解沉淀，装入透析袋中蒸馏水透析60h，每6h更换一次蒸馏水，冷冻干燥透析液得到胞外多糖。

实施例5

植物乳杆菌589产的胞外多糖的制备方法，与实施例2的不同之处在于，以质量浓度为10％的脱脂乳溶液为液体培养基替代MRS液体培养基，完成一代活化、二代活化和发酵培养。

实施例6

植物乳杆菌589产的胞外多糖的制备方法，包括以下步骤：

1)将植物乳杆菌589的菌株按1％的接种量接种于100mL的MRS液体培养基中，在37℃恒温培养箱中培养14h进行一代活化；将一代活化得到的菌液以1％的接种量接种于100mL的MRS液体培养基中，在37℃恒温培养箱中培养14h进行二代活化得到二代菌液；

将二代菌液按接种量2％接种于150mL的质量浓度10％的脱脂乳溶液培养基中，37℃培养1h 完成一级短时活化；然后重复一级短时活化过程完成二级短时活化，得到活化菌液；

2)将植物乳杆菌589的活化菌液按接种量1％接种于1L的质量浓度10％的脱脂乳溶液培养基中，在37℃恒温培养箱中发酵培养24h；

3)收集发酵培养后的植物乳杆菌589的菌液，煮沸10min灭菌，然后离心收集上清液，向上清液中加入质量体积百分比为80％(m/v)的三氯乙酸溶液至质量体积百分比为4％(m/v)，然后4℃静置过夜；

4)离心分离步骤3)静置后的溶液体系，收集上清液，向上清液中加入2.5倍体积的95％冰乙醇4℃过夜，离心收集沉淀；蒸馏水溶解沉淀，装入透析袋中蒸馏水透析48h，每8h更换一次蒸馏水，冷冻干燥透析液得到胞外多糖。

实施例7

植物乳杆菌589产的胞外多糖的制备方法，与实施例6的不同之处在于步骤1)过程：将二代菌液按接种量1％接种于100mL的质量浓度10％的脱脂乳溶液培养基中38℃培养1h完成一级短时活化；然后重复一级短时活化过程完成二级短时活化得到活化菌液。

实施例8

植物乳杆菌589产的胞外多糖的制备方法，与实施例6的不同之处在于步骤1)过程：将二代菌液按接种量0.8％接种于80mL的质量浓度8％的脱脂乳溶液培养基中37℃培养2h完成一级短时活化；然后重复一级短时活化过程完成二级短时活化得到活化菌液。

对比例1

采用实施例2同样的方法对商业LGG菌株进行发酵培养，冷冻干燥透析液后得到LGG菌株产的胞外多糖。

对比例2

与实施例6的不同之处在于，步骤1)和步骤2)中采用MRS液体培养基替代质量浓度10％的脱脂乳溶液培养基完成两级短时活化和发酵培养。

对比例3

与实施例6的不同之处在于，步骤2)中采用MRS液体培养基替代质量浓度10％的脱脂乳溶液培养基完成发酵培养。

对比例4

与实施例6的不同之处在于，步骤1)中采用质量浓度10％的脱脂乳溶液培养基替代MRS液体培养基完成一代活化和二代活化。

对比例5

与实施例6的不同之处在于，步骤1)中采用质量浓度10％的脱脂乳溶液培养基替代MRS液体培养基完成一代活化和二代活化；并在步骤1)和步骤2)中采用MRS液体培养基替代质量浓度10％的脱脂乳溶液完成两级短时活化和发酵培养。

植物乳杆菌589的性能测试

1、植物乳杆菌589的生理特征

本发明菌株植物乳杆菌589的生理特征使用API 50CHL系统测试。表1中列出了本发明菌株植物乳杆菌589菌株的API 50CHL测试的结果。

表1 API 50CHL测试的结果

。

2、植物乳杆菌589的生长曲线和产酸曲线

本发明菌株植物乳杆菌589经MRS液体培养基二代活化后，按1％接种量接种于100mL的MRS液体培养基中，在37℃温度下培养24h，每隔2h取样一次，测定在600nm波长的光密度(OD)值和pH值，绘制生长曲线和产酸曲线，设置三次重复，结果如图1所示。

从图1A可以看出，植物乳杆菌589在经过0～2h的迟缓期后，从2h开始快速生长，进入对数生长期，14h结束对数期后进入稳定期。由图1B可知，植物乳杆菌589在0～10h 快速生长，产酸迅速，16～24h趋于稳定，说明植物乳杆菌589具有良好的生长和发酵特性。

3、植物乳杆菌589的发酵特征

(1)液体培养基：将菌株植物乳杆菌589经MRS液体培养基二代活化后，在MRS固体培养基上划线，于37℃厌氧培养48h；用无菌接种棒挑取单菌落，观察单菌落拉丝情况；

(2)固体培养基：将菌株植物乳杆菌589经二代活化后，以1％的接种量接种在MRS液体培养基中，于37℃厌氧培养24h；用无菌玻璃棒搅拌，观察菌液拉丝情况。

结果如图2和图3所示，植物乳杆菌589单菌落和菌液拉丝明显，其中单菌落拉丝长1.5cm，菌液拉丝长4.7cm，菌液粘稠，不易离心。

4、植物乳杆菌589的产胞外多糖的能力测试

采用苯酚-硫酸法测总糖含量，DNS(3,5-二硝基水杨酸)比色法测定各实施例和对比例中还原糖含量，用总糖含量减去还原糖含量，差值即为胞外多糖含量，即：胞外多糖含量＝总糖含量-还原糖含量。测总糖回归方程：y＝0.0105x+0.0769(R²＝0.9986)，测还原糖回归方程： y＝2.0969x-0.217(R²＝0.9984)。

实施例2中植物乳杆菌589的胞外多糖产量与对比例1中商业LGG菌株的胞外多糖产量的对照结果见图4。

各实施例和对比例中胞外多糖产量见表2所示。

(1)植物菌株589与商业菌株LGG的产胞外多糖能力对比。

由图4可知，植物乳杆菌589胞外多糖产量为578.61±65.61mg/L，显著高于对照商业菌株LGG(280.00±35.00mg/L)，是对照商业菌株LGG的2.07倍。说明植物乳杆菌589 具有高产胞外多糖的能力。

(2)各实施例和对比例产胞外多糖的含量见表2所示。

表2胞外多糖含量测试结果。

5、植物乳杆菌589促进脾淋巴细胞增殖的能力

(1)脾淋巴细胞悬浮液获取：

在温度为21±2℃，湿度为70％，12h光照交替条件下饲养昆明小鼠，维持小鼠自由摄入饲料和饮水。昆明小鼠饲养1周后，脱颈椎处死，无菌取小鼠脾脏，用无菌的玻璃注射器芯将其碾碎，200目金属筛网过滤后，经ACK细胞裂解液裂解5min，加入含10％胎牛血清的无菌Hank’s液终止裂解，1000rpm，4℃离心5min，沉淀重悬于5mL含10％胎牛血清的 RPMI-1640培养基；用台盼蓝染色，血细胞计数板计数，计算活细胞数和活细胞率；调整细胞浓度为5×10⁶cells/mL；

(2)诱导增殖：

将细胞悬液加入96孔细胞培养板，每个处理5个重复，分为调零组(细胞培养基)，空白对照组(细胞培养基+细胞悬液cell)，诱导剂组(细胞培养基+细胞悬液cell+诱导剂10μg/mL Con A或LPS)，菌处理组(细胞培养基+细胞悬液cell++菌悬液1×10⁷cfu/mL)，诱导剂+菌处理组(细胞培养基+细胞悬液cell+诱导剂10μg/mL Con A或LPS+菌悬液1×10⁷ cfu/mL)，37℃5％CO₂培养箱中培养72h。培养结束后，加入MTT溶液(2.5mg/ml)，37℃显色4h后，吸出上清，再加入DMSO，用酶标仪于490nm下测定吸光值。

结果如图5所示，植物乳杆菌589能够显著促进脾淋巴细胞增殖。在没有诱导剂的条件下，提高79.79％，用量浓度仅1×10⁷CFU，与对照商业菌株LGG相当，是对照商业菌株LGG的1.02倍；在Con A诱导的条件下，提高127.55％，是对照商业菌株LGG的1.13倍；在LPS诱导的条件下，提高110.36％，是对照商业菌株LGG的1.20倍。说明植物乳杆菌589 能够显著促进脾脏中T、B淋巴细胞的增殖，具有免疫调节活性，且优于对照商业菌株LGG。

植物乳杆菌589胞外多糖促进脾淋巴细胞增殖的能力

(1)脾淋巴细胞悬浮液获取；与“植物乳杆菌589促进脾淋巴细胞增殖的能力”部分相同； (2)诱导增殖：

以实施例2所得胞外多糖和对比例1所得胞外多糖为例，将细胞悬液加入96孔细胞培养板，每个处理5个重复，分为调零组(细胞培养基)，空白对照组(细胞培养基+细胞悬液)，诱导剂组(细胞培养基+细胞悬液+诱导剂10μg/mL Con A或LPS)，菌处理组(细胞培养基+ 细胞悬液+菌株胞外多糖溶液20μg/mL)，诱导剂+菌株胞外多糖处理组(细胞培养基+细胞悬液+诱导剂10μg/mL Con A或LPS+菌株胞外多糖溶液20μg/mL)，37℃5％CO₂培养箱中培养72h。培养结束后，加入MTT溶液(2.5mg/ml)，37℃显色4h后，吸出上清，再加入DMSO，用酶标仪于490nm下测定吸光值。

结果如表3所示，植物乳杆菌589胞外多糖能够显著促进脾淋巴细胞增殖。在没有诱导剂的条件下，提高73.33％，显著高于对照商业菌株LGG，是对照商业菌株LGG的1.23倍；在Con A诱导的条件下，提高75.28％，是对照商业菌株LGG的1.23倍；在LPS诱导的条件下，提高76.96％，是对照商业菌株LGG的1.14倍。说明植物乳杆菌589胞外多糖能够显著促进脾脏中T、B淋巴细胞的增殖，具有免疫调节活性，且优于对照商业菌株LGG。

表3植物乳杆菌589产生的胞外多糖促脾淋巴细胞增殖结果

诱导剂	空白对照组	LGG胞外多糖	植物乳杆菌589胞外多糖
				不加诱导剂	0.150±0.006<sup>a</sup>	0.212±0.006<sup>b</sup>	0.260±0.020<sup>c</sup>
ConA(10μg/mL)	0.174±0.034<sup>a</sup>	0.248±0.043<sup>b</sup>	0.305±0.039<sup>c</sup>
				LPS(10μg/mL)	0.178±0.017<sup>a</sup>	0.276±0.008<sup>b</sup>	0.315±0.019<sup>c</sup>

注：a，b，c：p<0.05。

6、植物乳杆菌589产胞外多糖不同浓度的促脾淋巴细胞增殖的能力按照“植物乳杆菌589促进脾淋巴细胞增殖的能力”中的方法制备脾淋巴细胞悬液，调整细胞浓度为5×10⁶cells/mL；将细胞悬液加入96孔细胞培养板，每个处理5个重复，分为调零组(细胞培养基)，空白对照组(细胞培养基+细胞悬液)，诱导剂组(细胞培养基+细胞悬液+诱导剂10μg/mL Con A或LPS)，胞外多糖处理组(细胞培养基+细胞悬液+诱导剂10 μg/mL Con A或LPS胞外多糖溶液)，胞外多糖溶液浓度为1、5、10、25、50、100μg/mL， 37℃5％CO₂培养箱中培养72h。培养结束后，按照“植物乳杆菌589促进脾淋巴细胞增殖的能力”中的方法进行检测，其中，所用胞外多糖分别来源于实施例2。

结果如表4所示，植物乳杆菌589分泌的胞外多糖能够显著促进脾淋巴细胞增殖。在没有诱导剂的条件下可提高93.27～164.42％；在Con A诱导的条件下可提高81.58～149.12％；在LPS诱导的条件下可提高80.15～125.95％。说明植物乳杆菌589分泌的胞外多糖不同浓度作用效果不同，但都能够显著促进脾脏中T、B淋巴细胞的增殖，具有免疫调节活性，浓度在1～100μg/mL都有显著效果，但10～25μg/mL效果最佳。

表4植物乳杆菌589产生的胞外多糖不同浓度促脾淋巴细胞增殖结果

注：*：p<0.05；**：p<0.01。

应用实施例

实施例9植物乳杆菌589冻干菌粉的制作

本发明菌株植物乳杆菌589以1％的接种量接种于10mL液体MRS培养基中，在37℃恒温培养箱中培养14h(一代菌液)。一代菌液以1％的接种量接种于100mL液体MRS培养基中，在37℃恒温培养箱中培养14h(二代菌液)。二代种子1％的接种量接种于10L含有液体 MRS培养基的发酵罐中，150rpm，pH 6.0，37℃培养16h，收集菌液，8000rpm离心10min 收集菌体，用0.9％生理盐水洗涤一次，加入四倍菌泥量的含有脱脂乳粉、葡萄糖、甘油的保护剂中重悬，真空冷冻干燥，菌粉真空包装，制得的菌粉活菌数可达2×10¹¹CFU/g。将上述植物乳杆菌589冻干菌粉应用于药品、保健品、食品、饮料或发酵剂产品的制作和生产上。

实施例10植物乳杆菌589发酵乳的制作

称取脱脂乳100g，45-50℃的纯水900g，50℃温水溶解，剪切30min，50℃水化30min，均质，95℃杀菌10min，降温后按1％接种量接入应用实施例8中的植物乳杆菌589冻干菌粉，37℃发酵12h，4℃后熟8-12h。观察其凝乳状态，用打蛋器破乳后，检测其产酸曲线、拉丝长度、pH、黏度、酸度和活菌数，并对其发酵风味进行评估，设置三次重复。

结果如表5和图6所示，发酵乳凝乳状态紧实，表面光滑，无乳清洗出，破乳后丝滑粘稠，拉丝长度25.57cm，活菌数4.97×10⁸CFU/g，感官和风味良好，奶香明显，口感细腻丝滑，该发酵乳即为含有植物乳杆菌589及其胞外多糖的功能性发酵乳。

表5植物乳杆菌589发酵乳特性

拉丝长度(cm)	pH值	黏度(cP)	酸度(°T)	活菌数lg值(CFU/g)
					25.57±0.57	3.71±0.03	5910±8.98	89.67±0.45	8.70±0.05

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

例如，本申请还提供了一种可促进脾淋巴细胞增殖的组合物；该组合物可以为含有植物乳杆菌产的胞外多糖、或者含有植物乳杆菌589、或者含有植物乳杆菌589的衍生物的生理上可接受的赋形剂或稀释剂；

其中植物乳杆菌589的衍生物为植物乳杆菌589经诱变、驯化、基因重组或者自然突变而获得的突变体；或者植物乳杆菌589的衍生物为含有植物乳杆菌589和/或植物乳杆菌589的突变体的菌体培养物；或者植物乳杆菌589的衍生物为含有植物乳杆菌589产胞外多糖和/或植物乳杆菌589的突变体产胞外多糖的菌体培养物；

菌体培养物为培养的菌液或菌剂；

赋形剂和稀释剂为口服形式的食品、药品或保健品；食品为发酵乳、乳酪、含乳饮料、乳粉、固体饮料或发酵果蔬；药品或保健品为胶囊、粉剂或片剂。

Claims (9)

1.一种植物乳杆菌589产的胞外多糖，其特征在于，所述植物乳杆菌589保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏时间2018年5月25日，微生物保藏编号为CGMCC No.15811。

2.如权利要求1所述的植物乳杆菌589产的胞外多糖的制备方法，其特征在于，步骤如下：

1）对植物乳杆菌589进行活化；

2）将活化后的植物乳杆菌589接种于液体培养基中发酵培养；

3）收集发酵培养后的植物乳杆菌589的菌液，灭菌后离心收集上清液，向上清液中加入三氯乙酸溶液并静置；

4）离心分离步骤3）静置后的溶液体系，收集上清液并加冰乙醇沉降，离心分离并收集沉淀；蒸馏水透析沉淀，冷冻干燥透析液得到胞外多糖。

3.根据权利要求2所述的植物乳杆菌589产的胞外多糖的制备方法，其特征在于，

步骤1）中的活化包括一代活化和二代活化；所述一代活化为：将植物乳杆菌589的菌株以0.8～2%的接种量接种于80～150 mL液体培养基中，在35～38℃恒温培养箱中培养12～20 h完成一代活化；将一代活化后的菌株重复活化一次完成二代活化；

步骤2）的发酵培养为：将植物乳杆菌589通过全部活化过程后得到的活化菌液按接种量0.8～2%接种于0.8～1.5 L的液体培养基中，在35～38℃恒温培养箱中发酵培养20～30h；

步骤3）中三氯乙酸的加入方法为：加入质量体积百分比为75～90%的三氯乙酸溶液至质量体积百分比为4～5%，然后2～4℃静置过夜；

步骤4）的乙醇沉降和透析为：向上清液中加入2～3倍体积的95%冰乙醇2～4℃过夜，离心收集沉淀；蒸馏水溶解沉淀，装入透析袋中蒸馏水透析42～60 h，每6～8 h更换一次蒸馏水。

4.根据权利要求2或3所述的植物乳杆菌589产的胞外多糖的制备方法，其特征在于，所述液体培养基为MRS液体培养基或质量浓度10%的脱脂乳溶液培养基。

5.根据权利要求3所述的植物乳杆菌589产的胞外多糖的制备方法，其特征在于，

所述步骤1）的活化还包括在二代活化后的两级短时活化：将二代活化后的菌液按接种量0.8～2%接种于80～150 mL的质量浓度8～10%的脱脂乳溶液培养基37～38℃培养1～2 h完成一级短时活化；然后重复一级短时活化完成二级短时活化；其中一代活化和二代活化所用液体培养基为MRS液体培养基；

所述步骤2）的发酵培养为：将经过二级短时活化后的活化菌液按接种量0.8～2%接种于0.8～1.5 L的质量浓度8～10%的脱脂乳溶液培养基中，35～38℃恒温培养箱中发酵培养20～30 h。

6.如权利要求1所述的胞外多糖或植物乳杆菌589在促进脾淋巴细胞增殖上的应用。

7.一种可促进脾淋巴细胞增殖的组合物，其特征在于，所述组合物为含有如权利要求1所述的胞外多糖、或者含有植物乳杆菌589、或者含有植物乳杆菌589的衍生物的生理上可接受的赋形剂或稀释剂。

8.根据权利要求7所述的可促进脾淋巴细胞增殖的组合物，其特征在于，所述植物乳杆菌589的衍生物为植物乳杆菌589经诱变、驯化、基因重组或者自然突变而获得的突变体；或者所述植物乳杆菌589的衍生物为含有植物乳杆菌589和/或植物乳杆菌589的突变体的菌体培养物；或者所述植物乳杆菌589的衍生物为含有植物乳杆菌589产胞外多糖和/或植物乳杆菌589的突变体产胞外多糖的菌体培养物；所述菌体培养物为培养的菌液或菌剂。

9.根据权利要求7所的可促进脾淋巴细胞增殖的组合物，其特征在于，所述赋形剂和稀释剂为口服形式的食品、药品或保健品；

所述食品为发酵乳、乳酪、含乳饮料、乳粉、固体饮料或发酵果蔬；

所述药品或保健品为胶囊、粉剂或片剂。

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