CN112501046A - 一株具有减肥功能的发酵乳杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物领域，公开了一株具有减肥功能的发酵乳杆菌及其应用。该发酵乳杆菌命名为WHH3906，分离自我国西藏自治区采集的酥油中，已在2020年3月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，其保藏编号为CGMCC NO.19472，微生物分类命名为发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum。该发酵乳杆菌菌株能有效降低血清瘦素水平以恢复机体的瘦素敏感性，有效预防和治疗肥胖，缓解非酒精性脂肪肝，并能缓解慢性炎症；与植物乳杆菌1701复配后能协同缓解慢性炎症。

Description

一株具有减肥功能的发酵乳杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，尤其涉及一株具有减肥功能的发酵乳杆菌及其应用。
背景技术
根据我国疾控中心一项最新研究显示，对全国范围内的超过17万人进行调查发现，全国成年人肥胖的患病率为14％，其中男性的患病率为14％，女性为14.1％；腹部肥胖患病率为35.1％，男性患病率为30.7％，女性为32.4％，并存在地区及性别差异，其中京津冀的肥胖及腹部肥胖率最高。然而，随着小康生活的到来，我国居民生活水平将更上一层楼，超重与肥胖人口将越来越多，一系列随之而生的疾病也将会给人们的生活带来困扰，给国家经济的发展带来了沉重的负担。
肥胖已成为全世界范围内主要的公共卫生问题，不仅影响外表体征，还会对人体的健康造成严重危害。大量的流行病学研究和临床试验发现肥胖与胰岛素抵抗、糖尿病、非酒精性脂肪肝、高血脂、高血压、冠状动脉粥样硬化性心脏病等紧密相关，其用于治疗肥胖及肥胖并发症的医疗费用难以估量。目前，FDA已批准的减肥药主要有奥利司他、罗卡西林、利拉鲁肽、苯丁胺-托吡酯和纳曲酮-安非拉酮，这类药主要作用机理是酶类抑制剂或作用于神经系统增加饱腹感或减少食物摄入，来控制体重，长期服用易产生副作用，引起身体不适。肥胖易引发肠道微生物失衡，乳酸菌可以调节肠道微生态，改善肠道健康，增加肠道中乳酸菌、双歧杆菌和AKK(Akkermansia muciniphila)丰度，能够减少脂肪堆积，降低体重。同时，乳酸菌也是健康个体肠道菌群的重要组成部分，其在减肥功能方面存在一定的潜力。
目前，减肥相关的益生菌产品在中国市场尚属空白。但国外已有商业化益生菌菌株能够减少脂肪堆积或降低体重。UAS Labs的格氏乳杆菌BNR17(Lactobacillus gasseriBNR17) 具有抑制脂联素和瘦素分泌的作用，能够减少脂肪组织。杜邦丹尼斯克的动物双歧杆菌B420 (Bifidobacterium animalis ssp.lactis 420)能够控制体重，增加AKK(Akkermansia muciniphila) 菌的定植。森永乳业的短双歧杆菌B-3(Bifidobacteriumbreve B-3)有助于降低亚肥胖成年人的体脂水平。此类益生菌是从国外发酵食品或人体粪便中分离得到，且其功效验证多基于国外人群的大规模临床试验或流行病学分析，但国外人群与我国人群在人种基因、体质、生活环境、饮食以及肠道菌群组成等方面均存在差异，不一定适用于我国肥胖群体。同时，这些不同益生菌的作用具有菌株特异性，并且个体肠道菌群及生理状态差异明显，同一种益生菌不一定能够对所有人群都适用。因此，仍然需要开发更多具有控制体重、减少脂肪堆积的其它益生菌新菌株来填补现有菌株的空白，满足不同人群的需求。
此外，瘦素能够促进脂解和脂肪细胞凋亡，抑制脂肪合成，减少体内脂肪堆积，减轻体重，在天然免疫、获得性免疫中也发挥着重要作用。肥胖者血清瘦素水平虽然很高，但机体产生了瘦素抵抗，对瘦素不敏感或无反应。已有研究报道，瘦素水平过高会导致瘦素抵抗，对于肥胖个体而言，提高其血清瘦素水平反而会加剧体重增长，而适当降低其血清瘦素水平，能提高其瘦素敏感性，从而减轻体重，治疗肥胖。然而，目前尚未发现具有降低血清瘦素功能的发酵乳杆菌。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一株具有减肥功能的发酵乳杆菌及其应用。该发酵乳杆菌菌株能有效降低血清瘦素水平以恢复机体的瘦素敏感性，有效预防和治疗肥胖，缓解非酒精性脂肪肝，并能缓解慢性炎症。
本发明的具体技术方案为：
第一方面，本发明提供了一株具有减肥功能的发酵乳杆菌，所述发酵乳杆菌命名为WHH3906，已在2020年3月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，其保藏编号为CGMCC NO.19472，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，微生物分类命名为发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum。
上述发酵乳杆菌WHH3906是从我国西藏自治区采集的酥油中分离得到的，其16SrRNA基因序列如SEQ ID NO:1所示，生物学性质如实施例1所示。
上述发酵乳杆菌WHH3906具有减肥功能，具体表现在以下方面：
(1)具有良好的耐酸耐胆盐能力和黏附性，可以顺利通过胃肠道，并定殖于肠道中，发挥益生功能：在HT-29细胞模型试验中表现出良好的黏附能力，单细胞黏附菌数达7.01±0.86，分别是对照商业菌株LcS和LGG的4.64倍和1.34倍；在pH 2.5环境下孵育4h存活率为97.48％，在0.3％胆盐浓度下孵育8h存活率为79.85％，优于对照商业菌株LcS和LGG；
(2)能够有效降低体重，减少脂肪堆积：服用剂量在1×109CFU/d具有显著效果，体重降低水平达8.18％，体重增加量降低22.03％，脂肪重量降低19.13％，体脂比降低13.25％；
(3)能够显著降低血清总胆固醇和甘油三酯水平；
(4)能够显著降低血清瘦素水平，使肥胖个体恢复对瘦素的敏感性，因而能有效促进脂解和脂肪细胞凋亡，抑制脂肪合成，减少体内脂肪堆积，减轻体重。
上述发酵乳杆菌WHH3906能缓解非酒精性脂肪肝，具体表现在以下方面：
(1)能够显著降低肝脏重量和脏器比：服用剂量在1×109CFU/d具有显著效果，肝脏重量降低16.88％，脏器比降低6.25％；
(2)能够显著减轻肝脏组织细胞的脂肪变性，减少脂肪空泡，且空泡更小；
(3)具有较强的抗氧化能力，具有较高的清除DPPH能力和清除羟自由基能力：清除DPPH和羟自由基的能力分别是对照商业菌株的2.10倍和1.69倍，能够缓解肝脏由于氧化应激引起的损伤；
(4)能够显著降低肝脏中总胆固醇和甘油三酯的水平：服用活菌株剂量在1×109CFU/d范围内都具有显著效果，肝脏中总胆固醇降低15.15％，甘油三酯降低7.07％。
上述发酵乳杆菌WHH3906能缓解慢性炎症，具体表现在以下方面：
(1)能够有效促进脾淋巴细胞增殖；
(2)能够有效促进脾淋巴细胞分泌抑炎因子(即具有抑制炎症作用的细胞因子)IL-10，且能够促进IL-12的分泌；
(3)能够有效促进巨噬细胞分泌抑炎因子IL-10，抑制其分泌促炎因子(即具有促进炎症作用的细胞因子)IL-6、TNF-α和NO；
(4)能够显著降低血清中LPS的水平：服用剂量在1×109CFU/d具有显著效果，长期肥胖的大鼠血清中LPS的水平降低21.27％；
(5)能够显著降低血清中促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1和NO的水平；
(6)能够显著降低肝脏中促炎因子L-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1和NO的水平。
第二方面，本发明提供了一种具有减肥功能的发酵乳杆菌的突变体，所述突变体为对权利要求1所述发酵乳杆菌进行诱变、驯化、基因重组或者经自然突变而获得的突变体。
第三方面，本发明提供了所述发酵乳杆菌或所述突变体在制备用于减肥或控制体重的食品、药品、保健品或发酵剂中的应用。
第四方面，本发明提供了所述发酵乳杆菌或所述突变体在制备用于缓解非酒精性脂肪肝的食品、药品、保健品或发酵剂中的应用。
第五方面，本发明提供了所述发酵乳杆菌或所述突变体在制备用于缓解慢性炎症的食品、药品、保健品或发酵剂中的应用。
第六方面，本发明提供了一种组合物，含有所述发酵乳杆菌和/或所述突变体，并含有生理上可接受的赋形剂和/或稀释剂。
作为优选，所述组合物为食品、药品、保健品或发酵剂。
作为优选，所述食品为发酵乳、乳酪、含乳饮料、乳粉、发酵果蔬或固体饮料。
作为优选，所述药品或保健品的制剂形式为胶囊、粉剂或片剂。
作为优选，所述组合物为口服形式。
第七方面，本发明提供了一种用于缓解慢性炎症的组合物，含有所述发酵乳杆菌和/ 或所述突变体，并含有植物乳杆菌1701和/或其突变体；所述植物乳杆菌1701已在2019年 10月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCCNo.18728，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，微生物分类命名为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum；所述突变体为对所述植物乳杆菌进行诱变、驯化、基因重组或者经自然突变而获得的突变体。
植物乳杆菌1701也具有缓解慢性炎症的作用，它能提高血清中抑炎因子IL-10的水平，降低促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1和NO的水平，并能降低肝脏组织中促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1和NO的水平。研究发现，将发酵乳杆菌WHH3906和植物乳杆菌1701复配后，两者在缓解慢性炎症方面表现出较好的协同效果，相较于单一菌株而言，能更有效地提高血清中抑炎因子IL-10的水平，以及降低血清和肝脏中促炎因子IL-1β、IL-6、 TNF-α、MCP-1和NO的水平。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明所提供的发酵乳杆菌WHH3906具备良好的黏附特性和耐酸耐胆盐特性，可以顺利通过胃肠道，并定殖于肠道中，发挥益生功能；
(2)本发明所提供的发酵乳杆菌WHH3906能够降低脂肪重量、体脂比，以及血清中的瘦素、总胆固醇和甘油三酯水平，减少脂肪堆积，减轻体重，有效预防和治疗肥胖；
(3)本发明所提供的发酵乳杆菌WHH3906具有较强的抗氧化能力，能够降低肝脏重量，减少肝脏中总胆固醇和甘油三酯的含量，减轻肝脏组织细胞的脂肪变性，减少脂肪空泡，从而缓解非酒精性脂肪肝；
(4)本发明所提供的发酵乳杆菌WHH3906能够促进脾淋巴细胞增殖，促进脾淋巴细胞和巨噬细胞分泌IL-10，并促进脾淋巴细胞分泌IL-12，抑制巨噬细胞分泌IL-6、TNF-α和NO，降低机体中促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1和NO的水平，从而缓解慢性炎症；
(5)本发明所提供的发酵乳杆菌WHH3906和植物乳杆菌1701的组合物中，两种菌株在缓解慢性炎症方面表现出较好的协同效果，相较于单一菌株而言，该组合物能更有效地缓解慢性炎症；
(6)本发明所提供的发酵乳杆菌WHH3906所属的发酵乳杆菌是被囊括于卫生部2010年颁布的《可用于食品的菌种名单》的食品级微生物。
附图说明
图1为本发明菌株的菌落特征(左图)和革兰氏染色显微镜观察特征(右图)。
图2为本发明菌株的生长曲线。
图3为本发明菌株的黏附实验镜检结果图。其中，左图为对照商业菌株LcS的黏附实验镜检结果图，中间图为对照商业菌株LGG的黏附实验镜检结果图，右图为本发明菌株发酵乳杆菌WHH3906的黏附实验镜检结果图。
图4为大鼠摄食量和摄入总能量的变化。A图为摄食量，B图为摄入总能量。*：表示与模型组相比，差异显著，p<0.05；**：表示与模型组相比，差异极显著，p<0.01。
图5为大鼠体重和总增重的变化。A图为体重，B图为总增重。*：表示与模型组相比，差异显著，p<0.05；**：表示与模型组相比，差异极显著，p<0.01。
图6为大鼠脂肪重和体脂比的变化。A图为脂肪重，B图为体脂比。*：表示与模型组相比，差异显著，p<0.05；**：表示与模型组相比，差异极显著，p<0.01。
图7为大鼠血清总胆固醇和甘油三酯的变化。A图为总胆固醇，B图为甘油三酯。*：表示与模型组相比，差异显著，p<0.05；**：表示与模型组相比，差异极显著，p<0.01。
图8为大鼠血清瘦素的变化。*：表示与模型组相比，差异显著，p<0.05；**：表示与模型组相比，差异极显著，p<0.01。
图9为各组别大鼠的肝脏组织HE染色切片图。切片放大倍数为200倍，其中，左图为对照组，中间为模型组，右边为实验组。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施例1：发酵乳杆菌WHH3906的生物学性质
本发明所提供的菌株经鉴定属于发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)，命名为WHH3906菌株，于2020年3月13日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏，微生物保藏编号为CGMCC NO.19472。
本发明所提供的菌株发酵乳杆菌WHH3906是从我国西藏自治区采集的酥油中分离得到。
本发明所提供的菌株发酵乳杆菌WHH3906的生物学性质如下：
形态学特征：在MRS琼脂培养基中生长形态为乳白色圆形菌落，表面光滑湿润、边缘整齐、不透明、中央凸起。革兰氏染色呈典型阳性，显微镜下观察细胞呈短杆状，无鞭毛，不产芽孢，不运动(图1所示)。
培养特征：最适生长温度为37℃，兼性厌氧，生长于MRS培养基中。
生理特征：使用API 50CHL系统。表1中列出了本发明菌株发酵乳杆菌WHH3906 的API 50CHL测试的结果。
表1 API 50结果
Figure RE-GDA0002856559920000061
生物学鉴定：针对16S rRNA基因序列测序，结果如SEQ ID NO:1所示，将序列于NCBI的GenBank数据库中进行同源性比对分析，结果显示该菌株为发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)。
实施例2：发酵乳杆菌WHH3906的培养本发明菌株发酵乳杆菌WHH3906经二代活化后，按1％接种量接种于MRS培养基中，在37℃温度下培养24h，每隔1h取样一次，测定在600nm波长的光密度(OD)值，绘制生长曲线，设置三次重复。
结果如图2所示，发酵乳杆菌WHH3906在经过0-2h的迟缓期后，从2h开始快速生长进入对数生长期，13h结束对数期进入稳定期。
实施例3：发酵乳杆菌WHH3906的耐酸耐胆盐性能本发明菌株发酵乳杆菌WHH3906、对照商业菌株干酪乳杆菌代田株(LcS)和对照商业菌株鼠李糖乳杆菌GG(LGG)经二代活化后，取对数生长末期菌液，4000rpm离心10min，弃上清，获得菌泥，分别进行如下操作：①加入相同体积pH 2.5的MRS溶液，吹打混匀后，在37℃环境下孵育，用稀释涂布计数法测定0点及孵育1h、2h、4h后菌数的变化；②加入相同体积的含0.3％胆盐的MRS溶液，吹打混匀后，在37℃环境下孵育，用稀释涂布计数法测定0点及孵育4h、8h后菌数的变化，设置三次重复。菌株存活率计算公式：
菌株存活率(％)＝N1/N0*100％。
N1为菌株孵育后活菌数的log10值，N0为菌株初始活菌数的log10值。
结果如表2所示，本发明菌株发酵乳杆菌WHH3906具有良好的耐受特性。在pH 2.5环境下，孵育2h存活率为98.97％，孵育4h存活率为97.48％，显著优于对照商业菌株LcS，与对照商业菌株LGG相当。在0.3％胆盐浓度下，孵育4h存活率为80.38％，孵育8h存活率为79.85％，且4-8h活菌数基本没有变化，而对照商业菌株LcS和LGG未检测到活菌数。说明发酵乳杆菌WHH3906具有良好的胃酸和胆盐耐受特性，优于对照商业菌株LcS和LGG。
表2 耐受性结果
Figure RE-GDA0002856559920000071
-：未检测到。
实施例4：发酵乳杆菌WHH3906的黏附性
建立HT-29细胞培养体系，细胞生长于含10％胎牛血清的DMEM培养基中(含青霉素100U/mL，链霉素100mg/mL)。待细胞传至第三代，采用0.25％的胰酶(含EDTA)消化，获得单细胞悬液，细胞以1×106细胞/孔的密度接种于已放置细胞爬片的12孔细胞培养板中，于37℃，5％CO2培养箱中培养2d。
本发明菌株发酵乳杆菌WHH3906、对照商业菌株干酪乳杆菌代田株(LcS)和对照商业菌株鼠李糖乳杆菌GG(LGG)经二代活化后，取对数生长末期菌液，4000rpm离心10min，弃上清，获得菌泥，重悬于含10％胎牛血清的DMEM完全培养基(不加双抗)中，取2×108 CFU/mL的菌液1mL接种于上述12孔细胞培养板中，37℃下于5％CO2培养箱中孵育2h。孵育结束后，缓慢吸去培养液，用PBS洗涤3次，用100％甲醇固定8min。取出细胞爬片静置20min，经革兰氏染色后，用中性树脂封片。于光学显微镜下进行观察，设置三次重复，每个片子随机选取10个视野计数。
结果如表3和图3所示，发酵乳杆菌WHH3906的单细胞黏附数达7.01±0.86，显著优于对照商业菌株LcS和LGG(1.51±0.30，5.25±0.78)。
表3 黏附性结果
菌株编号 黏附率(菌数/细胞数)
LcS 1.51±0.30<sup>a</sup>
LGG 5.25±0.78<sup>b</sup>
WHH3906 7.01±0.86<sup>c</sup>
a，b，c：p<0.05。
实施例5：发酵乳杆菌WHH3906的减肥功效
本发明根据国家保健食品管理法规的有关规定，采用大鼠，在基础饲料中添加15％蔗糖、15％猪油、10％酪蛋白来诱发大鼠肥胖症。同时灌胃发酵乳杆菌WHH3906菌株，活菌数 1×109CFU/mL，其间每周对大鼠摄食量和体重进行检测，最后检测大鼠体重和脂肪含量，来判断该菌株是否具有减轻大鼠体重的功效。
将健康的SPF级雄性大鼠(6-8周龄，200±20g)，适应7天后，随机分为3组，每组 10只。动物饲养保持环境温度为21±2℃，湿度为30-70％，12h光照交替，自由饮水，自由摄入饲料，试验周期为8周。分组如下：
对照组：基础饲料喂养；
模型组：高脂饲料喂养造模，诱导肥胖模型；
实验组：高脂饲料喂养造模，灌胃本发明菌株发酵乳杆菌WHH3906菌悬液，灌胃剂量为1×109CFU/d；
饲料购自江苏省协同医药生物工程有限责任公司，基础饲料主要由鱼粉、小麦、玉米、豆粕、麸皮等组成，总能：3616kcal/kg；高脂饲料是在基础饲料中添加15％蔗糖、15％猪油、10％酪蛋白，总能：4334kcal/kg。
试验结束后，称体重，1％戊巴比妥钠(0.5ml/100g BW)麻醉，采用心脏穿刺取血获取大鼠血液样本，将血液样本取出后，静置30min，4℃，4000rpm离心15min，取上清，用ELISA试剂盒检测血清中总胆固醇、甘油三酯和瘦素含量。脱颈处死后，解剖取肝脏、肾周围脂肪、睾丸周围脂肪，并称重，计算脏器比和体脂比。
由图4可知，实验组的摄食量(图4A)和能量摄入量(图4B)同模型组之间无显著差异，说明发酵乳杆菌WHH3906并不是通过减少摄食量和能量摄入降低体重。
由图5A可知，高脂饮食饲喂一周后，与对照组相比，模型组体重显著高于对照组(p<0.01)，说明造模成功。与模型组相比，第0-6周实验组体重低于模型组，但没有显著性差异，第6-8周实验组体重显著低于模型组(p<0.05，p<0.01)，第8周时，体重降低水平达8.18％。由图5B可知，与模型组相比，实验组体重总增重显著低于模型组(p<0.01)，比模型组低22.03％。说明发酵乳杆菌WHH3906服用浓度在1×109CFU/d能够显著降低体重。
由图6可知，与模型组相比，实验组脂肪重和体脂比显著低于模型组(图6A和B， p<0.05，p<0.01)，分别比模型组降低19.13％和13.25％。说明发酵乳杆菌WHH3906菌株服用浓度在1×109CFU/d能够显著减少脂肪堆积和降低体脂比。
由图7可知，与模型组相比，实验组血清中总胆固醇(图7A)和甘油三酯(图7B) 显著低于模型组(p<0.01，p<0.05)。说明发酵乳杆菌WHH3906菌株服用浓度在1×109CFU/d 能够显著降低血脂水平。
由图8可知，与模型组相比，实验组血清中瘦素含量显著下降(p<0.01)。说明发酵乳杆菌WHH3906菌株服用浓度在1×109CFU/d能够显著降低血清瘦素水平，从而促进脂解和脂肪细胞凋亡，抑制脂肪合成，减少体内脂肪堆积，减轻体重。
总之，发酵乳杆菌WHH3906菌株服用浓度在1×109CFU/d能够显著降低体重，减少脂肪堆积，降低体脂比、血脂和血清瘦素，促进脂解和脂肪细胞凋亡，抑制脂肪合成，是一株具有减肥功能的新菌株。
实施例6：发酵乳杆菌WHH3906缓解非酒精性脂肪肝的功效
1清除DPPH自由基的能力
本发明菌株发酵乳杆菌WHH3906和对照商业菌株鼠李糖乳杆菌GG(LGG)经二代活化后，取对数生长末期菌液，4000rpm离心10min，弃上清，获得菌泥，PBS(pH＝7.4)洗涤2次，菌悬液OD600调至0.5±0.1。在反应体系中加入发酵乳杆菌WHH3906的菌悬液1mL，再加入 1mL0.1mmol/L DPPH的无水乙醇溶液，充分混匀后，室温下避光反应30min，然后经过6000 rpm离心10min，取上清液，测定517nm处的吸光度(OD值)。以等体积的生理盐水代替样品溶液作为对照组，并用等体积的生理盐水和无水乙醇的混合液作为空白调零。按照下式计算DPPH自由基的清除率：
DPPH自由基清除率＝(A0-A1)/A0×100％。
A0：对照的OD510值，A1：植物乳杆菌1701菌液的OD510值。
如表4所示，发酵乳杆菌WHH3906的DPPH自由基清除率达96.24±1.06％，显著高于对照商业菌株LGG(清除率为45.90±0.89％)，是对照商业菌株的2.10倍。说明发酵乳杆菌WHH3906具有较强的抗氧化能力。
表4 菌株的DPPH自由基清除能力结果
菌株编号 LGG WHH3906
DPPH自由基清除率(％) 45.90±0.89 96.24±1.06**
与商业对照菌相比，**：p<0.01。
2清除羟自由基的能力
本发明菌株发酵乳杆菌WHH3906和对照商业菌株鼠李糖乳杆菌GG(LGG)经二代活化后，取对数生长末期菌液，4000rpm离心10min，弃上清，获得菌泥，PBS(pH＝7.4)洗涤2次，测定菌悬液OD600。在反应体系中加入OD值为5的发酵乳杆菌WHH3906菌悬液1mL，再加入1mL生理盐水和1mL FeSO4(3mmol/L)。混匀后，加入1mL H2O2(3mmol/L)，室温静置10min后加入1mL水杨酸(3mmol/L，乙醇溶解)，混匀，37℃水浴20min，离心取上清测定510nm处的吸光值。以等体积的生理盐水代替样品溶液作为对照组，并用等体积的生理盐水和无水乙醇的混合液作为空白调零。按照下式计算羟自由基的清除率：
羟自由基清除率＝(As-Ap)/As×100％
Ap：发酵乳杆菌WHH3906菌液的OD510值，As：菌悬液换成0.9％的生理盐水的OD510值。
如表5所示，发酵乳杆菌WHH3906的羟自由基清除率达95.01±3.54％，显著高于对照商业菌株LGG(清除率为56.29±2.13％)，是对照商业菌株的1.69倍。说明发酵乳杆菌WHH3906具有较强的抗氧化能力。
表5 菌株的羟自由基清除能力结果
菌株编号 LGG WHH3906
羟自由基清除率(％) 56.29±2.13 95.01±3.54**
与商业对照菌相比，**：p<0.01。
3对肝脏重量以及肝脏中的甘油三酯和总胆固醇含量的影响
将健康的SPF级雄性大鼠(6-8周龄，200±20g)，适应7天后，随机分为3组，每组10只。动物饲养保持环境温度为21±2℃，湿度为30-70％，12h光照交替，自由饮水，自由摄入饲料。饲料购自江苏省协同医药生物工程有限责任公司，基础饲料主要由鱼粉、小麦、玉米、豆粕、麸皮等组成；高脂饲料是在基础饲料中添加15％蔗糖、15％猪油、10％酪蛋白。动物实验分组如下：
对照组：基础饲料喂养；
模型组：高脂饲料喂养造模，诱导肥胖模型，使大鼠发生非酒精性脂肪肝；
实验组：高脂饲料喂养造模，灌胃发酵乳杆菌WHH3906菌悬液，灌胃剂量为1×109CFU/d；试验周期为10周，试验结束后，称取体重，1％戊巴比妥钠(0.5ml/100g BW)麻醉，采用心脏穿刺取血获取大鼠血液样本，静置30min，4℃，4000rpm离心15min，取上清，备用。脱颈处死后，解剖取肝脏并称重，计算肝重系数。肝重系数＝肝脏重量(g)/体重(g)×100％。
肝脏称重后用PBS缓冲液制成匀浆，用试剂盒测定肝脏中甘油三酯、总胆固醇的含量。另取同一部位肝脏以1:9体积比，用4％多聚甲醛固定，用于石蜡包埋切片，随后进行HE染色，显微镜下观察肝脏组织形态变化。
由表6可知，与对照组相比，模型组大鼠的体重、肝脏重量以及肝重系数均显著高于对照组(p<0.001)，肝脏重比对照组高出46.17％，表明大鼠已经形成非酒精性脂肪肝。与此同时，实验组的体重、肝重显著低于模型组(p<0.01)，计算得到的肝重指数亦显著低于模型组(p<0.01)。说明发酵乳杆菌WHH3906在摄入剂量为1×109CFU/d时，具有显著改善非酒精性脂肪肝的作用。
表6 大鼠的体重、肝重及肝重系数
组别 体重(g) 肝脏重(g) 肝重系数(％)
对照组 361.41±15.60*** 12.93±0.94*** 3.58±0.22***
模型组 437.01±11.19 18.90±0.98 4.62±0.14
实验组 386.50±37.25** 15.71±2.44** 4.05±0.25**
*：表示与模型组相比，差异显著，p<0.05；**：表示与模型组相比，差异极显著，p<0.01；***：表示与模型组相比，差异极极显著，p<0.001。
由表7可知，与对照组相比，模型组大鼠肝脏中的甘油三酯和总胆固醇含量显著高于对照组(p<0.001)，说明高脂饮食会导致大鼠肝脏中脂质的增加，造成非酒精性脂肪肝。同时，实验组大鼠肝脏中的甘油三酯和总胆固醇含量显著低于模型组(p<0.05和p<0.01)。说明发酵乳杆菌WHH3906菌株在摄入剂量为1×109CFU/d时，可以有效减少肝脏中甘油三酯和总胆固醇含量的增加。
表7 大鼠肝脏中的甘油三酯和总胆固醇含量
组别 甘油三酯(mmol/L) 总胆固醇(mmol/L)
对照组 21.78±4.68*** 0.34±0.03***
模型组 258.53±14.94 0.66±0.08
实验组 240.25±17.15* 0.56±0.07**
*：表示与模型组相比，差异显著，p<0.05；**：表示与模型组相比，差异极显著，p<0.01；***：表示与模型组相比，差异极极显著，p<0.001。
组织形态学观察结果如图9所示，对照组大鼠的肝脏组织结构完整，细胞界限清晰，细胞核位于中央，未发现脂肪空泡。而模型组大鼠的肝脏细胞结构被破坏，胞内存在大量大小不等的脂滴聚集，细胞间隙不清，脂肪沉积明显，可见大量肝细胞脂肪空泡，说明高脂饮食会诱导大鼠非酒精性脂肪肝的发生。同时，我们发现实验组大鼠的肝脏细胞脂肪变性减少，脂肪空泡减少，且空泡变小。说明发酵乳杆菌WHH3906菌株在摄入剂量为1×109CFU/d时，可以有效缓解高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝。
综上所述，发酵乳杆菌WHH3906菌株在摄入剂量为1×109CFU/d时，可有效缓解高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝，减少肝脏中甘油三酯和胆固醇的积累，减轻肝脏组织脂肪变性，是一株具有缓解非酒精性脂肪肝功能的菌株。
实施例7：发酵乳杆菌WHH3906缓解慢性炎症的功效(体外实验)
1对脾淋巴细胞增殖的影响
昆明小鼠饲养温度为22±2℃，湿度为30-70％，12h光照交替，自由饮用水。昆明小鼠饲养1 周后，断颈处死，无菌取小鼠脾脏，用无菌的玻璃注射器芯将其碾碎，200目金属筛网过滤后，经ACK细胞裂解液裂解5min，加入含10％胎牛血清的无菌Hank’s液终止裂解，1000rpm，4℃离心5min，沉淀重悬于5mL含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基。用台盼蓝染色，血细胞计数板计数，计算活细胞数和活细胞率。调整细胞浓度为5×106cells/mL。
本发明菌株发酵乳杆菌WHH3906和对照商业菌株干酪乳杆菌代田株(LcS)经二代活化后，调节菌浓度为1×107CFU/mL。
将细胞悬液加至96孔细胞培养板，每个处理5个重复，分为调零组(细胞培养基)，空白对照组(细胞培养基+细胞悬液)，诱导剂组(细胞培养基+细胞悬液+诱导剂10μg/mLCon A或10μg/mL LPS)，菌处理组(细胞培养基+细胞悬液+诱导剂10μg/mL Con A或10μg/mLLPS+菌悬液1×107CFU/mL)。37℃条件下，CO2培养箱中培养72h。培养结束后，加入MTT 溶液(2.5mg/mL)，37℃共孵育4h后，吸出上清，再加入100μL DMSO，最后于490nm下测定吸光值。
结果如表8所示，在不加诱导剂的情况下，对照商业菌株LcS和WHH3906均可以显著促进小鼠脾淋巴细胞的增殖(分别为p<0.01和p<0.05)。在添加诱导剂ConA的条件下，对照商业菌株LcS和WHH3906均可以有效提高小鼠脾淋巴细胞中T淋巴细胞的增殖能力 (p<0.01)，并且在添加诱导剂LPS的条件下，WHH3906在一定程度上可以促进小鼠脾淋巴细胞中B淋巴细胞的增殖，但是对照商业菌株LcS效果不是很明显。表明本发明菌株发酵乳杆菌WHH3906在体外可以有效促进小鼠脾淋巴细胞的增殖。
表8 菌株对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响结果
处理方式 空白对照 LcS WHH3906
不加诱导剂 0.176±0.006 0.246±0.021** 0.227±0.010*
ConA(10μg/mL) 0.804±0.058 0.901±0.050** 0.870±0.040**
LPS(10μg/mL) 0.803±0.014 0.797±0.014 0.829±0.026
*：与空白对照相比，差异显著，p<0.05；**：与空白对照相比，差异极显著，p<0.01。
2对脾淋巴细胞分泌炎症因子的影响
按照实施例7“1对脾淋巴细胞增殖的影响”中小鼠脾淋巴细胞的制备方法制备脾淋巴细胞悬液，调整细胞浓度为5×106cells/mL。
本发明菌株发酵乳杆菌WHH3906和对照商业菌株干酪乳杆菌代田株(LcS)经二代活化后，调整均浓度到1×107CFU/mL。将细胞悬液加入96孔细胞培养板，每个处理5个重复，分为调零组(细胞培养基)，空白对照组(细胞培养基+细胞悬液)，菌处理组(细胞培养基+细胞悬液+菌悬液1×107CFU/mL)，37℃条件下，CO2培养箱中培养48h。培养结束后， 1500rpm离心10min，吸取上清，0.22μm滤膜过滤，采用ELISA试剂盒测定IL-10和IL-12 含量。
结果如表9所示，与空白对照组相比，WHH3906能够显著促进脾淋巴细胞分泌细胞因子IL-10，到达353.75±2.25pg/mL，显著高于商业对照菌株(305.82±4.26pg/mL)，是对照商业菌株的1.16倍；同时，WHH3906能够显著促进脾淋巴细胞分泌细胞因子IL-12，到达218.28±1.47pg/mL，显著高于商业对照菌株(171.96±3.68pg/mL)，是对照商业菌株的1.27 倍。说明发酵乳杆菌WHH3906能够显著促进脾淋巴细胞分泌细胞因子，且分泌IL-10的能力更强，具有抗炎活性。
表9 菌株对小鼠脾淋巴细胞分泌IL-10和IL-12的影响结果
组别 IL-10 IL-12
空白对照 192.73±2.59 97.24±2.28
LcS 305.82±4.26*** 171.96±3.68***
WHH3906 353.75±2.25***### 218.28±1.47***###
***：与空白对照相比，差异极极显著，p<0.001；###：与LcS相比，差异极极显著，p<0.001。
3对巨噬细胞分泌炎症因子的影响
建立RAW264.7细胞培养体系，细胞生长于含10％胎牛血清的DMEM培养基中(含青霉素100U/mL，链霉素100mg/mL)。待细胞传至第三代，采用0.25％的胰酶(含EDTA)消化，获得单细胞悬液，细胞以1×106细胞/孔的密度接种于24孔细胞培养板中，于37℃，5％CO2培养箱中培养48h。
本发明菌株发酵乳杆菌WHH3906和对照商业菌株干酪乳杆菌代田株(LcS)经二代活化后，取对数生长末期菌液，4000rpm离心10min，弃上清，获得菌泥，重悬于含10％胎牛血清的DMEM完全培养基(不加双抗)中，制成1×109CFU/mL的菌液。非炎症模型组每孔加入100μL菌悬液(1×109CFU/mL)，炎症模型组每孔加入100μL菌悬液(1×109CFU/mL) 和100μL LPS(10μg/ml)，于37℃，5％CO2培养箱中共孵育24h。然后，1500rpm离心10 min，吸取上清，0.22μm滤膜过滤，采用ELISA试剂盒测定NO、IL-10、IL-6和TNF-α含量。
结果如表10所示，在没有炎症诱导剂LPS的条件下，与商业菌株相比，发酵乳杆菌WHH3906促进RAW264.7细胞分泌IL-10的量显著高于商业菌株(p<0.01)，分泌IL-6和NO 的量显著低于商业菌株(p<0.01)，TNF-α分泌量与商业菌株相当。在LPS诱导的炎症条件下，与商业菌株相比，发酵乳杆菌WHH3906促进RAW264.7细胞分泌IL-10的量显著高于商业菌株(p<0.001)，分泌IL-6的量显著低于商业菌株(p<0.05)，NO和TNF-α分泌量与商业菌株相当。表明在炎症条件下，本发明菌株发酵乳杆菌WHH3906能够促进IL-10分泌，抑制 IL-6、TNF-α和NO分泌，具有改善炎症的功能。
表10 菌株对RAW264.7细胞分泌细胞因子的影响
Figure RE-GDA0002856559920000141
*：与空白对照相比，差异显著，p<0.05，**：与空白对照相比，差异极显著，p<0.01，***：与空白对照相比，差异极极显著，p<0.001；#：与LcS相比，差异显著，p<0.05，##：与LcS 相比，差异极显著，p<0.01，###：与LcS相比，差异极极显著，p<0.001。
实施例8：发酵乳杆菌WHH3906、植物乳杆菌1701以及两者的组合物缓解慢性炎症的功效
将健康的SPF级雄性大鼠(6-8周龄，200±20g)，适应7天后，随机分为5组，每组10只。动物饲养保持环境温度为21±2℃，湿度为30-70％，12h光照交替，自由饮水，自由摄入饲料。饲料购自江苏省协同医药生物工程有限责任公司，基础饲料主要由鱼粉、小麦、玉米、豆粕、麸皮等组成；高脂饲料是在基础饲料中添加15％蔗糖、15％猪油、10％酪蛋白。动物实验分组如下：
对照组：基础饲料喂养；
模型组：高脂饲料喂养造模，诱导肥胖模型，使大鼠发生炎症；
实验组1：高脂饲料喂养造模，灌胃发酵乳杆菌WHH3906菌株悬液，灌胃剂量为1×109CFU/d；实验组2：高脂饲料喂养造模，同时灌胃植物乳杆菌1701菌株悬液，灌胃剂量为1×109CFU/d；实验组3：高脂饲料喂养造模，灌胃发酵乳杆菌WHH3906菌株和植物乳杆菌1701菌株悬液，灌胃剂量为5×108CFU/d发酵乳杆菌WHH3906菌株+5×108CFU/d植物乳杆菌1701菌株；试验周期为10周，试验结束后，称体重，1％戊巴比妥钠(0.5mL/100g体重)麻醉，采用心脏穿刺取血获取大鼠血液样本，将血液样本取出后，静置30min，4℃，4000rpm离心15min，取上清，用ELISA试剂盒检测血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1和NO的含量。脱颈处死后，解剖取肝脏，用ELISA试剂盒检测肝脏中IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1和NO的含量。
由表11可知，与对照组相比，模型组大鼠血清中促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1 和NO的含量显著高于对照组(p<0.05，p<0.01)，说明大鼠体内已经发生炎症。
由表11可知，与模型组相比，实验组1、实验组2和实验组3大鼠血清中抑炎因子IL-10 水平显著高于模型组(p<0.01)，促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1和NO的含量显著低于模型组(p<0.05，p<0.01，p<0.001)，实验组3的效果明显优于实验组1和实验组2。说明发酵乳杆菌WHH3906菌株和植物乳杆菌1701菌株均能够显著降低大鼠体内炎症水平，具有缓解慢性炎症的功能，两者复合使用后体现出良好的协同效果，相较于单独使用而言缓解慢性炎症的效果更佳。
表11 大鼠血清中细胞因子的浓度变化
Figure RE-GDA0002856559920000151
与模型组相比，*：p<0.05；**：p<0.01，***：p<0.001。
由表12可知，与对照组相比，模型组肝脏组织中促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α、MCP-1 和NO的含量显著高于对照组(p<0.05，p<0.01)，说明肝脏已经发生炎症。
由表12可知，与模型组相比，实验组1、实验组2和实验组3大鼠肝脏组织中促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α、MCP-1和NO的含量显著低于模型组(p<0.05，p<0.01)，实验组3 的效果明显优于实验组1和实验组2。说明发酵乳杆菌WHH3906菌株和植物乳杆菌1701菌株均能够显著降低大鼠肝脏组织炎症水平，具有缓解炎症的功能，两者复合后体现出良好的协同效果，相较于单独使用而言缓解慢性炎症的效果更佳。
表12 肝脏炎症指标
处理 IL-1β(ng/L) IL-6(ng/L) TNF-α(ng/L) MCP-1(ng/L) NO(ng/μL)
对照组 17.05±0.99* 229.89±9.82* 296.18±10.54* 399.56±12.85* 0.52±0.04**
模型组 26.81±1.39 263.59±11.26 325.33±10.41 490.65±15.37 0.97±0.05
实验组1 19.19±3.51* 222.09±16.15* 307.59±7.27* 424.05±6.20* 0.64±0.04**
实验组2 18.50±1.78* 228.83±16.61* 305.61±8.16* 415.84±7.33* 0.60±0.04**
实验组3 15.31±0.87** 200.69±8.44* 294.67±8.25* 390.22±12.58* 0.53±0.03**
与模型组相比，*：p<0.05；**：p<0.01。
综上所述，发酵乳杆菌WHH3906菌株和植物乳杆菌1701菌株复合使用能够综合调节体内多种炎症因子水平，使抑炎因子水平提高、促炎因子水平降低，从而缓解机体慢性炎症，二者具有协同作用。
应用实施例
实施例1：发酵乳杆菌WHH3906冻干菌粉的制作
本发明菌株发酵乳杆菌WHH3906以1％的接种量接种于10ml液体MRS培养基中，在37℃恒温培养箱中培养12h(一代种子液)，以此传至两代。二代种子1％的接种量接种于10L含有液体MRS培养基的发酵罐中，37℃培养14h，收集菌液，8000rpm离心10min收集菌体，用0.9％生理盐水洗涤一次，加入四倍菌泥量的含有脱脂乳粉、葡萄糖、甘油的保护剂中重悬，真空冷冻干燥，菌粉真空包装。制得的菌粉活菌数可达1×1012CFU/g，可用于含有发酵乳杆菌WHH3906的具有减肥功能相关药品、保健品、食品、饮料或发酵剂产品的制作和生产。
实施例2：发酵乳杆菌WHH3906发酵乳的制作
准确称取脱脂乳100g，45-50℃纯净水900g，50℃温水溶解，剪切20min，50℃水化30min，均质，95℃杀菌5min。降温后，按1％接种量接入应用实施例1中的发酵乳杆菌WHH3906 发酵剂，37℃发酵12h，4℃后熟8-12h。观察其凝乳状态，用打蛋器破乳后，检测其拉丝长度、pH、酸度、黏度和活菌数，设置三次重复。
结果如表13所示，发酵乳凝乳状态紧实，表面光滑，有少量清洗出，破乳后，经较长时间搅拌丝滑粘稠，无拉丝，活菌数达3.33×108CFU/g，感官和风味良好，奶香浓郁，口感细腻丝滑，该发酵乳即为含有发酵乳杆菌WHH3906的具有减肥功能的发酵乳。
表13 发酵乳杆菌WHH3906发酵乳特性
pH 酸度(°T) 黏度(cP) 活菌数lg值(CFU/g)
4.15±0.06 73.18±0.75 2910±8.98 8.52±0.13
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。
序列表
<110> 杭州娃哈哈科技有限公司
<120> 一株具有减肥功能的发酵乳杆菌及其应用
<130> 2020
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1440
<212> DNA
<213> 发酵乳杆菌WHH3906(Lactobacillus fermentum WHH3906)
<400> 1
gcggctggct cctaaaaggt taccccaccg actttgggtg ttacaaactc tcatggtgtg 60
acgggcggtg tgtacaaggc ccgggaacgt attcaccgcg gcatgctgat ccgcgattac 120
tagcgattcc gacttcgtgc aggcgagttg cagcctgcag tccgaactga gaacggtttt 180
aagagatttg cttgccctcg cgagttcgcg actcgttgta ccgtccattg tagcacgtgt 240
gtagcccagg tcataagggg catgatgatc tgacgtcgtc cccaccttcc tccggtttgt 300
caccggcagt ctcactagag tgcccaactt aatgctggca actagtaaca agggttgcgc 360
tcgttgcggg acttaaccca acatctcacg acacgagctg acgacgacca tgcaccacct 420
gtcattgcgt tcccgaagga aacgccctat ctctagggtt ggcgcaagat gtcaagacct 480
ggtaaggttc ttcgcgtagc ttcgaattaa accacatgct ccaccgcttg tgcgggcccc 540
cgtcaattcc tttgagtttc aaccttgcgg tcgtactccc caggcggagt gcttaatgcg 600
ttagctccgg cactgaaggg cggaaaccct ccaacaccta gcactcatcg tttacggcat 660
ggactaccag ggtatctaat cctgttcgct acccatgctt tcgagtctca gcgtcagttg 720
cagaccaggt agccgccttc gccactggtg ttcttccata tatctacgca ttccaccgct 780
acacatggag ttccactacc ctcttctgca ctcaagttat ccagtttccg atgcacttct 840
ccggttaagc cgaaggcttt cacatcagac ttagaaaacc gcctgcactc tctttacgcc 900
caataaatcc ggataacgct tgccacctac gtattaccgc ggctgctggc acgtagttag 960
ccgtgacttt ctggttaaat accgtcaacg tatgaacagt tactctcata cgtgttcttc 1020
tttaacaaca gagctttacg agccgaaacc cttcttcact cacgcggtgt tgctccatca 1080
ggcttgcgcc cattgtggaa gattccctac tgctgcctcc cgtaggagta tgggccgtgt 1140
ctcagtccca ttgtggccga tcagtctctc aactcggcta tgcatcatcg ccttggtagg 1200
ccgttacccc accaacaagc taatgcaccg caggtccatc cagaagtgat agcgagaagc 1260
catcttttaa gcgttgttca tgcgaacaac gttgttatgc ggtattagca tctgtttcca 1320
aatgttgtcc cccgcttctg ggcaggttac ctacgtgtta ctcacccgtc cgccactcgt 1380
tggcgaccaa aatcaatcag gtgcaagcac catcaatcaa ttgggctcaa cgcgttcgac 1440

Claims (10)

1.一株具有减肥功能的发酵乳杆菌，其特征在于，所述发酵乳杆菌命名为WHH3906，已在2020年3月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，其保藏编号为CGMCC NO.19472，微生物分类命名为发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum。
2.一种具有减肥功能的发酵乳杆菌的突变体，其特征在于，所述突变体为对权利要求1所述发酵乳杆菌进行诱变、驯化、基因重组或者经自然突变而获得的突变体。
3.如权利要求1所述的发酵乳杆菌或权利要求2所述的突变体在制备用于减肥或控制体重的食品、药品、保健品或发酵剂中的应用。
4.如权利要求1所述的发酵乳杆菌或权利要求2所述的突变体在制备用于缓解非酒精性脂肪肝的食品、药品、保健品或发酵剂中的应用。
5.如权利要求1所述的发酵乳杆菌或权利要求2所述的突变体在制备用于缓解慢性炎症的食品、药品、保健品或发酵剂中的应用。
6.一种组合物，其特征在于，含有权利要求1所述的发酵乳杆菌和/或权利要求2所述的突变体，并含有生理上可接受的赋形剂和/或稀释剂。
7.如权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述组合物为食品、药品、保健品或发酵剂。
8.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述食品为发酵乳、乳酪、含乳饮料、乳粉、发酵果蔬或固体饮料。
9.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述药品或保健品的制剂形式为胶囊、粉剂或片剂。
10.一种用于缓解慢性炎症的组合物，其特征在于，含有权利要求1所述的发酵乳杆菌和/或权利要求2所述的突变体，并含有植物乳杆菌1701和/或其突变体；所述植物乳杆菌1701已在2019年10月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.18728，微生物分类命名为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum；所述突变体为对所述植物乳杆菌进行诱变、驯化、基因重组或者经自然突变而获得的突变体。
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